Krooninen sairaus

tiivistelmä

TAE226, bis-anilino pyrimidiiniyhdiste, on kehitetty estäjänä fokaalisen adheesion kinaasin (FAK) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä-I-reseptori (IGF-IR). Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutus TAE226 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), erityisesti keskittyen

EGFR

mutaatiostatuksesta riippumatta. TAE226 oli tehokkaampi soluja vastaan ​​mutantti EGFR, mukaan lukien T790M mutantti, kuin soluja vastaan ​​villityypin yksi. TAE226 inhiboi etusijassa fosfo-EGFR ja sen loppupään signalointi välittäjinä soluja mutantti EGFR kuin ne, joilla on villin tyypin yksi. Fosforylaatioon FAK: n ja IGF-IR: ei inhiboitui konsentraatio, jossa leviämisen

EGFR

-mutant soluihin estyi. Tulokset

in vitro

sitoutumisen määritys osoitti huomattavia eroja affiniteetti TAE226 välillä villityypin ja L858R (tai delE746_A750) mutantti, ja heikentynyt affiniteetti ATP L858R (tai delE746_A750) mutantti aiheutti hyvää reagointikykyä L858R (tai delE746_A750) mutantti solujen TAE226. Ja etu, L858R /T790M tai delE746_A750 /T790M-mutantti parannettu sitoutumisaffiniteetti TAE226 verrattuna L858R tai delE746_A750 mutantti, jolloin tehokkuus TAE226 vastaan ​​T790M mutanttisoluja huolimatta T790M mutaatio palauttaa ATP affiniteetti mutantin EGFR lähellä että villityypin. TAE226 osoitti myös suurempi affiniteetti on noin 15-kertainen varten L858R /T790M mutantti kuin villityypin yksi kineettisen vuorovaikutuksen analyysi. Kasvaimenvastainen vaikutus vastaan ​​

EGFR

-mutant kasvaimet mukaan lukien T790M mutaatio vahvistettiin hiirimalleissa ilman merkittävää toksisuutta. Yhteenvetona, olemme osoittaneet, että TAE226 esti aktivoinnin mutantin EGFR ja osoittivat anti-proliferatiivista aktiivisuutta NSCLCs kuljettaa

EGFR

mutaatioita, mukaan lukien T790M mutaatio.

Citation: Otani H, Yamamoto H, Takaoka M, Sakaguchi M, Soh J, Jida M, et al. (2015) TAE226, joka on bis-anilino pyrimidiini yhdiste, Estää EGFR-Mutant Kinase lukien T790M Mutant Show Anti-Tumor Vaikutus

EGFR

-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0129838. doi: 10,1371 /journal.pone.0129838

Academic Editor: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italia

vastaanotettu: 19 elokuu 2014; Hyväksytty: 13 toukokuu 2015; Julkaistu: 19 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Otani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grant-in-tuki Scientific Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan (apurahanumeron : 18790993 ST), https://www.mext.go.jp/english/. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Novartis Pharma AG tuettiin muodossa palkkojen tekijöille SH ja EK, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Vaikka laatijat käsikirjoituksen (SH ja EK) ovat työntekijöitä Novartis Pharma AG, tämä ei muuta kirjoittajien noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. Novartis Pharma AG tuettiin muodossa palkkojen tekijöille SH ja EK, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Keuhkosyöpä on jaettu kahteen histologinen ryhmään, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä. Huolimatta suuri pyrkimyksiä parantaa potilaiden selviytymiseen keuhkosyöpä, tyydyttävä eloonjäämisaste ei ole vielä saavutettu, koska suurin osa potilaista on kehittynyt taudin vaiheessa ja niiden kasvaimet ilmentävät luontainen resistenssi tavanomaisen kemoterapian [2]. Parantaa ennustetta potilaiden keuhkosyöpä, monissa kliinisissä ja perus tutkimuksiin, mukaan lukien translaatiotutkimus, on tehty [3, 4].

Molecular kohdistaminen terapia perustuu molekyylien muutosten syöpä on lupaava strategia keuhkosyövän syövät sekä muut pahanlaatuiset kasvaimet. Esimerkiksi, 4-anilinokinatsoliiniyhdisteiden-inhibiittorit, kuten gefitinibi ja erlotinibi, on suunniteltu estämään tyrosiinikinaasidomeeniin epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), joka on yli-ilmentynyt NSCLC; tällaiset inhibiittorit ovat parhaillaan käytetään hoitoon NSCLC [5-8]. Erityisen kiinnostavia nämä EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) tuottaa radikaaleja antituumorivaikutuksia vastaan ​​NSCLCs kuljettaa yhteistä

EGFR

mutaatioita, pienet deleetiot eksonissa 19 ja L858R mutaatio eksonissa 21. Näiden EGFR-TKI -sensitive mutaatioita, T790M mutaatio eksonissa 20 tunnetaan EGFR-TKI-resistentti mutaatio [9, 10]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että yhteinen

EGFR

mutaatiot tyrosiinikinaasidomeeniin ovat yleisempiä potilailla, joilla adenokarsinooma histologia, koskaan tupakointi historia, ja Itä-Aasian etnisyys [11-13]. Taajuus yhteisten

EGFR

mutaatio adenokarsinooma, joka riippuu potilaan taustan, vaihtelee 15-45%, mikä viittaa siihen, että yhteinen

EGFR

mutaatio on usein ja tärkeä tapahtuma keuhkojen adenokarsinoomat [11, 13, 14]. Sen sijaan, luontainen T790M mutaatiot ovat hyvin harvinaisia ​​[15]. Kuitenkin, T790M mutaatiot löytyy noin 50% tapauksista keskuudessa NSCLCs, että hankittu resistenssi EGFR-TKI [16].

lisäksi EGFR-TKI: kohdistaminen EGFR-proteiini, erilaisia ​​pienimolekyylisiä yhdisteitä on kehitetty kohdistaa syöpä erityinen molekyyli muutoksia. TAE226, bis-anilino pyrimidiiniyhdiste, kilpailee ATP fokaalisen adheesion kinaasin (FAK) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä-I-reseptori (IGF-IR). Tämä yhdiste kuulemma estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion moniin syöpiin kuten gliooma, Barrettin ruokatorven adenokarsinooma, munasarjasyöpä, peräsuolen ja rintasyöpiä [17-22].

FAK on ei-reseptori tyrosiinikinaasin että transdusoi signaaleja integriinireseptoriantagonisteja ja osallistuu useisiin solujen toimintoihin tarvitaan solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, liikkuvuuteen, ja hyökkäys [23]. IGF-IR on transmembraaninen reseptori tyrosiinikinaasin, joka osallistuu signa- jotka johtavat aktivointi sekä AKT ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) [24]. Nämä tyrosiinikinaaseihin tiedetään yliekspressoituvan monissa pahanlaatuiset kasvaimet mukaan lukien joitakin NSCLCs ja pelata onkogeenisessä rooli syöpäsolujen [25-27]. Nämä seikat ja taustan kannusti meitä tutkimaan kasvaimen vastaisen vaikutuksen TAE226 NSCLC, ja me yllättäen havaittu, että TAE226 mieluiten estää leviämisen

EGFR

-mutant NSCLC solulinjoja kuten T790M mutantti verrattuna

EGFR

-wild-tyyppinen NSCLC solulinjoja.

tässä tutkimuksessa kuvaamme kasvaimen vastainen vaikutus TAE226 on

EGFR

-mutant solujen

in vitro

ja

in vivo

ja tutkittiin anti-kasvain mekanismi TAE226 in

EGFR

-mutant soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Animal Care ja käyttö komitea Okayama University (Luvan numero: OKU-2007232). Kaikki Leikkaus suoritettiin ketamiini ja ksylatsiinin anestesian, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

reagenssit

NVP-TAE226 oli ystävällisesti Novartis Pharma AG (Basel, Sveitsi). ZD1839 (gefitinibin) luovutti ystävällisesti AstraZeneca (Wilmington, DE). Kantaliuosta Näiden yhdisteiden on vastaavasti liuottaa pitoisuutta 20 mM ja 10 mM kanssa dimetyylisulfoksidin (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes se käytettiin

in vitro

kokeita.

vasta

ensisijainen vasta-aineita seuraavia proteiineja käytettiin western blotting: polyklonaalista EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), IGF-IRβ, fosfo-IGF -IRβ (Tyr1131), AKT, fosfo-AKT (Ser473), p44 /p42-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK), ja fosfo-p44 /p42 MAPK-vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Monoklonaalinen anti-fokaalisen adheesion kinaasi (FAK), fosfo-FAK (pY397) vasta-aineet hankittiin Biosource (Berkeley, CA), ja anti-aktiini-vasta-aine, jota käytetään yhtä suuri lastaus valvontaa, ostettiin Sigma-Aldrich.

solulinjat ja soluviljelmä

vaikutuksen arvioimiseksi TAE226, seuraavien 17 NSCLC solulinjoissa, yksi rintasyöpäsolulinja (SK-BR-3), yksi mahasyöpä solulinja (MKN45) ja HEK -293T solulinjaa käytettiin

in vitro

ja

in vivo

kokeita. HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820, NCI-H1819, NCI-H1666, NCI-H1395, NCI-H2228, NCI-H1648, NCI-H1993, NCI-H838 ja NCI-H1299 solulinjoja ystävällisesti saatu Dr. Adi F. Gazdar (University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Dallas, TX, USA), joka perustettiin ne NSCLC solulinjoissa Dr. John D. Minna [28-30] paitsi NCI-H3255, joka perustettiin Dr. Bruce E. Johnson [11, 31]. Nämä solulinjat olivat osoittautuneet ovat yksittäisiä geneettinen alkuperä, jonka Powerplex 1,2 (Promega, Madison, WI) at University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, ennen kuin saimme näissä solulinjoissa [29]. PC-9 (luettelonumero: 37012) hankittiin Immuno-Biological Laboratories (Takasaki, Japani). MKN45 (luettelonumero: JCRB0254) ostettiin Japani Collection of Research Bioresources Cell Bank, National Institute of Biomedical Innovation (Ibaraki, Japani). SK-BR-3 (luettelonumero: HTB-30), A549 (luettelonumero: CCL-185), Calu-3 (luettelonumero: HTB-55) ja HEK-293T (luettelonumero: CRL-3216) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Gefitinibin kestävä PC-9 solulinja (RPC-9) perustettiin yksi kirjoittajista (K.K.) [32]. PC-9, HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820 ja RPC-9 on EGFR-TKI-herkkiä mutaatioita. Lisäksi NCI-H1975, NCI-H820 ja RPC-9-solulinjoja on myös T790M EGFR-TKI-resistenttejä mutaatio. Yksityiskohdat geneettisiä muutoksia näissä solulinjoissa lukuun ottamatta HCC4006 (delL747_A750, P ins) ja NCI-H820 (delE746_E749 /T790M) on esitetty taulukossa 1.

NCI-H3255 kasvatettiin ACL- 4 väliaineessa [33, 34], johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja muut syövän solulinjoja ylläpidettiin RPMI-1640-alustassa (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich). HEK-293T-solulinja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-Medium (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kaikki solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa täysin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa. Kaikki

in vitro

kokeet suoritettiin noin 80% konfluentteja viljelmiä.

Vaikutus TAE226 IGF-IR jälkeen seerumin nälkään

vaikutuksen arvioimiseksi TAE226 on IGF-IR alle ligandi-free-tilassa olemme analysoineet indusoi IGF-IR-fosforylaation jälkeen seerumin nälkään seuraa TAE226 hoitoon. Jälkeen solulinjat olivat ilman seerumia kolme tuntia ja käsiteltiin lisääntynyt pitoisuus TAE226 kaksi tuntia, ne stimuloitiin 100 ng /ml IGF-I rekombinantti (Sigma-Aldrich) 15 minuutin ajan ja sitten analysoitiin western-blottauksella.

määrittäminen lääkeaineen herkkyys TAE226 ja gefitinibin erilaisissa solulinjoissa

Drug herkkyys määritettiin modifioidulla MTS-määritystä CellTiter 96 vesikerros Solution Reagent (Promega, Madison, WI). Soluja yleensä ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheytenä, joka antaisi 80% konfluenssiin, jonka loppuun kokeen, vaihtelee kunkin solulinjan 3000-4000 kuoppaa kohti. Tämän jälkeen väliaine kuopissa korvattiin alustalla, joka sisälsi laimennettua lääkeainetta liuoksia TAE226 tai gefitinibin 4-log-alue tai täydellisessä elatusaineessa, joka jaettiin 8-jäljitellä kuoppiin. Soluja inkuboitiin kun läsnä oli kullakin pitoisuudella TAE226 48 tuntia ja gefitinibin 72 tuntia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa. Sen jälkeen, MTS väriaine lisättiin kuhunkin kuoppaan. Viljelmiä inkuboitiin vielä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Optiset tiheydet näytteistä mitattiin 490 nm: ssä käyttäen Immuno Mini NJ-2300 (Nalge Nunc International KK, Rochester, NY). Mean optinen tiheys kunkin lääkkeen pitoisuus laskettiin jälkeen heitetään korkein ja alhaisin arvo. Anti-kasvain vaikutuksia TAE226 ja gefitinibin kunkin solulinjan osoitettiin kannalta inhibiittorikonsentraationa 50% (IC

50), joka määritettiin piirtämällä kuvaaja prosentuaalinen solujen kasvun inhibition (Y-akseli) vs. lääkeaineen pitoisuus (X-akseli). IC

50 arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ja keskihajonnat. Kokeet toistettiin, kunnes keskihajonta tuli vähemmän kuin keskimääräinen.

Western blot-analyysi

Soluja viljeltiin 60 mm astiat yön yli, ja sitten sitä käsiteltiin DMSO: ssa tai kullakin pitoisuudella TAE226 ja gefitinibi. Seuraavaksi ne pestiin pois kylmällä PBS: llä ja lyysattiin 1 × soluhajotuspuskurin [20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na-

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM beeta-glyserofosfaatti, 1 mM Na

3Vo

4, 1 ug /ml leupeptiiniä] (Cell signalointi Technology) täydennettynä Complete, Mini (Roche, Basel, Sveitsi) poimia proteiinia. Sen jälkeen, kun proteiinipitoisuus mitattiin yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia (30 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Proteiinit on membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Seuraavat sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin: vuohen antirabbit tai anti-hiiri-IgG-konjugoidulla piparjuuriperoksidaasi (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Spesifisten signaaleja, membraaneja inkuboitiin ECL plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK).

In vitro

sitoutumismääritys variantin EGFR-TK domeenien

sitova kyky TAE 226 varianttia EGFR-TK verkkotunnuksia tutkittiin

in vitro

sitoutumisen määrityksessä. Variant EGFR-TK-domeenien koostui villin tyypin, delE746_A750, L858R, delE746_A750 /T790M, ja L858R /T790M. Yksityiskohtainen menetelmä kuvataan S1 Method.

Kineettinen vuorovaikutuksen analysointi TAE226 ja gefitinibin vastaan ​​villityypin EGFR ja L858R /T790M EGFR mutantti

luonnehtivat mekanismin toiminnan TAE226 on EGFR teimme kineettinen vuorovaikutuksen analysointi TAE226 ja gefitinibin (kontrollina) vastaan ​​villityypin EGFR ja L858R /T790M EGFR-mutantin Proteros Reporter tilavuus Assay (Proteros biostructures GmbH, Munchen, Saksa), jota käytettiin määrittämään seuraavat parametrit: K

d,

k

päälle,

k

pois ja viipymäaika. Proteros Reporter tilavuus määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [35, 36]. Yksityiskohtainen menetelmä kuvattiin S1 Method.

Animal ksenografti hiirimallissa

Tässä kokeessa käytimme BALB /c-nu /nu-naaraita nude-hiirissä 4-6 viikon iässä, jotka ostettiin Charles River Laboratories Japan, Inc (Yokohama, Japani). Ne ylläpidettiin spesifisissä-patogeenivapaissa olosuhteissa mukaisesti suuntaviivoja eläinten hoidon ja käytön komitea Okayama yliopistossa. PC-9 ja RPC-9-solulinjat (4,0 x 10

6/100 ui) sekoitettiin 100 ul: n kanssa Matrigeliä (Corning Life Sciences, Andover, MA) ympättiin ihonalaisesti 24 nude-hiirissä [4 eri ryhmien (n = 6 kussakin ryhmässä), jonka pitoisuus TAE226], joka oli noin 20 g painoa. TAE226 laimennettiin metyyliselluloosaa pitoisuus 0 mg /kg (ajoneuvo), 30 mg /kg, 60 mg /kg ja 90 mg /kg. Sen jälkeen, kun kasvaimen tilavuus on saavuttanut 200-400 mm

3, TAE226 annettiin oraalisesti kullekin nude-hiiri kerran päivässä sarjanumero 14 päivää. Kolmen päivän välein, kehon paino hiirillä ja suurempi akseli ja pienempi akseli mitattiin kunkin tuumorin ja laskettiin tuumorin tilavuus käyttäen seuraavaa kaavaa; (Pääakseli) x (pienempi akseli)

2 × 1/2 [37, 38]. Saat 14 päivää, kasvaimen tilavuus, kasvaimen kasvu ja painon analysoitiin keskiarvona kunkin ryhmän.

Tilastollinen

Opiskelijan

t

testillä tietojen vertailua kahden ryhmän välillä. Tiedot olivat edustettuina keskiarvo ± keskihajonta (SD).

P

0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Anti-proliferatiivinen vaikutus TAE226 on NSCLC solulinjoissa

arvioitiin kasvaimen vastainen vaikutus TAE226 käyttäen MTS-määritystä 15 NSCLC solulinjoissa, yksi rintasyöpäsolulinja ja yksi mahasyövän solulinja (taulukko 1). Määrä MTS jotka suoritettiin ja jokainen IC

50 saadun arvon riippumaton määrityksistä on esitetty S2 taulukossa. Kolme NSCLC solulinjoja (PC-9, HCC827 ja NCI-H3255) vain EGFR-TKI-herkkä

EGFR

mutaatiot ja kaksi NSCLC solulinjoissa (RPC-9 ja NCI-H1975) sekä TKI-herkkiä ja TKI-resistenttejä

EGFR

mutaatioita osoitti vastaavia IC

50-arvot, jotka vaihtelevat +0,086-0,31 uM. Sen sijaan, IC

50-arvot

EGFR

villityypin NSCLC solulinjoja (n = 10: vaihteli 0,28-6,2 uM) olivat korkeampia kuin

EGFR-

mutantti NSCLC solulinjat vaikka kaksi

BRAF

mutantti solulinjojen ja yksi

EML4

–

ALK

siirtämisellä solulinja osoitti keskitasolla IC

50-arvot (vaihteluväli 0,28 0,48 uM). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TAE226 oli tehokkaampi

EGFR

-mutant solulinjat, riippumatta läsnä TKI-resistenttejä

EGFR

T790M mutaatio, kuin

EGFR

villi tyyppinen solulinjat, erityisesti jotka eivät ole

BRAF

tai

EML4

–

ALK

muutoksiin.

lisäksi tutkittiin anti-kasvain vaikutus gefitinibin vastaan ​​14 NSCLC solulinjoja (taulukko 1). Kolme NSCLC solulinjoja kätkeminen ainoastaan ​​EGFR-TKI-herkkä

EGFR

mutaatio olivat herkkiä gefitinibin (IC

50-arvot vaihtelivat +0,0014-,0028 uM), kun taas muut NSCLC solulinjat kätkeminen villityypin

EGFR

(n = 9) tai TKI-resistenttejä

EGFR

mutaatio (n = 2) olivat resistenttejä (IC

50 oli vaihtelivat 5,3-32,6 pM). Nämä tiedot olivat yhtäpitäviä aikaisempien raporttien [10, 28].

vapautuminen FAK, IGF-IR ja EGFR-sukuiset proteiinit jälkeen TAE226 hoidon NSCLC solulinjoissa

tutkineet vaikutus TAE226 on FAK, IGF-IR ja EGFR-sukuiset proteiinit käyttäen 6 solulinjoja (PC-9, HCC827, NCI-H1975, RPC-9, NCI-H1299, ja NCI-H1819). Fosforylaatio FAK (Thy397) ja IGF-IR (Tyr1131), jotka ovat tavoitteet TAE226, ei merkittävästi inhiboi jopa pitoisuudella 5 uM kaikki 6 testatuissa solulinjoissa (kuvio 1). Sillä FAK, fosforylaatio inhiboitui pitoisuudessa 20 uM (tuloksia ei ole esitetty). IGF-IR, fosforylaatio inhiboitui täysin TAE226 jälkeen seerumin nälkään kaikki 4 testatuissa solulinjoissa (PC-9, RPC-9, NCI-H1299, ja NCI-H1819), riippumatta ligandin stimulaation (S1 kuvio). Tämä tulos osoitti, että TAE226 esti phoshorylation IGF-IR odotetusti.

NSCLC solulinjat EGFR-TKI-herkän (eksoni 19 poistot) mutaatio (PC-9 ja HCC827), solulinjat sekä EGFR- TKI-herkkä ja kestävä (T790M) mutaatiot (NCI-H1975 ja RPC-9), ja solulinjat villityypin EGFR (NCI-H1299 ja NCI-H1819) käsiteltiin TAE226 useilla pitoisuuksilla ja western blotting analyysi suoritettiin . Fosforylaatiot FAK ja IGF-IR ei tukahdutettiin kaikissa NSCLC testatuissa solulinjoissa. Sen sijaan fosforylaatiot EGFR ja sen loppupään proteiineja, AKT ja MAPK, tukahdutettiin alemmissa pitoisuus TAE226 in

EGFR

-mutant solulinjat riippumatta läsnäolon T790M mutaation verrattuna

EGFR

-wild-tyypin solulinjoja. Olemme inkuboitiin membraanin Actin (42 kDa), kun olemme inkuboitiin MAPK (42 ja 44 kDa) ja strippaus puskuria käytettiin, että kalvo.

Erityisen kiinnostava, fosforylaatio EGFR oli pääasiassa inhiboitu jonka TAE226 kaikissa neljässä

EGFR

-mutant solulinjoja (PC-9, HCC827, NCI-H1975, ja RPC-9), riippumatta läsnä TKI-resistenttien mutaatioiden. Lisäksi fosforylaatiot AKT ja MAPK, jotka ovat alavirtaan molekyylejä EGFR, myös esti näillä

EGFR

-mutant solulinjat. Sen sijaan fosforylaatiot EGFR, AKT, ja MAPK ei inhiboi solulinjoissa villityypin

EGFR

(NCI-H1299 ja NCI-H1819) (kuvio 1). Nämä tiedot osoittivat, että TAE226 saattaa olla voimakkaampi vaikutus mutantti-EGFR kuin villityypin EGFR.

vahvisti ilmentymisen taso FAK, p-FAK, IGF-IR, ja p-IGF-IR solulinjoissa ilman lääkealtistuksen käyttämällä kymmentä NSCLC solulinjoja (

EGFR

-mutant solulinjoissa PC-9, HCC827, NCI-H3255, HCC4006, NCI-H1975, NCI-H820 ja RPC-9;

EGFR

villityypin solulinjoilla, NCI-H1819, NCI-H1299 ja A549). Mitään merkittävää eroa ekspressiotaso kunkin proteiineihin havaittiin joukossa solulinjoissa (S2 kuvassa).

vaikutus TAE226 mutanttien EGFR-transfektoitujen HEK-293T-solulinjassa

tutkitaan anti-proliferatiivista vaikutusta TAE226 kaksi HEK-293T-solulinjojen stabiilisti transfektoitu villin tyypin EGFR tai mutantti-EGFR (L858R), että olimme aikaisemmin määritettyihin [39]. HEK-293T kanssa mutantti EGFR oli herkempi gefitinibin kuin HEK-293T villityypin EGFR (IC

50-arvot olivat 0,38 ± 0,087 ja 18,2 ± 3,9 uM, tässä järjestyksessä) (taulukko 1). TAE226 aiheutti suuremman anti-kasvain vaikutus HEK-293T mutantti EGFR kuin HEK-293T kanssa villityypin EGFR (IC

50-arvot olivat 0,41 ± 0,06 ja 3,0 ± 0,11 uM, tässä järjestyksessä) ( Pöytä 1). TAE226 esti fosforylaatiot EGFR ja AKT HEK-293T solun mutantti EGFR mutta ei HEK-293T solun villityypin EGFR (S3 kuvassa). Nämä tulokset osoittivat myös, että TAE226 esti solujen kasvua tai eloonjäämistä

EGFR

-mutant solujen tukahduttamalla mutantti EGFR-proteiini.

sitoutumisaffiniteetti TAE226 mutanttiin EGFR

arvioimiseksi sitoutumisaffiniteettia TAE226 EGFR-kinaasien, teimme

in vitro

sitoutumismääritys variantin EGFR-kinaasien (kuvio 2). Supernatantti fraktio sisälsi EGFR-kinaasi, joka ei sitoudu helmi-modifioitu ATP häiriön takia TAE226 (tai eksogeenisen ATP). Saostunut fraktio sisälsi EGFR-kinaasi, joka oli sitoutunut helmiin modifioitu ATP, mikä osoittaa, että TAE226 (tai eksogeenisen ATP) ei häiritse ATP: n sitoutuminen. Siten kaistanvoimakkuus kussakin TAE226 (tai eksogeenisen ATP) pitoisuus heijastaa kykyä TAE226 (tai eksogeenisen ATP) kilpailemaan helmi-modifioitu ATP EGFR kinaasien.

) yhteinen EGFR mutanttikinaaseihin ja B ) T790M sisälsi EGFR mutanttikinaaseihin. Viittä EGFR kinaasien, villityypin, eksoni 21 L858R-mutaation (L858R) tai eksonin 19 deleetio (delE746_A750), T790M rinnalla L858R-mutaation (L858R /T790M), ja T790M rinnalla delE746_A750 (delE746_A750 /T790M) , joka kompetitiivisesti sitoutuvat ATP tai TAE226, poimittiin ja inkuboitiin helmien modifioidun ATP. TAE226 tai yhdistelmä-DNA-ATP lisättiin kilpailemaan helmiä modifioitu ATP sitoutumisesta EGFR kinaasien. EGFR kinaasin binging kanssa helmiä modifioidun ATP oli läsnä sademäärä, ja EGFR kinaasin sitova TAE226 (tai yhdistelmä-ATP) oli läsnä supernatantissa. Western blottaus suoritettiin havaitsemiseksi EGFR kinaasien kunkin osan käyttäen HA-vasta-ainetta. * Kello 10 uM ATP; **, On 0,005 pM TAE226.

Yksi muunnos EGFR kinaaseja, jotka testattiin (villityypin, L858R, delE746_A750, L858R /T790M ja delE746_A750 /T790M), ei ole eroa määriä EGFR-kinaasien, joka sitoutuu helmi-modifioitu ATP todettiin valvonnassa tilassa (kuvio 2A ja 2B). Eksogeeninen ATP sitoutuu heikosti EGFR kinaasien pitoisuutena 1000 uM kaikki variantit testattiin (kuvio 2A). Sen sijaan, TAE226 alkoi sitoutua villityypin EGFR-kinaasin, jonka pitoisuus on 0,1 uM ja pienemmillä pitoisuuksilla mutantti poikkeavien eGFR-arvojen, joka osoittaa, että TAE226 oltava korkeampi affiniteetti EGFR kinaasien kuin ATP. Me arvioitu sitoutumisaffiniteetti TAE226 EGFR variantteja vertaamalla suhde osittain määrällisesti kaistan intensiteetin välillä supernatanttifraktiossa ja saostunut osa 0,1 uM TAE226 keskuudessa villityypin, L858R, tai delE746_A750 (S4A kuvio). Kvantifiointi käyttäen ImageJ ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD) osoitti, että sitoutumisaffiniteetti TAE226 oli noin 7,5-kertainen sekä mutantti poikkeavien eGFR-arvojen kuin villityypin EGFR (S4A kuvio). Vaikutus hankitun T790M mutaation sitoutumisaffiniteetti TAE226 yhteisiä mutantti EGFR kinaasit (L858R tai delE746_A750) arvioitiin myös pitoisuus 0,005 uM TAE226 ja 10 uM ATP: tä (kuvio 2B). Mielenkiintoista on, että sitoutumisaffiniteetti TAE226 oli suurempi T790M, joka sisälsi EGFR mutanttikinaaseihin (L858R /T790M tai delE746_A750 /T790M) kuin yhteisiä EGFR mutanttikinaaseihin (L858R tai delE746_A750) (S4b kuvio).

Interaction kinetiikka TAE226 n ja gefitinibin villityypin EGFR ja L858R /T790M EGFR mutantti

IC

50 ja K

d arvot TAE226 ja gefitinibin vastaan ​​villityypin EGFR ja L858R /T790M EGFR mutantti on esitetty taulukossa 2. IC

50 ja K

d arvot TAE226 olivat 0,326 uM ja 0,163 uM villityypin EGFR, ja 0,0193 uM ja 0,00966 uM L858R /T790M EGFR mutantti, vastaavasti. Mitä gefitinibi, ne olivat 0,0244 uM ja 0,0122 uM villityypin EGFR, ja 0,927 uM ja 0,463 uM L858R /T790M EGFR mutantti, vastaavasti. Gefitinibillä suurempi affiniteetti on noin 40-kertainen villityypin EGFR kuin L858R /T790M EGFR mutantti. Päinvastoin, TAE226 osoitti korkeampi affiniteetti noin 15-kertainen L858R /T790M EGFR mutantti kuin villityypin EGFR. Arvot

k

päälle ja

k

pois ei voitu laskea TAE226 varten sekä tyypin EGFR ja gefitinibin varten L858R /T790M EGFR mutantti takia lyhyt viipymä ( 1,4 min).

Anti-kasvain vaikutus TAE226 on NSCLC hiiren ksenograftimalleja

Koska meillä

in vitro

data, me tutkittiin anti-kasvain vaikutus TAE226 hiiren ksenograftimalleissa. Sen jälkeen kun ihonalainen kasvain tilavuus ympättiin PC-9 ja RPC-9 solulinjoja nude-hiirissä oli saavuttanut tilavuus 200-400 mm

3, käsittelimme nude-hiirissä suun kautta TAE226 (30 mg /kg , 60 mg /kg tai 90 mg /kg) tai metyyliselluloosaa ajoneuvon 14 päivää. Kasvaimen tilavuuden ja painon sekä ksenograftien mitattiin päivänä ennen suun kautta TAE226 ja joka kolmas päivä sen jälkeen. Ilmeisiä sivuvaikutuksia, mukaan lukien painon menetys, ei esiinny vehikkelillä käsitellyssä ryhmässä tai ryhmissä käsiteltiin 30 mg /kg tai 60 mg /kg TAE226, kun painon menetys havaittu hiirissä, joita käsiteltiin 90 mg /kg TAE226. Kasvaimen tilavuus sekä ksenografteissa vähentynyt merkittävästi ajan kuluessa, ja annoksesta riippuvalla tavalla, verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen hiirten (kuvio 3). Lisäksi sekä ksenografteissa EGFR-TKI-herkkiä (PC-9) ja EGFR-TKI-resistenttejä (RPC-9) solulinjat osoittivat samanlaisia ​​antituumorivaikutuksia vastauksena TAE226

in vivo

.

suun kautta TAE226 14 päivää estivät merkittävästi kasvaimen kasvua ihon alle ympätty hiiret ksenografteissa PC-9 (exon19 poistetaan) tai RPC-9 (exon19 poistetaan ja T790M mutaatio) jokaisen annoksen (30, 60 ja 90 mg /kg). Lisäksi, TAE226 osoitti samanlaista anti-kasvain vaikutus sekä ksenograftimalleja riippumatta siitä, EGFR T790M mutaatio.

Keskustelu

Kuten on esitetty suhde pieni EGFR-TKI ja

EGFR

mutaatio [40], kyky TAE226 kilpailla ATP, jolloin sen anti-kasvain potentiaali, määritetään kaksi tekijää: 1) sitova kyky TAE226 mutanttiin EGFR ja 2) affiniteetti ATP mutanttiin EGFR. On hyvin tunnettua, että affiniteetti ATP on pienempi yhteisiä EGFR mutanttien kuin villityypin EGFR [40].

näyttää olevan toinen tärkeä tekijä, joka vaikuttaa voimakkaasti vaikutukset molekyyli kohdistaminen lääkkeiden syöpäsolujen . Mukaan käsite ”onkogeenin riippuvuus”,

EGFR

-mutant solulinjat ovat erittäin riippuvaisia ​​mutantti EGFR varten solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [41]. Kun taas syy köyhien eston FAK tai IGF-IR aktiivisuus NSCLC ei ole selvää, meidän havaintojen mukaan TAE226 esti voimakkaasti mutantti EGFR verrattuna FAK ja IGF-IR, soluissa, jotka ovat ”koukussa” mutantti EGFR, saatu anti-kasvain aktiivisuutta TAE226. Huomionarvoista oli noin eroavaisuuksia IC

50

in vitro

kuin huokoista kinaasimäritykselle ja solun eston määritys joillekin onkogeenien. Tämä ilmiö näyttää selittää käsitteen ”onkogeenin lisäksi” että riippuvuutta tiettyihin onkogeenien voi olla erilainen eri kasvaimia ja onkogeenit. IC

50-arvot C-Src (0,91), HER2 (0,95), FGFR-1 (0,75), c-Met (0,16) ja ALK (0,15), jotka ovat usein aktivoidaan NSCLC, ovat vähemmän kuin vuonna EGFR (1,7) (S1 taulukko, päivitetään tietoja ref. 20), osoittaa, että TAE226 voi myös estää näiden kinaasien lisäksi EGFR NSCLCs, erityisesti jos kasvaimia ”koukussa” näiden kinaasien.

Mitä mekanismin, jonka mukaisesti T790M mutaatio on arveltu vaikuttavan pienimolekyylinen TKI kuten gefitinibi ja erlotinibi The T790M mutaatio on ajateltu aiheuttavan vastuksen steerisesti estämällä sitoutumisen TKI [9, 10, 42]. Lisäksi, Yun ja kollegat raportoitu, että nousu ATP affiniteetti on ensisijainen mekanismi, jolla T790M mutaatio aiheuttaa resistenssiä TKI; kun taas yhden L858R mutaatio vähentää sitoutumisaffiniteettia ATP noin 30-kertainen verrattuna villityypin EGFR, käyttöönotto lisää T790M mutaation palauttaa sitoutumisaffiniteetti ATP verrattavissa villityypin EGFR [43]. Mielenkiintoista on, että tietomme osoittavat, että IC

50-arvot TAE226 EGFR T790M rinnalla L858R (tai delE746_A750) mutantti-solut ovat samanlaiset kuin EGFR L858R (tai delE746_A750) mutanttisoluja, joka tarjoaa vastakkaisia ​​tuloksia verrataan IC

50-arvot gefitinibin heille.