Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tunnistaminen ylimääräisten ennustetekijöitä markkereita parantaa riskien kerrostuminen ja välttää ylihoito on yksi kiireellisimpiä kliiniset tarpeet eturauhassyövässä (PCA). MikroRNA, tärkeäksi sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen, lupaavia biomarkkereita eri syövän yhteisöjä, vaikka vaikutus kuin ennustetekijöiden ennustavia PCA ymmärretään huonosti. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää tiettyjä miRNA mahdollisina ennustetekijöitä merkkiaineiden korkean riskin PCa ja vahvistamaan niiden kliinistä vaikutusta.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Suoritimme miRNA-mikrosiruanalyysillä on korkean riskin PCa valmisteluryhmän valitaan niiden kliininen tulos (kliiniseen etenemiseen elinaika (CPFS) vs. kliininen vajaatoiminta (CF)). Havaitsimme seitsemän ehdokasta miRNA (

let-7a /b /c, miR-515-3p /5p, -181b, -146b

, ja

-361

), joka osoitti differentiaalikaavojen molempien ryhmiä. Edelleen qRT-PCR-analyysi paljasti alas-säätely jäsenten

let-7

perheen useimmissa suuri, hyvin tunnettu korkean riskin PCa kohortti (n = 98). Expression of

let-7 Twitter /

b Twitter /ja

-c

korreloi kliiniseen lopputulokseen parametrit tähän ryhmään. Vaikka

let-7a

ei näkynyt yhdistys tai korrelaatiota kliiniseen olennaiset tiedot,

let-7b

ja

let-7c

liittyi CF PCA potilaiden ja toimi osittain niin itsenäinen ennustetekijöiden merkki. Validointi tietoja käyttämällä itsenäinen suuren riskin tutkimuskohortissa paljasti, että

let-7b,

mutta ei

let-7c,

on vaikutusta itsenäisenä prognostinen merkkiaine BCR ja CF. Lisäksi tunnistimme

HMGA1

, ei-histoni proteiinin, uutena kohteena

let-7b

ja todettu korrelaatio

let-7b

alassäätöä kanssa HMGA1 yli-ilmentyminen ensisijainen PCa näytteissä.

Johtopäätös

Meidän tulokset määrittävät selvä miRNA ilmaus profiili PCA tapauksissa varhain CF ja tunnistettu

let-7b

kuten ennustetekijöiden biomarkkerina vuonna korkean riskin PCa. Tämä tutkimus korostaa

let-7b

kuin tuumorisuppressoriproteiinia miRNA korkean riskin PCa ja esittelee pohjalta parantaakseen Yksittäisenä terapia suuririskisille PCa potilailla.

Citation: Schubert M, Spahn M, Kneitz S, Scholz CJ, Joniau S, Stroebel P, et ai. (2013) Distinct microRNA Expression Profiili eturauhassyöpäpotilailla varhaiseen Clinical laiminlyönti ja vaikutus

let-7

kuten Prognostiset Marker korkean riskin Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (6): e65064. doi: 10,1371 /journal.pone.0065064

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 17 joulukuu 2012; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2013; Julkaistu: 14 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Schubert et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä julkaisu rahoitti Saksan Research Foundation (DFG) ja University of Wuerzburg vuonna rahoitusohjelman Open Access Publishing, eli Ferdinand Eisenberger myöntäminen Deutsche Gesellschaft für Urologie (German Society of Urology) myöntää ID ScM1 /FE-11; ja IZKF (Poikkitieteellinen Center for Clinical Research), Würzburgin yliopisto, myöntää ID Z-3/14. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin maligniteetti miesten Euroopassa, oli arviolta esiintyvyys 345900 vuonna 2006 [1]. Luonnollinen taudinkulku on heterogeeninen vaihdellen veltto erittäin aggressiivinen syöpä metastasizes varhaisessa vaiheessa aiheuttaen kipua ja ennenaikainen kuolema. Nykyinen riski stratifications kuten matala- /keski- /tai suuren riskin PCa yksin riitä ennustamaan kliiniseen tulokseen. Vaikka miesten korkean riskin PCa (PSA 20 ng /ml ja /tai biopsia Gleason Pisteet ≥8 ja /tai kliinisessä vaiheessa ≥ T3) edustavat heterogeeninen ryhmä potilaita. Vaikka luonnehdittu ryhmä, joka on köyhimpiä kliininen tulos kaikkien riskiryhmiin, vain enintään 30% kehittää etäpesäkkeitä ja kuolee heidän sairautensa [2] – [4]. Siksi uudet prognostisia biomarkkerit tarvitaan kiireesti paremmin Saharan kerrostuvat riskiryhmiin, tunnistaa tappava tauti, lopulta välttää ylihoito, ja parantaa yksilölliseen hoitoon. Tunnistaminen ennustetekijöitä markkereita, erityisesti tappava tauti, on tuskin mahdollista valitsematon PCa kollektiivinen. Vaikka korkean riskin PCa ikäluokat nyt näyttää paljon odotettua parempi tuloksia, ne ovat edelleen erinomainen ryhmä tunnistaa tekijät nimenomaan korreloivat tappava tauti.

On yhä enemmän todisteita siitä, että MikroRNA (miRNA) ovat sopivia ehdokkaita kehittää tällaisia ​​biomarkkereita. MiRNA ovat pieniä ei-koodaavan RNA säikeet, jotka säätelevät geenien ilmentymistä at transkription jälkeisellä ja translaation tasolla. Yksittäiset Mirs on ominaista joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien (oncomiRs) [5].

Useat raportit kuvaavat PCa erityisiä miRNA ilmaisu allekirjoitukset, mutta sellainen säännellyn miRNA on monipuolinen. Yksimielisyyttä näistä tutkimuksista, että valtaosa miRNA ovat alaspäin säädeltyjä PCA näytteissä [6] – [10]. Vaikka korrelaatio kasvaimen vaiheessa ja arvosana kuvattiin useita MIRS niiden merkitys kuin ennustetekijöitä markkereita ennustaa kovaa kliinisiä päätepisteitä, kuten kliininen vika tai syöpään liittyvät kuolemat, on edelleen vähäistä [8], [11] – [14]. On kuitenkin olemassa lupaavia lähestymistapoja havaita johdonmukaisuus muuttaa spesifisten miRNA ja taudin etenemistä. Larne ja työtoverit äskettäin tunnistaneet miRNA-pohjainen multimarker mallia ennustetyövälineenä progression PCA [15]. Meidän työryhmä aikaisemmin kuvattu

miR-221

olla ennustetyövälineenä merkkiaine taudin uusiutumisen korkean riskin PCa [16].

Jotkut useimmin mainittu MIRS jotka osoittavat alassäätöä in Eturauhassyövän ovat jäseniä

let-7

perhe [6], [9], [17], [18]. Tämä perhe koostuu useista jäsenistä, joiden monimuotoisuus on selvä mukaan isoformit (

kirjeet

7

a-g, -i, miR-98

). Ilmaisu Joidenkin

let-7

jäsentä osoitettiin olevan alassäädetty erilaisissa muissa syöpää yhteisöjä samoin, kuten rinta-, munasarja-, ja keuhkosyövän [19] – [21]. Tunnetut asiaa tavoitteet

let-7

ovat onkogeenien kuten

Ras

,

cmyc

,

EZH2

ja

HMGA2

[17] , [22] – [24], mikä osoittaa kasvaimen tukahduttava funktio

let-7

säätelemällä onkogeenien nimenomaisesti osallistu kasvuun ja uudistuva kapasiteetti Eturauhassyövän soluja. Viime aikoina on osoitettu, että PCa kantasolut ovat ominaista alas-säätely

let-7

perheenjäseniä ja että

let-7

on kriittisesti mukana aiheuttavan kasvaimia ohjaamalla androgeenireseptorin signalointi, leviämisen ja erilaistuminen [25] – [27]. Kuitenkin rooli

let-7

perheenjäseniinsä ennustetekijöitä markkereita PCA ei ole kuvattu tähän mennessä.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa miRNA differentiaalisesti ilmaistut korkean riskin PCA monipuolisia kliiniseen tulokseen. Olemme havainneet, joka koostui 7 miRNA liittyy varhainen kliininen uusiutuminen ja tunnistettu

let-7

perheenjäsenten asteittain säädellä vähentävästi aggressiivinen kasvain. Suuressa korkean riskin PCa kohortti me vahvistivat nämä tulokset ja osoittivat, että alas-säätely

kirjeet

7

b

korreloi biokemiallisten uusiutuminen ja kliinisen epäonnistumisen. Lisäksi olemme vahvistaneet

let-7b

itsenäisinä ennustetekijöiden merkki korkean riskin syöpä itsenäisessä validointi kohortin. Lisäksi olemme osoittaneet, että ilmentyminen

HMGA1

, ei-histoni-proteiini, säätelee

let-7b

sitoutumalla 5’UTR

HMGA1

. Tuloksemme osoittavat, että korkean riskin PCa on tunnusomaista tietty miRNA profiilin ja että yksittäiset

let-7

perheenjäsenet ovat lupaavia ennustetekijöitä merkkiaineita tässä potilasryhmässä.

Materiaalit ja menetelmät

potilasaineistoihin

Olemme työskennelleet kolme monipuolinen PCa kollektiiveja meidän analyysit:

Kohortti a koostuu 98 formaliinilla ja parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäyte on hyvin tunnettu ryhmä korkean riskin PCa potilaista [16]. Katso taulukko 1 klinikan-patologinen data. Kudosnäytteitä ja kliinistä tietoa hyödynnettiin microarray ja qRT-PCR analyysit MikroRNA sekä myöhemmin korrelaatio ja assosiaatiotutkimuksilla.

Kohortti B koostuu 92 FFPE näytteitä RP. Kudosnäyte ja klinikan-patologinen tiedot saatiin Department of Urology yliopistollisessa sairaalassa Leuven, Belgia (taulukko 1). Tämä ryhmä toimi validointi kollektiivinen vahvistaa roolia

let-7b

kuin ennustetekijöiden merkki.

Preoperatiivisen lavastus kohortti A ja B sisältyy DRE, joka on abdominopelvic-tietokonetomografia (CT) skannaa ja luukuvaus. Neoadjuvant hormonihoito, sädehoito tai kemoterapia oli poissulkuun. Imusolmuke etäpesäke ja eturauhasnäytteissä (koko vuori kohdat, 4 mm: n välein) on vaiheittainen ja porrastettu 2002 TNM luokittelu ja Gleason pisteytysjärjestelmä kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Seuranta suoritettiin 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden ajan leikkauksen, 6 kuukauden välein seuraavien 3 vuotta, ja sen jälkeen vuosittain. Biochemical uusiutumisen (BCR) määriteltiin PSA ≥0.2 ng /ml 2 peräkkäisen seurantakäyntejä. Kliiniset vika julistettiin kun joko paikallinen tai etäinen etäpesäkkeitä oli histologisesti todettu tai vahvistanut CT tai luukuvaus. Eloonjäämisaika (OS) määriteltiin aika RP kuolemaan johtuvan PCa tai komplikaatioita.

hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) näytteet olivat peräisin eturauhasen adenomectomy yksilöitä. Näytteet parafiiniin samoin; alueille 80% rauhasmainen kudosta käytettiin. Kaikki potilaat olivat normaalit PSA tasot ennen leikkausta ja syövän jätettiin histopatologisesti.

Kohortti C koostuu 21 syövän näytteestä saatujen Department of Urology yliopistollisessa sairaalassa Würzburg, Saksa. Paria tuore PCa kudosten ja viereisen hyvänlaatuisia kudosta, käytettiin mRNA ja miRNA eristäminen. Tämä ryhmä sisältää potilaalla on valitsematta histo-patologinen PCa yksilö (korkea-, keski-, ja alhainen riski syöpä). Koska mRNA eristäminen tuore kudosnäyte on tehokkaampaa kuin eristäminen FFPE näytteistä olemme työskennelleet tämän kohortin korrelaation tutkimuksia ilmaus

HMGA1

ja

let-7b

. Tätä analyysiä klinikan-patologinen tiedot olivat merkityksettömiä ja siksi ei ole esitetty. Histologinen arviointi suoritettiin Senior patologi (P.S.). Syöpä näytteitä, jotka sisältävät vähintään 80% pahanlaatuisia soluja käytettiin jatkotutkimuksiin. Alueet, joilla on vähintään 80% kanavat eikä syöpäsolujen valittiin viereisen hyvänlaatuisen kudoksen.

Tutkimukset hyväksyi paikallinen eettinen komitea lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Würzburg, Saksa (no. 59/04 ) ja katolisessa yliopistossa Belgian Leuvenissa (UZ Leuven Study määrä S54424; Belgian Study numero B322201214832); kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa.

Microarray Analysis

seulomiseksi ehdokas Mirs, on korreloi huonon lopputuloksen 6 BPH kudosten ja 13 korkean riskin PCa näytteet hybridisoitiin microarray (kohortti A) . Korkean riskin PCa näytteet jaettu kahteen ryhmään (ryhmä 1: CPFS (n = 7), ryhmä 2: CF (n = 6) (katso taulukko 2 lisätietoja). Joukko 668 Mirs (mittapäät 1564V2 Mirvana Applied Biosysems ) bongattiin päälle Nexterion ™ HISENSE E microarray liukuu neljänä rinnakkaisena. Käytimme Pure-Link FFPE Yhteensä RNA: n eristäminen Kit ja RiboMinus pitoisuus Module (Invitrogen) RNA puhdistukseen. Työnnä käsittely suoritettiin Applied Biosystems

miR

Vana ™ käsikirjat. Mikrosiruanalyysi on saatavilla GEO hakunumerolla GSE18671.

RNA ja Käänteinen transkriptio

Yhteensä RNA uuttamalla parafinoidut tai jäädytetyt kudosnäytteistä ja PCa solulinjoja suoritettiin käyttäen Palauta kaikki Total Nucleic Acid Isolation Kit ja kokonais-RNA Extraction Kit vastaavasti (Ambion ja miRNeasy Mini Kit, Qiagen). Erityinen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: n varsi-silmukka-käänteistranskriptioalukkeita mukaan TaqMan® miR määritys-protokolla (PE Applied Biosystems). Epäspesifinen cDNA synteesi suoritettiin IMPROM-II ™ Reverse Transcription System (Promega) mukaan absoluuttinen QPCR SYBR Green-protokollan (Thermo Scientific).

qRT-PCR

Vahvistus microarray tuloksia riippumattomia näytteitä ja lisääntynyt otoskoko tehtiin käyttäen qRT-PCR. M (i) RNA: n ilmentymistä kudosnäytteistä ja solulinjoissa kvantifioitiin joko Taqman® (MIR) tai SYBR Green (mRNA) määritys sarjat ja BioRad OPTICON 2, seuraamalla valmistajan ohjeita (BioRad). Alukkeet

let-7a-d, miR-16, -29a, -221, -146b,

ja

-181b

saatiin Applied Biosystems; pieni ydin- RNA

RNU6B

haettiin normalisointia.

β-Actin

toimi taloudenhoitaja

HMGA1

lauseke (Applied Biosystems). Suhteellinen m (i) RNA-ilmentyminen laskettiin vertailevan ACk

t-menetelmällä (ACk

t näyte = C

t näyte – C

t

RNU6B

). 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin arvioimaan kertaiseksi muutoksia m (i) R-lauseke välillä ja kontrollit. Mean C

t määritettiin kolmena kappaleena PCR kokeiluja. Keskihajonta oli ≤0.4, p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Soluviljely ja Ohimenevä transfektio

LNCaP ja PC-3-solut hankittiin ATCC, Saksa käyttäen kohdat 5-35. soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Solut ympättiin ja samanaikaisesti transfektoitiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 3,5 x 10

5 per kuoppa käyttämällä RPMI 1640 Medium Gibco ilman Phenolred, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), Glutamax (Invitrogen), NEAA (Gibco ), HEPES Puskuriliuos (PAA), ja natriumpyruvaattia liuosta (PAA). Ohimenevä transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine ™ reagenssia (Invitrogen) ja Opti-MEM® (Invitrogen-Gibco) jälkeen, toimittajan ohjeiden mukaisesti. Precursor- vastaavasti Antigo

let-7b

sovellettiin indusoida tai tukahduttaa

let-7b

ilmaisun, esi- ja anti-negatiivinen

let-7b

(Applied Biosystems) olivat käytetty kontrolli- transfektio. Solut kerättiin talteen 48 h transfektion jälkeen.

Western Blot

Solut lyysattiin Cytobuster tai Phosphosafe (Novagene) valmistuksen jälkeen ja määritetään yhtä suuret määrät proteiineja erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin myöhemmin nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad). Proteiinin ilmentymistä

HMGA1

käytettiin 1 mg /ml vuohen polyklonaalisia vasta-aineita (

HMGA1a /1b

, Abcam);

β-Actin

(Abcam) toimi taloudenhoitaja. Visualisointiin käytimme piparjuuriperoksidaasiin kytketty toissijainen vasta (Abcam ja Dako) ja ECL Plus Kit (GE Healthcare). Kvantifiointiin kaistan intensiteetin käytimme Image J (https://imagej.nih.gov/ij/).

lusiferaasimäärityssysteamiä

3’UTR Ihmisen

HMGA1

geeni PCR-monistettiin käyttäen seuraavia alukkeita, jotka sisälsivät muita Hind III tai Spe I -kohtiin: HMGA1Hindfor: 5′-GATC AAGCTTCATATTGTGGTGATGGAG-3 ’; HMGA1SpeIrev: 5’-CAAT ACTAGT GAACATTTGGCGCTGGTAG-3 ’. Saatu

HMGA1

PCR-fragmentti, joka sisältää kaksi eniten alavirtaan sijaitsevaa

let-7b

täydentäviä sivustoilta

HMGA1

kloonattiin alavirtaan Renilla lusiferaasin stop-kodoni lusiferaasireportteriplasmidi (pMIR- REPORT-lusiferaasia, apllied Biosystems) käyttäen Hind III ja Spel sivustoja. Suorittaa Lusiferaasimäärityksiä LNCaP-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 3,5 x 10

5 per kuoppa ja inkuboitiin 24 tuntia. Reportteri vektori transfektoida LNCaP kontrolli ei-kohdistettu RNA-oligonukleotidi tai

let-7

esiaste miRNA. Ohimenevä transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine ™ reagenssia (Invitrogen). 48 tunnin transfektion jälkeen analysoitiin lusiferaasiaktiivisuus Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Renillaa aktiivisuus käytettiin normalisoinnin ja kontrollina transfektiotehokkuuden.

Tilastollinen ja bioinformatiikan analyysi

Microarray-analyysi: Spot intensiteetit skannataan dioja kvantitoitiin käyttäen ScanAlyze Software (http: //rana .lbl.gov /EisenSoftware.htm). Tiedot analysoitiin eri R pakettien Bioconductor hanke (www.bioconductor.org). Tuloksena oleva signaali intensiteetit normalisoitiin varianssi vakauttaminen [28]. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien valittiin microarray tietojen Limma (Linear mallit microarray-analyysi) paketin [29].

qRT-PCR-analyysi: Näytteet verrattiin Welch Kaksi otoksen t-testiä. Ennen tarkempaa analyysiä kollektiivinen A, z-arvoja suhteellisen ilmaisun arvot luotiin. Myöhemmin optimaalinen cut-off-piste

let-7

ilmentyminen määritettiin vastaanotin toimii (ROC) käyrä analyysi (R-paketin ”Proc”). Saadun raja ilmaisua arvot kahtia. Liitot välillä ilmaisun ja kliinisen toistumisen määritettiin Coxin kanssa yksi- ja monimuuttuja malleja. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa perhe toiminto eri ajankohtina. Yhden ja usean vaaran tunnusluvut ja niiden 95% luottamusväli (CI) arvioitiin käyttämällä Coxin suhteellisten riskien mallia (Bioconductor paketti selviytymistarpeen). P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä. Voit testata, onko tämä lähestymistapa on sovellettavissa riippumaton testi aineisto, z-arvoja luotiin kollektiivinen B. Kuitenkin dichotomization kynnys peräisin kollektiivinen käytettiin A. Kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin kuin kollektiivisten A. korrelaatio

HMGA1

ja

let-7b

Pearsonin korrelaatio laskettiin.

Tulokset

Syöpä erityiset miRNA Expression status korkean riskin PCa

Me tehdään microarray analyysi miRNA eristetty kuudesta parafinoidut BPH ja 13 PCa näytteiden seulontaan ehdokasta miRNA liittyessä kehittymistä tai etenemistä korkean riskin sairaus. Analysoidut PCa tapaukset olivat osa täsmällisesti määriteltyä korkean riskin kollektiivinen (kohortti A) (taulukko 1) ja valittiin perustuen niiden kliiniseen tulokseen. Esivalitut PCa tapauksissa erotettiin kahteen ryhmään kliinisten vika ja seuranta ilman taudin uusiutumista (ryhmä 1: CPFS vs. ryhmä 2: CF). Taulukossa 2 esitetään syövän ominaisuuksia molemmissa ryhmissä.

Tavoitteena Tämän analyysin oli seulomiseksi tietyn miRNA allekirjoitus korkean riskin syöpäpotilailla, joilla tauti uusiutuu. Aluksi vertasimme miRNA ilmentymistä kaikissa 13 korkean riskin PCa tapauksissa yhdessä kuin hyvänlaatuinen tauti. Kaikista ilmentyvät eri miRNA (lauseke kertaluokkamuutos 1,5 ja p-arvo 0,05) enemmistö 61 Mirs olivat alassäädetty ja 21 MIRS olivat säädellään ylöspäin korkean riskin sairaus. Katso taulukko S1 kaikki ylä- ja alassäädetty miRNA. Hierarkkinen klusterointi perustuu valittuun 82 ilmentyvät eri miRNA, syntyy puun selvä ero pahanlaatuisen sairauden ja hyvänlaatuinen liikakasvu (Fig. 1A). Vaikka Vertailu suoritettiin ainoastaan ​​välillä hyvänlaatuinen ja pahanlaatuinen sairaus, sub-ryhmittely kasvainten perustuu niiden kliiniseen tulokseen oli ilmeinen.

. Microarray profilointi 6 BPH ja 13 korkean riskin PCa kudosnäytteiden (kohortti A). Jälkimmäinen oli jaettu kliininen tulos: ryhmä 1: korkean riskin PCa + CPFS (n = 7); ryhmä 2: korkean riskin PCa + CF (n = 6). Riveittäin skaalata heatplot geenien osoittaa kertainen muutos 1,5 ja oikaistu p-arvo 0,05. Punainen osoittaa korkea ilme, vihreä alhainen ilme. Syöpä- ja ei-syöpä eturauhasen kudoksia selvästi erillään. Clustering osoittaa eron ryhmän 1 ja 2. B. tekninen validointi microarray tietojen qRT-PCR. Suhteellinen ilmentyminen

miR-16

,

-29a

, ja

-221

analysoitiin 6 BPH (valkoinen) ja 13 korkean riskin PCa näytettä (harmaa). MiRNA ilme näkyy keinona BPH ja korkean riskin PCa ilmaisutapoja virhepalkit keskihajonta. * Osoittaa p 0,01, p-arvot laskettiin käyttäen Welch 2 otoksen t-testiä.

johtuvat teknisestä validointi array tulokset analysoimme ilmaus kolme kaikkein ilmentyvät eri miRNA, muiden joukossa. Kuten kuviossa 1 B ja 2B voisimme vahvistaa merkittäviä alas-säätely

let-7a /b /c, miR-16

,

-29a

,

-146, – 181

ja

-221

ennen nähty array tietojen qRT-PCR.

. Venn-kaavio, joka esittää suhteita ihmisen MIRS jotka ilmaistiin merkitsevästi erilainen (± 1,5 kertainen) PCA ryhmässä 1 vs. PCa ryhmä 2 vs. BPH (adj p 0,05). Piirit sisältävät määrä ylä- tai alassäädetty ihmisen MIRS kunkin pareittain vertailua. Yhteinen Mirs eri vertailut esitetään risteyksissä. Harmaa laatikot osoittavat ilmentymisen tilan

let-7

perheenjäseniä. Seuraavassa taulukossa luetellaan kaikki ihmisen MIRS joissa ilmaisu oli merkitsevästi erilainen joko välillä (gr.1 vs. gr.2), (gr.2 vs. BPH) ja (gr.1 vs. BPH) (punainen sarake); välillä (gr. 1 vs. gr. 2) ja (gr. 2 vs. BPH) (vihreä sarake); tai välillä (gr. 1 vs. gr. 2) ja (gr. 1 vs. BPH) (sininen pylväs). Kaikkien miRNA on luokiteltu perustuvat suurimman ilmaisun kertaluokkamuutos. Kaksi saraketta sivuun luettelo miRNA osoittavat ylös- tai alaspäin-asetuksen ilmentymisen (katso nuolet) ja ulottuvuus ilmaisun kertaluokkamuutos. B. validointi microarray tietojen qRT-PCR. Suhteellinen ilmentyminen

miR-146b

,

-181b

, ja

let-7 Twitter /

b Twitter /ja

-c

analysoitiin 6 BPH (valkoinen), 7 korkean riskin PCa näytteitä CPFS (ryhmä 1) (vaaleanharmaa) ja 6 korkean riskin PCa näytteitä CF (ryhmä 2) (tummanharmaa). MiRNA ilme näkyy keinona ilmaisun BPH ja korkean riskin kudosta, vastaavasti virhepalkit keskihajonta. * Osoittaa p 0,01, p-arvot laskettiin käyttäen Welch 2 otoksen t-testiä.

MiR Expression profiili Korkean riskin PCA Diverse Clinical ilman taudin etenemistä

Based erottamisesta sekä riskiryhmien klusterianalyysillä me arveltu löytää miRNA profiili PCA tapauksissa etenevä sairaus. Siksi olemme analysoineet microarray data osalta MIRS jotka differentiaalisesti ilmaistut sekä riskiryhmään (fold muutos 1,5 ja P-arvo 0,05). Venn kaavio kuviossa 2A ja kuviossa S1 visualisoida piirtämisen kaikkien ihmisten Mirs jotka differentiaalisesti ilmaistut BPH kudoksessa, korkean riskin PCa kudoksen CPFS ja korkean riskin kudoksen CF. Kaikkiaan 148 Mirs olivat monipuolisesti ilmaistiin kaikissa kolmessa kudoksessa tyyppiä. Ilmaisu seitsemän miRNA (eli

let-7a /c, miR-515-3p /5p, -181b, -146b

, ja

-361

) todettiin olevan merkitsevää eroa kaikki kolme ryhmää analysoitiin (BPH, ryhmä 1 ja 2), mikä osoittaa tiettyä miRNA profiilin suuririskisille PCA etenevä sairaus. 47 miRNA osoittivat eri ilmentymistä ryhmään 1 verrattuna ryhmiin 2; joukossa kymmenen eniten ilmentyvät eri miRNA löysimme useat jäsenet

let-7

perhe (Fig. S1).

Käyttämällä RT-PCR-analyysi ilmentymisen eroja BPH, ryhmä 1 ja 2 for

let-7a, let-7c

,

miR-146b

, ja

-181b

voitaisiin vahvistaa (Fig. 2B). Koska ilmaus

let-7b

ja

-d

osoitettiin syrjiä ainakin kaksi kolmesta kudoksen tyyppiä olemme mukana sekä

let-7

perheenjäsenten jatkotutkimuksissa . Kuten ennusti array data,

let-7

perheenjäsenet, progressiivinen alassäätöä hyvänlaatuisesta pahanlaatuiseen (ryhmä 1) ja edelleen aggressiivinen tauti (ryhmä 2), kun taas ilmaus

miR-146b

ja

-181b

oli matalin ryhmässä 1 (Fig. 2B).

Anna-7d

ilmentyminen oli tuskin havaittavissa RT-PCR: llä ja oli siis kuulu lisätutkimuksiin.

ilmentäminen

let-7a /b /c

on Merkittävästi alassäädetty korkean riskin PCa

microarray ja RT-PCR-analyysejä tunnistimme joitakin

let-7

perheenjäsenet (

let-7a-c

) mahdollisina ehdokas Mirs diagnostisia ja ennustetekijöitä markkereita korkean riskin PCa.

nyt halusimme vahvistaa nämä tulokset qRT-PCR kokeita koko korkean riskin kohortti A (n = 98). Tilastollinen analyysi qRT-PCR tiedot vahvistivat merkittävästi alas-säätely

let-7a-c

korkean riskin PCa tapauksissa verrattuna hyvänlaatuinen liikakasvu (p≤0.001) (Fig. 3A). Vuonna noin 81/84 /ja 96% kudosnäytteitä analysoitu, ilmaus

let-7a /b

ja

-c,

vastaavasti oli alle keskimääräisen ilmaisu BPH näytteiden (Fig. 3B), joka osoittaa kasvaimen erityinen arvo

let-7

perheenjäsenten potilailla, joilla on suuri riski eturauhasen syöpä.

. Laatikko- ja parta-juoni suhteellisen ilmentymisen

let-7a /b /c

6 BPH (valkoinen pylväs) ja 98 korkean riskin PCa (harmaa palkki) kudosnäytteet. Expression arvioitiin qRT-PCR. B. Kuva 3B yhteenveto mediaani ilmaus

let-7 Twitter /

b Twitter /

c

6 BPH ja 98 PCa näytteitä ja osoittaa vastaava keskihajonta ja p-arvo . Mediaani ilmentyminen BPH näytteitä käytettiin kynnyksen. Prosenttiosuus PCa näytteiden alassäädetty

let-7

ilmaisu on esitetty kuudes sarakkeessa. C. laatikko- ja viiksi-juoni näyttää ilmaus

let-7b

ja

-7c

98 korkean riskin PCa kudosten ja 6 BPH yksilöt; arvioidaan qRT-PCR. Alaryhmät perustuvat: • patologista kasvain ominaisuuksia, kuten Gleason pisteet ja patologinen kasvain vaiheessa (GS ≤7, pT ≤3a – vaaleanharmaa), (GS ≥8, pT ≥3b – tummanharmaa) ja • klinikka-patologinen ominaisuudet kuten BCR, CF, CRD (no BCR /no CF /no CRD – vaaleanharmaa), (BCR /CF /CRD – tummanharmaa). A. + C.

Anna-7 Twitter /

b Twitter /ja

-C

ilmaus esitetään tarkoittaa kanssa virhepalkit keskihajonta. * Osoittaa p 0,01 (A) tai p 0,05 (C). p-arvot laskettiin käyttäen Welch 2 otoksen t-testiä.

Down-regulation

let-7b

liittyy Aggressiivinen Cancer Ominaisuudet

Perustuu oletetaan, että jotkut

let-7

perheenjäsenet ovat asteittain säädellä vähentävästi aggressiivisempi PCa tapauksia (ryhmä 2), me arveltu, että alas-säätely

let-7

voi myös liittyä jossa klinikka-patologisia piirteitä tai prognoosi Eturauhassyövän potilaista. Siksi etsimme korrelaatiota

let-7a /b /c

ilmaisun ja kasvainten ominaisuuksiin PCA kollektiivisen samankaltaisen Gleason Score (7≤ GS ≥8), patologinen kasvain vaiheessa (3a ≤pT ≥3b) ja kliiniset päätepisteet kuten BCR, CF, ja CRD (katso taulukko 2). Löysimme progressiivinen alas-säätely

let-7b

potilailla, joilla on huono syövän ominaisuuksia kuten korkea Gleason Score (≥8), biokemiallisten uusiutuminen ja kliininen epäonnistuminen (p 0,05) (Fig. 3C). Kuitenkin ilmaus

let-7c

korreloi CF vain. Ei korreloi

let-7b

tai

-7c

ilmaisun ja patologinen kasvain vaiheessa (3a ≤pT ≥3b) tai CRD (Fig. 3C). Koska

let-7a

puuttui merkittävästi tuloksiin syövän ominaisuuksista ja kliinisten päätepisteiden me laiminlyödä tätä miR meidän jatkotutkimuksia (Fig. S2).

Anna-7b

ja

let-7c

kuin Prognostiset Marker for Progression in korkean riskin PCa Collective (kohortti A)

Voit selvittää

let-7b

tai

– 7c

voisi toimia ennustetyövälineenä indikaattorina biokemiallisten uusiutumisen tai kliinisten vika meillä kahtia korkean riskin valmisteluryhmän (kohortti A) matalan ja korkean

let-7b /c

ilme perustuu z-arvoja. Kaplan-Meier osoitti merkitsevää eroa ryhmien välillä korkean ja matalan

let-7b

ilmentymisen BCR (log rank p = 0,01), kun taas

let-7c

osoitti rajatapaus merkitys (log rank p = 0,08) (Fig. 4A). 10 v biokemiallinen ilman taudin etenemistä oli 65% ja 37% korkean ja matalan

let-7b

ilme, vastaavasti. Sillä

let-7b

ja

let-7c

Kaplan-Meier ennusti myös merkittävää eroa ryhmien korkea ja heikkoa ilmentymistä CF (log rank p 0,001) (Kuva. 4A) . 14 38 potilaasta (37%), joilla on alhainen

let-7b

ilmaus, mutta vain 5 potilasta 60: stä (8,3%) on korkea

let-7b

ilmentymisen ryhmässä havaittiin kokeneet CF.

Kaplan-Meier-analyysi biokemian ja kliinisen pahenemisvaiheen 98 ja 92 potilailla, joilla on suuri riski taudin (kohortti A ja B). Ryhmät olivat kahtia matalan ja korkean

let-7b

ja –

7c

ilme. Survival dikäyrät käyttämällä Bioconductor paketti ”eloonjääminen”. A. Kaplan Meier analyysin kohortin A oppiminen tietokokonaisuus (n = 98). B. Kaplan Meier analyysin kohortin B, testaus datajoukon (n = 92). Low

let-7b

ilmentyminen liittyy BCR ja CF.

Coxin regressioanalyysiä osoitti, että

let-7b

mutta ei

let-7c

ilme oli yksimuuttujaisesti merkittävä ennustamiseen BCR (HR 0,36 (0,16-0,82)). Kun

let-7b

ilmaisun ja Gleason Score katsottiin yhdessä monimuuttuja mallissa molemmat muuttujat itsenäisesti ennusti BCR. Lopulta arvioimme onko

let-7b

tai

let-7c

ovat riippumattomia markkereita kliiniseen epäonnistumiseen kohortissa A. ilmaus molemmat Mirs ovat yksimuuttujaisesti merkittävä ennustamiseen kliinisen vajaatoiminnan (taulukko 3). Kuitenkin monimuuttuja Coxin regressiomallin vain korkean Gleason pisteet, mutta ei

let-7b

tai –

c

merkittävästi korreloi huonoon ennusteeseen.

Yhteenvetona Kaplan Meier ja Coxin regressioanalyysi osoittaa, että alhainen

let-7b

ja

let-7c

ilmaisua voidaan korreloi BCR ja CF kohortin A.

validointi

let-7b

ja

let-7c

kuten Prognostiset merkkiaineet on riippumaton ulkopuolinen testaus Collective (kohortti B) B

validoimiseksi roolin

let-7b

ja –

c

kuin ennustetekijöitä markkereita teimme riippumattoman kollektiivinen ensiarvoisen korkean riskin PCa tapauksissa (kohortti B). Kuten jo havaittu kohortin olemme havainneet huomattavan alas-säätely

let-7b

ja

let-7c

PCA näytteissä verrattuna BPHS (taulukko S2). Loimme z-tason perusteella analysoitiin ACk

t ekspressiotietojen sekä

let-7

s testauksessa kohortissa. Myöhemmin me kahtia testauksen kohortin käyttäen cut-off tasoa tunnistettu kollektiivinen A. Kukin näyte ennustettiin joko suuri tai pieni riski BCR tai CF perustuu näistä rajoista.