Krooninen sairaus

tiivistelmä

histologinen alaluokkiin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on kasvava terapeuttinen vaikutus. Myöhemmässä syöpä vaiheissa kudosnäytteiden yleensä bioptically kerätään. Nämä pienet näytteet ovat poikkeuksellisia arvoa, koska molekyyli- analyysejä on nousemassa kohdennettuja hoitoja. Siksi tutkittiin mahdollisuutta, diagnostinen tarkkuus, taloudellisia ja prognostisia vaikutuksia kudosten säästävien monen samanaikaisen vasta-määritys alaluokkiin NSCLC. 265 NSCLC potilaiden kudosten multi paneelit (TMA) rakennettiin simuloida koepalojen. TMA värjättiin samanaikaisesti Kaksiväristen monen ainetestiin koostuvat TTF1, vimentiinistä, p63 ja neuroendokriininen markkereita (CD56, kromograniinilla A, synaptofysiinin). Luokittelu perustui pääasiassa nykyisen ehdotuksen IASLC hierarkkinen päätös puun alaluokkiin osaksi adenokarsinooma (LAC), levyepiteelisyöpä (SCC), iso cell neuroendokriininen karsinooma (LCNEC) ja NSCLC ei ole mainittu muualla. Investigation of kasvain heterogeenisyys osoittivat selkeästi pienempi vaihtelu immunohistokemiallista analyysien verrattuna perinteisiin luokitusta. Lisäksi selviytyminen analyysi yhdistettyä immunohistokemiallisella luokitus paljasti erillisiä erottaminen kunkin yksikön selviytymisen käyrä. Tämä oli tilastollisesti merkitsevä terapeuttisesti tärkeitä alaryhmiin (p = 0,045). Kuten morfologiset ja molekyylien syövän testaus on syntymässä, multi-ainetestiin yhdistettynä standardoitu luokittelu antaa tarkat ja luotettavat erottaminen histomorphological diagnooseista. Lisäksi se sallii kliinisesti merkittävää alatyypitys NSCLC lukien LCNEC. Multi-vasta-aineen määritys voi siten olla erityisen arvokasta, erityisesti diagnosoinnissa pienissä koepaloja. Se enää joutuisi tuottaa merkittäviä varoituksia syntymässä olevista terapeuttinen seurauksia. Integrointi Immunohistokemiallisen alatyypitys lukien tutkimus neuroendokriini erilaistumista standardin histopatologinen luokitus NSCLC on näin ollen otettava huomioon.

Citation: Kayser G, Csanádi A, Otto C, Plönes T, Bittermann N, Rawluk J, et al . (2013) Samanaikainen Multi-vasta-värjäytymisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Vahvistaa diagnostinen tarkkuus erityisesti pienissä kudosnäytteistä. PLoS ONE 8 (2): e56333. doi: 10,1371 /journal.pone.0056333

Editor: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 elokuu 2012; Hyväksytty: 8. tammikuuta 2013 Julkaistu: 13 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Kayser et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus on tuettu rahallisesti Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 850. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Keuhkosyöpä osoittaa korkeimmat kuolleisuus pahanlaatuisen sairauden ihmisille kaikkialla maailmassa [1], [2]. Huolimatta valtavaa edistystä nykylääketieteen, kuolleisuus keuhkosyöpään ovat vielä vakaassa tilassa heijastaa pikaisesti tehokkaita kohdennettuja kemoterapeuttisten aineiden hoidossa tämän laajalle levinnyt tauti. Niistä erottaminen pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jälkimmäinen voidaan edelleen luokitella alaluokkiin mukaan sen morfologinen ulkonäkö kolmeen pääryhmään: adenokarsinoomat (LAC), levyepiteelikarsinoomien (SCC) ja suuri solukarsinoomat (LCC). Rinnalla eri morfologia viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet biologisia eroja histologinen NSCLC alatyyppejä. Näitä ovat erilaiset ekspressiokuviot m-RNA: n ja immunohistokemiallisesti havaittavissa proteiinit, kuten tymidylaattisyntetaasin (TS). TS, osallistuvat DNA-korjausmekanismit, on yksi tärkeimmistä tavoitteista pemetreksediä ja merkittävästi suurempi ilmaistu SCC verrattuna LAC ja LCC. Scagliotti et ai. voisi osoittaa, että potilaat kärsivät LAC ja LCC hyötyä platin kemoterapian yhdessä pemetreksedin. Sen sijaan SCC potilaat hyötyvät yhdistelmä platinan gemsitabiinin kanssa [3]. Perustuu pääosin tämän tutkimuksen suosituksia tarkka alatyypitys NSCLC säädettiin kansallisessa keuhkosyövän suuntaviivat [4] – [6]. Dilemma varten patologeja tämä asetus on, toisaalta, nykyinen WHO: n luokituksen käyttöön vuonna 2004. WHO: n mukaan, alaluokitus NSCLC on tehtävä pääasiassa hematoxilin-eosiini (H DAKO Real Havaitsemisjärjestelmät AP /RED, koodi K5005). Toinen osa usean vasta-aine tahra muodostui primaarinen vasta-aine on suunnattu p63 (klooni 4A4) ja neuroendokriininen vasta-aineen cocktail kohdistaminen kromograniini A (klooni DAK-A3), synaptofysiinin (klooni SY38) ja CD56 (klooni 1B6). Inkubaatioajan näitä vasta-aineita oli 30 minuuttia. Piparjuuriperoksidaasi konjugoitu dekstraanipolymeerin kanssa sidottujen vasta-ainemolekyylien levitettiin ja värjäys suoritettiin inkuboimalla 3’3′-diamino-bentsidiiniä (DAB; DAKO kuvitella FLEX +, koodi 8012). Lopuksi, diat vastavärjättiin hematoxilin. Värjäystoimenpide suoritettiin DAKO Autostaineriin kaikille diat (yksityiskohtainen askel-askeleelta protokolla Document S1).

arviointi usean ainetestiin

synopsis kanssa histologinen kasvumalli yhdistetty histologista-IHC diagnoosin kullekin ydin tehtiin yhdenmukaiset ehdotettujen IASLC suuntaviivat [9]: täten, kirkas rauhas kasvutavat määritelty LAC riippumatonta ilmaisua IHC markkereita. Sama määriteltiin SCC, jos ceratinization ja /tai solujen välistä siltojen olivat läsnä. Kasvaimissa ilman selviä morfologisia H 0,001; korrelaatiokerroin -0,300, Kendall-tau-b). Merkittävä negatiivinen korrelaatio voidaan myös havaita TTF1 ja p63 (p 0,001; korrelaatiokerroin -0,262; Kendal-tau-b). Mikään muu positiivinen tai negatiivinen välisten vasta-korrelaatioita havaittiin. Nämä havainnot tukevat edelleen, että värjäyskuviot ja arviointi kunkin vasta-aineen ei vaaranneta mahdollisia taustavärjäyksen tai kromogeeni ristireaktioita. Siitä huolimatta, ydin- ja /tai soluliman kaksinkertainen positiivisuus erityisvaltuutuksiin värjäytymisen molemmille antigeeneille, i. e. TTF1 yhdistettynä p63 ja vimentiinista yhdistettynä neuroendokriini markkereita, vastaavasti, ovat edelleen selvästi erotettavissa (kuvio S2).

Normal keuhkokudoksessa (A), LAC (B), SCC (C) ja LCNEC (D) värjättiin yhdistetyn usean ainetestiin (ylhäällä) ja kukin yksittäinen mukana vasta-aine. Punainen ytimiä – TTF1; red sytoplasma – vimentiinista; ruskea ytimiä – p63; ruskea sytoplasma – neuroendocrine markkereita. Alla Kaksiväristen IHC määritys vastaavasta yhtenäisestä vasta-määritykset näkyvät samalla kasvaimen alueella. Vertailu kunkin yksittäisen vasta-värjäystä ja Kaksiväristen multi-vasta määritys osoittaa analoginen erityisiä positiivisuus samoissa soluissa ja ei paljasta mitään epäspesifistä taustavärjäyksen tai kromogeenista ristireaktiivisuutta.

TTF1 ja p63 ovat käyttökelpoisia markkereita arvioimiseksi sukua erilaistumisen

nykyinen WHO: n luokituksen ehdottaa H 0,001, taulukko S1). Kuten odotettua, AUC-arvot olivat suurempia IHC luokitus algoritmi verrattuna H 0,001; korrelaatiokerroin -0,262, Kendall-tau-b).

kasvaimensisäisenä heterogeenisuus on vähemmän näkyvästi IHC merkkiaineiden verrattuna morfologisiin kasvuvauhtiin

Koska heterogeenisuus kasvain morfologia tiedetään olevan korkea NSCLC olemme mukana kolme TMA ydintä kunkin kasvaimen. Ytimet otettu satunnaisesti koskevat kasvaimen alueelle jättää morfologisia bias. Kuten julkaistu ja kansainvälisesti hyväksyttyjä, analyysin kustakin TMA ydin voidaan olettaa verrattavissa analyysi kasvainbiopsioissa vuonna rutiinidiagnoosimenetelmää patologian [20], [21]. Mitä diagnostisia reittejä histopatologia, ensin luokiteltu kunkin TMA ydin rutiininomaisesti H kuvio S5). Morfologisiin arviointi, kaikki nämä LCNEC tapausten lisäksi osoitti neuroendokrii- kasvutavat. Käyttämällä yhdistettyjen IHC luokitus LCNEC voidaan siten diagnosoitu hienostunut ja standardoidulla tavalla.

Yhdistetty morfologinen ja multi-vasta-luokitus lisää kliinistä merkitystä NSCLC alatyypitys

Eri biologista käyttäytymistä pahanlaatuisten sairauksien kuvastuu yleensä erilaisiin tuloksiin pitkäaikaisseuranta- ylös. Arvioida, onko parempi ositus käyttämällä yhdistettyä histologisia ja IHC luokittelu, teimme selviytymisen analyysit sekä luokitusten, i. e. tavanomainen H kuvio 3). Toisaalta, morfologia-IHC luokitus annetaan selkeämpi erottaminen eloonjäämiskäyrien jokaisen yksikön kanssa tilastollinen suuntaus (p = 0,088, kuva 3). Yhdistäminen LAC ja NSCLC NOS mukaan terapeuttisten seuraus osaksi ”ei-levyepiteelikarsinooma syöpä” ja vertaamalla näitä SCC ja LCNEC kokonaiselossaoloaika oli merkitsevää eroa näissä potilasryhmissä (p = 0,045, kuva 3).

NSCLC alatyyppejä olivat diagnosoitu H E resektio yksilöt (A) ja yhdistetyn IHC luokitus algoritmi (B). Muita IHC luokitus erottaa erillisiä histologisia yksiköiden viittaa eri biologista käyttäytymistä. Ryhmittely eri yhtiöiden mukaan terapeuttisen seuraukset (C ja D), ei eroja selviytymistä ovat ilmeisiä tavanomaisilla H D) .

Bi-color multi-ainetestiin säästää kudosta ja taloudellisten resurssien

protokolla tästä immunohistokemiallisesti luokitella NSCLC koostuu samanaikaisen tahra 6 erilaista vasta-aineita. Siten määrä kudosta tarvitaan luonteenomaiset NSCLC koepaloja käsittää vain 16,7% verrattuna mitä tarvitaan 6 yhden vasta-aineen määrityksiä. Näin ollen ainoastaan ​​1/6

th lasin sildes ja peitinlasit tarvitaan. Koska protokolla käyttää vasta-seoksia TTF1 ja vimentiinista sekä p63 yhdistettynä neuroendokriinivasteen cocktail, 1/3

rd värjäystä ja Estoreagenssien tarvitaan. Sama pätee kromogeeninen havaitsemiseen pulloihin. Meidän laitos, kulut reagenssit on laskettu 3,30 € plus ylimääräinen 0,20 €, lasilevyllä per IHC tahra. Kuvissa per tapauksessa tämä johtaa kokonaismäärä 6,80 € meidän monen ainetestiin verrattuna 21.80 € 6 yhden vasta-protokollia. Siten käyttö multi-ainetestiin säästää jopa 68,8% kuluista laboratorioreagensseina.

Koska doublestaining menettely kuitenkin kaiken aikaa tarvitaan loppuun protokollan kestää noin 4 tuntia verrattuna 1,5- 2 tuntia yhden vasta-tahroja. Mutta kuten protokolla voi helposti perustetaan automatisoidun immunohistokemiallisella värjäyksellä koneita, ole negatiivista vaikutusta työmäärä laboratorioteknikot tapahtuu. Päinvastoin, värjäytyminen automaatio on pitkäaikainen ja teknikot voivat suorittaa monimutkaisempia ja aikaa vieviä tehtäviä tämän toimenpiteen aikana. Lisäksi aika slide lajittelu on jätetty kokonaan pois.

diagnosointiin patologi ainoa dia on arvioitava. Täten kaikki IHC värjäyskuviot voidaan arvioida samanaikaisesti ja mikä vielä tärkeämpää samoissa soluissa. Mikroskooppinen dioja ei tarvitse muuttaa ja diagnostisia alueita ei saa siirtynyt. Koska diagnostinen arviointi kertaa diagnostisten patologian ovat hyvin vaihteleva, aika säästää käyttämällä multi-vasta-aineen määritys voidaan vain arvioida. Kokemuksia usean ainetestiin säästää noin kaksi kolmasosaa ajasta arvioimiseen tarvittavien vastaava 6 yhden vasta-tahroja.

Keskustelu

Maailmanlaajuisesti keuhkosyöpä on yleisin kuolinsyy kaikkien pahanlaatuisten tautien [1], [22]. Vaikka on ollut nykyaikaisen syöpähoidon, kuolleisuus NSCLC potilaat eivät ole muuttuneet merkittävästi viime vuosikymmeninä [1], [2], [22]. Kehitysmaiden tutkimuksen henkilökohtainen syövän hallintaan useita biomarkkereita on kohdennettu ennustusarvon tiettyjen kemoterapeuttisten aineiden [23] – [27]. Scagliotti et ai. kuvattu hyötyä Gemsitabiinin on platinaa perustuva kemoterapeuttina sairastavat kehittynyt NSCLC jos histologia osoitti hallitseva levy- erilaistumista. Lisäksi potilaat, joiden histologia osoitti hallitseva LAC eriyttäminen oli suurempi hyöty, jos annetaan pemetreksediin [3]. Niinpä suosituksia kemoterapia-järjestelmät perustuvat nyt histologiseen erilaistumiseen NSCLC ja on toteutettu useissa kansallisissa NSCLC hoitosuositusten [4] – [6]. Nykyisessä WHO: n luokituksen histologinen tyypitys keuhkosyövän 1) perustuu pitkälti vakio H & E-värjäystä ja 2) vaatii histopatologinen tutkimus resektio yksilöitä, erityisesti ottaen huomioon, että lähes 50% keuhkosyövässä näytteille enemmän kuin yksi suuri histologinen alatyyppi [2]. Toisaalta, työtä Scagliotti perustuu kohortin NSCLC potilaiden diagnosoitu pitkälle UICC vaiheissa IIIB ja IV. Täällä, histologinen tyypitys on tehtävä pieniä kudosnäytteitä, kuten useimmiten resektio yksilöitä eivät ole käytettävissä näillä potilailla. Siksi IHC markkereita ja paneelit ovat ehdottaneet useat kirjoittajat alatyypitys NSCLC [8], [28], [29]. Näistä TTF1 havaitsemiseksi rauhas ja p63 varten suomuinen eriyttäminen näyttävät olevan luotettavin merkkiaineita alaluokkiin NSCLC [8], [9]. Näistä syistä päätimme TTF1 ja p63 markkereina linjaa eriyttämistä NSCLC, ja perustettu diagnostinen polku yhdistyvät perinteisen morfologia ja IHC ilmentymismalleja analogisesti ehdotuksen IASLC [9]. Viime aikoina typistetty p63-proteiinin DeltaNp63 (p40) on kuvattu olevan suurempi spesifisyys squamous erilaistumiseen verrattuna täyspitkän proteiinin [XPath VIRHE: tuntemattoman muuttujan ”START2”.], [31]. Mutta molemmat antigeenejä, täyspitkät p63 ja DeltaNp63, on sama herkkyys okasolusyöpään [30], [31]. Koska ilmaus p63 on diagnostisesti arvioidaan jälkeen TTF1 (kuva 2), voidaan olettaa, että molemmat vasta-aineet antaisi saman luokituksen tulokset meidän multi-vasta-aineen määritys. Voit sisällyttää LCNEC laajensimme vasta-paneeli paitsi vimentiinista, joka voi toimia markkerina sarcomatoid kohdunkaulan [8], mutta myös neurendocrine markkereita (CD56, synaptofysiinin, Kromograniini A). Positiivisuus yhden tai useamman näiden markkereiden tarvitaan diagnoosin neuroendocrine erilaistumista [2]. Jotta säästää rajallinen kudoksen biopsia materiaalia, me onnistuneesti bi-väri multi-vasta-värjäys määritys, joka mahdollistaa paitsi samanaikaisen värjäys 6 vasta samana kudosleike, mutta myös todellinen samanaikainen arviointi. Sen osoittamiseksi, ettei häiriöitä välillä vasta useita validointi kokeita on tehty: Testipakkauksen värjättiin meidän multi-vasta-aineen määritys ja sarja pääluokkaa on värjätty kunkin vasta-aineen, erikseen. Täällä ei eroja värjäyskuviot tai kromogeeni tausta reaktiot voitiin havaita (kuva 2, kuva S1). Selvittämään mahdollisia rajat värjäys toisen DAB-pohjainen tunnistusjärjestelmä määritys suoritettiin koepaketin kun jätetään pois toisen ensisijaisen vasta-aineita (p63, kromograniini a, synaptofysiinin, CD56). Jos vapaa ja /tai helposti sidontakohdat ensimmäisen vasta-aineiden olemassa olevia, nämä olisivat näkyvissä ruskea väri. Uudelleen värjättyjä laseja, nämä kokeet osoittavat, että kaikki sitoutumiskohdat ensimmäisen primaaristen vasta-aineiden (vimentiinin, TTF1) on estänyt AEC perustuva tunnistus järjestelmä ei ruskea DAB värjäytymistä oli näkyvä (kuvio S1). Kumpikaan voisimme valaista tahansa positiivinen tilastollinen korrelaatio vasta visualisoidaan samalla kromogeeninen havaitsemismenetelmä. Jos oli taustavärjäyksen joko ydin- tai sytoplasmista vastaavan merkkiaineiden johtaa virheelliseen tulkintaan, tämä olisi näkynyt positiivinen tilastollinen korrelaatioita. Päinvastoin, me havaittiin tilastollisesti merkittävä negatiivinen korrelaatio p63 kanssa neuroendocrine markkereita, sekä TTF1. Äskettäin Sterlacci ym perustettu kaksinkertainen tahroja koostuu TTF1 /CK7, p63 /CK5 /6 ja TTF1 /CK5 /6 luokittelu NSCLC ja paljasti tulokset sama kuin meidän [10]. Yanagita et ai. ovat julkaisseet kaupallisesti saatavilla multi-vasta-ainemääritys, joka sisälsi 4-vasta-aineita, TTF1, napsiini A, p63 ja CK5 /6 [11]. Nämä aiemmin perustettu vasta-cocktaileja olla hyötyä, vaan ainoastaan ​​erottavat LAC alkaen SCC. Mahdollisuus tutkia varten LCNEC ei oteta huomioon. Kuitenkin, varsinkin tämä kokonaisuus LCNEC paitsi elää infavourable ennuste, mutta kemoterapeuttisten järjestelmien samanlaisia, joita käytetään SCLC on pidettävä [14]. Nykyisessä kirjallisuudessa, LCNEC vain diagnosoidaan, jos NSCLC osoittavat neuroendocrine kasvutavat yhdessä ilmaisun ainakin yhden neuroendocrine markkereita CD56, kromograniini A tai synaptofysiinin [2].