Krooninen sairaus

tiivistelmä

Huolimatta androgeenien puute hoitoa (ADT), pysyviä androgeenireseptorin (AR) signalointi mahdollistaa seuraus kastraation resistenttien eturauhassyövän (CRPC). Eturauhassyövässä (PCA) solut, ADT voi parantaa AR aktiivisuutta kautta induktion oksidatiivisen stressin. Tässä tutkimme roolit Nrf1 ja Nrf2, transkriptiotekijät, jotka säätelevät antioksidantti geeniekspressiota, hormoneja välittämän AR transaktivaatiota käyttäen syngeneeisissä

in vitro

mallissa androgeeniriippuvaisessa (LNCaP) ja kastrointi resistenttejä (C4-2B ) PCa soluja. Dihydrotestosteroni (DHT) stimuloi transaktivaation androgeenireseptorin vaste-elementin (ARE) oli merkittävästi suurempi C4-2B soluissa kuin LNCaP. DHT-indusoitua AR-transaktivaatiota kytkettiin suurempi tumaansiirtymiseen p65-Nrf1 in C4-2B-soluissa, verrattuna LNCaP-soluja. Sitä vastoin DHT stimulaatio tukahdutti yhteensä Nrf2 tasot C4-2B soluissa mutta kohonneet yhteensä Nrf2 tasot LNCaP. Mielenkiintoista, siRNA välittämä vaimentaminen Nrf1 heikennettyjä AR transactivation taas p65-Nrf1 yliekspressio parannettu AR transaktivointimäärityksen. Myöhemmät tutkimukset osoittivat, että Nrf1 fyysisesti vuorovaikutuksessa AR ja lisää AR: n DNA: ta sitova aktiivisuus, mikä viittaa siihen, että p65-Nrf1 isoformi on mahdollinen AR koaktivaattoriproteiinin. Sen sijaan Nrf2 tukahdutti AR-välitteistä transaktivaatiota stimuloimalla tumakertymään p120-Nrf1 joka tukahdutti AR transaktivointimäärityksen. Kvantitatiivinen RT-PCR tutkimuksia edelleen vahvisti induktioilmiöiden p65-Nrf1 isoformi on androgeenireseptorin geenien, PSA ja TMPRSS2. Siksi meidän Pääteltiin ero roolit Nrf1 ja Nrf2 säätelyssä AR transakti- PCA soluissa. Tuloksemme osoittavat myös, että DHT-stimuloitu kasvu p65-Nrf1 ja samanaikainen tukahduttaminen sekä Nrf2 ja p120-Nrf1 lopulta helpotetaan AR transaktivaatiota CRPC soluissa.

Citation: Schultz MA, Hagan SS, Datta A, Zhang Y, Freeman ML, Sikka SC, et al. (2014) Nrf1 ja Nrf2 -transkriptiotekijät Asetus androgeenireseptorin transaktivointi eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (1): e87204. doi: 10,1371 /journal.pone.0087204

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 19 helmikuu 2013; Hyväksytty: 26 joulukuu 2013; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Schultz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tukivat varoja puolustusministeriön; PC080811 (D. M.), PC081598 (AA), ja National Institute of Health, T32-CA093240 (MF), ja Louisiana Cancer Research Consortium (DM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toinen johtava syy syöpään liittyvät kuolemat American men [1] ja kohonnut androgeenireseptorin (AR) signalointi helpottaa PCa kasvua. Siksi androgeenien puute hoitoa (ADT) suunniteltiin heikentävistä systeemisiä androgeenitason ja siten tukahduttaa AR signalointi hormoni riippuvaisten PCa solut [2]. Kuitenkin potilaat vain vastata ADT noin 18 kuukautta johtuen valintaa ja seuraus kastraatio resistenttien eturauhassyövän (CRPC) soluja. Mielenkiintoista, CRPC solut säilyttävät sekä AR ilme ja toiminta [2], [3]. Siksi ymmärtäminen mekanismit pysyvien Jälleenkytkentätoiminto in CRPC soluissa huolimatta ADT auttavat kehittämään hoitostrategioita että tukahduttaa PCa toistuminen.

On ehdotettu, että jäljellä androgeenituotantoa sisällä kasvain mikroympäristön vahvistaa jatkuvia AR signalointi [3 ]. Dihydrotestosteroni (DHT) on voimakas androgen, joka stimuloi AR välitteistä transaktivaa- on androgeenisesti vaste-elementin (ARE), läsnä promoottorit lukuisten geenien tärkeitä PCA solujen kasvuun [4]. Mielenkiintoista, klassisen AR transaktivointimäärityksen reitin usein ohitetaan CRPC soluissa, joissa pysyviä Jälleenkytkentätoiminto huolimatta esiintyy alhainen androgeenitason [5], [6]. Tämä AR transaktivaatiota CRPC soluissa on katsottu johtuvan AR ilmaisun ja tehostettu ilmentyminen entsyymejä, jotka muuntavat androgeenien DHT [3], [7]. Kuitenkin viime aikoina todisteita myös, että rinnakkaisia ​​signalointi polkuja, jotka lisäävät ilmentymistä ja aktiivisuutta AR koaktivaattoreiden voi olla merkittävä rooli säätelyssä AR toimintaa [3], [8]. Jotkut näistä AR koaktivaattoreiden voi muuttaa konformaatiota AR ligandia sitovan taskun, mikä lisää sitovan spesifisyyden AR steroidiligandeja. Vaihtoehtoisesti AR voi liittyä erilaisia ​​kofaktoreita ja chaperones jotka helpottavat sen ydinvoiman lokalisointi ja sitovat kapasiteetti [9]. Siksi tunnistaminen AR kofaktoreita parantaa ymmärrystämme Eturauhassyövän eteneminen CRPC.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että ADT voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) on merkittävä rooli PCA etenemisessä kastraatio vastus [ ,,,0],10]. Krooninen oksidatiivista stressiä on havaittu aggressiivista PCa soluissa ja raportit ovat osoittaneet, että nämä solut voivat käyttää ROS aiheuttama antioksidantti proteiineja parantaa selviytymistä ja ylläpitää AR signalointi [6], [11] – [13]. Monet efektoreita ROS signalointi jotka toimivat AR koaktivaattoreiden yliekspressoituvat PCA ja niiden ilmentyminen voidaan säädellä hormoni signalointi [14] – [16]. Antioksidantti proteiini peroxiredoxin-1 (Prx-1) toimii kaperonina parantaa hormoni signalointi ja androgeenireseptorin herkkyys kautta suora vuorovaikutus AR, joka täydentää sen tumaanohjaussignaali [14], [15]. Lisäksi häiriöitä androgeenin signalointia (ts ADT) eturauhasen voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä lisäämällä ilmentymistä ROS tuottaa NADPH oksidaasien (NOX) [16], [17]. Nämä muutokset ROS vaikuttavat toimintaan transkriptiotekijöiden, kuten Nrf1 ja Nrf2 (NF-E2 liittyvä tekijä 1 ja 2), että säätelemään lukuisia antioksidantti proteiinien ja NADPH Oksidaasit [18] – [20]. Tuloksena muutokset NOX ja antioksidantti proteiinin ilmentyminen voi liittyä lisääntynyt kasvain selviytymisen [21] – [23]. Vaikka molemmat Nrf1 ja Nrf2 on merkittäviä vaikutuksia oksidatiivisen stressin signalointi, niiden suorat vaikutukset AR transaktivointimäärityksen ei ole aiemmin tutkittu.

Nrf1 ja Nrf2 ovat päällikön sääntelyviranomaisten oksidatiivisen stressin aiheuttama geenien ilmentyminen [18], [ ,,,0],24] – [26]. Ne ovat cap-n-kaulus perus leusiinivetoketjun (CNC-bZIP) transkriptiotekijöitä, että vastauksena erilaisiin oksidatiivisen stressin, voi säädellä geeniekspressiota läpi elektro- vaste-elementti (EpRE). Normaaleissa homeostatic redox olosuhteissa Nrf2 on sekvestroida Keap1 (Kelch kaltainen ECH liittyvä proteiini 1) sytoplasmassa, jossa se säätelee negatiivisesti Nrf2 kautta ubikitiinipromoottori välittämän proteasomaalisten hajoaminen [26]. Kun ROS stimulaatio, Keap1 vapauttaa Nrf2 jotta sen ydinvoiman lokalisointi ja transaktivaation kautta EpRE sekvenssit. Vaikka paljon huomiota on keskittynyt roolista Nrf2 syövässä [25], tutkimuksia roolista Nrf1 on huutava pula.

Toisin Nrf2, N-pään domeeni (NTD) on Nrf1 (TCF11), joka ankkuroi Nrf1 endoplasmakalvostoon (ER), kalvon ja tumakalvon, säätelee Nrf1 aktivointi ja sen translokaation tumaan [27] – [29]. Lisäksi ihmisen Nrf1 geeni voidaan tuottaa sekä koko pituudeltaan 120 kDa Nrf1 (p120-Nrf1) ja useita katkaistu (36, 55, 65, ja 95 kDa) isoformit Nrf1 [30], [31]. Näistä pienemmät Nrf1 isomuotojen, N-terminaalin-katkaistu 65 kDa isoformi (p65-Nrf1) on osoitettu olevan merkittäviä sääntelyn vaikutukset suhteessa Nrf2 välitteisen transkription. Mielenkiintoista, täytäntöön ekspressio p65-Nrf1 voi estää Nrf2-välitteisen induktion EpRE geenien [30]. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että sekä Nrf1 ja Nrf2 välittävät ROS signalointi [18], [30]. Siten ROS signalointi ja solujen homeostaasin voi tapahtua sääntelyn kriittisen tasapaino Nrf1 ja Nrf2 ilmaisun ja toimintaa. Kuitenkin niiden roolia AR transakti- PCA soluissa ei ole tutkittu.

Useat tutkimukset ovat sekaantuneet tärkeyttä Nrf2 PCA [32] – [34]. Ilmaisu on Nrf2 korreloi negatiivisesti Gleason tulokset PCA potilailla [32] ja kevyemmästä Nrf2 on yhdistetty lisääntynyt aggressiivisuus TRAMP PCa hiirimallissa [33], [34]. Kiinnostavaa kyllä, se on myös ehdotettu, että Nrf1 voi säädellä Nrf2 ilmaisun sääntelyn olevan EpRE sijaitsee Nrf2 promoottori alueella [35]. Huolimatta kyky Nrf1 tukahduttamiseksi Nrf2 välitteisen transkription [30], rooli Nrf1 PCA etenemistä ei tunneta. Meidän aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CRPC solulinja C4-2B on kohonnut ekspressio p65-Nrf1 ja vähentynyt ilmentyminen Nrf2, verrattuna androgeeniriippuvaista LNCaP-solujen ja ei-tuumorigeenisen RWPE-1 ja RWPE-2-soluja [36] . Koska sekä parannettu AR signalointi ja androgeenideprivaatio voi aiheuttaa ROS ilmaisua, me olettaisi, että Nrf1 ja Nrf2 voi olla suora rooli säätelyssä AR signalointi PCA soluissa [3], [10]. Siksi me tutkimme, Nrf1 ja Nrf2 differentiaalisesti moduloida AR transaktivaatiota androgeeniriippuvaisessa LNCaP-soluissa ja niiden androgeeniriippumattomaksi sub-line, C4-2B.

Koska LNCaP ja C4-2B solut ovat syngeneeisissä PCa linjat, meidän havainnot näissä solulinjoissa mukaan Nrf1 ja Nrf2 voi olla merkittävä rooli PCa etenemisensä ilmentymä CRPC fenotyypin. Meidän havainnot osoittivat selvästi, että vastakkaiset toiminnot Nrf2 ja p65 ja p120 isoformeja Nrf1 voi säädellä DHT-indusoitua AR transaktivaatiota PCA soluissa. Tutkimuksemme edelleen sotkea uusia mekanismeja, joiden kautta Nrf1 ja Nrf2 sääntelyä modifioitu kastraatio kestävä C4-2B solulinjan helpottaa parannetun AR transaktivaatiota.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

LNCaP-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC; Catalog # CRL-1740). C4-2B solulinja on luu metastaattinen alalinja johdettu LNCaP, ja oli ystävällinen lahjoitus tri Lelund Chung [37]. Molemmat solulinjat viljeltiin RPMI-1640-mediaa Mediatech (Manassas, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Mediatech). DHT käsittelyt tehtiin fenolipunaista RPMI media (Mediatech), jossa 10% puuhiilellä puhdistettua naudan sikiön seerumia (CS-FBS) Innovative Research Labs (Novi, Michigan). Solut trypsinoitiin, maljattiin ja annettiin kiinnittyä yön yli täydellisen media, jonka jälkeen väliaine vaihdettiin CS-FBS sisältävät RPMI. Yön yli inkuboinnin CS-FBS sisältävillä alustoilla, solut altistettiin DHT (0-10 nM) CS-FBS-alustaan ​​ja kerättiin osoitetuissa kertaa mitata RNA: ta, proteiinia ja reportterigeenin ilmentymistä.

Reagenssit

DHT saatiin Steraloids (Wilton, VA). Nrf1-vasta-aine saatiin Proteintech Group (Chicago, IL). Vasta-aineet Nrf2, AR, ja TATA sitova proteiini (TBP) saatiin Abcam (Cambridge, MA). Isotyypin IgG: tä (ei-spesifistä kontrolli) ja kaikki toissijaiset anti-humaani-vasta-aineet saatiin Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-V5-vasta-aine saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). AR-vasta-aine, jota käytetään ChIP määrityksissä saatiin Active motiivi (Carlsbad, CA). Nrf1 erityinen siRNA ja epäspesifinen kontrolli (NC1) siRNA saatiin Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, Cat # HSC.RNAI. N003204.12.1-3). Plasmidit saatiin seuraavista lähteistä: p65-Nrf1 ekspressiovektorin (p65-Nrf1-V5His) oli armollinen lahjoitus tri Chan [30], p120-Nrf1-V5His ekspressiovektori saatiin tri Zhang [38] ja psPSA-Luc toimittaja (tulikärpäsen lusiferaasi) vektori saatiin tri Abdel-Mageed laboratoriossa [39]. PRL-TK (renilla lusiferaasi) vektori hankittiin Promega (Madison, WI). Nrf2 ekspressiovektori (pCMV6-Nrf2) hankittiin Origene (Rockville, MD) ja pcDNA3.1 kontrollivektori ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

Kvantitatiivinen RT-PCR

käsittelyn jälkeen mRNA eristettiin käyttäen Trizol-reagenssia mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen). CDNA valmistettiin käyttäen High Capacity Reverse Transcription Kit Applied Biosystems (Foster City, CA). RT-PCR-alukkeet syntetisoitiin Midland Certified Reagent Company (Midland, TX) ja SYBR Green Master Mix toimitti Applied Biosystems (Foster City, CA). Seuraavat alukesekvenssit käytettiin kvantitatiivista RT-PCR:

AR

: 5′-GGTGAGCAGAGTGCCCTATC-3 ’ja 5′-GAAGACCTTGCAGCTTCCAC-3’;

GAPDH

: 5′-TCCCATCACCATCTTCCA-3 ’ja 5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3’;

PSA:

5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ’ja 5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3’; ja

TMPRSS2

:5′-GTCCCCACTGTCTACGAGGT-3 ’ja 5′-CAGACGACGGGGTTGGAAG-3’. Kertaiseksi muutoksia geenien ilmentyminen laskettiin normalisoinnin jälkeen vastaaviksi GAPDH mRNA.

Nuclear Protein Extraction

Nuclear pellettejä westernit eristettiin käyttäen CER-I ja CER-II uuttamalla puskureita päässä NE-PER Nuclear Extraction kit (Pierce, Rockford, IL). Tumat pestiin HBSS: llä ja tumaproteiini uutettiin mukautetun tumaproteiini lyysipuskuria [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 500 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium-deoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 mM EDTA]. Nuclear proteiini kvantitoitiin käyttäen BCA-proteiinin arviointi kit Thermo Scientific (Rockford, IL).

immunoblottauksella

Proteiininäytteet keitettiin 01:01 tilavuuden proteiinin ja latauspuskuria [100 mM Tris (pH 6,8), 25% glyserolia, 2% SDS, 0,01% bromofenolisinistä, 10% 2-merkaptoetanolia] viisi minuuttia. Tumaproteiinit (20-50 ug) suoritettiin elektroforeesi Tris-HCl PAGE-geeleissä ja märkä siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kun oli salvattu 5% maitoa TBST-puskurissa (TBS, jossa 0,05% Tween-20), kalvoja hybridisoitiin mainituilla vasta-aineilla. Vyöhykkeet detektoitiin sitten käyttäen LumiGLO kemiluminesenssisubstraatilla järjestelmän (KPL, Gaithersburg, MD). Kaistaintensiteettejä kvantifioitiin Image-J ohjelmisto (NIH) ja arvot normalisoitiin TBP proteiinin tasot omilla näytteissä.

Transient Transfektio ja Lusiferaasimäärityksiä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille yön yli ennen transfektiota Lipofectamine-2000-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja ilmoitettu vektorit. Lusiferaasin määrityksiä, solut transfektoitiin joko psPSA-

luc

reportteriplasmidilla yksin tai yhdessä yhtä suuret määrät Nrf1 ekspressiovektorin (p65-Nrf1-V5-His tai p120-Nrf1-V5-His), tai Nrf2 ekspressiovektori (pCMV6-Nrf2), tai verrokkina ekspressiovektoriin (pcDNA3.1). Normalisoimaan transfektiotehokkuuden solut myös kotransfektoitiin PRL-TK (Renillaa lusiferaasi) vektori. Western suoritettiin myös ilmoitetuilla ekspressiovektoreilla yksin. Lyhyesti, soluja inkuboitiin yön yli transfektion liuosta (20 ui Lipofectamine, 400 ng sivektorissa ja /tai ekspressiovektoria, ja 100 ng PRL-TK) 2 ml: ssa seerumia /fenolipunaista media. Yön yli inkuboinnin jälkeen, väliaine poistettiin ja solut altistettiin DHT (0, 1 tai 10 nM) 24 tuntia CS-FBS sisälsi fenolipunaista RPMI. Solu-uutteet otettiin talteen ja lusiferaasi-tasot määritettiin käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay Kit (Promega, Madison, WI). Jokaisessa kokeessa, tulikärpäsen lusiferaasi-arvot (mistä psPSA-luc), normalisoitiin Renilla lusiferaasi-arvot (mistä PRL-TK). Nuclear proteiini uutettiin käsittelyn jälkeen ja arvioitiin western muutoksia ydin- proteiinin ilmentymisen. Samanaikaisesti kokeissa solut myös transfektoitu Nrf1 ja Nrf2 ekspressiovektorit yksin valvomiseksi DHT-indusoitua kaksi AR geenien, PSA (eturauhasen spesifisen antigeenin) ja TMPRSS2 (transmembraaninen proteaasi, seriini 2).

siRNA transfektio

Short häiritsevä RNA (siRNA) transfektiot suoritettiin käyttäen Transfast-reagenssia Promega (Madison, WI). Lyhyesti, soluja inkuboitiin yön yli (~18 t) trans- liuokseen, joka koostui Transfast reagenssia (2:01 laimennus), ja 20 nM joko Nrf1 siRNA tai NC1 (kontrolli) siRNA seerumissa ja fenolipunaista RPMI. Plasmidin cotransfections solut samanaikaisesti transfektoitiin sekä siRNA ja plasmidi, jonka 2:01 laimennoksena Transfast reagenssin, kuten on kuvattu lusiferaasimääritystä osassa. Yön yli transfektion, väliaine poistettiin ja solut altistettiin asianomaiset hoidot. Sitten solut otettiin talteen 24 tunnin kuluttua ja lusiferaasin määritykset suoritettiin. Samanaikaisesti näytteet, RNA ja ydinvoima proteiini saatiin seurata geeniekspressiota qRT-PCR ja western.

Immunosaostaminen

samanaikainen immunosaostus ja immunoblottauksen (co-IP /IB) tutkimukset, LNCaP ja C4-2B soluja käsiteltiin 0, 1, tai 10 nM DHT 6 tunnin ajan. Tumapelletit eristettiin käyttämällä ydin- eristäminen puskuria (10 mM HEPES, 10 mM KCI, 2 mM MgCI

2, 100 uM EDTA, 500 uM DTT: tä, 0,625% NP-40, proteaasi-inhibiittori, ja fosfataasi-inhibiittorit). Pesun jälkeen PBS: llä kaksi kertaa, RIPA-puskuria (150 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA, 1% deoksikolaattia, 1% Triton X-100, 0,1% SDS: ää, proteaasi-inhibiittori, ja fosfataasi-inhibiittorit), lisättiin ydinaseiden pellettejä ja pelletit sonikoitiin eristämiseksi ydin- proteiiniin. Proteiini valmiiksi raivattu 30 min proteiini-G /proteiini-A agaroosijyväsiä (Calbiochem kissa # IP10). AR-vasta-aine (Abcam; ab74272) lisättiin sitten 100 ug ydin- proteiinia 400 ul: ssa RIPA lyysipuskuria ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Proteiini-G /proteiini-A-agaroosi-helmet lisättiin sitten proteiinia ja inkuboitiin 2 tuntia. Inkuboinnin jälkeen helmet pestiin 3 kertaa RIPA-lyysipuskuria, ja täyteväriä lisättiin näytteeseen. Sitten näytteet keitettiin 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa, ladattiin geeliin, ja immunoblotattiin (IB), jossa mainituilla vasta-aineilla.

Kromatiini immunosaostus

kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) määritykset käytimme kaksi eri sarjat, The Covaris (Woburn, MA) truChIP kromatiinin leikkaus kit ionisoitumattomilla puskuriin ja Active Motif (Carlsbad, CA) ChIP-IT korkea herkkyys kit. Määritykset suoritettiin valmistajan protokollien, vähäisin muutoksin. Lyhyesti, DHT käsitelty (6 tuntia) LNCaP ja C4-2B solut murtunut käyttäen Covaris truChIP kit käyttäen E220 keskittynyt-ultrasonicator maasta Covaris. Kromatiinin näytteet laimennettiin alibittipuskurin Active Motif kit. Sitten näytteet immunosaostettiin (IP) joko Nrf1 vasta-aine (Proteintech Group) tai AR-vasta-(Active motiivi). Loput määritys suoritettiin Active Motif kit ohjeita. Ovat erityisiä qRT-PCR suoritettiin IP-DNA: lla käyttäen alukkeita ARE-II-sekvenssit sijaitsevat PSA-promoottori (5′-CCACAAGATCTTTTT ATGATGACAG-3 ’ja 5′-GCTCATGGAGACTTCATCTAG-3’). Muutokset monistettu kaistaintensiteettejä kvantitoitiin.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Analyysit

2

toisen sukupolven DIG Gel Shift Kit Roche (Branford, CT) käytettiin EMSA tutkimuksiin. Androgen vaste-elementti (ARE) ja TCF11 ja TCF11 /MafG (Nrf1 sitova) sekvenssit [29] syntetisoitiin Midland Certified reagenssin yritys. Sekvenssit kullekin EMSA oligonukleotidin ovat seuraavat:

TCF11

:5′-GTCATTT-3 ’ja 3′-AAATGAC-5’;

OVAT

: 5′-GATCCTTGCAGAACAGCAA GTGCTAGCTG-3 ’ja 3′-GAACGTCTTGTCGTTCACGATCGACCTAG-5’; ja

TCF11

/

MafG

: 5′-CCCAAATGACAATGCGATTGA-3 ’, 3′-TCAATCGCATTGTCATTTGGG-5’ (Genomatix Matlnspector). Lyhyesti, ydinvoima proteiini uutetaan soluista käsitelty DHT 6 tuntia ja sitomisreaktioihin DIG merkityt oligonukleotidit tehtiin. OVAT oligot inkuboitiin tumaproteiini (10 ug) 30 minuuttia, minkä jälkeen näyte latauspuskuria lisättiin ja näytteitä ajettiin elektroforeesissa 5% TBE-PAGE-geelillä (Bio-Rad, Hercules, CA). Sitten näytteet siirrettiin nailonkalvolle, inkuboitiin estopuskurilla, altistetaan anti-DIG-vasta-aine, pestiin ja kehitettiin käyttäen ECL-kemiluminesenssi-järjestelmä, kuten on kuvattu aikaisemmin. Kilpailun tutkimukset tumauutteet esi-inkuboitiin ylimäärän kanssa (50-kertainen) leimaamattomia ARE, TCF11 tai TCF11 /MafG oligoja 30 min ennen DIG-leimatun OVAT oligot lisättiin reaktioon. Kokeissa käyttämällä vasta-aineita, kilpailemaan Nrf1 sitovia tumauutteita pre-inkuboitiin joko Nrf1 vasta-aineella tai kanin IgG: tä (ei-spesifinen kontrolli) 30 minuutin ajan, ennen kuin DIG-leimatun OVAT oligot lisättiin reaktioon. Elektroforeesi, siirto, ja hybridisaatio suoritettiin kuten on kuvattu edellä.

Tilastollinen analyysi

Kukin käsittely kunto koostui 2-4 toistetaan, ja kukin koe suoritettiin 2-5 kertaa. Suhteellinen ekspressio määritettiin vertaamalla hoitoa arvot kontrolliarvoihin normalisoinnin jälkeen lastaus valvontaa. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin kaksisuuntaisella ANOVA: lla käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston. Merkittävät muutokset valvonnan osoitetaan p-arvot 0,05.

Tulokset

AR transaktivointi Tasot ovat huomattavasti korkeammat C4-2B soluissa kuin LNCaP

vertaa DHT aiheuttama AR transaktivaatiota tasoilla LNCaP ja C4-2B soluja, toteutimme Lusiferaasimäärityksiä vuonna psPSA-

luc

vektori transfektoiduissa soluissa (kuvio. 1A). Havaitsimme, että AR-transaktivaatiota oli merkitsevästi (p 0,001) korkeampi C4-2B soluissa kuin LNCaP-soluissa. Sen jälkeen DHT hoidossa, LNCaP-solut osoittivat annosriippuvaisen kasvu AR transakti- (5 kertaa 1 nM ja 21-kertaisesti 10 nM). Sen sijaan C4-2B-soluja, 100-kertainen nousu havaittiin jo 1 nM DHT (p 0,001) ja yli 130-kertainen lisäys (p 0,001) havaittiin altistuksen jälkeen 10 nM DHT (Fig. 1A ). Teimme myös immunoblottauksella selvittäviä ydinaseiden AR energian summana sekä stimuloimattomasta ja DHT-stimuloiduissa olosuhteissa (Fig. 1 B). Molemmissa solulinjoissa, 2-5 kertainen lisäys ydin- AR tasoilla nähtiin 24 tunnin DHT-stimulaatio. Huolimatta siitä samankaltainen ydin- AR tasoilla jälkeen DHT hoidon, C4-2B solut osoittivat merkitsevästi korkeampi AR transaktivointimäärityksen arvoja verrattuna LNCaP. Tämä osoitti, että ylimääräinen mekanismeja, jotka voimistavat DHT-stimuloitujen AR-transaktivaatiota ovat läsnä C4-2B soluissa.

(A). Solut kotransfektoitiin psPSA-

luc

ja PRL-TK (sisäinen kontrolli). Vaikutus 24 tunnin stimulaation joko 1 nM tai 10 nM DHT taitteelta muutoksista lusiferaasiaktiivisuudessa (firefly /renilla RLU) esitetään (n = 3). DHT aiheuttama AR transaktivaatiota on merkittävästi (***; p 0,001) korkeampi C4-2B soluissa verrattuna LNCaP. (B). DHT aiheuttama AR ydinvoiman lokalisointi LNCaP ja C4-2B soluja. Sen jälkeen 24 tuntia DHT (0, 1 ja 10 nM) stimulaatio (n = 4) western immunobloteilla osoittavat muutoksia AR ydin- tasoilla. Sekä C4-2B ja LNCaP-solut osoittivat samalla tasolla ydinvoiman AR seuraavista DHT-stimulaatio. (C). p65-Nrf1 ja Nrf2 tasoille DHT stimulaatiota. Western immunoblot osoittaa ydin- p65-Nrf1 ja Nrf2 tasoille 24 tunnin DHT stimulaation (n = 3). Erot ydin- p65-Nrf1 ja Nrf2 havaittiin LNCaP ja C4-2B soluja. Kertamuutoksia ja ± SEM arvot edustavat suhteellisia eroja ilmaisua AR, p65-Nrf1, ja Nrf2. Molemmissa (B) ja (C), tiedot normalisoitiin TBP tasolle kussakin näytteessä.

DHT säätelyyn p65-Nrf1 ja Nrf2 Nuclear lokalisointi

ensimmäinen määritetty, jos DHT käsittely muuttuu Nrf1 ja Nrf2 ydinvoiman lokalisointi (Fig. 1 C). Nuclear tasoja p65-Nrf1 olivat eri tavoin vaikuttaa LNCaP ja C4-2B soluja. Vuonna C4-2B soluissa, DHT stimulaatio lisääntynyt ydinvoiman p65-Nrf1 tasolla, kun taas LNCaP DHT-stimulaatio ei merkittävästi muuta ydin- p65-Nrf1 tasolle. Kuitenkin Nrf2 ydinvoiman lokalisointi ei merkittävästi muutettu DHT hoidossa joko LNCaP tai C4-2B soluja (Fig. 1 C). Siksi tutkimme kyky p65-Nrf1 ja Nrf2 säädellä AR transaktivaatiota molemmissa PCa solulinjoissa.

modulaatio p65-Nrf1 Expression merkittävästi muuttunut DHT-indusoitua AR transaktivointi

tutki kohdunulkoinen muutokset Nrf1 tasoilla voi vaikuttaa AR transaktivaatiota DHT stimuloiman LNCaP ja C4-2B soluja (Fig. 2). Koska ydinvoiman p65-Nrf1 on konstitutiivisesti suurempi C4-2B soluissa kuin LNCaP [36], käytimme siRNA hiljentää endogeenisten Nrf1 tasoja C4-2B soluissa (Fig. 2A 2B) ja V5-His ajettu p65- Nrf1 ekspressiovektori (p65Nrf1-V5-His) yli-ilmentämään p65-Nrf1 LNCaP-soluissa (kuvio. 2C 2D). Tasot ydin- Nrf1 siRNA transfektoiduissa C4-2B-soluihin ja tasot V5 fuusioproteiinien Nrf1 yli-ilmennetään LNCaP-solut on esitetty kuvioissa 2B ja 2D, vastaavasti. Vuonna C4-2B solut kotransfektoitiin psPSA-

luc

vektori, ja joko Nrf1 siRNA tai NC1 ohjaus siRNA, Lusiferaasimäärityksiä osoitti Nrf1 tukahduttaminen merkitsevästi (p 0,001) pienentää AR transaktivaatiota (Fig. 2A). LNCaP-solut, Lusiferaasimäärityksiä osoitti myös, että p65-Nrf1 yli-ilmentyminen lisää DHT-stimuloitu AR aktiivisuus noin 2-kertaisesti 1 nM DHT ja noin 4,4-kertaisesti 10 nM DHT (p 0,001) (Fig. 2C). Nämä havainnot ehdotti, että p65-Nrf1 parantaa AR transaktivaatiota AR transaktivaatiota molemmissa PCa solulinjoissa.

(A) vaikutus Nrf1 Knockdown on AR transaktivaatiota DHT-stimuloiduista C4-2B soluissa. Solut kotransfektoitiin kanssa psPSA-luc vektori ja joko Nrf1 siRNA tai valvoa siRNA (NC1). Kertamuutoksia lusiferaasiaktiivisuudessa (firefly /renilla RLU) seuraavat Nrf1 taintumisen näkyvät (n = 3; p 0,01). (B) NMR-p65-Nrf1 proteiinin tasot sen jälkeen, kun siRNA-välitteisen knockdovvn-in C4-2B-soluissa (n = 2). Data normalisoitiin TBP tasolle. (C) vaikutus p65-Nrf1 ilmentymisen vaikutus DHT-indusoitua AR transaktivaatiota LNCaP-soluissa. Solut kotransfektoitiin kanssa psPSA-luc vektori ja joko kontrollivektorilla (pcDNA3.1) tai p65-Nrf1 ekspressiovektoriin (p65-Nrf1-V5-His). Kertainen muutos lusiferaasiaktiivisuuden seuraavat Nrf1 yli-ilmentyminen on esitetty (n = 3; p 0,001). (D) Muutokset ydin- V5 proteiinia (tag) pcDNA3.1 (kontrolli) tai p65-Nrf1-V5-His transfektoiduissa LNCaP-soluja (n = 2). Kertamuutoksia edustavat suhteellisia (V5 /TBP) erot Nrf1.

Samalla tutkimuksissa, myös mitattuna ilmaus kaksi AR geenien, PSA ja TMPRSS2, soluissa, jotka oli transfektoitu p65-Nrf1 ilme vektori (Fig. S1-A S1-B). Meidän qRT-PCR tiedot osoittivat selvästi, että p65-Nrf1 merkitsevästi (p 0,01) lisää sekä TMPRSS2 ja PSA-mRNA tasoilla DHT-käsiteltyjen LNCaP. Tämä toimi tukevana todisteita siitä, että p65-Nrf1 on potentiaalinen AR koaktivaattorikompleksien.

Nrf2 säätelee negatiivisesti AR transaktivointi

Vaikutukset Nrf2 ilmentymisen vaikutus AR transaktivaatiota seurattiin sekä LNCaP ja C4-2B solut (Fig. 3). Nrf2 yliekspressio merkittävästi tukahdutti DHT-stimuloi AR aktiivisuutta. LNCaP-soluja (kuvio. 3A), Nrf2 yliekspressio tukahdutetaan AR transaktivointimäärityksen molemmissa pohjapinta (50%; p 0,001) ja DHT-stimuloiduissa olosuhteissa (60%; p 0,0001). Nrf2 yliekspressio vähensi myös DHT-indusoitua AR transaktivaatiota tasoilla C4-2B soluissa (Kuva. 3B) noin 33% 1 nM DHT ja 40% 10 nM DHT (p 0,05). Nuclear Nrf2 ilmentyminen transfektoiduissa LNCaP ja C4-2B solut yllä jokaisen käsittelyn olosuhteissa.

vaikutukset Nrf2 ilmentymisen vaikutus DHT-stimuloidun AR aktiivisuutta seurattiin sekä LNCaP (A) ja C4-2B (B) solut. Solut, jotka on transfektoitu psPSA-luc-reportterin plasmidi ja joko Nrf2 ekspressiovektori (pCMV-Nrf2) tai kontrollivektori (pcDNA3.1) ja stimuloitiin DHT (0-10 nM) 24 tuntia (n = 5) . Merkittäviä eroja lusiferaasiaktiivisuudessa (firefly /renilla RLU) alkaen kontrollit edustettuina *; p 0,05, ***; p 0,001 ja ****; p 0,0001. Molemmissa (A) ja (B), paneelit edellä Pylväiden edustavat muutoksia ydinvoiman Nrf2 tasoilla transfektion jälkeen pCMV-Nrf2. In (C) ja (D), vaikutukset Nrf2 ilmentymisen vaikutus ydin- tasoilla AR sekä käsittelemätöntä ja DHT (0, 1, 10 nM), joita hoidettiin LNCaP (C) ja C4-2B (D) solut on esitetty. Data normalisoitiin ydin- TBP tasolle. Kertamuutoksia ja ± SEM arvot edustavat eroja ydinvoiman AR-arvoja verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

Seuraavaksi vaikutus Nrf2 ilmentymisen vaikutus ydin- AR mitattiin molemmissa LNCaP (Fig. 3C) ja C4-2B-solut (Fig. 3d). Mielenkiintoista on, että DHT-käsiteltyjen LNCaP, Nrf2 yliekspressio alennetaan AR tumaanohjaussignaali lähes 79%. Kuitenkin Nrf2 yliekspressio ei merkittävästi muuttanut ydinaseiden AR tasoilla DHT-käsiteltyjen C4-2B soluissa. Nämä havainnot osoittavat, että Nrf2 voi olla voimakas negatiivinen säätelijä DHT-indusoitua AR-transaktivaatiota sekä PCa solulinjoissa. Kuitenkin LNCaP, mutta ei C4-2B soluissa, tämä estävä vaikutus saattaa välittyä kautta tukahduttaminen AR ydinvoiman lokalisointi.

Muutokset Nrf1 ja Nrf2 eivät muuta AR Gene Expression tai AR Nuclear lokalisointi

seuraava arvioidaan, onko muutoksia Nrf1 ja Nrf2 yliekspressio vaikuttaa AR-geenin ilmentymisen ja AR ydinvoiman lokalisointi (Fig. S2). qRT-PCR tutkimukset osoittivat, että kumpikaan p65-Nrf1 yliekspressio LNCaP-soluissa (kuvio. S2-A) eikä p65-Nrf1 knockdovvn in C4-2B soluissa (Kuva. S2-B) poikkeava AR-mRNA-tasot, joko pohjapinta tai DHT stimuloimaa olosuhteissa. Western immuno- tutkimukset osoittivat, että DHT-indusoitua tumaanohjaussignaali AR ei vaikuttanut joko p65-Nrf1 yli-ilmentymisen (Fig. S2-C) tai Nrf1 pudotus (kuvio. S2-D). Vastaavasti, Nrf2 yliekspressio DHT-käsitelty LNCaP ja C4-2B-solut eivät merkittävästi vaikuta AR-geenin ilmentymistä (Fig. S2-E S2-F). Siten Nrf1 ei muuta AR transaktivaatiota säätelemällä joko AR-geenin ilmentyminen tai AR tumaanohjaussignaali. Lisäksi tukahduttava vaikutus Nrf2 eivät muutosten vuoksi AR geeniekspressiota.

Proteiini-proteiini vuorovaikutukset Nuclear Nrf1 ja AR esiintyä sekä LNCaP ja C4-2B Cells

Voit selvittää, Nrf1 proteiinit (p65- ja p120-) säätelevät Jälleenkytkentätoiminto kautta suora vuorovaikutus ydin- AR proteiinin, suoritimme AR immuunisaostuksissa (IP) tumauutteista käsittelemättömän ja DHT-käsiteltyjen LNCaP ja C4-2B soluja (Fig. 4A). IP Sitten proteiinit immunoblotattiin (IB) joko p65-Nrf1 tai p120-Nrf1. Co-IP /IB tutkimukset osoittivat, että sekä p65-Nrf1 ja p120-Nrf1 liittävät ydin- AR proteiinin sekä LNCaP ja C4-2B soluja. Kuitenkin ydinvoiman AR vuorovaikutuksessa p65-Nrf1 paljon korkeammalla tasolla kuin mitä havaittiin p120-Nrf1.