Krooninen sairaus

tiivistelmä

Porcupine (PORCN) on kalvoon sitoutunut O-asyyli- transferaasin, joka tarvitaan palmitoylation Wnt-proteiinien, ja että on välttämätöntä monipuolinen Wnt väyliä Wnt-Wntless (WLS) sitova, Wnt eritystä, ja Wnt signalointi aktiivisuutta. Testasimme, jos PORCN tarvittiin leviämisen transformoitujen solujen. Knockdovvn PORCN useiden riippumattomien siRNA johtaa solukasvun vika osajoukko epiteelin syövän solulinjat. Kasvu vika on muunnos-riippuvainen ihmisen rintaepiteelisolulinja (HMEC) soluja. Lisäksi indusoituvia PORCN pudotus kaksi riippumatonta shRNAs merkittävästi vähentää kasvua vakiintuneiden MDA-MB-231 syöpätapausta potilaalle tehdä ksenograftien immuunipuutteisilla hiirillä. Yllättäen leviämisen virhe johtuva menetys PORCN tapahtuu Wnt-riippumattomalla tavalla, koska se pelastaminen uudelleen ilmentäminen katalyyttisesti aktiivinen PORCN, ja ei ole nähnyt jälkeen RNAi-välitteinen knockdovvn Wnt kantajaproteiini WLS, eikä hoidon jälkeen kanssa PORCN estäjän IWP. Sopusoinnussa rooli Wnt-riippumaton reitissä knockdovvn PORCN säätelee selkeitä geenejä, joita ei muuteta muulla estäjiä Wnt signalointia. PORCN proteiini näyttää siis kuutamo uudella signalointireitin, joka on nopeutta rajoittava varten syöpäsolujen kasvua ja kasvaimen kehittymisen riippumaton sen entsymaattista toimintaa vuonna Wnt biosynteesin ja erityksen.

Citation: Covey TM, Kaur S, Tan Ong T , Proffitt KD, Wu Y, Tan P, et al. (2012) PORCN moonlights on Wnt-Independent joka säätelee Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 7 (4): e34532. doi: 10,1371 /journal.pone.0034532

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 08 joulukuu 2011; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2012; Julkaistu: 11 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Covey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Duke-NUS Signature tutkimusohjelma ja Singapore translaatiotutkimusta (tähti) tutkija Award (ja DMV) viraston rahoittaman tiede-, teknologia- ja tutkimus, Singapore, ja terveysministeriö, Singapore. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnts erittyvät asyloituja glykoproteiineja, jotka voivat toimia autokriinisella tai lyhyen kantaman molekyylejä ja pitkän kantaman morfogeeneille. 19 ihmisen eri Wnts säädellä useita signalointireittien, ja niiden säätelyhäiriö on sekaantunut monipuolinen häiriöt kehityksen kantasolujen biologiaan, lisääntymistä ja angiogeneesiin [1], [2]. On siis voimakasta kiinnostusta manipulointi Wnt reitin vaikka interventio monipuolinen pistettä Wnt tuotannossa ja loppupään signalointi porrastetusti. Yksi strategia saavuttaa laaja häiriöitä Wnt signalointireittien on estää Wnt eritystä estämällä PORCN proteiinin.

Porcupine (PORCN) havaittiin ensimmäisen Drosophila segmentti napaisuus geeni välttämätön normaalin jakelun Wingless (Wg ), Drosophila homologi WNT [3]. PORCN on jäsen Membraaniin sitoutuneen O-asyyli transferaasi (MBOAT) perheen ja konservoitunut lajien keskuudessa [4], [5]. PORCN on multi-pass kiinteä kalvo entsyymi asuvat Endoplasmakalvosto ja tarvitaan lipidien muuttamiseen Wnt proteiineja. Asylointi PORCN näyttää olevan ehdottoman välttämätöntä asianmukaisen eritystä ja toimintaa kaikkien selkärankaisten Wnts [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] ja geneettinen poisto PORCN on alkion tappava [12], [13]. PORCN ei ole tunnettuja toiminto kuin sen rooli biogeneesille Wnts, ja on sen vuoksi houkutteleva terapeuttinen kohde sairauksissa lisääntynyt Wnt signalointia. Itse asiassa, useita pienimolekyylisiä estäjiä PORCN toiminta on ollut viime aikoina raportoitu, mukaan lukien Inhibitor Wnt Tuotanto 1 ja 2 (IWP-1 ja IWP-2) [14]. On olemassa kaksi yleistä lähestymistapaa PORCN inhibition, farmakologisen ja geneettisen. Erityisesti nämä menetelmät PORCN esto voi antaa erilaisia ​​tuloksia. Tämä voi johtua eri kestot ja eston, vaan myös siksi, että geneettinen ablaatio entsyymin voi yllättäen paljastaa useita toisistaan ​​riippumattomia toimintoja yhden geenin tuote.

kaksi sivustoja Wnt proteiineja voidaan asyloida: seriini, joka vastaa S209 on WNT3A on palmitoleated, kun taas kysteiini vastaa Cys77 on palmitoyloidaan [4], [11], [15]. Ser209 asylointi edellyttää WNT sitoutumiseen Wntless (WLS) [16], joka on erittäin hyvin säilynyt moniteiseksi transmembraaniproteiiniksi nimenomaisesti osallistu Wnt eritystä [17], [18], [19]. WLS kuljettaa Wnts solukalvoon, jossa ne sitten vapautuu solunulkoiseen tilaan pH-riippuvaisella tavalla. Yhdenmukainen WLS rooli Wnt eritystä, soluja, joista puuttuu toiminnallinen WLS kerääntyä Wg Golgin [17] ja joilta puuttuu WLS olla tappava kehitykseen fenotyyppejä sopusoinnussa avainasemassa Wnt signalointia [20]. Rooli Wnt kysteiini asyloinnin on vähemmän selkeä [21]. Cys77 näyttää olevan osallisena signalointi aktiivisuus erittyvän proteiinin, kuten mutaatio sivuston johtaa erittyvä proteiini, jossa vaihtelevasti vähentää signaloinnin aktiivisuus [15]. Palmitoylation tällä sivustolla voi olla tarpeen sitoutumisesta Frizzled tai muihin reseptoreihin.

Vaikka PORCN on selvästi kriittinen Wnt eritystä ja toiminta, sitä ei tiedetä, jos se pelaa lisätehtäviä eroaa sen entsymaattista toimintaa on Wnt-reitin . Esimerkiksi PORCN voisi asyloida ylimääräisiä ei-Wnt alustoille. Vaihtoehtoisesti, koska PORCN on evoluutiossa vanha proteiinin läsnä yksinkertaisin metazoans [22], se voi olla yhdessä kehittynyt entsyymi-riippumaton, ”pimeä” toimii hyvin. Koska PORCN on sekä kriittinen kehittämiseen ja potentiaalinen terapeuttinen kohde ihmisen sairauksissa, on tärkeää ymmärtää täysin roolin PORCN proteiinin soluissa. Leikellä rooli PORCN in Wnt-riippuvaisen versus Wnt-riippumaton reittejä, vertasimme estävä vaikutus Wnt erityksen useita keinoja, mukaan lukien PORCN pudotus, WLS pudotus, ja pienimolekyylisiä inhibitio PORCN. Huomaamme, että PORCN toimii ainakin kaksi riippumatonta väyliä, joka ohjaa Wnt eritystä, ja toinen, joka ei vaadi palmitoyyli transferaasin aktiivisuus, mutta joka on nopeutta rajoittava kasvun transformoitujen epiteelisolujen ja säätelee ilmentymistä erillisen joukon geenejä . PORCN n Wnt-itsenäistä roolia nopeaan lisääntymiseen on merkittäviä vaikutuksia sekä alkionkehityksen ja syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki kokeet suoritettiin hiirillä puuttua asiaan ja tarvittavat tieteellisiä kysymyksiä. Nämä suoritettiin käyttäen suositellaan anestesian ja kipulääkkeet toimenpiteiden aikana ja tehdään ajoissa estämään tarpeetonta kipua tai rasitusta hiirillä. Kaikki kokeet suoritettiin hyväksyntää NUS Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC).

Solut, plasmidit ja reagenssit

Kaikki syövän solulinjat saatiin ATCC. STF ja STF3A solut, jotka ovat peräisin HEK 293-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [23]. HMEC muunneta (hTERT + H-Ras-V12 + p53 Knockdown) ja ikuisti (hTERT) solut olivat lahja Mathijs Voorhoeve, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore. Uros hiiren alkion kantasoluja (ES-solut), joilla on kohdennettu PORCN lokuksen, joka asettaa loxP ylävirtaan eksonin 8 ja alavirtaan eksonista 10 tehtiin Ozgene. PORCN null geeni-kohdennetuista ES-solut valittiin Davor Solter laboratoriosta (Institute for Medical Biology, Singapore). MDA-MB-231-solut ekspressoivat pTRIPZ tehtiin käyttämällä lentiviruksen transduktion (Open Biosystems). ShRNA sekvenssit käytettiin P1: 5′- CCT GGA TAT CCT TCC ACA GCT -3 ’P2: 5′- TAT TTA GCC AAT AAG ACA TGG T -3′, W1: 5’- ACC AAG AAG CTG TGC ATT GTT – 3 ’, W5: 5′- TGG ACA TTG CCT TCA AGC TAA-3’. pMKIT-HA-mPORC-D (lahja Tatsuhiko Kadowaki) kloonattiin retroviruksen plasmidiin MSCV-puro (lahja Mathijs Voorhoeve). Point ja siRNA-immuuni mutantit tehtiin käyttämällä Stratagene Quikchange mutageneesiä. MDA-MB-231 ja MCF7-soluja, jotka ilmensivät stabiilisti villityypin ja mutantti-PORCN kertyi retroviruksen transduktion ja valinta puromysiiniä. Pieni molekyyli PORCN estäjät IWP-1 ja IWP-2 oli jalomielinen lahjoitus tohtori Lawrence Lum. siRNA olivat Dharmacon: Ohjaus /Non-kohdistaminen (# D-001810-01-05), PORCN 7 (# J-009613-07), PORCN 8 (# J-009613-08), WLS 5 (# J-018728 -05), beeta-kateniini 11 (# J-093415-11).

RT-PCR /qPCR.

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Qiagen RNeasy Kit, 1 ug RNA: ta oli käänteiskopioitua käyttäen Bio-Rad iScript cDNA synteesi kit, ja qPCR suoritettiin Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermixiä.

hiiri kasvainmuodoista.

ohimenevä knockdown, 100000 MDA-MB-231 solut transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA: t (ohjaus tai P7) ja sitten ruiskutetaan 4

sijalle utarerasvaa pad 6 viikkoa vanhoja naaraspuolisia NOD-SCID-hiirissä. Sillä PORCN ja WLS kasvainmuodosta, 500000 MDA-MB-231 solua 50 ul: DMEM ruiskutettiin ortotooppisesti 4

sijalle utarerasvaa pad 6 viikkoa vanhoja naaraspuolisia BALB /c-nude-hiirissä. Yksi viikko ruiskeen jälkeen, niitit poistettiin ja tuumorin kasvu kvantitoitiin mittaamalla tulkilla. Aiheuttavan PORCN Knockdown, juomavettä täydennettiin doksisykliini 0,5 mg /ml ja päivittyy joka toinen päivä. Kun tutkimuksen päättyessä, kasvaimet kerättiin, punnittiin, ja geenin ilmentyminen analysoitiin.

leviämisen Studies.

Solut maljattiin 70-80% konfluenssiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin jolla on määritetty siRNA: t 100 nM käyttäen Dharmafect 1 seuraten valmistajan protokollaa. 24 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja maljattiin uudelleen 1:40 1:80 laimennos 12-kuoppaisilla levyillä. Lisääntymisen tutkimuksissa IWP, solut maljattiin 12-kuoppalevyille 10% konfluenssiin. Media sisältävä ajoneuvo (DMSO) tai IWP-1/2: ta päivittyvät päivittäin. 12-kuoppalevyillä kerättiin 7 päivän ajan, kiinteä jääkylmällä MeOH, ja värjättiin kristallivioletilla (0,5% CV 25% MeOH). Määrällisesti solujen määrä, kristallivioletti- liuotettiin 1% natriumdeoksikolaattia vedessä ja absorbanssi mitattiin 590 nm: ssä. Rinnakkaiset kokeet suoritettiin ja solut trypsinoitiin ja laskettiin Beckman Coulter Counter yli 7 päivän jakson aikana.

Microarray.

MDA-MB-231-solujen (70-80% konfluentteja) oli transfektoitiin 50 nM siRNA: ssa 48 tuntia. RNA eristettiin käyttämällä RNeasy-puhdistuskittiä Qiagenilta. Leimattua cRNA valmistettiin ja hybridisoitiin Affymetrix U133_Plus_2.0 microarray mukaan valmistajan protokollia. Array data normalisoitiin käyttäen RMA-algoritmia. 1482 vaihtelevia geenejä havaitaan 1 tavalla ANOVA algoritmi (False Discovery Rate (FDR) = 0,01). Hierarkkinen klusterointi raportissa esitellään merkittävästi eri näytteiden välillä 1482 vaihtelevia geenejä. Analyysi suoritettiin käyttäen Partek ohjelmistoa.

Tulokset

PORCN tarvitaan Wnt erityksen

Jos haluat luoda työkaluja tutkintaan PORCN toiminto tunnistimme ja validoitu kaksi riippumatonta ja ei- päällekkäisiä siRNA: t, siP7 ja siP8, että tavoite kaikkien silmukoitumisvariantteja PORCN ja antoi yli 90% pudotus on PORCN mRNA: ta (kuvio 1A) HEK-293-soluja. Kuten odotettua, pudotus ja PORCN läsnä transfektoitujen WNT3A johti vähenemiseen β-kateniinin /TCF-ajettu lusiferaasin ekspressiota HEK-293-soluja, joissa on integroitu SuperTopFlash toimittaja (STF-solut) (kuvio 1 B). Samoin knockdovvn PORCN in STF solujen vakaa integrointi WNT3A (STF3A solut) johti viasta WNT3A erittyminen alustaan ​​(kuvio 1 C), sopusoinnussa PORCN keskeinen aseman Wnt eritystä.

. STF3A solut transfektoitiin 100 nM ilmoitettu siRNA ja PORCN viestin analysoitiin 48 tuntia myöhemmin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR. Histogrammi edustaa suhteellista PORCN mRNA normalisoitu Actin mRNA. NT, ei transfektoitu; Sic, siRNA valvonta; siP7 ja siP8 erityisiä PORCN siRNA: t. B. PORCN Knockdown lohkoja Wnt /β-kateniinin signalointi. Suhteellinen Wnt /β-kateniinin signalointi mitattiin STF3A transfektoiduissa soluissa 100 nM Sic, siP7 tai siP8 siRNA. C. PORCN Knockdown estää WNT3A eritystä. STF3A solut transfektoitiin 100 nM ilmoitettu siRNA. Media muutettiin 1% FCS media 48 tuntia transfektion jälkeen, ja kerätty 16 tuntia myöhemmin. Runsaasti WNT3A arvioitiin 30 ui medium (Media) ja 15 ug kokosolulysaateista (WC) SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus, jossa mainituilla vasta-aineilla. Aktiini immunoblottauksella osoittaa yhtä suuri loading kokosolulysaateista. D. suhteellinen määrä MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen on pienentynyt sen jälkeen, kun PORCN pudotus. Solut transfektoitiin ilmoitetuilla siRNA: t ja lisääntymistä arvioitiin kuten koemenettelyt. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan. E. PORCN Knockdown hidastaa kasvua useiden rintasyövän solulinjoissa. Solujen määrä arvioitiin 4 vrk transfektion siP7 siRNA ja piirrettiin% leviämisen ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa. *, P 0,05; **, P 0,01 erilaisuuden kontrollista. F. PORCN Knockdown selektiivisesti hidastaa kasvua transformoituneiden hMECs. Vaikutus PORCN pudotus kasvuun hMECs kuolemattomiksi hTERT tai HMEC-hTERT, jotka on transformoitu ilmentyminen H-RasV12 ja vakaa pudotus p53 arvioitiin 6 päivää transfektion jälkeen ohjaus tai siP7 siRNA. Transfektiotehokkuutta molemmissa solutyypeissä oli 80% arvioituna GFP: n ilmentymisen. *, P 0,05 verrattuna ohjaus siRNA. G. PORCN pudotus sivupersoonat ilmaus Wnt /β-kateniinin kohdegeenien. Suhteellinen viesti PORCN ja muita Wnt /β-kateniinin kohdegeenien MDA-MB-231-solut (ylhäällä) ja SK-BR-3-soluja (alhaalla) määritettiin qRT-PCR: llä 72-tuntia transfektion jälkeen 100 nM ilmoitettu siRNA.

menetys PORCN estää rintasyövän solujen kasvua

Voit testata PORCN oli tärkeää rintasyövän solujen lisääntymisen ensin arvioinut ilmentymistä paneelissa rintasyövän solulinjoissa. PORCN mRNA oli läsnä kaikissa linjat testattu, MDA-MB-231 ja SUM-159 solut näytetään runsain, (kuva S1A). Olemme lisäksi analysoitiin näiden solujen pohjapinta Wnt /β-kateniinin signalointia, mutta ei nähdä johdonmukaisia ​​tai tilastollisesti merkittäviä aktivointi TOPFlash yli negatiivisen kontrollin FOPFlash reportteri tahansa testatuista solulinjoista (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka jotkin näistä solulinjoista on raportoitu olevan endogeenisen Wnt /β-kateniinin aktivoitunut siksi säätelyä Wnts ja vaiennettu erittyvän Wnt estäjien [24], [25], [26], mukaan meidän viljelyolosuhteissa ei ole viitteitä Wnt- autokriinisen silmukan.

Koska Wnt signalointi voi aktivoida sekä β-kateniinin riippuvainen ja β-kateniinin riippumaton reittejä, testasimme jos PORCN knockdown vaikuttanut leviämisen ja säilymisen näiden ihmisen rintasyövän solulinjoissa vaikkei havaittavien endogeenisen β-kateniinin signalointi. PORCN siRNA: t siP7 ja siP8 pystyivät tuottamaan vähintään 75% pudotus on PORCN mRNA: MDA-MB-231-soluja (kuvio 1G). Yllättäen tämä aiheutti vähentyneen merkittävästi solujen lisääntymisen ajan myötä (kuvio 1 D). Nämä havainnot laajennettiin vuonna viisi uutta rintasyövän solulinjoissa; RNAi-välitteinen knockdovvn PORCN aiheutti tilastollisesti merkittävän laskun proliferaatiossa (kuvio 1 E) kussakin solulinjassa testattu. RNAi-välitteinen knockdovvn PORCN on raportoitu aiheuttavan apoptoosia ihmisen keuhkosyövän soluja [27], vaikka tämä havainto ei voitu itsenäisesti jäljentää [28]. Vaikka olemme löytäneet lasku kasvua useissa rintasyöpäsolulinjoissa, PORCN pudotus ei johtanut apoptoosia tai siirtyminen solusyklin jakautumisen tahansa syövän linjat testattiin (kuvio S1B, ja dataa ei näytetty). Erityisesti PORCN knockdown ei vaikuta leviämisen kaikkien solujen. Esimerkiksi, mesodermistä peräisin syövän linjat, kuten HT-1080 fibrosarkooma, ja transformoituja BJ fibroblasteja ei mitattavasti vaikutusta (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, PORCN ei ole välttämätön kasvulle alkion kantasoluja ja hiiren alkion fibroblasteissa [12], [13]. Tärkeää on, että kasvu vaikutus PORCN Knockdown on muunnos erityinen epiteelisoluissa. Muuttunut hMECs ovat herkkiä PORCN Knockdown taas kuolemattomaksi HMECs eivät vaikuta (kuvio 1 F). Yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että vaikutus PORCN Knockdown kasvuun ei riipu Wnt signalointia transformoitua hMECs eivät näy mitään merkkejä Wnt /β-kateniinin autokriinisten signalointia (tuloksia ei ole esitetty).

seuraukset PORCN knockdown tutkittiin edelleen määrittämällä endogeenisten Wnt kohdegeenien SK-BR-3 ja MDA-MB-231-solujen, koska niillä oli suurin leviämisen vian jälkeen PORCN knockdown. Nämä linjat on raportoitu olevan autokriinisten Wnt signalointia [24], [29], vaikka emme voineet havaita tätä TOPFLASH määrityksissä tässä nimenomaisessa solulinjoissa. PORCN Knockdown MDA-MB-231-solujen johti vaatimaton, mutta tilastollisesti merkitsevä lasku runsaasti transkriptien koodaava Wnt kohdegeeneissä AXIN2, sykliini D, ja LEF1 (kuvio 1 G, yläpaneeli). Merkittävä väheneminen sekä AXIN2 ja LEF1 mRNA havaittiin SK-BR-3-soluissa (kuvio 1 G, alapaneeli). Yhdessä PORCN Knockdown laski kasvuvauhti useita transformoiduissa solulinjoissa, ja tämä korreloi puutteellisesti kanssa knockdovvn Wnt /β-kateniinin kohdegeenin lukien AXIN2, sykliini D ja CMYC.

knockdovvn PORCN hidastaa kasvaimen kasvu käytettäessä potilaalle tehdä hiirimallissa

Vastatakseen onko PORCN knockdown saattaa hidastaa syöpäsolujen kasvua entistä monimutkainen ympäristö, jossa ylimääräinen peruskudoksettoman johdettuja signaaleja voidaan myös stimuloida, tutkimme määrä perustamisen kasvainten

in vivo

. MDA-MB-231-soluja, jotka on transfektoitu siControl tai siP7 siRNA oli ortotooppisesti injektoitiin NOD-SCID-hiirissä ja kasvaimen ottaa seurattiin. MDA-MB-231-solujen ohimenevän PORCN knockdown näkyy 2 viikon viive kasvain take verrattuna kontrolleihin (Kuva S1C). Viive kasvainmuodostusta ehdotti, että PORCN geeni toiminto on tärkeää kasvaimen ottaa ja /tai etenemistä ja kannusti meitä jatkamaan vakaata knockdown lähestymistapaa.

Voit testata menetys PORCN vaikuttaisi olevien kasvainten kasvua, me seulotaan 25 MIR-30 perustuvan konstruktioita ja tunnisti kaksi riippumatonta MikroRNA säädettyä vankka PORCN knockdown. Nämä kloonattiin indusoitavissa lentivirusvektori, pTRIPZ, joka tarjoaa kaksi ilmentyminen Red Fluorescent Protein (RFP) ja shRNAmir läsnä ollessa doksisykliini. MDA-MB-231-soluja tuotettiin stabiilisti integroitu pTRIPZ ajo joko salattu shRNAmir (shControl) tai yksi kahdesta itsenäisestä shRNAmirs kaikkia silmukoitumisvariantteja PORCN (kutsutaan tässä shP1 ja shP2). Viljellyissä soluissa, lisäksi doksisykliiniä johti induktioon shRNAmir kanssa ~75%: n vähennys PORCN viestin ja korkea ekspressio RFP (kuvio 2A). Kuten odotettua, tämä lasku PORCN mRNA: MDA-MB-231-solujen johti vähenemiseen WNT3A aktivoitu signaloinnin STF toimittaja (kuvio 2B). Sen testaamiseksi PORCN Knockdown voitiin indusoida

in vivo

solut ruiskutetaan ortotooppisesti BALB /c-nude-hiirissä. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet ilmeni selvänä koko (~0.2 cm), doksisykliini lisättiin juomaveteen. 7 päivän kuluttua siitä, doksisykliini, kasvaimet kerättiin ja analysoitiin PORCN viestin. Sekä shP1 ja shP2 kasvaimia oli väheneminen PORCN viesti, joka osoittaa, että doksisykliini on saavuttamassa solut ja asiakkuutta PORCN knockdown

in vivo

(kuvio 2C).

. Perustaminen PORCN indusoituvan knockdown. MDA-MB-231-soluja, joilla on stabiili integrointi pTRIPZ- SHC (kontrolli), -shP1 tai -shP2 shRNAmir käsiteltiin 5 ng /ml Doksisykliini (oikealla) tai ajoneuvon ohjaus (vasemmalla). PORCN ja Actin mRNA arvioitiin RT-PCR: llä, ja RFP ilmentyminen arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla. B. Inducible knockdovvn PORCN estää Wnt /β-kateniinin signalointi. Stabiili MDA-MB-231-solulinjat transfektoitiin ohimenevästi WNT3A ekspressiovektoriin ja SuperTOPflash ja Renilla lusiferaasireportteri- plasmidit, ja sitten käsiteltiin 5 ng /ml Dox 48 tuntia ennen arviointia Wnt /β-kateniinin signalointia, kuten on kuvattu. Histogrammi edustaa SuperTOPflash signalointi suhteessa Renilla lusiferaasiekspressio. C. Inducible knockdovvn PORCN mRNA potilaalle tehdä ksenografteissa. Vakaa solulinjat ruiskutettiin ortotooppisesti 4

th utarerasvaa pad BALB /c-nude-hiirissä. Sen jälkeen perustetaan kouraantuntuva kasvaimia (15 päivää), Dox lisättiin veteen 7 päivän aikana, kasvaimet kerättiin ja mRNA runsaus arvioitiin qRT-PCR. Histogrammi edustaa suhteellista PORCN mRNA normalisoitu Actin mRNA. D. PORCN Knockdown hidastaa syövän kasvua. Kasvaimet kerättiin ja punnittiin 19 päivää aloittamisen jälkeen doksisykliinikäsittely. E. Cancer kasvua hidastavat indusoituva PORCN knockdown. Kasvaimen tilavuus mitattiin satulat ilmoitettuina aikoina.

Voit testata, onko PORCN Knockdown vaikuttaa kasvaimen kasvua, samalla solulinjat ruiskutettiin ortotooppisesti BALB /c-nude-hiirissä. Kasvainten annettiin saavuttaa ~0.2 cm halkaisijaltaan (noin 2 viikon kuluttua injektion), ja sitten PORCN knockdown aiheutettiin lisäämällä doksisykliini veteen. Induktion jälkeen Doxycyline, oli merkittävä väheneminen kasvuvauhti ilmentävien kasvainten joko shP1 tai shP2 (kuvio 2E). Tämä näytti olevan annoksesta riippuvainen, koska shP1 tuottaa sekä suuremman knockdovvn PORCN ja suurempi vähennys kasvaimen kasvua (kuvio 2C ja E). Kun ohjaus saavutettu tuumoreiden ~ 1 cm halkaisijaltaan, hiiret tapettiin. Kasvaimet leikattiin irti, punnittiin ja mitattiin. Kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä ja kevyempiä, jos ne sisältyvät indusoidun shP1 tai shP2 shRNAmir (kuvio 2D). Nämä tulokset osoittavat, että knockdovvn PORCN mRNA vakiintunut potilaalle tehdä rintasyövän johtaa merkittävään viivästymiseen kasvaimen kasvua. Siten PORCN on ratkaiseva rooli MDA-MB-231-solujen lisääntymisen sekä kulttuurin ja ksenografteissa.

Menetys PORCN vaikuttaa syöpäsolun kasvua on Wnt-riippumattomalla tavalla

Edellä tulokset osoittavat, että pudotus on PORCN säätelee leviämisen useita rintasyövän solulinjoissa. Vaikutus proliferaatioon ei johdu off-tavoite vaikutuksia RNAi, sillä saimme identtiset tulokset kaksi erillistä siRNA: t ja kaksi riippumatonta shRNAmirs vastaan ​​yhteensä 4 eri alueiden PORCN. Mikä tärkeintä, RNAi-konstruktit olivat sisällä koodaava sekvenssi, joka on jokaisessa neljästä ihmisen PORCN silmukointivariantit. Koska vaikutus PORCN Knockdown eivät korreloineet vahvasti sen vaikutus β-kateniinin riippuvainen geeneistä kuten AXIN2, sykliini D, ja CMYC, me harkitsi mahdollisuutta, että PORCN Knockdown voisi vähentää solujen kasvua kautta β-kateniinin riippumaton autokriinisen Wnt silmukka tai vaihtoehtoisesti että PORCN on joitakin muita, Wnt-riippumaton toimintoja. Erottamaan näitä mahdollisuuksia, me inhiboi Wnt eritystä kaksi riippumatonta lähestymistapaa.

asylointi Wnts mukaan PORCN tarvitaan niiden sitoutuminen liikenteen proteiinia, WLS, joka kuljettaa Wnts päässä ER: ään tai Golgin plasman kalvo ennen eritystä [16]. Sellaisenaan, farmakologinen esto asyloinnin ja menetys WLS sekä estävät Wnt eritystä sukua PORCN pudotus [17], [18]. Sikäli kuin tiedämme tähän mennessä kaikki nisäkkäiden Wnts vaativat sekä PORCN ja WLS eritystä varten. Kuten odotettua, siRNA knockdovvn WLS ja PORCN kaikki samalla tavalla ja se esti tehokkaasti WNT3A perustuvaa signalointia (kuvio 3A). PORCN entsymaattista toimintaa voidaan estää kanssa pienmolekyylisalpaaja- IWP-1 [14]. Samanlaisia ​​julkaistuihin tuloksiin, huomasimme, että IWP-1 estää Wnt erittyminen alustaan ​​kanssa IC

50 -200 nM (kuvio 3B). IWP-1 myös inhiboi tehokkaasti WNT3A perustuva signalointi MDA-MB-231-soluja samoilla annoksilla (kuvio 3C). Käyttämällä näitä vaihtoehtoisia lähestymistapoja, tutkimme seurauksena vähentynyt Wnt eritys syöpäsolujen kasvua.

. WLS, β-kateniinin, ja PORCN knockdown esto- Wnt /β-kateniinin signalointi STF3A soluissa. Seuraavia siRNA: t käytettiin 100 nM: for PORCN, siP7; for WLS, siW5; for β-kateniinin, siβC11. B. IWP-1 inhiboi WNT3A eritystä. Esikäsitelty väliaine STF3A solujen arvioitiin WNT3A, kuten on kuvattu sen jälkeen, kun soluja inkuboitiin 16 tuntia, kun läsnä on ilmoitetun pitoisuuden IWP-1. C. IWP-1 estää WNT3A perustuva signalointi MDA-MB-231-soluja. MDA-MB-231-solut kotransfektoitiin WNT3A ja STF ja käsiteltiin yön yli ajoneuvon (DMSO) tai osoitettu annoksia IWP-1. D. Ilmoitettu solulinjat joko transfektoitu siRNA: t kuten edellä, tai käsitelty IWP-1 tai ajoneuvon hallinnan. Solujen kokonaismäärään päivänä 6 arvioitiin, kuten on kuvattu, ja käsittelemättömiin soluihin verrattuna. IWP-1 käytettiin 2 uM ja päivittyy 24 tunnin välein. E. Western blot WLS MDA-MB-231-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti SHC shW1, ja shW5 shRNAs. F. WLS Knockdown ei hidasta kasvaimen kasvua. MDA-MB-231-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti SHC shW1, ja shW5 shRNAs injektoitiin ortotooppisesti BALB /c-nude-hiirissä, ja kasvaimen kasvua seurattiin, kuten on kuvattu. G. WLS viesti tasoja kasvaimissa uutettu (E), arvioidaan qRT-PCR ja normalisoitu Actin.

Yllättäen toisin PORCN knockdown, knockdovvn WLS oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta proliferaatioon syöpä solulinja testattiin, mukaan lukien MDA-MB-231, MCF7, DLD-1, SK-BR-3, T47D, ja HeLa-solut (kuvio 3D ja tietoja ei ole esitetty). Samoin, β-kateniinin pudotus ei vaikuttanut solujen kasvuun MDA-MB-231 tai MCF7-soluja. Vahvistaa tehoa pudotus menetys β-kateniinin merkittävästi vähentynyt leviämisen DLD-1-soluissa, jotka ovat vakiintuneet β-kateniinin johtuen mutaation adenomatoottisen polypoosin coli (APC) -geenin (kuvio 3D). Pieni vaikutus β-kateniinin Knockdown MDA-MB-231 soluproliferaatiota tässä kokeessa ei havaittu toistuvan kokeiluja. Lisäksi lisäämällä IWP-1 annoksilla, jotka antavat 80%: n vähennys Wnt /β-kateniinin signalointi ei ollut vaikutusta solujen kasvuun tai elinkelpoisuuden MDA-MB-231, MCF7, ja DLD-1-solut, rivit, jotka olivat herkkä sekä PORCN siRNA ja shRNA (kuvio 3D). Laajensimme tämä tulos paneelin muiden syöpäsolujen linjojen ja myös löytänyt mitään vaikutusta IWP-1 tai sukuinen molekyyli IWP-2 solujen kasvuun ja kannattavuuden (kuva S2). Nämä tulokset osoittavat, että saarto Wnt erityksen WLS Knockdown tai IWP käsittely ei muuttanut syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymistä, mikä tarkoittaa, että nämä solut eivät ole riippuvaisia ​​autokriininen Wnt signalointia. Tärkeää on, tämä tieto viittaa siihen, että menetys PORCN voi siis vaikuttaa kasvuun on Wnt riippumattomalla tavalla.

Menetys WLS ei vaikuta kasvaimen ottaa tai kasvua

Koska yllättävä puute vaikutuksen WLS knockdown soluviljelmässä, pyrimme laajentamaan tätä tulosta kasvain malli. MDA-MB-231-solut stabiilisti transdusoitiin kahdella shRNA kohdistaminen WLS (shW1 ja shW5) tai kontrolli shRNA, (SHC). Molemmat shRNA kohdistaminen WLS antoi tehokkaan Knockdown mRNA ( 80%) ja proteiini tasolla (kuvio 3E). Nämä solut injektoitiin ortotooppisesti BALB /c-nude-hiirillä ja kasvaimen etenemistä seurattiin. Kasvaimet kaikista kolmesta riviä kasvoi hyvin samanlainen korko (kuvio 3F). Kun kasvaimet olivat saavuttaneet ~ 1 cm halkaisijaltaan, ne poistettiin ja arvioitiin pysyvyys WLS knockdown. Sekä shW1 ja shW5 säilyttänyt 60% knockdovvn WLS kasvaimissa (kuvio 3G). Näin ollen, vaikka WLS knockdown on tehokas, pysyviä, ja vähentää β-kateniinin signalointi, sillä ei ole mitään vaikutusta MDA-MB-231 solujen kasvuun tai ksenograftikasvaimissa. Kun otetaan lisäksi huomioon vaikutus PORCN Knockdown kasvaimen kasvuun (kuvio 2E), tämä tieto tukee edelleen ajatusta Wnt-riippumattoman aseman PORCN syöpäsolun kasvua

in vivo

Wild Type ja mutantti PORCN molemmat pelastus kasvun vaikutukset

PORCN knockdown hidastui syövän leviämisen, toisin estäminen PORCN entsyymiaktiivisuuden kanssa pienimolekyylisiä IWP-1. Tämä paradoksi ehdotti, että PORCN proteiini saattaa olla tarpeen rakenteellinen rooli soluissa. Sen vahvistamiseksi, että menetys PORCN proteiini on vastuussa havaitusta kasvun vaikutukset, pyrimme pelastaa tämän fenotyypin käyttämällä siRNA-immuuni version hiiren PORCN-D. Käyttämällä MSCV-3XHA-merkitty mPORCN-D-konstrukti [4], käytettiin kohdennettua mutageneesiä antaa immuniteetin siP7 siRNA. Jotta katalyyttisesti inaktiivinen PORCN, me muuntunut H341, invariantti MBOAT katalyyttinen jäännös ennustettu osallistua PORCN katalyyttinen aktiivisuus. Kokeiluja useita PORCN-null solulinjoissa vahvistettiin, että mPORCN (H341A) on kokonaan katalyyttisesti inaktiivinen (kuvio 4E ja tietoja ei ole esitetty). Lisäksi, PORCN (H341L) on äskettäin osoitettu olevan katalyyttisesti inaktiivinen in PORCN null ES-soluihin [13]. Ohimenevä transfektioiden PORCN mutantti ekspressoitiin tasoisena villityypin PORCN ja toimii määräävässä negatiivinen tavalla, tehokkaasti estämällä sekä Wnt eritystä ja TCF-ajettu lusiferaasin ilmentymisen STF3A soluissa (kuvio S3, A-C). Käyttämällä siRNA-immuuni versiot Näiden rakenteiden, me kotransfektoitiin MDA-MB-231-solujen siP7 siRNA ja näytti sitä ei ollut vaikutusta runsaasti kohdunulkoinen PORCN proteiinin (kuvio 4A, yläpaneeli), vahvistaa immuniteetin siP7 siRNA. MDA-MB-231 soluihin, jotka ekspressoivat villityypin mPORCN ovat lisänneet WNT3A-driven STF aktiivisuutta (kuvio 4B). Erityisesti, MDA-MB-231 soluihin, jotka ilmentävät H341A mPORCN ovat vähentäneet WNT3A-ajettu β-kateniinin signalointi aktiivisuutta, sopusoinnussa vallitsevan negatiivisen toiminto MDA-MB-231-soluja samoin. Sekä villityypin ja H341A PORCN kolokalisoituvat kanssa kalneksiini (kuvio 4C), ER merkki [30], yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien osoittavat PORCN lokalisointi ER [4].

. Western blot-analyysi MDA-MB-231-soluja, jotka on transfektoitu P7 immuunijärjestelmän konstruktit HA-merkitty WT ja H341A PORCN. PORCN rakenne sisältää 2 ylimääräistä hiljaisia ​​mutaatioita, jotka tekevät sen immuuni P7 siRNA knockdown. EV, tyhjä vektori; WT, villityypin PORCN-HA; MT, H341A-PORCN-HA. B. villityypin mutta ei mutantti PORCN stimuloi Wnt /β-kateniinin signalointia. MDA-MB-231-soluja kotransfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat WT- ja H341A-PORCN, WNT3A, ja SuperTOPflash toimittaja. H341A-PORCN on merkittävä hallitseva negatiivinen vaikutus Wnt /β-kateniinin signalointi. C. villityypin ja mutantti PORCN asianmukaisesti lokalisoitu. Epäsuora immunofluoresenssimikroskoopilla suoritettiin anti-HA vasta-aine ja Endoplasmakalvosto merkki kalneksiini. D. villityypin ja hallitseva negatiivinen H341A PORCN ovat yhtä tehokkaita pelastaminen kasvua vika aiheuttamia PORCN knockdown. MDA-MB-231 oli kotransfektoitiin P7 siRNA ja PORCN ilmentämiskonstrukteja kuten on osoitettu. Solumäärät mitattiin kuten on kuvattu.