Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cdc37 on 50 kDa molekyyli- chaperone joka kohdistuu luonnostaan ​​epästabiili proteiini kinaasien avulla molekyylitason kaperoni HSP90. Se on myös yli-ilmentynyt onkoproteiinin joka välittää syövän synty ja ylläpito pahanlaatuisen fenotyypin stabiloimalla heikentynyt rakenteita mutantin ja /tai yli-ilmentynyt onkogeenisten kinaasien. Kirjoittajat raportoivat, että Cdc37 ei rajoitu solun vaan se on myös läsnä pinnalla MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän soluja, kun on osoitettu osallistua syövän solun liikkuvuus prosesseja. Lisäksi osoitamme, käyttäen anti-Cdc37 solun läpäisemätön vasta-ainetta, joka samalla sen solunsisäisen vastine, tämä pinta allas Cdc37 erityisesti vuorovaikutuksessa HSP90 sekä nikinaasireseptoreiden HER2 ja EGFR solun pinnalla, todennäköisesti toimii kofaktorina in HSP90: n solunulkoisten chaperoning toimintaa. Lopuksi käy ilmi, että toiminnallinen inhibitio pinnan HSP90 käyttäen mAb 4C5, solun läpäisemätön monoklonaalinen vasta-aine tämän proteiinin, johtaa paitsi häiriöitä Cdc37 /HSP90 monimutkainen, mutta myös estämällä Cdc37 /ErB reseptorien komplekseja. Nämä tulokset tukevat olennainen rooli pinta Cdc37 yhteistuumin HSP90 solun pinnalla aikana syöpäsoluinvaasiota prosesseja ja vahvistaa terapeuttista potentiaalia mAb 4C5 varten syövän hoitoon.

Citation: El Hamidieh A, Grammatikakis N , Patsavoudi E (2012) Cell Surface Cdc37 Osallistuu Solunulkoisilla HSP90 välittämä syöpäsoluinvaasiota. PLoS ONE 7 (8): e42722. doi: 10,1371 /journal.pone.0042722

Editor: Wanjin Hong, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2012 Julkaistu: 17 elokuu 2012

Copyright: © El Hamidieh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AEH vastaanotettu apurahan Helleenien Pasteur-instituutti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

HSP90 on molekyyli chaperone joka toimii yhdessä kohortin yhteistyössä chaperones ohjaamaan vakautus- ja aktivointi joukko signalointi proteiineja, kuten onkogeeniset kinaasien, transkriptiotekijät ja hormonin reseptorit [1], [2 ]. Cdc37 (Solunjakautumisen sykli proteiini 37) pidetään keskeisenä tekijänä tämän multimeerisiä kaperoni- koneet, pelaa erikoistunut ja korvaamaton rooli kypsymisen ja /tai stabilointia suuri osajoukko proteiinikinaasien, sekaantuneet signaalitransduktion, leviämisen ja selviytymistä [ ,,,0],3]. Estämällä sulkemisen N-terminaalisen HSP90 ATP-sitoutumiskohta, Cdc37 estää ATP toiminnan HSP90 [4] ja avustaa lastaus kinaasin asiakkaan proteiinien päälle kaperonin koneet [4], [5]. Ιn erityisesti Cdc37 toimii sovittimen tai tukirakenteen, helpottaa asiakkaan kinaasi vuorovaikutuksessa HSP90 [6] ja sen jälkeen rekrytoimalla nämä asiakkaan kinaasien osaksi HSP90 monimutkainen, se stabiloi ja /tai ylläpitää niitä taitto-toimivaltaisen konformaatioon [7]. Lisäksi, Cdc37 edistää kokoonpano HSP90-proteiinikinaasin kompleksit [8] ja ilmaisun määräävän-negatiivinen muoto, joka ei ole HSP90-sitova domeeni inhiboi kinaasin aktivaation nisäkässoluissa [9]. Monet asiakas proteiinit vuorovaikuttavat suoraan sekä Cdc37 ja HSP90 ja niiden taitto, kypsymiseen ja vakaus riippuvat aktiivisuudesta molempien saattajia. Näin ollen Cdc37 välittää muodostumista HSP90-Raf1 [9] ja HSP90-Cdk4 kompleksit [10], ja nämä vuorovaikutukset ovat välttämättömiä proteiinin stabiiliuden ja kinaasi-toiminto. Monimutkainen suhde Cdc37 ja HSP90 on kuvattu havainto, että niiden vuorovaikutus stabiloidaan asiakas proteiini [11]. Viime vuosina on ollut kasvavaa näyttöä siitä, että solunsisäinen HSP90 on keskeinen rooli hankinta ja ylläpito pahanlaatuisen fenotyypin [12], [13], [14], [15]. Näin ollen on olemassa kasvavaa kiinnostusta Cdc37 yhteydessä maligniteetin [16], [17], koska Cdc37 säätelee myös useita kasvaimia synnyttävän kinaasi asiakkaita. Itse Cdc37 arvot ovat lisääntyneet monissa kliinisissä syövissä [17]. Erityisesti, Cdc37, on lisääntynyt lisääntyviin kudoksiin, ja se on voimakkaasti ilmaistu tietyissä syövissä, mukaan lukien anaplastinen suuri solu lymfooma [18] akuutti myelosyyttileukemia [19], maksasyövän [20] ja multippeli myelooma [21]. Lisäksi tiedot on esitetty osoittaa, että Cdc37 voi toimia onkogeenin, kuten hiiriä suunniteltu yliekspressoivat Cdc37 kehittää kasvaimia, suurella taajuudella [22], mikä viittaa siihen, että perustetaan proteiinikinaasi teille, joita välittävät HSP90 /Cdc37 voi olla korko -rajoittavia tapahtuma epiteelisolujen transformaatio [22]. Viime aikoina on osoitettu, että Cdc37 on tärkeää säilyttää eturauhasen tuumorin solujen kasvua [23]. Lisäksi verihiutaleiden kasvutekijän reseptori alfa jota säädellään ylöspäin ja aktivoitua useilla maligniteettien muodostaa kompleksin HSP90 ja yhteistyössä chaperoniproteiiniin Cdc37 munasarjasyöpää, glioblastooma, ja keuhkosyövän soluihin [24]. Yhdessä nämä tulokset tukevat kohdentamista Cdc37 syövän hoidossa.

ja muut ovat aikaisemmin tunnistettu ekstrasellulaarinen altaan HSP90 sekä normaali- että syöpäsolujen jonka osoitettiin olla mukana maahanmuuttoa ja invaasio prosesseja, vastaavasti [ ,,,0],25], [26], [27], [28], [29], [30]. Lisäksi ja hyödyntämällä toiminnan estävää ominaisuudet solun läpäisemättömän monoklonaalinen vasta-aine nimeltä mAb 4C5, jotka on suunnattu erityisesti HSP90 olemme osoittaneet, että ekstrasellulaarisen HSP90 vuorovaikutuksessa HER-2 solun pinnalla [28] sekä metalloproteinaasilla MMP-2 ja MMP-9 [29]. Vaikka yhä useammat HSP90: n co-chaperones kuten HSP70, Hop ja p23 löytyi myös solun pinnalla [31], [32], [33], niiden toiminta ja taustalla mekanismeja ei ole vielä selvitetty. Mainitut seikat huomioon ottaen huomioon, että tässä työssä tutkimme solun pinnalla lokalisointi Cdc37 ja tutkimme sen mahdollista osallistumista syöpäsoluinvaasiota prosesseissa sekä sen mahdollisten vuorovaikutuksessa olevaa kumppanit tämän prosessin aikana, käyttäen MDA-MB-453 ja MDA- MB-231 ihmisen rintasyövän solulinjoissa ja kaupallisesti saatavilla polyklonaalista vasta-ainetta vastaan, Cdc37. Lisäksi ja ottaen huomioon aiemmin kerrotut tiedot osoittavat, että mAb 4C5 estää syöpäsolujen invaasiota häiritsemällä yhdistys solunulkoisen HSP90 HER2 [28] ja metalloproteinaasilla MMP2 ja MMP-9 [29] tässä työssä tutkimme mahdollinen vaikutus tämän solun läpäisemätöntä anti-HSP90 vasta-aineen vuorovaikutusta pinnan Cdc37 kanssa HSP90 ja ErbB-reseptoreita.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

MAb 4C5 on tuotettu laboratoriossamme, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],34]. Esillä olevassa tutkimuksessa, mAb 4C5 käytettiin konsentroitiin seerumittomassa supernatantti kaikissa kokeissa suoritettiin. Polyklonaalisia vasta-aineita EGFR: ää, HER-2, ja monoklonaalinen vasta-aine sykliini D1 saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Kaksi anti-Cdc37 vasta, Santa Cruz Biotechnology ja Abcam tunnustaa eri epitooppeja käytettiin. Polyklonaalisia vasta-aineita HSP90 olivat Chemiconilta International. DMEM, RPMI ja naudan sikiön seerumia (FBS), oli Invitrogen-yhtiöstä. Kaikki muut materiaalit olivat lähteistä aikaisemmin on kuvattu [25].

Soluviljelmät ja immunof-

HER-2-yli-ilmentävät MDA-MB-453, EGFR-over-ilmentävät MDA-MB- 231 rintasyövän solulinjoissa ja muiden syöpäsolujen epiteelisolujen rinta MCF-12A hankittiin American Type Culture Collection. MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluja ylläpidettiin RPMI ja DMEM, vastaavasti, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. MCF-12A-solut ylläpidettiin DMEM-HAM F12, johon oli lisätty 20 ng /ml ihmisen EGF, 100 ng /ml hydrokortisonia, 0,01 mg /ml naudan insuliinia ja 10% FBS: ää.

immunofluoresenssitutkimukset, solut maljattiin poly-L-lysiinillä päällystettyihin peitelaseille, tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa 48-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin sopivassa elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua solut siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen 18 tuntia. Live-MDA-MB-453, MDA-MB-231 ja MCF-12A solut leimattiin epäsuoralla immunofluoresenssilla aiemmin raportoidun [28]. Lyhyesti, tallentamattomiin soluja inkuboitiin 2 ug /ml anti-Cdc37-vasta-aineen 2 tuntia. Sitten solut pestiin, kiinnitettiin jääkylmässä asetonissa, ja leimattiin Alexa488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen.

valmistaminen solulysaateista, Western blot-analyysi ja Co-immunosaostus

Soluja kasvatettiin 25 cm

2 pulloissa elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, kunnes subkonfluenssin, siirtynyt seerumittomassa väliaineessa 24 h ja sitten altistettiin anti-Cdc37 ja /tai mAb 4C5: ssa 16 tuntia. Ohjaus kasvatettiin joko pelkästään viljelyalustassa tai viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 200 ug /ml IgG2a monoklonaalinen vasta-aine eivät liity proteiini BM88 [35]. Ylimääräinen sitoutumaton vasta-aine poistettiin sitten pesemällä tuoreella elatusaineella. Viljelmiä pestiin välittömästi kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä ja lyysattiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [28].

Cellular suoritettiin fraktiointi soluviljelmissä valmistettiin ja käsiteltiin, kuten edellä on kuvattu, käyttäen compartmental proteiini Extraction Kit (Chemicon), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Yhteensä ja /tai compartmental proteiinin lysaatit määrällisesti, ja yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia suoritettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot kanssa sopivia vasta-aineita. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL chemiluminescence reagenssia (Amersham Biosciences) ja X-Omat AR -filmille (Eastman Kodak Co.), kuten on kuvattu valmistajan.

Co-immunosaostus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Lyhyesti, yhtä suuria määriä esipuhdistettiin solulysaateista inkuboitiin sopivia vasta-aineita 18 h 4 ° C: ssa. Immunokompleksien inkuboitiin sitten 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa proteiini G-Sepharose ja pestiin kolme kertaa hajotuspuskurilla. Sitoutuneet proteiinit analysoitiin geelielektroforeesilla, jota seuraa Western blot kuten edellä on kuvattu. Kaikkien immuunisaostuskokeissa, negatiiviset kontrollit tehtiin käyttämällä merkityksetöntä IgGs.

Vasta Internalisaatio Pitoisuus

Vasta sisäistämisen kokeet suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [28]. Lyhyesti, soluja inkuboitiin, kun viljelmän 200 ug /ml anti-Cdc37-vasta-ainetta 16 tuntia. Sitten solut pestiin ja kiinnitettiin kylmässä asetonissa 3 minuutin ajan. Havaitsemiseksi mahdollisimman sisäistämisen vasta-aineen, solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssä ja sen jälkeen inkuboitiin Alexa488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Molecular Probes). Kaikissa kokeissa, kontrollit tehtiin käyttämällä mAb 4C5, joka on solu läpäisemätön ja kaupallisen anti-HSP90, joka sisäistetään [27].

RNA-interferenssi

Plasmidi pLL3.7 kanssa insertio kohdistaminen Cdc37 käytettiin. Cdc37 pudotettiin lyhyillä hiusneula-RNA: t. Tätä tarkoitusta varten ”WI siRNA Selection Program” alkaen Whitehead Institute for Biomedical Research käytettiin, suunnitella ja valita siRNA kohdistaminen Cdc37. Jotta voidaan luoda varsi-silmukka-rakenne, välikkeen (TTCAAGAGA) insertoitiin sense- ja antisense-sekvenssit. DNA oligomeerit hybridisoitiin ja kloonattiin pLL3.7 plasmidiin. Lisäämällä varmistettiin sekvensoimalla. MDA-MB 453 ja MDA-MB 231 soluja kasvatettiin tiheyteen 70% ja sitten transfektoitiin 3 ug plasmidi-DNA, johon on asennettu sekvenssien tai ei (kontrolli), käyttäen Xfect transfektioreagenssia Clontech, mukaan valmistajan protokollaa. 72 tuntia transfektion jälkeen, solut kerättiin, hajotettiin ja niille suoritettiin Western blot -analyysi. Immunofluoresens- havaitsemiseksi Cdc37, solut maljattiin poly-L-lysiinillä päällystetty peitinlaseilla ja transfektoitiin plasmidi-DNA kuten edellä. 72 tuntia transfektion jälkeen, elävät solut pestiin PBS: llä, inkuboitiin anti-Cdc37-vasta-ainetta 2 tunnin ajan, kiinnitettiin jääkylmällä asetonilla ja leimattiin Alexa647-sekundaarisella vasta-aineella.

Wound Healing Motility Pitoisuus

määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Lyhyesti, MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluja maljattiin 48-kuoppalevylle tiheyteen 1,5 x 10

5 solua /kuoppa ja 5 x 10

4 solua /kuoppa, vastaavasti, ja jätettiin 24 h seerumia sisältävässä väliaineessa, ilman lisäkäsittelyä. Elatusaine vaihdettiin sitten seerumittomaan, ja 16 tuntia myöhemmin, solu-vapaa alue muodostettiin varovasti raaputtamalla yksisolukerros steriiliin keltainen Gilson-pipetin kärki, mikä johtaa siihen, että muodostuu 1 mm levyinen cell vapaa alue. Välittömästi sen jälkeen, raapiminen, kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla, tai väliaineessa, joka sisältää anti-Cdc37-vasta-ainetta. Ohjaus kasvatettiin joko pelkästään viljelyalustassa tai viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 200 ug /ml IgG2a monoklonaalinen vasta-aine eivät liity proteiini BM88 [35].

Migration rintasyöpäsolujen raossa seurattiin mikroskooppisesti annetaan aikavälein käyttämällä Leica DM IL -käänteismikroskoopissa, joka on varustettu LEICA DM300 videokamera liitetään tietokoneeseen. Esto muuttoliikkeen arvioitiin hankkimalla ja analysoimalla digitaalisten kuvien, käyttäen Image Pro Plus analyysin ohjelmisto [36] ja arvioitiin kahdella eri tavalla riippuen solulinjasta tutkittu. Tarkemmin sanottuna MDA-MB-453-solujen se ilmaistiin prosentteina kattama etäisyys solut kontrolliviljelmissä, ottaa huomioon, että MDA-MB-231-solujen se ilmaistiin prosentteina solujen havaita kuilu haava kontrolliviljelmiin tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

testiä.

tulokset

Cdc37 ilmentyy solun pinnalla MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 rintasyöpä solut

jotta voidaan tutkia solun pintaan lokalisointia Cdc37, tallentamattomiin MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän soluja inkuboitiin anti-Cdc37 vasta-aine. Sitten solut pestiin, kiinteät ja leimattiin Alexa488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Siten primaarinen vasta-aine oli pääsy vain ulkopinnalle solun. Havaittu immunovärjäystä vahvisti solun pinnalla lokalisoinnin Cdc37 sekä ihmisen rintasyövän solulinjoissa tutkittu (Fig. 1). Positiivisena kontrollina, mAb 4C5, joka sitoutuu spesifisesti pinnan HSP90, joiden läsnäolo on aiemmin esitetty molemmissa solulinjoissa [28] [26] on käytetty. Tässä vaiheessa on kiinnostavaa huomata, että immunofluoresenssilla kokeet osoittivat, kuten odotettua, ei ole paitsi Cdc37 myös HSP90: n pinnalla aikuisten kuin syöpä MCF-12A-solut (Fig. S1). Muita positiiviset kontrollit levitettiin käyttäen vasta-aineita HER-2 ja EGFR varten MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluissa, vastaavasti. Lopulta vasta-aineet vastaan ​​EGFR ja HER2 käytettiin negatiivisina valvonta MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluissa, vastaavasti (Fig. 1A ja B). Edellä esitetyt tulokset varmistettiin Western blot käyttäen kalvofraktiot johdettu kahden solulinjan (Fig. 1 C ja D). Positiivisena kontrollina anti-HER2 (Fig. 1 C) ja anti-EGFR (Fig. 1 D) vasta-aineita käytettiin, MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 kalvon solulysaateista, vastaavasti. Vuonna solulimafraktiot ja odotetusti anti-Cdc37 antoi positiivisen immuunivärjäystä taas vasta-aineita ErB reseptoreita olivat negatiivisia. Lisäksi solulimafraktiot molempien solulinjojen antoi positiivisen immunovärjäystä, kun immunobloted vasta-aineen kanssa, oli solunsisäinen sykliini-D1, kun taas kalvo fraktiot olivat negatiivisia (Fig. 1 C ja D), mikä vahvistaa jakeiden puhtauden käytetään tässä ja immunoprecipitaion alla kuvatut kokeet.

, epäsuoralla immunofluoresenssilla elävien MDA-MB 453 solua käyttäen anti-Cdc37 vasta-aine. Immunoleimaus paljastaa pinta lokalisoinnin Cdc37. Anti-HER2 ja mAb 4C5 käytettiin positiivisina kontrolleina. Anti -EGFR vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. B, epäsuoralla immunofluoresenssilla elävien MDA-MB 231 solua käyttäen anti-Cdc37 vasta-aine. Anti-EGFR ja mAb 4C5 käytettiin positiivisina kontrolleina. Anti -HER2 vasta-aineita käytettiin negatiivisena kontrollina. C, Cell fraktioinnin MDA-MB 453 soluja ja sen jälkeen Western blot-analyysi vahvisti läsnäolo Cdc37 solukalvon jakeet. Anti-HER2-vasta-aineita käytettiin positiivisina ja negatiivisina kontrolleina kalvoon ja solulimafraktiot vastaavasti. D, Cell fraktioinnin MDA-MB 231 soluja ja sen jälkeen Western blot-analyysi vahvisti läsnäolo Cdc37 solukalvon jakeet. Anti-EGFR-vasta-aineita käytettiin positiivisina ja negatiivisina kontrolleina kalvoon ja solulimafraktiot vastaavasti. C ja D-vasta-ainetta vastaan, oli solunsisäinen sykliini D1 antoi positiivisen ja negatiivisen immuunivärjäyty- sytosolin ja membraanin jakeet molemmissa solulinjoissa, vastaavasti. CF, sytosolifraktion; MF, kalvofraktiossa. Asteikko bar = 20 pm.

Jotta spesifisyyden varmistamiseksi kaupallisen anti-Cdc37-vasta käytetty meidän tutkimuksissa siRNA tekniikkaa on sovellettu. Tarkemmin sanoen, kun MDA-MB-453 ja MDA-MB-231cells transfektoitiin siRNA kohdistaminen Cdc37 immunovärjättiin edellä kuvatulla tavalla anti-Cdc37-vasta-aine, joka on äärimmäisen heikko merkintöjä havaittiin verrattuna soluihin transfek- toituna kontrollivektorilla (Fig. 2 A ja B). Vastaavasti, kun Western blot -analyysillä käyttämällä anti-Cdc37-vasta-aine tehtiin kokosoluliuotteissa johdettu edellä soluja, väheni merkittävästi immunovärjäyksellä saatiin lysaateista transfektoitiin siRNA kohdistettu Cdc37 verrattuna contols (Fig. 2C ja D ).

A, B, immunofluoresenssi elävien MDA-MB 453 ja MDA-MB 231-soluissa, käyttäen anti-Cdc37-vasta-ainetta. Solut transfektoitiin siRNA kohdistaminen Cdc37 (shRNA Cdc37) tai plasmidi-DNA: ilman lisäys (kontrolli). ShRNA Cdc37 transfektoidut solut osoittavat erittäin pieniä määriä pinta-immunofluoresenssivärjäyksen verrattuna kontrolleihin. Mittakaava = 20 um. C, D, Western blot-analyysi kokosoluliuotteista peräisin MDA-MB 453 ja MDA-MB 231-soluissa, käyttämällä anti-Cdc37-vasta-ainetta, ja solut, jotka on transfektoitu siRNA kohdistaminen Cdc37 ja kontrollisoluja. Taso Cdc37 havaittu on huomattavasti alhaisempi molemmissa solulinjoissa transfektoitu siRNA kohdistamista Cdc37, verrattuna kont-.

Anti-Cdc37 vasta-aine on solu läpäisemätön

Solu läpäisemätön luonne anti-Cdc37 käyttää tutkittiin inkuboimalla MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluja, kun taas viljelmässä vasta-aineen kanssa 16 tuntia. Sitten solut pestään huolellisesti, ja vasta-aineen sitoutumisen analysoitiin sen jälkeen, kun kiinnitys ja solujen permeabilisaation, käyttäen Alexa488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Havaitsimme, että sekä solulinjat anti-Cdc37-vasta-ainetta ei ole sisällytetty hintoihin ja pysyi sitoutuneen solun pinnalla (Fig. 3). MAb 4C5 ja polyklonaalisen anti-HSP90 jotka on aikaisemmin osoitettu pysyvän pinnalla ja sisäistetään vastaavasti [27], käytettiin verrokkeina (Fig. 3). On huomattava, että kun edellä mainittuja soluja inkuboitiin pelkästään viljelyalustassa negatiivisena kontrollina, ei immunovärjäyksellä saatiin (tuloksia ei ole esitetty).

Anti-Cdc37-vasta-aineen internalisaation testattiin sekä MDA-MB 453 ja MDA-MB 231 soluja. Elävät solut kahdesta solulinjoja kasvatettiin peitinlaseilla ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 16 h anti-Cdc37. MAb 4C5 ja anti-HSP90 käytettiin positiivisten ja negatiivisten kontrollien vastaavasti. Havaitsemista varten vasta-aineen internalisaation, solut kiinnitettiin ja tehtiin läpäiseviksi, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät ja vasta-aineet todettiin konfokaalimikroskopialla käyttämällä Alexa 488 sekundäärinen vasta-aine. O sisäistämisen anti-Cdc37-vasta-ainetta havaittiin myös molemmissa solulinjoissa. Asteikko bar = 20 pm.

Pinta Cdc37 on osallisena rintasyövän soluliikkuvuus

Todettuaan, että anti-Cdc37 vasta-aine ole sisäistäneet, vaan pysyy nimenomaan sidottu solu- pinnalla, kun inkuboitiin olo MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluja, tutkimme seuraavaksi mahdollista osallistumista pinnan Cdc37 on motiliteettia näiden rintasyöpäsolujen, käyttäen haavan paranemista määrityksessä. Ohjaus kasvatettiin joko pelkästään viljelyalustassa tai viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 200 ug /ml vasta-ainetta vastaan, jotka eivät liity proteiini BM88 [35]. On tärkeää huomata, että ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa ei havaittu kahden tyyppisiä tarkastuksia käyttää. Säätöarvo jossa on esitetty keskiarvo kahden kontrolli. Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja kuvio. 5A läsnä anti-Cdc37-vasta-elatusaineessa sekä MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluja, johti merkittävästi hitaampaa haavan, verrattuna kontrolleihin kasvatetuissa viljelmissä pelkästään viljelyalustassa. Tarkemmin sanottuna, 57,7% ja 35,8% inhibitio syöpäsolujen motiliteetin saatiin, kun 200 ug /ml anti-Cdc37 sisällytettiin kasvatusalustaa MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluissa (kuviot. 4C ja 5C). Trypaanisinisellä värjäys suoritetaan päätepiste haavan määrityksessä, osoittivat, että kuolleisuus käsiteltyjen solujen kanssa vasta-aine oli samanlainen kuin havaittiin kontrolliviljelmissä sekä solulinjoissa (kuviot. 4B ja 5B). Tämä tulos tukee edelleen, että vähentynyt solun liikkuvuus havaittu, kun läsnä on anti-Cdc37-vasta-aine, joka ei ole sisäistetään ei aiheuta solukuolemaa, vaan estämällä pinnan altaan Cdc37. Tässä vaiheessa on tärkeää huomata, että tässä määrityksessä, vaikutus anti-Cdc37-vasta-aine on suunnattu soluinvaasion eikä kohti solujen lisääntymistä, koska hyvin alhainen (alle 7%) BrdU havaittiin sekä ihmisen rintasyövän soluviljelmät käsiteltiin kuten edellä, joilla ei ole ilmeisiä eroja erilaisissa koeolosuhteissa (tuloksia ei ole esitetty).

A, Haavan paranemista määrityksessä. Kuvat saatu 0 tuntia ja 24 tunnin kuluttua alusta muodostumisen. Solut anna siirtää valvonta olosuhteissa tai kun läsnä on 200 ug /ml anti-Cdc37-vasta-ainetta. B, lopussa ajankohtaan solut värjättiin Trypan Blue. Mitään merkittävää solukuolemaa havaittiin molemmissa tapauksissa. C, Kvantitatiivisten vaikutus Cdc37 solujen muuttoliike. Lisäämällä 200 ug /ml anti-Cdc37-vasta-aineen soluviljelyalustaan ​​johti 57,7%: n inhibitio haavan verrattuna kontrolliin, joka katsottiin 100%: een haavan sulkeutumiseen (P 0,005). Sarake on keskiarvo kolmen erillisen kokeen ± SE. Sisällä yksi koe kukin ehto testattiin kolmena kappaleena. Mittaviivat A = 165 nm, B = 80 pm.

, Haavan paranemista määritys. Kuvat saatu 0 tuntia ja 24 tunnin kuluttua alusta muodostumisen. Solut anna siirtää valvonta olosuhteissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät tai, kun läsnä on 200 ug /ml anti-Cdc37-vasta-ainetta. B, lopussa ajankohtaan solut värjättiin Trypan Blue. Mitään merkittävää solukuolemaa havaittiin molemmissa tapauksissa. C, Kvantitatiivisten vaikutus Cdc37 solujen muuttoliike. Lisäämällä 200 ug /ml anti-Cdc37-vasta-aineen soluviljelyaineeseen johti 35,8%: n inhibitio soluja valtaavat ero verrattuna kontrolliin, joka katsottiin 100%: een haavan sulkeutumiseen (P 0,005). Sarake on keskiarvo kolmen erillisen kokeen ± SE. Sisällä yksi koe kukin ehto testattiin kolmena kappaleena. Mittaviivat A = 165 nm, B = 80 pm.

Pinta Cdc37 vuorovaikutuksessa HSP90 molemmissa rintasyövän solulinjoissa ja HER-2 ja EGFR MDA-MB-453 ja MDA-MB- 231cells vastaavasti

Kun otetaan huomioon edellä esitetty osallistumista pinnan Cdc37 vuonna syöpäsoluinvaasiota prosesseja tutkimme seuraavaksi mahdollisia yhteisvaikutuksia tämän molekyylin kanssa HSP90 ja ErB nikinaasireseptoreiden. Tätä varten suoritimme samanaikainen immunosaostus kokeita käyttäen kalvofraktiot johdettu MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-soluja viljeltiin joko ohjaus väliaineessa mainitut materiaalit ja menetelmät tai, kun läsnä on 200 ug /ml anti- Cdc37-vasta-ainetta 16 tuntia ja immunosaostettiin anti-Cdc37-vasta-ainetta. Western blot-analyysi käyttämällä anti-HSP90, anti-HER2 ja anti-EGFR-vasta-aineiden osalta, osoitti, että anti-Cdc37-vasta-aine spesifisesti häiritsee pinnan vuorovaikutus Cdc37 kanssa HSP90 ja molemmat reseptorit kahdessa solulinjassa tutkittu (Fig. 6A), koska määrän väheneminen näiden molekyylien havaittiin käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolleihin. Tässä vaiheessa on tärkeää huomata, että havaittu häiriö vahvistaa solun pinnalla lokalisoinnin molekyylivuorovaikutusten tutkittu, koska kuten edellä on esitetty, anti-Cdc37-vasta-aine ei ole hintoihin, ja pysyy sitoutuneena solun pintaan, kun mukana elatusaineessa.

A, kalvo proteiinifraktioiksi MDA-MB 453 ja MDA-MB 231 solua (verrokki) on immunoprecipitaded anti-Cdc37 vasta-aine. Analyysi sitoutuneiden proteiinien Western blot anti HSP90 vasta-aineella ja anti HER-2 ja anti -EGFR vasta vastaavasti paljasti, että Cdc37 vuorovaikutuksessa paitsi HSP90 vaan myös molempien ErB reseptorien tutkittu. Läsnäolo 200 ug /ml solun läpäisemättömän anti-Cdc37 16 h elatusaineessa kahden solulinjoista seurasi immunosaostuksella ja Western blot-analyysi kuten edellä ilmeni, että anti-Cdc37-vasta häiritsee yhdistys Cdc37 kanssa HSP90 ja ErbB-reseptorien kahdessa solulinjassa. B, MDA-MB 453 ja MDA-MB 231 soluja käsiteltiin tai ei ole 200 ug /ml mAb 4C5: ssa 16 tuntia. Membraaniproteiini jakeet, jotka ovat peräisin näistä viljelmistä immunoprecipitaded anti-Cdc37 ja sen jälkeen Western blot-analyysi käyttämällä anti-HSP90 ja anti-HER2-ja anti EGFR-vasta-aineiden osalta. C, Membrane proteiinifraktiot MDA-MB 231 soluja viljeltiin puuttuessa tai läsnä oli 200 ug /ml mAb 4C5: ssa 16 tuntia immunosaostettiin anti-EGFR-vasta-aine. Analyysi sitoutuneiden proteiinien Western blot anti-HSP90-vasta paljasti, että pinta HSP90 vuorovaikutuksessa EGFR ja että tämä vuorovaikutus häiriintyy mAb 4C5. Merkityksetön IgGs toimi negatiivisena kontrollina kaikkien edellä kokeissa. D, Densitometria kvantifiointiin havaittu vähensi vuorovaikutukset läsnäollessa anti-Cdc37 elatusaineessa MDA-MB 453 ja MDA-MB 231 solua johti 33% ja 59% lasku kanssa HSP90 ja HER-2 vastaavasti koskien MDA -MB 453-soluissa ja 56% ja 47% lasku kanssa HSP90 ja EGFR vastaavasti koskien MDA-MB 231 soluja. MAbin läsnä 4C5 kasvualustaan ​​MDA-MB 453 ja MDA-MB 231 solua johti 60% ja 58% lasku kanssa HSP90 ja HER-2 vastaavasti koskien MDA-MB 453 soluja ja on 88% ja 70% vähenee HSP90 ja EGFR vastaavasti koskien MDA-MB 231 soluja.

MAb 4C5 nimenomaan häiritsee pinnan vuorovaikutus Cdc37 kanssa HSP90 ja ErB reseptorit

Todettuaan, että samalla sen solunsisäinen vastine, pinta Cdc37 liitetään fyysisesti pinta HSP90, seuraavan kerran pyrittiin tutkimaan vaikutusta toiminnan estävää anti-HSP90 monoklonaalinen vasta-aine, mAb 4C5, tässä vuorovaikutuksessa. Tätä varten kalvo jakeet, jotka ovat peräisin MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 viljelmiä, joita oli käsitelty 200 ug /ml mAb 4C5: ssa 16 tuntia immunosaostettiin anti-Cdc37-vasta-ainetta. Western blot-analyysillä käyttämällä anti-HSP90 paljasti, että mAb 4C5 erityisesti häiritsee pinnan vuorovaikutus Cdc37 kanssa HSP90 sekä syöpäsolulinjoissa käyttää (Fig. 6B). Tarkemmin sanottuna anti-Cdc37-vasta-co-immunosaostettiin alhaisempi HSP90 mAbin 4C5 käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolleihin.

Olemme aiemmin osoittaneet, käyttäen mAb 4C5, että pinta-HSP90 erityisesti vuorovaikutuksessa solunulkoisen domeenin HER -2 MDA-MB-453-solujen [28] .Vuonna läsnä työtä ja jotta edelleen tutkia vaikutustapa pinnan Cdc37 kahdessa solulinjoissa tutkittu, se oli tarpeen ensin tutkia mahdollisuutta pinnan vuorovaikutusta altaan HSP90 EGFR. Tätä varten kalvo jakeet, jotka ovat peräisin MDA-MB-231 käsitellyissä viljelmissä ilman tai, kun läsnä on 200 ug /ml mAb 4C5: ssa 16 h, immunosaostettiin anti-HSP90-vasta-aineen ja immunoblotattu anti-EGFR. Kuten on esitetty kuviossa. 6C EGFR nimenomaan vuorovaikutuksessa HSP90. Havaittu väheneminen läsnäollessa solun läpäisemättömän mAb 4C5 osoittaa solun pinnan lokalisointi Tämän vuorovaikutuksen oltuaan yhdistyksen pinnan HSP90 ja EGFR ja lisäksi että Cdc37 vuorovaikutuksessa paitsi HSP90 vaan myös HER2 ja EGFR meidän vieressä pyrittiin tutkimaan mahdollinen vaikutus mAb 4C5 yhteiskäytöstä chaperoniproteiiniin vuorovaikutus ErB reseptoreihin. Näin ollen kalvon osa on johdettu MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 käsitellyissä viljelmissä tai 200 ug /ml mAb 4C5: ssa 16 h immunosaostettiin anti-Cdc37-vasta-ainetta. Western blot-analyysi käyttämällä anti-HER2 ja anti-EGFR-vasta-aineiden osalta, osoitti, että mAb 4C5 erityisesti häiritsee pinnan vuorovaikutus Cdc37 sekä reseptorimolekyylien, koska alhaisempi ErbB-reseptorien havaittiin mAb 4C5 käsitellyissä viljelmissä (Fig. 6B).

keskustelu

Tässä työssä osoitamme, että yhteistyössä chaperoniproteiiniin Cdc37 on lokalisoitu pinnalla MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 rintasyövän soluja, joissa on tarpeen varten motiliteettia näiden solujen ja samalla sen solunsisäisen vastine se nimenomaan vuorovaikutuksessa molekyylien kaperoni HSP90. Lisäksi meidän tulokset osoittavat, että tämä pinta allas Cdc37 suoraan vuorovaikutuksessa jäsenten ErbB- perheen kasvutekijän reseptoreita mahdollisesti toimimalla yhteistyössä tekijä HSP90 solunulkoiseen chaperoning toimintaa osallinen syöpäsoluinvaasiota prosesseja ja että anti-HSP90-vasta mAb 4C5 häiritsee nämä vuorovaikutukset.

solun pinnalla lokalisointia Cdc37 osoitettiin sekä immunosytokemialla elävien MDA-MB-453 ja MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ja western blot käyttäen membraanifraktiota lysaatit, jotka ovat peräisin näistä solulinjoista.

inhibitio MDA-MB-453 ja MDA-MB-231 rintasyövän solun liikkuvuus, anti-Cdc37-vasta-aineen osoitettiin käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. Esiintyminen vasta-aineen elatusaineessa vähensi merkittävästi liikkuvuuden määrä molemmissa solulinjoissa tutkittu. Tässä vaiheessa on mielenkiintoista todeta, että kun anti-HSP90-vasta-aineen mAb 4C5 ja anti-Cdc37-vasta-aine on sisällytetty joko erikseen tai yhdessä elatusaineessa edellä solujen ole tilastollisesti merkittäviä eroja ei havaittu haavan sulkemiseen.