Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Int-6

(Integraatiokohdan 6) todettiin onkogeeni seulonnassa kasvaimia aiheuttavasta hiiren maitorauhasen (MMTV) lisäyksiä.

INT6

ilmentyminen muuttunut ihmisen syövissä, mutta tarkkaa roolia häirinnyt

INT6

kasvainten synnyssä on epäselvä, ja eläinmallissa tutkia

Int-6

fysiologinen on on puuttunut.

Keskeiset havainnot

Täällä luomme

in vivo

mallissa Int6 toimivat seeprakala, ja geneettistä ja kemiallisia geneettinen lähestymistapoja sotkea Int6 kudos- erityinen modulaattori MEK-ERK signalointi. Huomaamme, että Int6 tarvitaan normaaliin ilmentymistä MEK1 proteiinin ihmissoluissa, ja Erk signalointia seeprakalan alkioiden. Menetys joko Int6 tai Mek signalointi aiheuttaa vaurioita kallon kehittäminen sekä Int6 ja Erk-signalointi on päällekkäisiä verkkotunnuksia kudosilmentämisen.

merkitys

Tutkimus antaa uutta käsityksen fysiologinen rooli selkärankaisten Int6, ja vaikuttavat hoitoon ihmisen kasvaimista esittäessä muuttaa

INT6

ilme.

Citation: Grzmil M, Whiting D, Maule J, Anastasaki C, Amatruda JF, Kelsh RN, et al . (2007)

INT6

Syöpä Gene ja MEK signalointireitteihin Converge aikana Zebrafish Development. PLoS ONE 2 (9): E 959. doi: 10,1371 /journal.pone.0000959

Academic Editor: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 elokuu 2007; Hyväksytty: 02 syyskuu 2007; Julkaistu: 26 syyskuu 2007

Copyright © 2007 Grzmil et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ Rahoitin MRC apurahan EEP, ja avustuksilla CRUK ja AICR on Cjn. Rahoittajat ollut mitään roolia suunnittelussa tai tutkimuksen tekeminen, keräämiseen, analysointiin, tai tietojen tulkintaa, tai valmisteen, tarkastelun tai hyväksyntä käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

alkionkehityksen ja kasvainten kehittymiseen usein jakaa taustalla molekyylitason mekanismit-käsite kuvataan geenien tunnistaminen häiritsivät hiiren rintarauhasen (MMTV) in rintasyövissä [1]. Tärkeä esimerkki,

Int-1

geenin, joka on yleinen integraatio sivuston MMTV vuonna nisäkasvaimia, koodaa homologi

Drosophila siivetön

geeni [2], [3] ja oli myöhemmin nimeltään

Wnt1

(siivetön /Int) tunnustuksena tämän säilytetyn toiminnon. Wnt signalointia nyt tiedetään keskeytyvän monissa ihmisen kasvaintyypit, erityisesti paksusuolisyövän [4]. Muut

Int

geenejä, kuten

Int-2

ja

4

(Fgf3, 4), ja

Int-3

(Notch4), koodata mitogeeneille ja sääntelyviranomaisten kehityksen myös misactivated monissa syövissä [1], [5].

useimmissa tapauksissa MMTV aktivoi

Int

geeniekspressiota seurauksena proviraalisten integraatio ylävirtaan promoottorialueen. Huomattavaa on, kaikki kolme MMTV insertioita löytyy

Int-6

, joka koodaa komponentti eukaryoottitranslaatioon Rei’issä tekijä 3 (eIF3), havaittiin rajojen sisällä introneja, ja vastakkaiseen transkription suunnan

Int-6

geenin, luoda katkaistun

Int-6

mRNA [1], [6]. Kohdunulkoinen ilmaus vastaavasti katkaistun

Int-6

voi muuttaa soluviljelmissä [7], [8], ja edistää pysyviä maitorauhasen keuhkorakkuloiden liikakasvu ja tuumorigeneesiä siirtogeenisissä hiirissä [9].

Huolimatta tärkeitä todisteita hyväksi rooli INT6 ihmisen tuumorigeneesiä [10] – [12], molekyylitason perustan INT6 syövän kehittymisessä on edelleen ratkaisematta. Erittäin konservoitunut eukaryooteissa, INT6 sisältää PCI-domeeni, löytyy proteiinien 19S-sääntelyn kansi proteasomin, The COP9 signalosomi (CSN), ja eIF3 translaation aloi- kompleksi; kaikki kolme kompleksit jakaa yleistä rakenteellista samankaltaisuutta, ja INT6 on todettu, joka liittyy kuhunkin [13]. Kun yli-ilmennetään hiivassa, Int6 indusoi monilääkeaineresistenssi aktivoimalla AP-1-transkriptiotekijän [14], [15], ja ihmisen soluissa, välillä INT6 toiminto sisältää hallittu kehitys läpi mitoosin [16], sääntely proteasomin -riippuvaisella vakaus MCM7 [17] ja HIF2α [18], ja hölynpölyä välittämä mRNA rappeutuminen [19].

ilman eläinmallissa Int6 menettämisestä toiminto käytettävissä, päättelimme, että ymmärtämään

INT6

aikana kehittäminen loisi uusia käsityksen INT6 toiminto normaaleissa selkärankaisten soluissa, mikä tarjoaa uuden näkökulman INT6 toiminnon syövän muodostumisen. Täällä käytetään seeprakala ja nisäkässolut, kuvaamme ensimmäinen Int6 menettämisestä toiminnon fenotyypin eläimessä, ja linkittää Int6 kanssa signalointireitin, että kuten ne suoritetaan muiden

Int

geenejä, on kriittinen molemmille kehittäminen ja syöpä.

tulokset

Int6 on välttämätöntä zebrafish alkionkehityksen

Päätimme tutkia fysiologinen rooli zebrafish Int6 kehityksen aikana, käyttäen morfolino oligonukleotidejä (MOS) vähentää int6 proteiinia, sekä

int6

hi2470

insertionaalisiin mutanttisolullnjan (ystävällisesti N. Hopkins, A. Amsterdamissa ja S. Farrington. MIT). Seeprakala Int6 on yli 90% identtinen sen aminohapposekvenssin ihmisen INT6 (

Ensembl

ENSDARG00000002549) ja käyttämällä Int6 vasta-ainetta vastaan ​​N-päähän ihmisen INT6 [20] me todenneet, että

int6

MO johti menetykseen Int6 (kuvio 1A). Kuten INT6 on liitetty G2 /M-vaiheen solusyklikontrollin, ensin suoritetaan koko-mount immunohistokemia kanssa myöhään G2 /M vaiheessa merkki, fosfori-histoni H3, ja löytyy vain vähäisessä määrin solumääristä lopulla G2 /M vaiheessa

int6

morphant kontrolliin verrattuna (kuva S1). Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että alkioita ruiskutetaan

int6

MO oli kehitystarpeita vikoja (kuvio 1 B-N), etenkin vähennetään melanisation 2 päivää post-lannoitus (DPF:

int-6

MO n = 51/53; con MO n = 0/35;

int-6 5MM

n = 3/31); väärään pigmentti solujen häntää 3 DPF (

int-6

MO n = 46/49; con MO n = 3/30); ja epänormaali leuka morphogenesis, jossa rustoa elementtien alennettu tai sen muoto 4 ja 5 DPF (

int-6

MO n = 81/85 4 DPF, n = 76/83 5 DPF; con MO 1/67 4 DPF , n = 1/61 5 DPF). Kallon ja pigmentin kennovikojen havaittiin

int-6

morphant ja

hi2470

mutantti mukaan

int-6

voisi vaikuttaa kehitykseen hermostopienan-cell (NCC ) johdannaiset. Käytimme useita markkereita väärennöskeskukset ja niiden johdannaiset arvioida, kun nämä fenotyyppejä syntyy, ja löysi Int6 eivät näyttäneet vaadita erittely tai järjestämisestä premigratory ja vaeltavat ruston esiasteita (kuvio S2). Sen sijaan Alcian sininen rusto värjäys paljasti erityinen menetys viidestä ceratobranchial rusto elementtiä

int6

morphants, kun taas Meckelin, palatoquadrate, ja hyoid ruston olivat kaikki läsnä, vaikkakin epämuodostunut (5,5 DPF

int6

MO n = 45/53; con MO n = 1/34, Kuva 1I-L, kuva S3). Expression of

int6

mRNA uudelleen tavanomaisen kallon elementtejä

int6

morphant (

tuloksia ei ole esitetty

); ja

int6

hi2470

mutantti oli lähes identtinen kraniofakiaalisten fenotyypin (kuvio 1 M, N), joka osoittaa todellisen vaatimus Int6 sisään kallon ja kasvojen kehittämiseen.

(A) Western blot-analyysi Int6 (*) in seeprakalalla alkioiden ruiskutetaan ohjaus (con) MO tai

int6

MO. (B)

int6

morphant melanosyyttejä ovat vähemmän tummat. (C-F) Int6 vaaditaan pigmentin solun sijoittamista hännän, kuten

int6

morphants ja

int6

hi2470

mutantteja kadottanut pigmenttiä soluja hännän fin (D, nuoli ). Ympäristön valo valaisee iridophore ”tähti-kevyt” kuvio näkyy

int6

hi2470

alkioiden (F, nuoli). (G-H) 5 DPF, alkioiden pistetään con MO on selvästi nähtävissä certobranical kaaria, kun taas

int6

morphants ei ole näkyvissä certobranical kaaria, lisäksi muita poikkeavuuksia, kuten nauttimatta jäänyt ruskuaispussi, sydän ja silmien kehitystä. (SISÄÄN). Alcian sinivärjäyksen 5 dpf alkioiden on vähentynyt ceratobrancial kaaria 1 kautta 5. M, Meckelin; PQ, palatoquadrate; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial.

Menetys Int6 muuttaa MEK proteiinia ja Erk signalointi

biokemialliset todisteet fissio hiiva viittaa siihen, että Int6 on osa erikoistunut eIF3 käännös initiaatiokompleksin jotka voivat kohdistaa tiettyihin mRNA: t käännettäväksi [21]. Kun otetaan huomioon osallistumista INT6 soluproliferaatioon [16], Western blot käyttäen paneeli vasta-aineita proteiineja vastaan ​​osallistuvat solusyklin ja niihin liittyvät signalointireittien tehtiin käyttämällä lysaatit ohjaus ja INT6 siRNA transfektoitiin MDA-MB-231-soluja. 16-proteiinit tutkittiin tällä tavalla, vain MEK1 tasot muutettu INT6 siRNA transfektiolla (kuvio 2). Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [20], löysimme

INT6

-siRNA solulysaateista oli kevyemmästä INT6 proteiinia verrattuna transfektoimattomilla ja kääntää

INT6

-siRNA järjestyksessä. Olemme myös löytäneet vähenevät tuntuvasti MEK1 proteiinin tasoja, jotka korreloivat menetys INT6, kun taas BAX, tubuliinia ja aktiini-proteiinin tasot ilmestyi muuttumattomina

INT6

-siRNA transfektoiduissa soluissa (kuvio 2A). Menetys MEK1 oli nimenomaan proteiinin tasolla kuin semikvantitatiivinen-PCR osoitti normaalin tason

MEK1

mRNA

INT6

-siRNA käsiteltyjä soluja, sekä odotettua alhaisempia INT6 viesti

INT6

-siRNA transfektoiduissa soluissa (kuvio 2B). Mahdollisuus, että

INT6

saattavat vaikuttaa MAPK signalointi säätämällä MEK proteiinin tasot sai meidät tutkimaan fosforyloitumisaste Erk1 /2, alavirtaan tavoitteita Mek kinaasien, vuonna

int6

morphant seeprakalan alkioiden . Verrattuna kontrolli MO alkiot,

int6

morphant alkio lysaatit oli vähentänyt fosfo-Erk tasot (kuvio 2C). Nämä tiedot viittaavat siihen uutta toimintoa varten Int6 valvonnassa MAPK signaloinnin kehittyvässä alkiossa, mahdollisesti suorassa valvonnassa MEK1 proteiinin tasoja.

. Osteosarkooma U2-OS-solut transfektoimattomissa (U), tai transfektoitu siRNA kohdistettu

INT6

mRNA (si) tai käänteisessä järjestyksessä (R), osoittavat alenemisesta INT6 ja MEK1 proteiinia nimenomaan transfektion jälkeen

INT6-

siRNA, mutta ei vähentynyt BAX, tubuliinia tai aktiini-proteiinin tasot. (B) Semi-kvantitatiivinen-PCR-ohjelmia

MEK1

mRNA ei vaikuta päinvastaisessa järjestyksessä ja

INT6

-siRNA käsiteltyjen solujen yhdistettynä odotettua alenemisesta

INT6

viesti

INT6

-siRNA transfektoiduista soluista. c, PCR-kontrolli ilman DNA: ta. (C) Phospho-Erk tasot vähenevät

int6

morphants, kun taas ponceau tahra tunnistaa yhtäläiset lastaus proteiinia geelillä.

Int6 ja Mek reitit lähenevät kehityksen aikana

Jos Int6 ohjaa Mek aktiivisuuden kehittyvän alkion, me teorian, että tietty kehittää kudokset saattanut päällekkäisiä ilmentymisen domeeneja Int6 proteiinin ja fosfo-Erk aktiivisuutta. Todellakin, immunohistokemia vasta-aineiden kanssa Int6 ja fosfo-Erk paljasti toimialojen päällekkäisyyttä ilmaisun kehittyvässä kallon alueella 3 ja 4 DPF alkioiden (Kuva 3A-F). Vahva Int6 kudosspesifisiä ilmentymistä havaittiin myös kehittyvässä suolistossa ja linssi, alueilla, joilla oli vähän tai ei ollenkaan fosfo-Erk ilmentymistä (kuvio S4). Kun otetaan huomioon havaittu fosfo-Erk ja Int6 ilmentymistä kallon ja kasvojen alueen, me arveltu, että jotkut Int6 fenotyyppejä, kuten leuan muodostumista vika, voidaan phenocopied mukaan tukahduttamisen Erk-signalointia. Koska tulkinnasta MO fenotyyppien on hiljattain vaikeuttaa tunnistamista MO aiheuttaman p53-riippuvaista kallon vikoja [22], käytimme vaihtoehtoisen lähestymistavan – erittäin valikoiva, kliinisesti aktiivinen MEK estäjä CI-1040 [23] – vähentämään Mek signalointi seeprakalasta. Lisäsimme lääkeaineen 4 hpf pitoisuutena 0,25, 0,5, ja 1,0 uM, ja vahvisti menetys fosfo-Erk ilmentymisen Western blot -analyysillä (

tuloksia ei ole esitetty

). Erityisesti, lisäksi CI-1040 aiheuttivat annoksesta riippuvan menetys posterior rakenteiden alkion, siten, että 1,0 uM CI-1040 aiheuttivat vakavia etu-taka-(AP) akselin vika (kuvio 4A-C), sopusoinnussa rooli FGF signalointia kehittämiseen AP akselin [24]. CI-1040 aiheuttivat myös menetyksen ceratobranchial ruston elementtejä, kun taas etummainen elementit – Meckel n, palatoquadrate ja hyoid rustoa – oli läsnä, mutta epämuodostumia (kuvio 3G-J), joka on samanlainen vaikutukset nähdään

int6

morphants ja mutantit, .

(A-F). Immunohistokemiallista of Int6 ja fosfo-Erk kehittyvissä kallon ja kasvojen kudosten, laskuri värjättiin hematoksyliinillä, ja fosfori-histoni H3 osoittamaan pyöräily soluihin. (G, H) Vatsan koko mount näkymät Alcian sinistyneen nielun rustojen osoittavat menetys ceratobrancial kaaria 1-5 ja vähentämisestä Meckelin (M), palatoquadrate (PQ) ja ceratohyal (CH) rustoista 4 DPF alkioiden hoidettiin 0,5 uM CI-1040. (I, J) jaksot 4 dpf alkioiden hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätään jälkeen 0,5 uM CI-1040 käsittely paljastaa menetys CB kaaria 1-5 (suluissa). E, ethmoid levy; PC, Parachordal rustoa.

Selventämään lisäksi biologista merkitystä Int6 ja Mek signalointi, me käytti helppous, jolla signalointipolkujen voidaan muuttaa farmakologisesti tietyillä geneettinen yhteyksissä seeprakalan järjestelmässä. Me perusteltu, että jos Int6 edistää aktivoitumista Mek signalointi, sitten alkiot, joilla on alentunut Int6 pitäisi olla yliherkkiä pieniä annoksia MEK estäjän CI-1040. Vuonna ohjaus alkiot käsiteltiin 0,25 uM CI-1040, ei muutoksia etu-taka-akseliin havaittiin (kuva 4B). Lisäksi,

int6

morphants syntyy pieniä annoksia MO (0,25 ng) ei ollut muuttunut AP akselin (kuvio 4D). Sen sijaan yhdessä pienen annoksen CI-1040, pienen annoksen

int6

morphant osoitti pahasti parannettu AP akselin fenotyypin (kuvio 4E). Yhdessä nämä tiedot antaa lisää todisteita siitä, että

int6

voi olla rooli moduloivan MEK signalointi

in vivo

.

(A-C). Vain alkiot käsiteltiin 1,0 uM CI-1040, eikä 0,25 uM, osoittavat menetys posterior rakenteiden, toisin kuin (D)

int6

morphants (

int6

MO 0,25 ng). (E, F) Yhdessä 0,25 uM CI-1040, 0,25 ug

int6

MO aiheuttaa dramaattisen muuttaminen etu-taka-akseliin.

Keskustelu

Aktivoidut vuonna useimmat syövät, MAPK signalointireitin on kaikkein houkuttelevia kohteita novel syöpälääkkeiden [23]. Kuten MAPK signalointireittien, useimmat

Int

väyliä – Wnt, Fgf, ja Notch – säilytetään säätelijöitä kehitys, jotka ovat usein aktivoidaan edistää kasvaimen synnyssä. Tulosten mukaan, kuten muutkin

Int

geenituotteita,

Int6

tarvitaan selkärankaisten kehityksen (kuvio 1), osittain aikaan uusi kerros MAPK signaalitransduktion asetuksen (kuvio 2) . Kanssa monenlaisia ​​solujen toiminnan johtuvan INT6, Mekanistisen yksityiskohta tämä valvonta pysyy ymmärrettävä; varhaiset tutkimukset osoittavat vähentäminen MEK1 in

INT6

-siRNA käsitelty nisäkässoluja ei riipu proteasomin (MG Cjn,

julkaisematon data

), suoraa MEK1 sääntelyä INT6 riippuvaisten käännös mahdollisuus.

Äskettäin merkitys RAS, RAF ja MEK ihmisen tauti on jatkettu syöpää havainto, että ihmisen ituradan mutaatioita näiden geenien aiheuttavat LEOPARD-Noonan perheen oireyhtymien [25] . Yksityiskohtainen immunohistokemiallinen hiirillä ovat tunnistaneet hyvin säädeltyä, tiettyjä verkkotunnuksia erillisistä ja dynaamisen ERK fosforylaatio koko kehittämistä, myös nielun kaaria ja raajasilmuihin [26]. Ensimmäisessä Int6 proteiinin ilmentyminen tutkimukset kokonaisuutena kehittää eläinten, osoitamme, että Int6 on alueellisesti päällekkäisiä verkkotunnuksia proteiinin ilmentymisen kanssa fosfo-Erk, ensisijaisesti kallon alueella (kuva 3, kuva S4). Luotonanto biologista merkitystä näitä havaintoja, osoitamme, että ilmiasun on jaettu menetys Int6 ja inhibition Mek aktiivisuuden (kuvio 3). Lisäksi osittainen menetys Int6 aiheuttaa alkioiden olevan erittäin herkkiä lievästi vaarantamatta annoksen Mek eston, paljastaen

in vivo

vuorovaikutuksen Int6 proteiinin ilmentymisen ja kehittävän Mek-Erk signalointia (kuva 4). Jo yli-ilmentyminen Ras-Raf-Mek signalointi aiheuttaa morfologisia vikoja, tällä hetkellä siirtogeenisten linjojen jotka mahdollistavat ajallinen valvonta Mek signalointi, joka on arvokas väline syvemmälle geneettistä leikkelyn Int6-Mek-Erk suhde

in vivo

. Se on kriittinen myöhemmissä tutkimuksissa sen selvittämiseksi, Int6 kykenee ohjaamaan sekä MEK1 ja MEK2; alkuperäistä MO tutkimukset osoittavat, että MEK2 voi olla erityinen rooli melanosyyttien muuttoliikkeen (CA EEP,

julkaisematon data

), nostaa mahdollisuus, että pigmentti solujen vaeltamiseen puutteita havaittiin

int6

morphants kuvastavat myös muuttuneessa MEK signalointi.

FGF signalointi on ratkaisevaa luuston kehitykseen, esimerkkinä mutaatiot, jotka häiritsevät FGF signalointi ihmisen geneettisessä luuston poikkeavuuksia oireyhtymät [27]. Kehitysmaissa hiiren alkion, useimmat fosfo-ERK ovat päällekkäin FGF signalointidomeeneja [26]. FGF molekyylejä ovat ehdolla ylävirtaan aktivointia Int6-moderoitu Mek-Erk signalointi että muovaa kraniofakiaalisten luuranko selkärankaiset [28], [29], ja ehdokas alavirtaan tavoitteita Int6-Mek-Erk signalointi sisältää Kondrosyyttifenotyypin eriyttäminen transkriptiotekijä Sox9 , joka edellyttää Mek toimintaa transkriptionaalista aktiivisuutta [30]. Toteamme myös, että

Erk2

, mutta ei

ERK1

, on nimenomaan ilmaistu nielun kaaria kahden päivän ikäisen zebrafish alkioiden [31], mahdollisesti viittaa siihen, että Int6-Mek modulaatio kehittyvässä kallon alue voi nimenomaan signaloida tavoitteita Erk2.

suhteutetaan Int6 modulaatio Mek-Erk signalointi syövän kehitystä on uusi kulma tulevaisuuden tutkimuksessa. Yksi mahdollisuus on, että MMTV indusoitiin nisäkasvaimia, katkaistun Int-6-proteiini voi toimia onkogeenin muuttamalla MEK-ERK-signalointia. Ehdotamme, että erilaiset solujen sijainnit Int6 yhdistettynä ohimolohkon ja lokalisoinnin MEK1 /2 ja Erk1 /2, voi johtaa hienosäätöä Mek-Erk signalointireittien tietyissä kudoksissa kehityksen aikana, ja niillä voi olla merkittäviä vaikutuksia roolia INT6 kasvainten synnyssä.

Methods

Zebrafish kasvatuksessa ja morfolino tutkimukset

Zerbafish (

Danio rerio

) linjat AB, AB *, ja AB * -TPL nostettiin ja lavastettuja kuvatulla [32], [33]. MOS (taulukko 1) suunniteltiin ja hankittiin Gene Tools, LLC (USA), ja 1 ng ruiskutetaan yhden soluvaiheessa alkioita.

Fenotyyppikuvaus analyysi

Fenotyyppikuvaus analyysi oli kuvatussa: solukierron tutkimukset [34]; Alcian sininen värjäys [35]; koetinsynteesimenetelmiä ja koko-mount in situ -hybridisaatiot [36]. cDNA koettimia hermostopienasta markkereita olivat ystävällinen lahja David Raible (University of Washington, USA). Polyadenyloitu

int6

mRNA luotiin käyttäen Ambion mMessage mMachine (# 1340).

Soluviljely ja RT-PCR-analyysillä

MDA-MB-231-soluja kasvatettiin ja transfek- kuin on kuvattu [19] käyttämällä Lipofectamine (Invitrogen) ja SI-oligonukleotidien (taulukko 1; Eurogentec) lopulliseen konsentraatioon 100 nM Optimemiä (Gibco). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen eristettiin kokonais-RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen) ja yksi askel RT-PCR-reaktioissa (Qiagen) suoritetaan käyttämällä spesifisiä alukkeita (taulukko 1).

immunoblottauksella

kokosolulysaateista ja seeprakala uutteet syntyy [31], [19] ja immunohistokemia suoritettiin, kuten on kuvattu [36]. Vasta-aineita käytettiin taulukossa 2.

tukeminen Information

Kuva S1.

Cell cycle analyysi int6 morphants. Koko-mount immunohistokemia kanssa myöhään G2 /M vaiheessa merkki, fosfori-histoni H3 näyttää vain vähäisessä määrin solumääristä lopulla G2 /M vaihe int6 morphant kontrolliin verrattuna. Vastaavasti, DNA-pitoisuus mitattuna virtaussytometrialla paljastaa vain lievää laskua soluja G2 /M-vaiheen int6 morphant. Niinpä huomaamme, että menetys Int6 normaaleissa selkärankaisten soluissa (sekä muita ihmisen syövän solulinjoissa, MG Cjn julkaisematon data) ei näy tuloksen kertymistä solut G2 /M etenemistä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0000959.s001

(4,75 MB TIF) B Kuva S2.

Lateral näkemykset in situ hybridisaatio hermostopienan merkkiaineiden ohjaus ja int6 morphants paljastaen mitään muutoksia solujen määrä tai muuttoliikettä osoittamien normaalisti ilmaus dlx2 (vaiheet 6-36 hpf, tutkittiin kahden tunnin välein), eikä varhaisen merkkiaineiden NCC ja melanosyyttien, kuten sox10, CRESTIN, etana ja mitfa (24 HPF) in int6 morphants. Nämä havainnot laajennettiin tutkimalla siirtogeenisen sox10-GFP line (1) paljastaa muuttumattomana GFP-proteiinia ekspressoivien NC johdettuja soluja int6 morphants ensimmäisten 48 hpf, mutta menetys GFP ilmentävien eriytetyn nielun kaaria 3-7 3 DPF ( dataa ei esitetty).

doi: 10,1371 /journal.pone.0000959.s002

(40,41 MB TIF)

Kuva S3.

kehittäminen nielun kaaria kehittyvässä ohjaus (A-C) ja (D-F) int6 morphant eläimiä. Huomaa menetys nielun kaaria (A, kiinnike) on int6 morphants (kiinnike). Leikkeet värjättiin metyleenisinisellä. Anterior vasemmalle.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0000959.s003

(14,09 MB TIF) B Kuva S4.

immunohistokemia of Int6 ja fosfo-Erk värjäytymisen 4 DPF alkioiden. (A, B) Vaikka Int6 ja fosfo-Erk signalointi päällekkäisyyttä kallon ja kasvojen alueen, niillä on myös erillisiä kuvioita, esimerkiksi silmään ja (C, D) gut. Toteamme, että vaikka Int6 ja fosfo-Erk on päällekkäisiä verkkotunnuksia ilmaisuvapautta kallon ja kasvojen alueen Int6 värjäytymistä kallon alueella oli vahvempi kuin fosfo-Erk, ja fosfori-Erk värjäys rajoitu tiettyihin kudoksiin sisällä kraniofakiaalisten alueella. M, Meckelin; E: ethmoid levy; CH, ceratohyal; CB, ceratobrancial. Sagittaalinen leike, etummainen vasemmalle.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0000959.s004

(17,60 MB TIF) B

Kiitokset

Olemme kiitollisia N. Hopkins , A. Amsterdam ja S. Farrington varten

int6

hi2470

linja; R. Marais ja C. Marshall CI-1040; D. Raible varten DNA-rakenteita; K. Gull anti-tubuliinin vasta-aineet; E. Prichard ylimääräisiä CI-1040 havainnot; D. Faratian apua immunohistokemia; B. Morgan apunaan käsikirjoituksen valmistelu; L. Poulton kriittistä käsittelyyn käsin; ja N. Hastie ja D. Harrison varten hyödyllisiä keskusteluja.