Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, ErbB3 /HER3- voi olla hyödyllinen prognostinen markkeri peräsuolen syövän. Kasvaimet, joiden suoliston kantasolujen allekirjoitus on myös osoitettu olevan aggressiivisempi. Täällä me tutkia, ErbB3 liittyy suoliston kantasolujen merkkiaineita kolorektaalisyövässä ja jos syövän kantasolut kasvaimiin on merkitty ilmaus ErbB3. Expression ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita (LGR5, EPHB2, CD44s ja CD44v6) arvioitiin qRT-PCR ensisijainen Kolorektaalituumorien (vaiheet 0-IV) ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin 53 potilasta. Lokalisointi erbB3 EPHB2 ja KI-67 kasvaimiin tutkittiin käyttäen co-immunofluoresenssilla. Expression ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita olivat merkittävästi koholla adenoomien ja peräsuolen kasvaimet verrattuna normaaliin kudokseen. Positiiviset korrelaatiot havaittiin välillä ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita. Kuitenkin, co-immunofluoresenssi- analyysi osoitti, että erbB3 ja EPHB2 merkitty tiettyjä solupopulaatioita, jotka olivat sisällä toisensa poissulkevia kasvainten selvä proliferatiivinen potentiaali, suurin osa ErbB3 + ve-solut ovat ei-proliferatiivinen. Tämä malli muistuttaa solujen organisaation sisällä normaalin paksusuolen epiteelissä jossa EPHB2 leimattuja lisääntyvät solut asumaan krypta pohja ja ErbB3 ve solujen merkitä erilaistuneita soluja yläosassa kryptissa. Tuloksemme osoittavat, että ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita korreloi kolorektaalisyövissä. ErbB3 paikantuu erilaistuneita solu- populaatiot kasvaimia, jotka ovat ei-proliferatiivisia ja erillään syövän kantasoluja. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että kasvaimet sisältävät erillisiä varsi, proliferatiivisia ja erilaistumista osastoihin samanlainen läsnä normaalissa crypts.

Citation: Jarde T, Kass L, Staples M, Lescesen H, Carne P, Oliva K, et al. (2015) ErbB3 Positiivisesti korreloi Suoliston Stem Cell tussit mutta Merkitsee Erilliset Non Proliferative solupopulaation peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (9): e0138336. doi: 10,1371 /journal.pone.0138336

Editor: Michelina Plateroti, University Claude Bernard Lyon 1, FRANCE

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2014; Hyväksytty: 28 elokuu 2015; Julkaistu: 14 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Jarde et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tekijät myöntävät tukea tätä työtä National Health ja Medical Research Council (Australia) hankeavustuksista 1010429 HA ja PJM, ja 1.011.187 HA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu ja tappava syöpiä maailmanlaajuisesti yli 1,2 miljoonaa uutta tapausta ja 0,6 miljoonaa kuolemantapausta arvioitiin vuonna 2008 [1]. Hoitostrategioita jotka sisältävät kirurginen resektio kytketty kemoterapia ovat suhteellisen tehokkaita hoidettaessa koko kasvain massa. Kuitenkin monet syövät uudelleen esiintyä kuukausia tai vuosia. Taudin pahenemiseen on ehdotettu johtuvan kemoterapiaa resistenttien syövän kantasoluja, jotka levittävät ennen kasvaimen resektiota. Nämä multipotentteja solut voivat sitten aiheuttaa uuden kasvaimen, joka johtaa syövän uusiutumista ja etäpesäke. Viimeaikaiset edistysaskeleet peräsuolen syöpä ovat johtaneet siihen, että jokin suoliston kantasolujen markkereita, kuten LGR5, EPHB2, ja CD44 [2-4]. Normaalissa paksusuolen epiteelissä, nämä merkit on rajoitettu pohjan kryptissa jossa kantasolujen oleskella. Korkeampia ekspressiotasoja näiden markkereiden löytyy peräsuolen syövän verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen ja LGR5 ilmaisun positiivisesti korreloi määrä imusolmukemetastaaseja [4-7]. Kolorektaalisyöpä potilaalla on korkea ilmentymä suoliston kantasolujen geeni allekirjoitus, kuten LGR5 ja EPHB2, on 10-kertaa suurempi taudin uusiutumisen riski verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen [8]. Ymmärtäminen signalointireittejä ja molekyylit säätelevät syövän kantasoluja tarvitaan vahvojen prognoosi- lähestymistapoja ja uusia hoitostrategioita.

erbB reseptorityrosiinikinaasien, joka tunnetaan myös HER reseptorit, on neljä jäsentä-erbb1 /HER1 , erbB2 /HER2, ErbB3 /HER3 ja erbB4 /HER4. Nämä reseptorit ovat keskeisiä modulaattoreiden normaaliin kasvuun ja kehitykseen sekä niiden säätelyhäiriö on liitetty aloittamiseen ja etenemisessä syöpien [9, 10]. Vasta-aine-pohjainen hoitoja suunnattu erbb1 tai erbB2, pyrkinyt vähentämään niiden signaalitransduktion ominaisuudet, ovat osoittaneet kliinistä hyötyä hoidettaessa useita kasvaimia [11]. Puuttumisen vuoksi aktiivisen solunsisäisen tyrosiinikinaasialueeseen, ErbB3 jätetty huomiotta useita vuosia syövän tavoite [12]. Kuitenkin ErbB3 on äskettäin ehdotettu olevan mukana kehittynyt resistenssi hoitojen ja on tullut potentiaalinen terapeuttinen kohde johtavat erilaisilta anti-ErbB3-vasta-aineet [13]. Vaikka tarkkaa vaikutusta ErbB3 kolorektaalisyövässä ei täysin tunneta, useat tutkimukset viittaavat siihen, että ErbB3 häiriintyy kasvaimissa. Esimerkiksi ErbB3 somaattisia mutaatioita on tunnistettu 11% paksusuolen syövistä ja useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ErbB3 ilmaistaan ​​36-89% on paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [14-20]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt ErbB3-proteiinin ilmentymistä paksusuolensyöpä liittyy myös vähentynyt elossaololuku [20, 21].

In vitro

, ErbB3 knockdown vähentynyt solujen lisääntymistä, indusoi apoptoosin ja tukossa migraatio koolonkarsinoomasoluissa [21]. Samanlainen mekanismi havaittiin

in vivo

jossa ErbB3 pudotus viivästynyt kasvaimen kasvua [14]. Vaikka nämä tiedot ovat selvästi osoittavat onkogeenisessä mahdollisuuksia ErbB3, se ei tällä hetkellä tiedetä, onko ErbB3 säätelee peräsuolen syövän kantasolujen allas, joka on ehdotettu ajaa kasvaimen aloittamista ja kasvaimen uusiutumisen [8, 22].

Materiaalit ja menetelmät

Patient rekrytointi ja kudoksen keräys

Viisikymmentä kolme primaarisessa adenoomia (n = 4) tai adenokarsinoomat (n = 49) tehtiin leikkaus vuonna 2012/2013 at Cabrini Hospital (Malvern, Victoria) . Tutkimuksen hyväksyi Cabrini Human Research Ethics komitea. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Kasvaimen yksilöt ja vastaaviin normaaleihin paksusuolen kudokset tuoreeltaan tallennettu RNAlater (Qiagen) ja RNA ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi kudosten ilmentymisanalyysiä.

Soluviljely

LIM1215, LIM1899, LIM2405, LIM2550 , Caco2 ja SW480 paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa (toimitettiin lahjana Ludwig Institute for Cancer Research, Parkville, Australia) [23-26]. Solut, paitsi Caco2-solut, jotka siirrostettiin rutiinisti RPMI 1640, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco), penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco) ja glutamax (Gibco). Caco2-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 20% vasikan sikiön seerumia (Gibco), penisilliiniä /streptomysiiniä (Gibco) ja glutamax (Gibco). Soluja viljeltiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2, 37 ° C: ssa.

RNA: n uutto, cDNA valmistelu ja kvantitatiivinen RT-PCR-

kudokset saadaan resektoidun peräsuolen syöpien ja sovitettu normaalia kudosta homogenisoitiin ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Life Technologies) ja RNeasy mini -kittiä (Qiagen). Kokonais-RNA uutettiin peräsuolen syövän solut 6 solulinjoja käyttäen RNeasy mini -kittiä (Qiagen). RNA käänteistranskriboitiin käyttäen QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Triplikaattinäytteet analysoitiin LightCycler 480 koneen (Roche Diagnostics). Geeniekspressiotasot laskettiin 2

-DDCt menetelmää käyttäen geometrinen keskiarvo 2 taloudenhoito geenejä. p-ACTIN ja β-2-mikroglobuliinin kuin normalisointi, koska ne syntyy parhaat pisteet vertailussa karsinoomat normaalin limakalvon [27, 28]. Alukkeita luetellaan S1 taulukossa.

Immunofluoresenssikoe

Kiinteät kudokset parafiiniin ja leikattiin 4 um: n leikkeitä. Objektilasit deparaffinised ksyleenissä, rehydratoitiin asteittai- alkoholeja ja inkuboitiin sitraattipuskurissa (pH = 6), 10 minuutin ajan paine liesi.

peräsuolen syövän solut 6 eri solulinjoja viljeltiin 4 päivää siitä, poly-L-lysiinillä päällystetty dioja, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä asetoni 10 minuuttia.

sekä kudosleikkeiden peräsuolen syövän solulinja levyt blokattiin CAS lohkon (Life Technologies) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ennen inkubointia yön yli 4 ° primaarisilla vasta-aineilla, EPHB2 (R 2-kertainen) verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin (kuvio 1). Mediaani taso ErbB3 ilmentymisen adenokarsinoomat (0,141) oli huomattavasti korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa (0,079) (Wilcoxonin parittaista testi, p 0,0005) (kuvio 1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin adenoomien verrattuna normaaleissa kudoksissa, vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (Parilliset Student T testi, p = 0,061) todennäköisesti vähäisen määrän adenooma näytteiden tässä potilasryhmässä kohortissa (n = 4) (kuvio 2A ). Keskiarvo logaritmi kertainen muutos (0,587) oli merkittävästi erilainen kuin 0 (p = 0,009, yhden otoksen t-testi). Lineaarinen regressio mallinnus osoitti, että ErbB3-ekspressiotasot olivat merkittävästi korkeammat IV vaiheessa kasvaimissa verrattuna vaiheeseen I kasvaimia (kerroin = 1,36, (95%: n luottamusväli (CI) 0,07, 2,64), p = 0,039, tuloksia ei ole esitetty). Ei ollut muita merkittäviä suhteita ErbB3 ekspressiotasot ja kliinisiä markkereita, kuten taudin vaiheessa, laatu ja TNM vaiheissa. Lisääntynyt ilmentyminen ErbB3 vuonna ja -adenokarsinoomien verrattuna normaaleissa kudoksissa varmistettiin immunohistokemiallisesti (kuvio 2B). ErbB3 on pääasiassa lokalisoitu apikaaliseen ja basolateraaliseen solun pinnan normaalin suolen epiteelisolujen ja havaittiin solun pinnalla useimmissa kasvainten joidenkin diffuusi sytoplasman värjäytymistä ilmenee joissakin tapauksissa (S1 kuvio).

Quantitative real-time PCR tulokset on ilmaistu suhteessa täsmäsi normaalin kudoksen kunkin adenokarsinooma (n = 50). Insertit osoittavat boxplots vertaamalla absoluuttiset arvot geenin ilmentymisen normaalissa (N) ja kasvaimen (T) kudoksiin. * Merkittävä ero verrattuna ohjata kudoksiin (Wilcoxonin merkki rank testi, p 0,001).

(A): keskimääräinen ekspressiotasot (2

-ΔΔCt) kunkin geenin laskettiin suhteessa beeta-2-mikroglobuliini- ja β-aktiini ekspressiotasot by qRT-PCR normaaleissa paksusuolessa kudoksissa (n = 54), peräsuolen adenoomien (n = 4) ja peräsuolen adenokarsinoomat (n = 54) (keskiarvo ± sem). Merkittäviä eroja (*) verrattuna kontrolliin kudoksiin (Parilliset Studentin t-testillä, p 0,001). (B): n immunohistokemiallinen havaitseminen ErbB3 ja EPHB2 normaalissa paksusuolen kudoksessa, adenooma ja adenokarsinooma. Mittakaava, 50 um.

Ilmaisu useiden suoliston kantasolujen merkkiaineita tutkittiin (LGR5, EPHB2, CD44s ja CD44v6). CD44s on isoformi yhteinen kaikille CD44 variantteja ja sitä on käytetty tunnistamaan putatiivista kantasolujen useita kudostyypeissä. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että CD44v6, joka sisältää variantti eksonin 6, oli tärkeä säätelijä suoliston kantasolujen ja syövän muodostumisen niin olemme analysoineet meidän tutkimuksissa [29, 30]. LGR5, EPHB2, CD44s ja CD44v6 olivat kaikki merkitsevästi säädellään ylöspäin syövän kudoksissa verrattuna normaaleissa kudoksissa (mediaani 9,4-kertainen, 3,5-kertainen, 3,0-kertaiseksi ja 6,4-kertaiseksi, kaikki p-arvot 0,0005; yksi- otoksen t-testit kirjautunut arvojen = 1) (kuvio 1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin adenoomien verrattuna normaaleissa kudoksissa (kuvio 2A). Ilmentymistasojen LGR5, EPHB2, CD44s ja CD44v6 lisättiin vähintään 2-kertaisesti 70,8% (34/48), 72,0% (36/50), 66,0% (33/50) ja 86,0% (43/50) kasvaimen kudokset verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin (kuvio 1). Lisääntynyt ilmentyminen EPHB2 vuonna ja -adenokarsinoomien verrattuna normaaleissa kudoksissa varmistettiin immunohistokemiallisesti ja selvästi lokalisoitu epiteelin kasvainkudoksen (kuvio 2B). EPHB2 ekspressiotasot olivat merkittävästi korkeammat vaiheessa III, mutta ei vaiheessa IV, kasvaimet verrattuna vaiheeseen I kasvaimia (kerroin = 1,47 (95% CI 0,30, 2,64), p = 0,015). Ei ollut muita merkittäviä suhteita ilmaus kantasolujen ja kliinisten merkkiaineiden.

ErbB3 positiivisesti korreloi suoliston kantasolujen merkkiaineita peräsuolen ja paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjoissa

väliset korrelaatiot mRNA kertamuutoksia ( adenokarsinooma

vs

normaali) merkkiaineiden kuvattu taulukossa 1 arvioitiin käyttäen Spearmanin testi. Suoliston kantasolujen merkki kertamuutoksia (LGR5, EPHB2, CD44s ja CD44v6) olivat positiivisesti välinen korrelaatio (taulukko 1). Mielenkiintoista on, että positiivinen korrelaatio havaittiin välillä ErbB3 ja kantasolujen merkkiaineita LGR5, EPHB2 ja CD44v6 (taulukko 1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun adenooma ja adenokarsinooma yhdistettiin (S3 taulukko).

qRT-PCR-analyysi EPHB2 ja ErbB3 ekspressiotasot suoritettiin myös käyttäen 6 kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat. Sekä ErbB3 ja EPHB2 havaittiin eri ekspressiotasot näissä solulinjoissa (kuvio 3A). Tärkeintä on, ja kun havaittiin ensisijaisen kasvaimia, ilmaus ErbB3 ja EPHB2 korreloi positiivisesti (kuvio 3B, Pearson korrelaatio testi, rho = 0,999, p 0,0001).

(A): Keskimääräinen lauseke tasot (2

-ΔΔCt) ErbB3 ja EPHB2 laskettiin suhteessa beeta-2-mikroglobuliini- ja β-aktiini ekspressiotasot by qRT-PCR 6 eri peräsuolen syövän solulinjoissa (n = 3, keskiarvo ± sem). (B): positiivinen lineaarinen korrelaatio ErbB3 ja EPHB2 ekspressiotasot (Pearson korrelaatio testi, rho = 0,999, p 0,0001).

Paksusuolisyöpä muistuttaa normaalia paksusuolikudos

Positiivinen korrelaatioita löytyy RNA-tasolla välillä ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita sai meidät tutkimaan mahdollisia kolokalisaation ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita kasvaimissa. Useita vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja LGR5 (Sigma-Aldrich, HPA012530; Abgent, AP2745, Abcam, ab75850), CD44 (Abcam, ab41478) ja EPHB2 (R kuvio 5B). 60% (9/15) kasvaimia oli vastavuoroinen ilmaus EPHB2 ja ErbB3 (kuvio 5A, kasvaimen 6-14, kuvio 5C ja 5D). Yksi kasvain leimasi puuttuminen EPHB2 + solujen ja esiintyy suuri populaatio kaksinkertaisen negatiivisia soluja (EPHB2- /ERBB3-, 85,1% syöpäsolujen) (kuvio 5A ja 5E). Huomattavaa on, että kaikki kasvaimet tutkittiin sisälsi kaksinkertainen negatiiviset solut (26,4% syöpäsoluja), jotka vaihtelevat 6,8%: sta 85,1% soluista kohti kasvain. Läsnäolon soluissa, jotka koekspressoivat EPHB2 ja ErbB3 oli harvinaista (2,1% kasvainsoluja). Ilmaisu ErbB3 tutkittiin myös 6 peräsuolen syövän solulinjoissa immunofluoresenssilla (S2A kuvio). Mukaisesti qRT-PCR tietoja, ErbB3 havaittiin LIM1215, LIM1899, Caco2 ja SW480 syöpäsoluja. Tärkeää on, että ilmaus ErbB3 oli heterogeeninen näissä solulinjoissa merkitty läsnäolo ErbB3 + ja ERBB3- soluja. Lisäksi solulinjoja, jotka sisälsivät havaittavan ja vankka ErbB3 solupopulaation (LIM1215 ja LIM1899), EPHB2 ja ErbB3 merkitty erillisiä solupopulaatioiden (S2B kuvio), jota on havaittu tutkimuksessamme ihmisen paksusuolen ja peräsuolen kasvaimia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että erillisiä solupopulaatioita löytyy näissä solulinjoissa.

(A): Taajuus EPHB2 + ja ErbB3 + solujen kolorektaalisyövässä (n = 15). (B, C, D, E): Co-immuunifluoresenssivasta havaitseminen EPHB2 (vihreä) ja ErbB3 (punainen) edustavissa kolorektaalisyövässä näytteitä vastavärjättiin DAPI (sininen). Huomaa, kun läsnä on yksi EPHB2- /ErbB3 + solu (valkoinen nuoli) kasvaimen rikastettu EPHB2 + /ERBB3- soluja (B). Huomaa läsnä kaksinkertainen negatiivisia soluja (valkoinen nuoli) kasvaimen sisältää sekä EPHB2 + /ERBB3- ja EPHB2- /ErbB3 + solupopulaatioiden (D). Mittakaava, 50 um.

Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että EPHB2 ja ErbB3 tunnistaa eri alatyyppiä peräsuolen syöpä, kuten kantasolujen rikastetun kasvaimet (EPHB2 + /ERBB3-), kasvaimia, jotka sisältävät toisiaan poissulkevia osastoja (EPHB2 + /ErbB3 +) tai kasvaimet, joilta puuttuu EPHB2 kantasolujen (EPHB2-).

ErbB3 + syöpäsolut ovat pääasiallisesti ei proliferatiivinen ja eriytetty toisin EPHB2 + syöpäsoluja

Jos haluat määrittää proliferatiivinen tila ErbB3 + syöpäsolujen ensisijainen peräsuolen syöpä, kudokset kolminkertainen värjättiin KI-67, joka on tunnettu solujen lisääntymistä markkeri, ErbB3 ja EPHB2. Yllättäen ErbB3 + syöpäsolut harvoin samanaikaisesti paikallistaa KI-67 tumavärjäystä (kuvio 6A ja S3 kuvassa). Sitä vastoin saman kasvaimen, EPHB2 + solut olivat pääasiassa positiivisia KI-67 (kuvio 6A). Double negatiiviset solut (EPHB2- /ERBB3-) olivat myös KI-67 positiivisia. Samanlaisia ​​havaintoja todettiin lukuisia kasvaimia (kuvio 6B ja S4 kuvassa). Kiinnostavaa kyllä, nämä havainnot olivat muistuttaa proliferatiivisen tilan normaalin paksusuolen koska KI-67 + lisääntyvät solut havaittiin vain alaosassa krypta, jossa EPHB2 + solut lokalisoitu (S5 kuvio).

(A ja B): Detection of EPHB2 (vihreä), ErbB3 (punainen) ja KI-67 (harmaa) samanaikainen immunofluoresenssilla kaksi edustavaa kolorektaalisyövässä näytteitä (DAPI, sininen). (C): jakautuminen P-H3 + proliferatiivinen solujen 4 eri solupopulaatioiden 8 peräsuolen syövän näytettä. (D ja E) Detection of EPHB2 (vihreä), ErbB3 (punainen) ja P-H3 (harmaa) samanaikainen immunofluoresenssilla kaksi edustavaa kolorektaalisyövässä näytteitä (DAPI, sininen). Mittakaava, 50 um.

Vahvista ei-proliferatiivinen luonne EPHB2- /ErbB3 + soluja, toinen leviämisen merkki (P-H3), joka tunnistaa mitoosi soluja, käytettiin 8 peräsuolen syöpä näytettä joka sisälsi vahvan ErbB3 + solupopulaation (perustuen kuvio 4A). Seuraavat co-immunofluoresenssi- ja kuva-analyysi, määrä P-H3 + solujen neljän eri solupopulaatioiden (EPHB2 + /ErbB3 +; EPHB2 + /ERBB3-; EPHB2- /ErbB3 +; EPHB2- /ERBB3-) kvantifioitiin (100-200 P -H3 + solua per kasvain). 70,0% (vaihteluväli 57,5%: sta 81,8%) P-H3 + solut sijaitsevat EPHB2 + /ERBB3- väestö, kun taas sitä vastoin vain 8,8% (2,5-14,0%) P-H3 + solut sijaitsevat EPHB2- /ErbB3 + solupopulaatio (kuvio 6C). P-H3 + solut olivat harvoin kaksinkertainen positiivisia EPHB2 ja ErbB3 (5,6%) (kuvio 6C). Edustavia kuvat osoittavat lokalisaatio P-H3 + solujen EPHB2 + /ERBB3- solupopulaation 2 eri kasvaimissa on esitetty kuvassa 6D ja 6E.

tutkimiseksi eriytetty asema EPHB2- /ErbB3 + solujen peräsuolen syöpä, kudokset kolminkertainen värjättiin MUC2, markkeri eriytetty pikarisoluja, ErbB3 ja EPHB2. Mielenkiintoista on, että suurin osa MUC2 + peräsuolen syövän solut olivat myös EPHB2- /ErbB3 + (kuvio 7A). Samanlaisia ​​havaintoja todettiin lukuisia kasvaimia (kuvio 7B ja S6 kuvassa). Kuitenkin alaryhmä EPHB2- /ErbB3 + syöpäsolut eivät olleet positiivisia MUC2 näissä kasvaimissa (kuvio 7A ja 7B, valkoiset nuolet). Lisäksi, peräsuolen kasvaimia, jotka eivät sisällä mitään MUC2 + soluja oli edelleen EPHB2- /ErbB3 + solupopulaation (tietoja ei esitetty).

Detection of EPHB2 (vihreä), ErbB3 (punainen) ja MUC2 (harmaa), jonka co-immunofluoresenssilla kaksi edustavaa kolorektaalisyövässä näytteitä (DAPI, sininen). Huomautus läsnäolo EPHB2- /ErbB3 + soluja (valkoinen nuoli), jotka ovat MUC2-. Mittakaava, 50 um.

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että ErbB3 + peräsuolen syövän solut ovat pääasiallisesti ei proliferatiivisia ja eriytetty, toisin kuin EPHB2 + soluihin.

Keskustelu

jotta voitaisiin määrittää, onko ErbB3 signalointi on rooli säätelyssä peräsuolen syövän kantasoluja, ilmaus ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita tutkittiin useita Kolorektaalituumorien, kuten alkuvaiheen adenoomien ja karsinoomien (vaihe I-IV). Löysimme merkitsevää nousua ErbB3 mRNA tasojen adenoomien ja peräsuolen syöpien verrattuna normaaleihin kudoksiin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin LGR5, EPHB2, CD44s ja CD44v6 mukaisesti aikaisempien tutkimusten. [4, 5, 8] Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että ilmaus ErbB3 ja kantasolujen merkkiaineita ovat koholla koko asteittain syövän. Mitä mielenkiintoisinta, olemme päättäneet, että ErbB3 ja useat molekyylit, jotka merkitsevät kantasolujen populaatioiden positiivisesti korreloi RNA-tasolla kolorektaalisyövässä.

Tämä havainto sai meidät tutkimaan, jos ErbB3 oli läsnä kantasolupopulaatiosta kasvaimiin. Analysoimme onko EPHB2, määritellyn kantasolujen markkeri, co-paikallistaa ErbB3 ilme kolorektaalisyövässä kudoksissa. Tämä paljasti kolme erilaista syöpää osajoukon perustuu i) rikastamista EPHB2 + solujen ja puute ErbB3 + solujen, ii) puuttuminen EPHB2 + solujen tai iii) läsnäolo sekä ErbB3 + ja EPHB2 + syöpäsolun populaatiot. Myöhemmässä osajoukko, ErbB3 ja EPHB2 merkitty eri toisensa poissulkevia solupopulaatioiden erottuva proliferatiivinen potentiaali, suurin osa ErbB3 + solujen ollessa ei-proliferatiivinen. Yllättäen nämä tulokset osoittivat, että vaikka oli positiivinen korrelaatio ilmaisu ErbB3 ja EPHB2 RNA-tasolla, nämä kaksi markkereita ei ollut läsnä samoissa soluissa. Mielenkiintoista on, että ilmentyminen ErbB3 ja EPHB2 erillisiin verkko-havaittiin normaalissa paksusuolen epiteelissä, jossa EPHB2 merkitty kantasolujen ja proliferatiivinen esiasteita on crypt pohjassa ja ErbB3 merkitty ei-proliferatiivinen eriytetty soluosastoon yläosassa suoliston kryptissa. Tuloksemme osoittavat, että useimmat kolorektaalisyövissä tarkastelimme muistuttavat normaalia kudosta kanssa erilliseen solun osastojen ja proliferatiivinen tila ja että kaksi EPHB2 /ErbB3 allekirjoitus voi tunnistaa kasvaimia tämän morfologia. Samanlainen ilmaus on havaittu kolorektaalisyövissä käyttäen EPHB2 ja sytokeratiinia 20 kuin differentiaatiomarkkeri [8, 31]. Mielenkiintoista, sytokeratiinista 20 ilmentymistasot alassäädetty kolorektaalisyövässä kudoksissa verrattuna normaaleissa kudoksissa, toisin kuin ErbB3 meidän tutkimuksissa, mikä viittaa monimutkaisempaa rooli ErbB3 [8]. Yhdenmukainen ilmentymisprofiili ErbB3, ilmentymisen tasojen PMEPA1, joka on markkeri terminaalisesti erilaistuneita soluja yksinomaan löytyy pinnalla paksusuolen epiteelin kryptien, lisätään peräsuolen kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin [32], mikä viittaa siihen, että molekyylit, jotka merkitsevät eriytetty solupopulaatio voidaan myös koholla joissakin tapauksissa aikana peräsuolen syövän syntymistä.

Tuloksemme osoittavat, että kohdistaminen ErbB3 kolorektaalisyövässä käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat parhaillaan kehitteillä [13], voivat kohdistaa erilaistuneet solut ja edistää poistaminen kasvain irtotavarana mutta ne eivät saa vaikuttaa proliferatiivinen syövän kantasolujen kaltaisia ​​solupopulaation. Tämä vielä kokeellisesti testata. Tuhoaminen eriytetty peräsuolen syövän solut voivat olla hyödyllisiä, koska nämä solut ovat äskettäin kuvattu tärkeä välittäjä vastustuskyvyn hoidon [33] ja voi suojata kasvain aloittamista soluja kemoterapiaa agentti irinotekaani johtuen niiden huumeiden heitto- valmiuksia [33]. Olisi mielenkiintoista määrittää, eriytetty solupopulaation kuvata Emmink

et al

. päällekkäinen ErbB3 + eriytetty väestöstä. Lisäksi nämä ei-proliferatiivinen ErbB3 + solut voivat silti olla oma roolinsa aikana kasvaimen uusiutumisen kuin se on raportoitu, että postmitoottisia suoliston soluista voidaan de-erilaistua, hankkivat kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia ja aloittaa tuumorigeneesiä joissakin tapauksissa [34].

Kohonneita ErbB3 ilmaisun on liittynyt vähentynyt elossaololuku kolorektaalisyövässä [20, 21]. Tuntuu ratkaisevan tärkeää määritellä, ovatko nämä ErbB3 + solut ovat tärkeitä tekijöitä syövän synnyn ja toimivatko ne tukemalla liittyvän kantasolun väestölle tai suoraan edistää vähenemiseen elossaololuku.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että kohonnut ilmentyminen ErbB3 ja suoliston kantasolujen merkkiaineita ovat yhteisiä piirteitä kolorektaalisyövissä ja tunnistaa kasvaimia, jotka sisältävät eriytetty ei-proliferatiivinen solupopulaatioiden eroaa proliferatiivinen alueilta, joilla syöpä kantasolut sijaitsevat. Perustuen ekspressioon EPHB2 kantasolujen markkeri ja ErbB3 differentiaatiomarkkeri, me alustavasti ehdottaa, että paksusuolen ja peräsuolen syöpiä on järjestetty i) varsi-like cell rikastettu kasvaimia, ii) eriytetty kasvaimia, jossa on varsi-, kuten soluosastoon tai iii), josta puuttuu EPHB2 kantasolujen.

tukeminen Information

S1 Kuva. ErbB3 on pääasiassa sijaitsee kalvon adenokarsinoomia.

Immunohistokemiallinen tunnistus ErbB3 7 peräsuolen syövän näytteet osoittavat hallitseva vahvan kalvon värjäytyminen (A-D) tai molemmat diffundoitua soluliman ja kalvon värjäys (E-G). Mittakaava, 50 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138336.s001

(TIF)

S2 Kuva. ErbB3 on heterogeenisesti ilmaistaan ​​peräsuolen syövän solulinjoissa.

(A): Immunofluoresoivat havaitseminen ErbB3 (punainen) 6 eri syöpäsolulinjoissa vastavärjättiin DAPI (sininen). (B): Expression of ErbB3 (vihreä) ja EPHB2 (punainen) in LIM1215 ja LIM1899 syöpäsolulinjoissa vastavärjättiin DAPI (sininen). Mittakaava, 50 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138336.s002

(TIF)

S3 Fig. ErbB3 positiiviset peräsuolen syöpä solut ovat pääasiassa ei-proliferatiivinen.

Co-immuunifluoresenssivasta havaitseminen KI-67 (vihreä) ja ErbB3 (punainen) kahdessa eri kolorektaalisyövässä näytteitä vastavärjättiin DAPI (sininen). Mittakaava, 50 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138336.s003

(TIF)

S4 Fig. ErbB3 positiivisia ja peräsuolen syövän solut ovat pääasiassa ei proliferatiivinen toisin EPHB2 positiivisia soluja.

Co-immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen KI-67 (vihreä), ErbB3 (punainen, A, C, E) ja EPHB2 (punainen, B, D, F) kolmessa eri peräsuolen syövän näytteitä, DAPI (sininen). Mittakaava, 50 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138336.s004

(TIF)

S5 Fig. EPHB2 positiiviset solut ovat KI-67 positiivinen normaaleissa ihmisen paksusuolessa.

Co-immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen EPHB2 (vihreä) ja KI-67 (punainen) normaalissa paksusuolen kudoksessa (DAPI, sininen). Huomautus puuttuessa KI-67-positiivisia soluja on eriytetty osastoon (valkoinen nuoli). Mittakaava, 50 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0138336.s005

(TIF) B S6 Fig.