Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yhteinen maligniteetit mutta nykyinen hoitomenetelmät kokeneille CRC ovat tehottomampia. Siten uusia terapeuttisia lähestymistapoja tarvitaan kipeästi. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää osallistuminen ydin- proteiinikinaasi CK2 α-alayksikköä (CK2α) kasvaimen etenemistä ja ennustetta ihmisen CRC.

Menetelmät /Principal Havainnot

Ilmentymistasoja ydinaseiden CK2α analysoitiin 245 peräsuolen kudoksissa potilailla, joilla on CRC immunohistokemiallisesti, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR ja Western blot. Olemme korreloi ilmaisu tasoilla ennusteeseen viittaavia parametreja ja ennusteen ihmisen CRC potilailla. Yliekspressio ydinaseiden CK2α korreloi merkitsevästi syvyys invaasio, imusolmukestatuksesta, American sekakomitean Cancer (AJCC) lavastus, eriytyminen, ja hermoa hyökkäystä. Potilaat, joilla on korkea ekspressiotasot ydin- CK2α oli huomattavasti huonompi yleistä eloonjäämisaste verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen ekspressiotasot ydinaseiden CK2α. Monen variate Coxin regressioanalyysiä, yliekspressio ydin- CK2α oli osoittautunut riippumaton ennustetekijöitä merkkiaine CRC. Lisäksi, DLD-1 ihmisen paksusuolen syöpäsoluja käytettiin kuin solujen malli tutkia roolia CK2α solun kasvuun, ja ilmentymistä CK2α DLD-1-soluissa estettiin käyttämällä siRNA tekniikkaa. Tulokset osoittivat, että CK2α erityisiä siRNA hoito johti kasvun estoon.

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä yliekspressio ydin- CK2α voi olla hyödyllinen markkeri lopputuloksen ennustaminen potilaalla on CRC.

Citation: Lin KY, Tai C, Hsu JC, Li CF, Fang CL, Lai HC, et al. (2011) yli-ilmentyminen Nuclear proteiinikinaasi CK2 α katalyyttinen alayksikkö (CK2α) kuin huono Prognosticator Human peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (2): e17193. doi: 10,1371 /journal.pone.0017193

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 11 elokuu 2010; Hyväksytty: 25 tammikuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tukea (DOH98-TD-I-111-TM006) Department of Health, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) osuus noin 1 miljoonaa uutta tapausta vuonna 2002 (9,4% koko maailman), ja toisin kuin useimmat sivustot, numerot eivät olleet niin erilaisia ​​miehillä ja naisilla (suhde, 1.2:1) [1]. Mitä esiintyvyys, CRC sijoittuu neljänneksi taajuus miehillä ja kolmanneksi naisilla. On ainakin 25-kertainen vaihtelu esiintyy CRC maailmanlaajuisesti. Suurin esiintymistiheys hinnat ovat Pohjois-Amerikassa, Länsi-Euroopassa, ja, miehillä erityisesti, Japani. Esiintyvyys on yleensä pieni Afrikassa ja keskitason eteläosissa Etelä-Amerikassa. Taiwanissa, CRC riveissä toiseksi useimmin diagnosoitu maligniteetti ja aiheuttaa yli 10000 kuolemantapausta vuosittain (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; näytetty joulukuussa 2008). Huolimatta nykyisten kirurgisten tekniikoiden ja kemoterapiaa, jotka ovat tehneet merkittäviä parannuksia, paranemisasteella kehittyneen CRC edelleen alhainen ja sairastuvuus on korkea [2]. Niinpä edistysaskeleet tämän sairauden hoitoa ovat todennäköisesti peräisin parempi ymmärrys sen synnyssä ja biologiset ominaisuudet.

prognoosi vasta diagnosoitu CRC pääasiassa riippuvainen Yhdysvaltojen sekakomitean Cancer (AJCC) vaihe määräytyy syvyys invaasio, osallistuminen imusolmukkeiden ja kaukana etäpesäkkeitä [3], [4]. Kuitenkin itse asiassa on hyvin tunnettua, että potilaat, joilla on sama AJCC vaiheessa CRC näyttö selviytymisen heterogeenisyys, ja jotkut potilaat, joilla suhteellisen lyhyistä eloonjääntiajoista. Niinpä tunnistaminen lupaavammalta ennustetekijöiden jotka ovat todellakin hyvin ennustavia CRC potilaalla, joille kirurginen hoito on pakollista. Useat tutkimukset ovat osoittaneet roolin että geneettiset muutokset voivat olla kehittämiseen ja etenemiseen CRC [5], [6]. Molecular patologian voi olla hyödyllistä ei vain ymmärtää taudin synnyssä, mutta myös antaa hyödyllisiä prognostisten molekyylimarkkereita. Jotkut ehdottivat biologiset ennustavat tekijät sisältävät yli-ilmentyminen verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF), tehostajaa zeste homologin 2 ja transglutaminaasivasta 2 [7] – [9].

proteiinikinaasi CK2 (aiemmin tunnettu nimellä kaseiinikinaasi 2) on erittäin konservoitunut seriini /treoniini-kinaasi. Se jaetaan kaikkialle eukaryoottisissa organismien, jossa se esiintyy useimmiten esiintyvän tetrameerinen komplekseja, jotka koostuvat kahdesta katalyyttisestä alayksiköstä (αα, α ’α’ tai αα ’) ja kaksi sääntelyyn β-alayksiköitä [10], [11]. CK2 on erittäin monikäyttöinen proteiinikinaasi, jossa laaja valikoima yli 300 substraatteja, joista monet ovat kriittisesti mukana prosessissa solujen kasvua, lisääntymistä ja erilaistumista [12], [13]. Häiriöt

Saccharomyces cerevisiae

geenit koodaavat molemmat CK2 katalyyttinen alayksiköistä johtaa epäonnistumiseen kehitykseen, ja osoittaa, että pudotuspelit koodaavan geenin sääntely CK2 β-alayksikköä hiirillä on myös tappava entisestään korostanut CK2 ylläpitämisessä solujen elävyyden normaalissa solussa elämään ja alkionkehityksen aikana [14], [15]. Vuonna β-alayksikön, tiettyjen kysteiinitähteet voivat olla rooli ankkurointi kinaasi ydinaseiden rakenteita. CK2 toiminta voi olla rooli solujen kasvun kautta signalointi keskeisiä alueita ydin- matriisin ja chromatin rakenteita [16]. Useita kasvuärsykkeille voi parantaa CK2 ydinvoiman shuttling, jotta suurempi tumaanohjaussignaali havaitaan kasvainsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin [17], [18].

Lisäksi CK2 säätelyhäiriötä kasvainsoluissa voi vaikuttaa apoptoottista aktiivisuutta ja parantaa solujen selviytymistä [19]. CK2 voi käyttää antiapoptoottisten vaikutuksia eri mekanismien kautta. Esimerkiksi, CK2 estämään apoptoosin suojaamalla Bid päässä tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) aiheuttama kaspaasi-8-välitteinen hajoaminen [20]. CK2 on mukana myös fosforylaation useita proteiineja, jotka liittyvät apoptoosin, mukaan lukien p53and tumatekijä-KB: n [21], [22]. Lisäksi Fas-reseptorin välittämä solukuolema säätelee CK2 ilmaisun [23].

taso CK2 näyttää säädeltyä normaaleissa soluissa, vastustavat muutosta niiden luontaisten taso CK2 [24]. Lisääntyvä näyttö osoittaa, että CK2 entsyymi on osa sääntelyn proteiinikinaasi verkostoja, jotka ovat mukana useissa näkökohtia solutransformaatioon ja syöpä [25]. Kohonneita CK2 tasolla ja toiminta ovat johdonmukaisesti havaittu erilaisissa ihmisen syövissä, kuten rintarauhasen, pään ja kaulan, ja munuaissyövän [26] – [28]. Yliekspressio sekä varoituksia merkitys CK2 α-alayksikön on todettu vain keuhkosyövän, eturauhassyövän ja leukemia [29] – [31]. Tietääksemme ilmaisun ja ennustetekijöiden merkitys ydin- CK2α ihmisen CRC on vielä tuntematon. Tavoitteet Tämän oli tutkia suhdetta ydin- CK2α ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia parametreja ja ennusteen ihmisen CRC potilailla. Olemme myös arvioineet vaikutuksia siRNA-inhiboitu CK2α ilme leviämisen koolonkarsinoomasoluissa.

Tulokset

Perustietojen

Kaksi satoja ja neljäkymmentäviisi CRC potilasta, 139 urosta ja 106 naarasta, otettiin tässä tutkimuksessa. Ikä vaihteli 21-88 vuotta täyttäneistä aluksi diagnoosi (keskiarvo 64 vuotta). Perustuu AJCC luokitusta oli 36 vaiheessa I potilaat, 98 vaiheessa II potilaille, 110 vaiheen III potilaita, ja 1 vaihe IV potilaalle. Seuranta niille potilaille vaihteli +2,93-123,97kuukausi (keskiarvo 68,3 kuukautta). Seuranta-aikana, 69 potilasta kuoli CRC. Leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita ei esiintynyt näillä potilailla.

Nuclear CK2α ilmentyminen säädeltiin ja liittyy useita ennusteeseen viittaavia parametreja CRC

Tutkimme ilmaisua ydinvoiman CK2α 245 CRC potilailla immunohistokemiallisesti ja neljä potilasta Western blotilla. Tulokset osoittivat, että ydinaseiden CK2α ilmaisu oli suurempi tuumorikudoksissa kuin ei-tuumorikudoksissa (kuvio 1). Lisäksi, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että ekspressio CK2α kasvoi merkittävästi kasvainkudoksissa verrattuna ei-tuumorikudoksissa (taulukko 1). Kuten taulukosta 2, ydin- CK2α ilme oli tilastollisesti merkitsevä korrelaatio syvyys invaasio (

P

= 0,008), imusolmukestatuksesta (

P

0,001), AJCC lavastus (

P

0,001), eriytyminen (

P

= 0,011), ja hermoa invaasio (

P

= 0,041). Edustaja mikrovalokuvat ydin- CK2α ilmaisujen eri parametreja kuvassa 2. Ei ollut merkittävää yhteyttä välillä ydin- CK2α ilmaisun ja ikä, sukupuoli, ja verisuonten invaasio.

Nuclear CK2α ilmentymistä ei ollut kasvainta ja tuumorikudoksia , analysoitiin immunohistokemiallisesti, oli esitetty paneeli A ja B, vastaavasti. Suurennus: 400 x. Paneeli C. Nuclear CK2α ilmaisun neljässä ei ollut kasvainta /kasvaimen parit tutkittiin Western blot.

Suurennus: 400 x.

yli-ilmentymän ydinaseiden CK2α itsenäisenä prognostinen merkkiaine CRC

korrelaatiot kliinisten tulosten kanssa ydin- CK2α ilme on esitetty kuvassa 3. Inferior kokonaiselossaoloaika oli merkitsevästi yhteydessä yliekspressio ydin- CK2α (keskiarvo merkintöjä indeksi 40%,

P

0,0001). Potilaat, joilla on korkea ekspressiotasot ydin- CK2α oli kymmenen vuoden yleistä eloonjäämisaste 22,2% verrattuna 72,5% potilailla, joilla on alhainen ekspressiotasot ydinaseiden CK2α.

Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. Merkitsevyystaso:

P

0,05.

uni-variate analyysi prognoosi- merkkiaineiden CRC on koottu taulukkoon 3. imusolmukestatuksesta (

P

= 0,025) ja yliekspressio ydin- CK2α (

P

0,0001) korreloi merkittävästi eloonjäämiseen.

Tämä yhdistys välillä yliekspressio ydin- CK2α ja selviytymisen pysyi jälkeenkin valvoa muita tunnettu prognostisia markkereita usean variate analyysi (taulukko 4). Monen variate analyysi, yliekspressio ydin- CK2α oli ennusteen itsenäinen (riskisuhde = 4,53, 95% luottamusväli = 2,46-8,32,

P

0,0001).

Effect of kaataa of CK2α paksusuolen syövän soluproliferaatioon

vaikutuksen määrittämiseksi CK2α ilmaisun DLD-1 ihmisen paksusuolen syöpä solujen lisääntymistä,

CK2

α-geeni, joka pudotettiin transfektoimalla CK2α- erityisiä siRNA. Salatut siRNA: t käytettiin verrokkeina. Jälkeen CK2α-spesifisiä siRNA hoitoa, ilmentymisen taso ydin- CK2α DLD-1-soluissa oli merkittävästi inhiboitu (kuvio 4A). Kuitenkin salattu siRNA aiheutti merkittävää estoa (kuvio 4A). Laskimme pesäkkeiden lukumäärä siRNA-käsitellyn ja un-käsitellyn DLD-1-soluissa. Siirtomaat CK2α-specific siRNA-käsitellyt solut olivat merkittävästi vähemmän kuin YK-käsiteltyjen ja salattuja siRNA käsiteltyjä soluja (laski 33% (päivä 8) ja 57% (päivä 14) niistä un-käsiteltyjen solujen, vastaavasti ) (kuvio 4B). Edustaja mikrovalokuvat näytettiin kuviossa 4C. Tulokset osoittivat rooli CK2α edistämisessä solujen lisääntymisen ja on sopusoinnussa kliinisiä tietoja edellä kuvatulla tavalla.

Paneeli A. Nuclear CK2α ilmaisun siRNA käsitelty ja un-käsitellyn DLD-1 koolonsyöpäsoluihin tutkittiin Western blot-analyysi. Paneeli B. histogrammit edustavat soluproleferaatiomäärityksessä tulosten perusteella keskimäärin kolmen erillisen kokeen. * Merkitsee

P

0,001 verrattuna un hoidetuista DLD-1-soluissa. Paneeli C. Edustaja mikrovalokuvat.

Keskustelu

Kohonnut CK2α mRNA-tasolla on raportoitu useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien melanooman ja keuhkosyövän [32], [33]. Huolimatta näistä tutkimuksista, kliiniset tiedot käsitellään konkreettisena ilmentymänä CK2α proteiinitasolla ovat vähissä. Eräs tuore tutkimus osoitti kohonneita CK2α proteiinin ilmentyminen eturauhassyövässä [30]. Tietääksemme tämä on ainoa tutkimus käyttäen immunohistokemiallisesti arvioimiseksi CK2α ilmentyminen ihmisen syövissä. Ilmaisu ydin- CK2α ihmisen CRC on vielä tuntematon. Esillä olevassa tutkimuksessa ekspressiotasot ydinvoiman CK2α peräsuolen kudoksissa 245 potilasta, joilla CRC arvioitiin, ja tulokset osoittivat, että ydinaseiden CK2α ilmaisu oli korkeampi kasvaimen peräsuolen kudoksiin kuin ei-kasvain peräsuolen kudoksiin.

lisäksi tuloksemme osoittivat CK2α tumakertymään CRC, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimus eturauhassyövässä. Mekanistisena perusteella CK2α tumakertymään on tällä hetkellä epäselvä, mutta koska se CK2 katalyyttinen alayksikkö, sen jatkuva läsnäolo tumassa ehkä paitsi liittyä lisääntynyt proliferatiivista kapasiteettia dedifferentoituneiden kasvainsolujen vaan myös niiden merkitty vastustuskykyä apoptoottisia signaaleja. Mikä voisi olla toiminnallinen seurausta ydinvoiman kertymisen CK2 syöpäsoluissa? Yhdessä tutkimuksessa suoritetaan Scaglioni et al. osoittivat, että CK2 fosforyloituu promyelosyyttinen leukemia proteiinin (PML, kasvain vaimennin) ja kohdennetut sen hajoamista proteasomista [34]. Menetys kriittisen CK2 fosforylaatiota sivusto PML johti vakauttaminen tämän proteiinin lisääminen PML: n indusoiman apoptoosin. Lisäksi ihmisen ei-pienisoluisen keuhkosyövässä, on käänteinen suhde PML ilmaisun ja CK2 toimintaa. Koska PML on ydinaseeton matriisi liittynyt proteiini, ydinvoiman kertyminen CK2 voi olla toiminnallisesti merkityksellisiä inaktivoimaan kasvain esti toimintoja PML. Toisessa tutkimuksessa, CK2 on hiljattain kuvattu keskeinen säätelijä tuumorisuppressorigeenin NKX3.1 LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Kuten PML todettiin, että esto CK2 aktiivisuus LNCaP-solujen estäjä apigeniiniä johti nopea lasku NKX3.1 kertymistä, joka pelastettiin proteasomin esto [35].

Nykyisessä tutkimuksessa olemme osoitettu ensimmäistä kertaa, että yliekspressio ydinvoiman CK2α CRC kudoksissa läheisesti korreloi useiden ennusteeseen viittaavia muuttujat, kuten syvyys kasvaimen invaasio, imusolmuke etäpesäke, ja hermoa hyökkäystä. Vaikka mekanismeista nämä yhdistykset ovat vielä epäselviä, useita rivejä todisteita näistä korrelaatioita käsitellään alla. Ensinnäkin näyttöä yhdistyksen välillä yli-ilmentyminen ydin- CK2 ja syvyys hyökkäyksen tulee metalloproteinaasien (MMP: t), jotka ovat pitkään yhdistetty syöpään solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [36]. Tuore tutkimus osoitti, että PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen yli-ilmentävät kalvo tyypin 1 matriisin metalloproteinaasi (MT1-MMP) kasvoi nopeammin kuin valetransfektoiduista ohjaus soluihin [37]. Tämä tulos viittaa siihen, että hyökkäys edistävät MT1-MMP liittyy suoraan kasvaimeen aggressiivisuus. Genominlaajuisten ilmentymisen profilointi MT1-MMP-yli-ilmentävät versus MT1-MMP-vaiennetaan syöpäsoluja ja lisäksi data mining analyysi ennestään ilmentymisen tietokanta 190 ihmisen kasvaimissa 14 syöpätyyppien johti tunnistaa 11 geenejä, mukaan lukien CK2, ilmaus joka korreloi tiukasti ja yleisesti kanssa, MT1-MMP [38]. Toiseksi, käyttämällä immunohistokemia, yhdistyksen välillä VEGF-C: n ja kehittäminen imusolmuke etäpesäke on kuvattu Yonemura Y et ai [39]. Vastauksena hypoksia, tapahtui useimmissa kasvaimia kasvatettiin suurempi kuin 1 mm

3: n ilmentyminen VEGF-C voidaan stimuloida hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) [40]. On osoitettu, että inhibiittorit CK2 estetty aktivointi HIF-1, ja sitten VEGF: n ilmentymistä-C [41]. Lopuksi lisääntynyt neuriitin muodostuminen osoitti edellisessä

in vitro

tutkimukset viittaavat siihen, että aksonimikrotubuluksiin muutto voi olla avaintekijä hermoa hyökkäystä. Aksonaalisen kasvu on monimutkainen prosessi, joka vaatii neurotrofiset kasvutekijät ja aksonaalinen ohjaus molekyylit [42], [43]. Yhdessä tutkimuksessa suoritetaan Arevalo et al. osoittivat, että hermokasvutekijä, yksi neurotrofisten kasvutekijöiden, voi edistää aksonien kasvua aktivaation kautta CK2 [44].

tutkimus osoitti, että yli-ilmentyminen ydin- CK2α voi olla itsenäinen prognostinen merkkiaine CRC. Kliiniset tiedot käsitellään ennustetekijöiden arvo CK2α ovat rajalliset. Käyttämällä globaalin geenin ilmentymisen profiloinnin CK2α geeni on tunnistettu prognostinen markkeri potilailla, joilla on okasolusyöpä keuhkojen [29]. Laramas et ai. kunhan näyttöä vahvan yhteyden ydinvoiman lokalisoinnin CK2α ja köyhien ennustetekijät ihmisen eturauhassyövän [30]. Lisäksi tutkimukset Kim et al. osoittivat, että yli-ilmentyminen CK2α proteiinin leukemia liittyi huono potilaiden hoitotuloksiin [31]. Tietääksemme ei ole raportti mainita ennustetekijöiden merkitystä ydin- CK2α ihmisen CRC. On huomionarvoista todeta, että ensimmäistä kertaa, yliekspressio ydin- CK2α voi olla itsenäinen ennustetekijöitä merkkiaine CRC. Yliekspressio ydinvoiman CK2α on siten käyttökelpoinen markkeri lopputuloksen ennustaminen potilailla, joilla on CRC, joka oli kirurginen kasvaimen resektion. Potilaat, joilla CRC osoittavat yliekspressio ydinvoiman CK2α olisi seurataan tarkasti.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkittavat

Potilas Kohortissa 245 peräkkäistä CRC tapauksissa vuodesta 1998 kautta 2002 dokumentointia patologisen ja kliiniset tekijät ja kliinisten tulosten. Kukaan näistä potilaista ei ollut saanut ennen leikkausta kemoterapiaa ja /tai sädehoitoa. Ei-kasvain osa otettiin selvästi normaalista peräsuolen limakalvo pois kasvaimesta resektoitiin peräsuolen näytteestä. Ennusteeseen viittaavia parametreja CRC määritettiin mukaisesti AJCC luokitusta. Seurannan kesto määriteltiin välisenä aikana toiminta päivämäärä ja edellisen käynnin, mukaan potilaan kaavio. Institutionaalinen Review Board Chi-Mei Medical Center hyväksyi kudoksen hankinta protokollan toteuttamaan tämän tutkimuksen. Kirjallinen suostumus saatiin jokaiselle osallistujalle ennen kudoksen hankintaa. Kasvain /ei-kasvain paria peräsuolen kudosten analysoitiin ydin- CK2α ilmentymistä.

immunohistokemiallinen analyysi

Nuclear CK2α ilmentyminen analysoitiin immunohistokemiallisesti. Parafinoidut kudosblokeista leikeltiin 5 um ja siirrettiin mikroskoopin (Muto Pure Chemicals, Tokio, Japani). Hepatooma käytettiin positiivisena kontrollina CK2α. Negatiivinen kontrolli koostui poisjättäminen primaarisen vasta-aineen ja inkubointia fosfaattipuskurisuolaliuoksella. Jälkeen rehyfration ja antigeenin haku, antigeeni esto suoritettiin käyttäen Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution (Dako, Carpinteria, CA) 5 minuutin ajan. Objektilasit jälkeen sitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aine: polyklonaalinen anti-CK2α (Stressgen Bioreagents, Victoria, Kanada) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa laimennoksena 1:50. Detection immunoreaktiivisen värjäys suoritettiin avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksi mukainen menetelmä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Herkkä Dako REAL EnVision Detection System (Dako) käytettiin tunnistusjärjestelmä. Inkuboinnin jälkeen diaminobentsidiinillä 5-8 minuuttia, leikkeet vastavärjättiin ja asennettu mikroskooppisen tulkintaa. Immunoreaktiivisuuden oli itsenäisesti tekee kaksi patologit (C-F Li ja C-L Fang). Prosenttiosuus kasvainsolujen, joilla on kohtalainen tai voimakas ydinaseiden immunoreaktiivisuus nauhoitettiin, ja tulokset samasta potilaasta otettiin keskiarvo saamiseksi keskimääräinen ydin- CK2α merkintöjä indeksi. Cutoff keskiarvon merkintöjä indeksi määritellä ydinaseiden CK2α yliekspressio oli ydinreaktiivisuus in 40% soluista (mediaani-arvo). Kliiniset tiedonkeruun ja immunohistokemiallinen analyysi tehtiin toisistaan ​​riippumatta, on tutkijan sokkotutkimuksessa.

RNA ja cDNA-synteesi

mukaan valmistajan ohjeiden, kokonais-RNA: 10 kasvain ja non -tumor paria peräsuolen kudosten eristettiin käyttäen RNA kit (Sigma, St. Louis, MO). RNA laatu analysoitiin Agilant 2100 Bioanalyzer. RIN arvot kaikkien 20 näytettä olivat yli 7. cDNA-synteesi suoritettiin kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa [45]. Syntetisoitiin cDNA säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

Alukkeet ja koettimet

Taqman Gene Expression Assays, kuten alukkeita ja koettimia CK2α ja β-aktiini, sisäinen kontrolli, hankittiin Applied biosysteemien. Määritys määrä CK2α ja β-aktiini oli Hs00751002_s1, ja Hs99999903_m1, vastaavasti.

Quantitative real-time PCR

ekspressiotasot kohdegeenien mitattiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems), kuten on kuvattu edellisessä tutkimuksessa [45]. Kynnyssyklistä (

C

t

) on murto-syklin, jossa fluoresenssi syntyy koettimen katkaisua ylittää kiinteän tason yli lähtötason. Jotta valittu kynnys, pienempi kopioluvun johtaa korkeampaan

C

t

arvo. Määrä CK2α mRNA kasvain tai ei-tuumorikudoksia, standardisoituja määrä β-aktiini-mRNA, ilmaistiin Δ

C

kasvain

tai Δ

C

ei-kasvain

=

C

t

(CK2α) –

C

t

(β-aktiini).

Soluviljely ja siRNA hoito

Ihmisen koolonisyöpäsolulinja (DLD-1) saatiin Elintarviketeollisuus tutkimus- ja koulutusinstituutti (Hsinchu, Taiwan). Soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Moregate BioTech, Bulimba QLD, Australia), 100 yksikköä /ml penisilliini G: tä, 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia, ja 250 ng /ml amfoterisiini B: tä (kaikki Sigma). Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. SiRNA hoitoon, solut transfektoitiin 30 nM CK2α-spesifisiä tai salattu siRNA (Applied Biosystems) käyttäen SIPORT NeoFX transfektio Agent. 48 tuntia transfektion jälkeen, ydin- proteiinit uutettiin, ja sen jälkeen Western blot suoritettiin vaikutuksen arvioimiseksi siRNA hoidon.

Nuclear proteiinivalmisteesta

Yhteensä solu- ja kudos- ydin- proteiinit uutettiin NE -eläkkeensaajaa Nuclear ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) mukaan valmistajan ohjeiden. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology) naudan seerumin albumiinia standardina.

immunoblottauksella

Denaturoitu proteiini näytteet altistettiin 10% SDS-PAGE. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Estetty blotteja inkuboitiin huoneenlämpötilassa yön yli anti-CK2α polyklonaalista vasta-ainetta (1:161 laimennus). β-aktiini (Sigma, 1:8000 laimennus) käytettiin sisäisenä kontrollina yhtäläisten proteiinia lastaus. Blotteja inkuboitiin edelleen sekundaarisia vasta-aineita konjugoituna peroksidaasiin (Sigma) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Parannettu kemiluminesenssin reagenssit (Pierce Biotechnology) käytettiin visualisoimaan suunnattu proteiineja, jotka sitten osittain kvantitatiivisesti mitattuna densitometria. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa, itsenäisesti.

Soluproliferaatiomääritys

jälkeen siRNA hoidon, transfektoituja soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 4 , 8 ja 14 päivää. Yksittäiset pesäkkeet ( 50 solua /pesäke) kiinteään, värjättiin käyttäen liuosta, jossa oli 1% kristalliviolettia metanolissa 30 minuutin ajan, ja laskettiin. Määritys suoritettiin kolme kertaa, itsenäisesti. Kutakin koetta varten, kaksi kaivoa olosuhdetta kohti käytettiin. Virhe palkit SD

Tilastollinen

erot ydin- CK2α ilmaisun välillä kasvain ja ei-tuumorikudoksia samalla potilaalla ja soluproliferaatiota analysoitiin käyttämällä pariksi

t

testata. Joitakin ennusteeseen viittaavia parametreja tutkittiin tässä tutkimuksessa. He olivat ikä, sukupuoli, syvyys invaasio, imusolmukestatuksesta, lavastus, eriytyminen, verisuonten ja hermoa hyökkäystä. Korrelaatio ydin- CK2α ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia parametreja tutkittiin χ

2 testiä. Kaikki aika-to-tapahtuman päätepisteisiin mukaan eri ennusteeseen viittaavia parametreja piirrettiin Kaplan-Meier menetelmä ja merkitys määritettiin sitten uni-variate log-rank-testi. Periaatteessa nämä merkittävät muuttujat uni-variate analyysi (

P

≤0.05) merkittiin usean variate Coxin regressiomallin määrittää riskisuhde ja riippumattomuus prognoosi- vaikutus vaiheittain taaksepäin tavalla. Kaikki tiedot analysoitiin SPSS ohjelmistoversio 14 (SPSS, Chicago, IL).

P

arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Kuo-Shan Wen hänen avustaan ​​immunohistokemiallisesti. Kirjoittajat myös kiittää Wen-Chun Chen hänen apua kliinisten tietojen keruu.