Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjojen syöpä on yksi johtavista syistä naisten kuolemaan ja kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja tarvitaan kiireesti. Nuclear factor-KB: n (NF-KB) konstitutiivisesti aktivoitu useiden syöpätyyppien, kuten munasarjasyövän, ja on tunnettu tukea eloonjäämistä syöpäsoluja. Kuitenkin molekyylimekanismeja pysyviä NF-KB: munasarjasyövän edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Me raportoimme tässä, että sen lisäksi, että aiemmin raportoitu kanoninen aktivointi, NF-KB aktivoituu läpi noncanonical väylän munasarjasyöpäsoluja. RNA-interferenssi-välitteinen hiljentäminen NF-KB asiakkuutta kinaasi (NIK), keskeinen säätelijä noncanonical koulutusjakson, vähensi NF-κB2 /p52 sitoutuu DNA: han ja NF-KB-riippuvaista reportterigeeniekspressiota sekä NF-KB: n kohdegeenin ilmaisu. Varsinkin ankkurista riippuva ja riippumattaman solukasvu heikentynyt NIK-köyhdytettyä soluissa. Ehtyminen NIK myös tukahdutti kasvaimen muodostumista nude-hiiret ksenograftin määrityksessä. Nämä tulokset osoittavat, että NIK: lla on keskeinen rooli konstitutiivista NF-KB ja etenemisen munasarjasyöpäsoluja ja viittaavat siihen, että NIK edustaa houkutteleva terapeuttinen kohde munasarjasyöpä.

Citation: Uno M, Saitoh Y, Mochida K, Tsuruyama E, Kiyono T, Imoto I, et ai. (2014) NF-KB indusoiva Kinase, Keski Signaling Component Non-Canonical Pathway NF-KB, Auttaa munasarjasyöpä Progression. PLoS ONE 9 (2): e88347. doi: 10,1371 /journal.pone.0088347

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 30 elokuu 2013; Hyväksytty: 12 tammikuu 2014; Julkaistu: 12 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Uno et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustus-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia alueita opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia Japanin S.Yamaoka (22117004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyövän on yksi tappava gynekologinen syöpäsairauksia ja sen eloonjäämisaste on paljon pienempi kuin muiden syöpien, jotka vaikuttavat naisiin. Koska munasarjasyöpä aluksi osoittaa hienovaraisia ​​ja epäspesifisiä oireita, suurin osa potilaista esiintyy edennyt sairaus, jotta aggressiivinen kirurginen hoito yhdessä kemoterapian edelleen tavanomaista hoitoa. Vaikka edistysaskeleet kemoterapia parantaa selviytymisen munasarjasyöpä potilaille, ne eivät useinkaan vastaa ensimmäistä kemoterapiaa tai uusiutumisen saavuttamisen jälkeen myönteisen vastauksen [1]. Näin ollen uusia terapeuttisia lähestymistapoja tarvitaan pikaisesti paremmin hoitotulokseen.

NF-KB on transkriptiotekijä mukana erilaisten biologisten prosessien, kuten immuunivasteen, tulehduksen, syövän ja solukuolemaa [2]. Nisäkässoluissa, NF-KB koostuu homo- ja heterodimeerejä viisi jäsentä, NF-κB1 (p50 ja sen esiaste p105), NF-κB2 (p52 ja sen esiaste p100), RelA (p65), RelB ja c-Rel . Leposoluissa aktiivisuus NF-KB on tarkoin säädeltyä sen vuorovaikutus estävää IKB proteiineja. Edeltäjä proteiini p105 läpikäy konstitutiivisia käsittelyä solun proteasomin joka poistaa IKB kaltainen C-pään alue tuottaa p50. Sen sijaan, p52 tuotanto vaatii IKB kinaasi (IKK) aiheuttaman fosforylaatio ja proteasomin välittämä käsittely P100. NF-KB signalointi välittyy kahden reitin nimeltään kanoninen ja noncanonical polkuja. Aktivointi kanoninen reitin pääasiassa laukaisee sytokiinien ärsykkeet, kuten tuumorinekroositekijä-α (TNFa) ja interleukiini-1β, jonka jälkeen aktivointi IKK monimutkainen, joka koostuu kahdesta proteiinikinaasien IKKα ja IKKβ ja säätelyproteiini NF-KB olennainen modulaattori (NEMO myös nimeltään IKKγ). Aktivoitu IKK aiheuttama fosforylaatiota IκBα johtaa sen polyubiquitination ja proteasomaalisten hajoamista, jonka jälkeen translokaatio p50-RelA heterodimeeri tumaan ja induktion kohdegeenin ilmentymisen. Noncanonical NF-KB-reitin aktivoivat erityisesti TNF-reseptoriperheen jäsenet, kuten B-soluja aktivoiva tekijä (BAFF) reseptori, CD40 ja lymfotoksiini beetan reseptoria, jotka sitoutuvat TNF-reseptoriin liittyvän tekijän (TRAF) 2 tai TRAF3. Noncanonical NF-KB: n aktivaation on raportoitu luottaa kohonnut ilmentyminen NF-KB-indusoivia kinaasi (NIK), jotka on saavutettu kahdella tavalla joko heikentyvän K48 polyubiquitination NIK tai tehostetun mRNA: n ilmentymisen. Stimuloimattomissa soluissa, TRAF3 linkkejä NIK usean alayksikön E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi, joka koostuu TRAF2: sta ja solun apoptoosi-inhibiittori 1 ja 2 (cIAP1 ja cIAP2), mikä johtaa K48 polyubiquitination ja proteasomaalisten hajoamista NIK, säilyttäen näin NIK ilmentymistä alhaisella taso. Vastauksena stimulaation sytokiinien kuten BAFF tai CD40-ligandin, TRAF3 rekrytoimista reseptoriin ja läpikäy ubikitinaatio välittämän proteasomaalisten hajoamista. Tämä johtaa vakauttamiseen ja kertyminen juuri syntetisoidun NIK, vaikka nämä ärsykkeet eivät kasvata

NIK

mRNA-tasolla [3], [4]. Vuonna hematopoieettiset syöpäsolut kuten multippeli myelooma ja aikuisten T-solujen leukemiaa sekä keuhkosyöpään solut joko vakauttaminen NIK-proteiinin kautta heikentynyt negatiivinen sääntelyä TRAF3 /TRAF2 /CIAP kompleksin tai poikkeava ilmentymä

NIK

mRNA on raportoitu [5], [6], [7], [8]. Joka tapauksessa, kertyminen NIK johtaa aktivointi IKK monimutkaisia, mikä puolestaan ​​fosforyloi P100 johtavat sen käsittelyn p52 ja tumaansiirtymiseen että p52 /RelB heterodimeerin. Toisin kuin aktivointi kanoninen reitin, noncanonical NF-KB: n aktivaatio ei vaadi yhdistyksen NEMO kanssa IKK monimutkainen ja se on suhteellisen pysyviä [9].

Aiemmat raportit osoittivat, konstitutiivisen NF-KB: n ja sen panos ilmentymä pahanlaatuinen fenotyyppi useiden syöpätyyppien. NF-KB: n aktivaatio johtaa kohonnut ilmentyminen liittyvien geenien solusyklin etenemisen, selviytymisen ja invaasion syöpäsoluja. Esimerkiksi yliekspressio sykliini D1, joka on tärkeä säätelijä solusyklin, edistää syöpäsolujen proliferaatiota, kun taas sääntelemättömään ilmentymiseen B-solujen lymfooma-xl suojaa syöpäsolujen apoptoosia. Lisäksi matriisi metallopeptidaasi 9 (MMP-9) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä edistää kasvaimen invaasion ja angiogeneesin [10]. Kuten munasarjasyöpä, esto IKKβ aktiivisuuden, joko pieni molekyyli estäjä tai RNAi-välitteinen geenien, ilmoitettiin tukahduttaa leviämisen ja invaasion munasarjasyövän solulinjoissa [11]. Blockade of NF-KB: n signaloinnin ilmentämällä vallitsevaa negatiivista muotoa IκBα muuttunut tumorigeneesin munasarjasyövän solulinjoissa [12]. Lisäksi kertyminen ydinvoiman RelA ovarioiden ilmoitettiin liittää huonon ennusteen [13]. Kuitenkin mekanismit jatkuvasta NF-KB-aktivaation munasarjasyöpäsoluja ovat pysyneet suurelta osin tuntemattomia. Rattan et al. osoitti, että ilmentyminen transkription elongaatiotekijä A-kaltainen 7, suppressori RelA-riippuvaista geenin transkriptio, on usein alas-säädellä munasarjasyöpäsoluja [14]. Olemme äskettäin raportoitu kohonnut ilmentyminen NIK ja sen rooli onkogeenisia ominaisuuksien aikuisten T-solujen leukemiaa ja keuhkosyövän soluja, joissa

NIK

mRNA poikkeavasti ilmaistiin [7], [8]. Tässä tutkimuksessa osoitamme tärkeitä rooleja NIK leviämisen

in vitro

ja tuumorigeenisyystesti munasarjasyöpä soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kokeet käyttämällä ensisijaista munasarjasyöpä näytteet hyväksynyt eettinen komitea Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen yliopiston ja kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikista potilaista. Kaikki eläinkokeet suoritettiin hyväksyntää eläinten Study komitean Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (Lupa nro 0120286A) ja sopeutui kaikki asiaankuuluvat ohjeet ja lait.

Soluviljely ja Perusnäytteissä

neljä ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa, RMG-I, RMUG-S, RMUG-L ja MCAS saatiin Japanin Collection of Research Bioresources Cell Bank (Tokio, Japani) ja 2 munasarjasyövän solulinjoissa, OMC-3 ja JHOC- 5, olivat RIKEN Cell Bank of Japan (Tsukuba, Japani) [15]. RMG-I, RMUG-S, RMUG-L ja OMC-3 kasvatettiin Hamin F-12-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. JHOC-5 viljeltiin 01:01 seokseen Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) ja Hamin F12, joka sisälsi 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, johon on lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). MCAS viljeltiin Eaglen Minimum Essential Medium, joka sisälsi 20% FBS. Kaikki muut munasarjasyövän solulinjoissa on kuvattu muualla [16], [17], [18]. Ihmisen alkion munuaisen solulinjat, HEK293 ja HEK293T viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää. HOSE1C on kuolemattomaksi ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja perustetaan ensisijaisesti ihmisen munasarjan pintaepiteelissä (HOSE) solujen infektion jälkeen retrovirusten ilmentävät mutantti Cdk4, cyclinD1 ja ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin [19]. HOSE1C Soluja viljeltiin 1:01 DMEM: ää ja Ham F12, johon oli lisätty 10% FBS: ää. Kaikki välineet, joita oli täydennetty 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia. Ensisijainen munasarjasyöpä näytettä otettiin 12 potilasta sidoksissa sairaalassa Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University. Mediaani-ikä potilailla oli 56,5 vuotta, vaihdellen 27-80 vuotta. Niistä 12 munasarjasyöpiä, 5 olivat histologisesti vakavien syöpä, 4 olivat selkeitä cell carcinoma, 2 olivat endomet- karsinooma ja 1 oli yalk varrella kasvain.

valmistaminen solun uutteiden

valmistamiseksi kokonaisessa solu-uutteet, solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurilla [20 mM tris (hydroksimetyyli) aminometaani-HCI: a (pH 7,5), 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% deoksikolaatti, 0,1% SDS] . Uuttamisessa soluliman ja tumaproteiinit, solut ensin hajotettiin hypotoniseen puskuriin [20 mM 4- (2-hydroksietyyli) -1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES) (pH 7,8), 0,15 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 0,15 mM ethyleneglycoltetracetic happo , 10 mM KCI] ja inkuboitiin jään päällä 10 minuuttia. NP-40 lisättiin loppupitoisuuteen 1%, ja solususpensiot sentrifugoitiin 14000 rpm: llä 5 minuutin ajan. Supernatantit käytettiin sytoplasmisen otteita. Pelletit pestiin kolme kertaa isotonisella puskurilla [20 mM HEPES (pH 7,8), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA: a ja 25% glyserolia] ja suspendoitiin uudelleen ydin- uuttopuskuriin [20 mM HEPES (pH 7,8), 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 25% glyserolia ja 1 mM ditiotreitolia (DTT)]. 30 minuutin inkuboinnin 4 ° C: ssa jatkuvasti sekoittaen, suspensiota sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 2 minuuttia. Supernatantit otettiin talteen ja käytettiin tumauutteet. RIPA, hypotoninen ja ydin- uuttamalla puskureita täydennetty 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä, 0,57 mM phenylmethanesulfonylfluoride, 100 uM natriumvanadaattia, 20 mM β-glyserofosfaatti. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin määrityksellä.

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) B

Viisi ug tumauutteita inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa sitoutumispuskuriin [10 mM HEPES ( pH 7,8), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT: tä, 2,5% glyserolia ja 0,5 ug poly (dl-dC)] 0,5 ng

32P-leimattua NF-KB-spesifisellä koettimella, jotka on saatu H -2Kb promoottorin tai

32P-leimattua Oct-1 anturi [20], [21]. Super-shift määrityksissä tumauutteita esi-inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden tai antiseerumi 1 tunnin ajan jäillä ennen inkubaatiota leimatun koettimen kanssa. Seuraavilla vasta-aineilla tai antiseerumilla käytettiin esi-inkubaatio: vasta-aineen p50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, # sc-7178 X), puhdistettua kaniinin IgG: tä (Cedarlane Laboratories, Hornby, Kanada) ja anti-p52 seerumia ( Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA, 06-413). Pre-immuuni seerumi, anti-RelA ja anti-RelB Vastaseerumeja ystävällisesti Drs. N.R. Riisi (NCI, MA) ja A. Israel (Institut Pasteur, Pariisi). Sillä kompetitiivinen sitoutumismääritys, tumaproteiinit inkuboitiin 100-kertainen molaarinen ylimäärä kylmää oligonukleotidin ennen lisäämällä leimattu koetin. Proteiini-DNA-kompleksit erotettiin polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi 2,5% glyserolia ja sen jälkeen autoradiografialla.

NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus

sitoutuminen p52 tai RelB NF-KB: n sitoutuva sekvenssi kvantifioitiin TransAm ™ NF-KB Family Kit (Active motiivi, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 5 ug tumauutteita lisättiin 96-kuoppalevylle esipäällystetty sisältävän oligonukleotidin NF-KB: n konsensussekvenssi. Aktivoitu p52 tai RelB läsnä otteita sitoutuminen tähän nukleotidin havaittiin toissijaisen vasta-aineilla konjugoituna HRP.

Immunoblottausmääritys

Kokosolun (30 ug), sytoplasmisen (30 ug) ja ydin- (10 ug) lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin immunoblottauksella. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-NF-κB2 p52 (C-5) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-7386) havaitsemiseksi p52 ja sen esiaste P100; anti-NIK (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, # 4994); anti-RelB (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-226); anti-fosfo-P100 (Ser866 /870) (Cell Signaling, # 4810); anti-fosfo-IκBα (Ser32 /36) (5A5) (Cell Signaling, # 5205); anti-IκBα (C-21) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-371); anti-fosfo-IKKα (Ser180) /IKKβ (Ser181) (Cell Signaling, # 2681), anti-IKKα (H-744, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7218), anti-IKKα /β (H-470, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7607), anti-TRAF2 (C90-481) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 558890); anti-TRAF3 (H-122) (Santa Cruz Biotechnology, SC-1828); anti-cIAP1 (R anti-Lamin A /C (4C11) (Soluviestintä, # 4774); anti-α-tubuliinin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, T9026). Havaitsemiseksi endogeenisen NIK-proteiinia, solut käsiteltiin 0,1% DMSO: ta tai 20 uM MG132 (PEPTIDE INSTITUTE, Osaka, Japani) 6 tuntia ja sytoplasminen uutteet alistettiin immunoblot-analyysillä.

Reaaliaikainen käänteistranskriptio -PCR (RT-PCR) analyysi

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu aiemmin [7]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin solulinjoista ja munasarjasyöpä kudoksissa käyttäen ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. MRNA-tasot on

NIK

,

sykliini D1

ja

MMP-9

kvantitoitiin käyttäen StepOnePlus reaaliaikaisen RT-PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sata ng kokonais-RNA: ta tehtiin kvantitatiivinen RT-PCR: llä käyttäen TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagenssit Kit (Applied Biosystems). Käänteistranskriptio suoritettiin 48 ° C: ssa 30 minuuttia ja Taq DNA-polymeraasia oli aktivoitu 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 45 monistussykliä denaturointi 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja hehkutus ja laajentaminen 60 ° C: ssa 1 minuutti . MRNA-tasot normalisoitiin 18S ribosomaalisen RNA: n tasot mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä käyttäen 100 ug kokonais-RNA: ta. Expression of miR-31 tutkittiin käyttäen TaqMan® Micro RNA-määritykset (Applied Biosystems) valmistajan ohjeiden mukaisesti. MIR-31 tasot normalisoitiin kanssa RNU48 ekspressiotasoja.

lentiviruksien

Lentivirusvektorikonstruktit jotka kykenevät ekspressoimaan shRNA kohdistaminen

NIK

(PCS-puro-Niki-1 ja PCS -puro-Niki-2) on aiemmin kuvattu [7]. Kohdistamisen spesifinen sekvenssi

vihreän fluoresoivan proteiinin

(GFP) 5′-ACCCGCGCCGAGGTGAAG-3 ’insertoitiin välittömästi alavirtaan H1 promoottorin pSuperRetoro vektorin (Oligoengine, Seattle, WA, USA), ja se tuottaa PSR-GFPi . ShRNA ekspressiokasetti siirrettiin lentivirusvektori, PCS-puro-PRE kantaen puromysiiniresistenssigeenin ilmaistuna kontrollin alaisena ja fosfoglyseraattikinaasipromoottorin [7]. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin PCS-puro-GFPi. Tuotantoon lentivirusten joka kykenee ilmentämään shRNA, HEK293T solut kotransfektoitiin PCS-puro-GFPi (shCtl), PCS-puro-Niki-1 (shNIK-1) tai PCS-puro-Niki-2 (shNIK-2) yhdessä pCMV-ΔR8.2 pakkaus konstruktio ja pHCMV-VSV-G (eräänlainen lahja tri ISY Chen) käyttäen FuGENE6 (Promega, Madison, WI, USA). Viljelmän supernatantit kerättiin ja suodatettiin 56 tuntia transfektion jälkeen. RMG-I ja JHOC-5-solut infektoitiin näillä lentivirukset 12 tuntia, kun läsnä oli 10 ug /ml polybreeniä. Infektoidut solut selektoitiin, kun läsnä oli 4 ug /ml puromysiiniä (Sigma-Aldrich), 24 tuntia infektion jälkeen.

NF-KB: n reportterigeenimäärityksessä

RMG-I ja JHOC-5-soluja tartunnan lentivirusvektoreita kuljettavat joko NF-KB-reagoiva promoottori perustuva Firefly

lusiferaasi

geeni (CS-KB-R2.2) tai elongaatiotekijä (EF) -1α promoottori-driven

Renilla lusiferaasia

geeni (pCERp) [8], [22]. Tuloksena solujen altaat myöhemmin tartunnan lentiviruksien kykenee ilmentämään kunkin shRNA. Kun valinta on 4 ug /ml puromysiiniä ja 3 päivää, solut kerättiin ja lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). NF-KB-riippuvaista Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitu EF-1α promoottori perustuva riippuvainen

Renilla

lusiferaasiaktiivisuutta.

Cell-kaarianalyysin

Solut kiinnitettiin 70% etanolia ja inkuboitiin 0,5 mg /ml RNase 45 minuuttia ja värjättiin sitten 30 ug /ml propidiumjodidia 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. DNA pitoisuus solujen mitattiin FACS Calibur järjestelmää (BD Biosciences) ja analysoitiin CellQuest ohjelmistojen (BD Biosciences).

Soft agar määritys

RMG-I soluja, jotka ilmentävät shCtl tai shNIK-1 olivat ympättiin F-12 väliaine, joka sisälsi 0,33% agaria. 4 viikon inkuboinnin pesäkkeitä suurempia kuin 60 um laskettiin arvioimaan kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun.

Hiiri ksenografti kasvainmuoto

BALB /cAJcl-nu /nu-hiiriä (CLEA Japani , Tokio, Japani) ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa kunnossa Experimental Animal Center of Tokyo Lääketieteen ja hammaslääketieteen University. RMG-I soluja, jotka ilmentävät shCtl tai shNIK-1 suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa. Kateenkorvattomiin hiiriä (5-6 viikkoa vanhoja) rokotettiin ihonalaisesti postauricular alueella 5 x 10

6 solua. Kasvaimen tilavuus kirjattiin viikoittain. Suurin pituussuuntainen halkaisija (pituus) ja suurin poikittainen halkaisija (leveys) mitattiin mittaharpilla. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tuumorin tilavuus = pituus x leveys

2/2. Kaikki hiiret tapettiin 3 viikkoa inokulaation jälkeen ja paino kunkin kasvaimen mitattiin.

Tilastot

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD tai edustavat kuvat vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kahden tailed Studentin t-testiä. Potilaan näytteen analysointia ja hiirimallissa, merkittäviä eroja ryhmien välillä määritettiin Mann-Whitney U-testi.

P

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Noncanonical NF-KB: n aktivaation munasarjasyöpäsoluja

Tutkitaan kuinka NF -κB konstitutiivisesti aktivoituu munasarjasyöpäsoluja, me ensin tarkasteltiin NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden EMSA. Munasarjasyöpä solut osoittivat selvästi kohonnut NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus verrattuna HEK293-soluissa tiedetään olevan pohjapinta NF-KB: n aktiivisuutta. HOSE1C, kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja osoitti NF-KB: n sitoutumisen aktiivisuus niinkin alhainen kuin HEK293-solut, ja sitä käytettiin kontrollina seuraavat tutkimukset (kuvio 1A). Sitoutumisesta radio-leimattu koetin kilpaili tehokkaasti ylimäärällä kylmää koetin, mikä osoittaa Sitoutumisen spesifisyyttä (kuvio 1 B). Vaikka jatkuva NF-KB: n on raportoitu munasarjasyövän, NF-KB: n DNA: ta sitovan kompleksit mukana näissä soluissa on jäänyt tuntemattomaksi. Super-shift analyysit paljastivat, että ei ainoastaan ​​NFKB1 /p50 ja RelA, mutta myös NFKB2 /p52 ja RelB olivat mukana NF-KB: n DNA: ta sitovan komplekseja RMG-I ja JHOC-5-soluissa (kuvio 1 B). Immunoblottings osoitti näissä solulinjoissa ilmaisi nimenomaan fosforyloidun muotoja IKKα, IKKβ ja IκBα (kuvio 1 C). Fosforylaatiota IKKβ ja IκBα oli voimakkaampi in JHOC-5 ja MCAS solujen samalla IKKα oli pääasiassa fosforyloitu in RMG-I ja OMC-3-soluissa, mikä viittaa etuoikeutettu aktivointi kanoninen ja noncanonical reittejä kussakin solulinjoissa. Se, että ilmentyminen NFKB2 /p100 riippuu pitkälti NF-KB: n aktivoitumisen kautta kanoninen reitti voi osittain selittää runsas ilmentyminen NFKB2 /p100 ja sen fosforyloidun muodon sekä p52 in JHOC-5-soluissa. Fosforyloidun muodon p100 havaittiin munasarjasyövän solulinjoissa lukuun ottamatta RMUG-S, mutta ei kontrolli 293 tai HOSE1C soluja. Läsnäolo RelA ja RelB tumaan korreloi tulokset EMSA (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittavat, että sekä kanoninen ja /tai noncanoncal NF-KB-polut aktivoituvat eri munasarjan syöpäsolujen.

(A) Viisi mikrogrammaa tumauutteiden osoitetusta solulinjat tehtiin EMSA käyttäen

32P-leimattuja oligonukleotideja, jotka sisältävät NF-KB: n sitoutuva sekvenssi tai Oct-1-sitoutuva sekvenssi koettimina. (B) kompetitiomäärityksessä ydin- näytteitä esi-inkuboitiin 100-kertainen molaarinen ylimäärä kylmää oligonukleotidin ennen lisäämällä leimattu koetin (vasen paneeli). DNA-sitovan NF-KB komponenttien osoitettuun solulinjoissa määritettiin super-shift EMSA (oikea paneeli). Tumauutteita (5 ug) osoitetusta solulinjojen soluja esi-inkuboitiin 30 minuuttia puhdistetun hiiri-IgG, anti-p50 ja anti-c-Rel-vasta-aineita, pre-immuuni (PI), anti-p52, anti-RelA tai anti-RelB seerumit, ja alistetaan sitten EMSA NF-KB-spesifisen koettimen. (C ja D) Nuclear (10 ug), sytoplasminen (30 ug) tai koko solun (30 ug) uutteita alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottings kanssa mainituilla vasta-aineilla.

NIK: lla keskeinen rooli konstitutiivista NF-KB aktivaation munasarjasyöpäsoluja

Kohonnut ilmaus NFKB2 /p52 sai meidät tutkimaan NIK ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti, että ohjaus HOSE1C solut osoittivat suurempia CT ero kuin 28 munasarjasyövän solulinjoissa testattu, joista 17 solulinjat ilmensivät 4- 16-kertaisesti enemmän

NIK

mRNA kuin kontrolli HOSE1C soluja (kuvio 2A). Tuoreessa raportissa osoitetaan, että menetys mikroRNA miR-31 kohdistaminen

NIK

taustalla konstitutiivisen NF-KB: aikuisten T-solujen leukemian soluja [23]. Siksi arvioitiin miR-31 ilmentyminen munasarjasyöpäsoluja kvantitatiivisen RT-PCR. Neljä 6 syöpäsolulinjojen oli vähemmän kuin 1/8 miR-31 RNA HOSE1C soluissa vaikka korrelaatio

NIK

ja miR-31 RNA ilme ei ollut merkitsevä (kuvio 2B ja 2C). Tärkeää on, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi munasarjasyövän kudosten paljasti mediaani 2,4-kertainen

NIK

mRNA: n ilmentymisen verrattuna normaaliin munasarjakudoksessa (kuvio 2D). Kuitenkin miR-31 ilmentyminen munasarjasyövän kudoksissa ei merkittävästi poikkeavat normaalista munasarjan kudoksissa eikä tilastollisesti korreloi

NIK

mRNA ilmaisu (kuvio 2E ja 2F). Näin ollen tietyt tapaukset

NIK

mRNA kertymistä ei voida selittää ainoastaan ​​pienentää miR-31 ilmentyminen ja ehdottavat aiemmin paljastettiin mekanismi (t)

NIK

mRNA yli-ilmentymisen.

( A ja D) Kokonais-RNA uutettiin osoitetusta solulinjoja tai munasarjasyöpä kudosten ja altistettiin reaaliaikaisen RT-PCR kvantifioimiseksi

NIK

mRNA: n ilmentymisen. (EN) ACt määritetään välinen ero Ct-arvo on

NIK

mRNA: ta ja että laimennetun 18S rRNA. Yhden tähdellä kuvaavat merkitsevää laskua (

P

0,05) ACt arvon verrattuna HOSE1C soluihin. (D)

NIK

mRNA normalisoitiin 18S RNA. Suhteellinen

NIK

mRNA-tasot ovat osoittaneet kertainen lisäys mRNA runsaasti suhteessa keskimääräiseen normaalin munasarjat (mielivaltaisesti 1). (B ja E) Total RNA käytetään paneelien A ja D saatettiin reaaliaikaisen RT-PCR miR-31 kvantifiointiin. (B) toinen ACt määritetään välinen ero Ct-arvo miR-31 ja että sisäisen valvonnan RNU48. Yhden tähdellä merkitsevät merkittävää kasvua (

P

0,05) ACt arvon verrattuna HOSE1C soluihin. (E) MIR-31-tasot olivat normalisoitiin vastaavaan RNU48 tasoilla. Suhteellinen miR-31 tasot ovat osoittaneet kertaiseksi miR-31 runsauden suhteessa keskimääräiseen normaalin munasarjat (mielivaltaisesti 1). (C, F) Pearsonin korrelaatiokerroin R

2 väliin NIK mRNA ja miR-31 tasoa laskettiin. (G) Kolmekymmentä mikrogrammaa lysaatit altistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottings kanssa mainituilla vasta-aineilla. Havaitsemiseksi endogeenisen NIK, soluja käsiteltiin MG132 (20 uM) tai DMSO: ssa 6 tunnin ajan ennen valmisteen sytoplasman otteita. n.s., ei ole merkittävä.

Expression of NIK-proteiini on tiukasti säännelty polyubiquitination ja proteasomin-välitteinen hajoaminen ja pidetään yleensä havaita immunoblottauksella estämättä sen nopea hajoaminen. Ilmaisu TRAF2: sta, 3 ja cIAP1 munasarjasyövän solulinjoissa että säädellä negatiivisesti NIK ilmentymistä pysyi verrattavissa ohjata soluja (kuvio S1). Kuten olemme pystyneet havaitsemaan NIK-proteiini yksinkertaisella immunoblottaus tai immunosaostuksella kytkettyä immunoblottauksen avulla soluliman lysaatit näiden solujen, käsittelimme solut proteasomin estäjä MG132 ennen proteiiniuutto. NIK-proteiini oli helposti havaittavissa munasarjasyövän solujen läsnäollessa MG132, mutta ei kontrolli HOSE1C eikä HEK293-soluissa (kuvio 2G), mikä osoittaa, tehostettu tuotanto NIK-proteiinin munasarjasyöpäsoluja. Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että NIK on poikkeavasti se esitettiin pretranslational tasolla munasarjasyöpäsoluja.

Aiemmat raportit osoittivat, että huonon ennusteen munasarjasyöpä potilaiden korreloi yli-ilmentymisen pro-MMP-9 ja sykliini D1 [24], [25], jonka ilmentymistä tiedetään säätelevän NF-KB: n. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit osoittivat, että

MMP-9

mRNA-tasot useimpien munasarjasyövän solulinjoissa oli suurempi kuin kontrolli HOSE1C soluja.

MMP-9

mRNA-tasot kussakin solulinjassa ei korreloinut

NIK

mRNA (kuvio 3A). Tasot

cyclinD1

mRNA kaikilla testatuilla munasarjasyövän solulinjoissa ylitti HEK293-solut, kun taas HOSE1C solut ekspressoidaan runsaasti

cyclinD1

mRNA vuoksi pakko tämän geenin ilmentyminen kuolemattomaksi. Munasarjasyövän kudoksissa,

MMP-9

mRNA: n ilmentyminen oli merkitsevästi säädelty ja

sykliini D1

mRNA-tasot oli taipumus kasvaa munasarjasyöpään kudoksissa vaikka nämä mRNA ilmaisun kunkin näytteen ei korreloinut

NIK

mRNA: n ilmentymisen (kuvio 3B).

Kokonais-RNA uutettiin osoitetusta solulinjat (A) tai munasarjasyöpä kudosten (B) suoritettiin reaaliaikainen RT-PCR kvantifioimiseksi

MMP-9

tai

sykliini D1

mRNA ilmaisun. (EN) ACt määritetään välinen ero Ct-arvo on

MMP-9

tai

sykliini D1

mRNA: ta ja että laimennetun 18S rRNA. Yhden tähdellä kuvaavat merkitsevää eroa (

P

0,05) ACt arvon verrattuna HOSE1C soluihin (

MMP-9

) tai HEK293-soluissa (

sykliini D1

). (B) mRNA-tasot normalisoitiin 18S RNA. Suhteelliset mRNA-tasot ovat osoittaneet kertainen lisäys mRNA runsaasti suhteessa keskimääräiseen normaalin munasarjat (mielivaltaisesti 1). Pearsonin korrelaatiokerrointa R

2 välillä

MMP-9

tai

sykliini D1

ja

NIK

mRNA osoitettiin. Suhteelliset mRNA-tasot lasketaan kertainen lisäys mRNA runsaasti suhteessa kuin HOSE1C solut (

MMP-9

) tai HEK293-soluissa (

sykliini D1

).

Tutkitaan kuinka NIK säätelee NF-KB-riippuvaista geenin transkription munasarjasyövän solulinjoissa, loimme NF-KB reportterisolulinjaa järjestelmän lentiviruksen transduktion. RMG-I ja JHOC-5-solut infektoitiin lentivirusvektoreita kuljettavat Monkey

lusiferaasi

transkriptioyksikkö valvonnassa NF-KB-riippuvainen promoottori tai

renilla lusiferaasi

transkriptioyksikkö valvonnassa konstitutiivinen elongaatiotekijä 1α-peräinen promoottori sisäisenä kontrollina. Vakiintuneista solu- altaat myöhemmin tartunnan lentiviruksen kykenee ekspressoimaan joko shRNA kohdistaminen

NIK

tai

GFP

ja alistettiin Lusiferaasimäärityksiä. Ehtyminen NIK varmistettiin kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja immunoblottauksella läsnä ollessa MG132 (kuvio 4A). NIK ehtyminen vähentää p52 ilmentymistä ja NF-KB: n riippuvaisen reportterigeenin ilmentymisen RMG-I ja JHOC-5-soluissa (kuvio 4B ja 4C). Expression toisen shRNA kohdistaminen

NIK

mRNA johti samanlainen tukahduttaminen NF-KB-riippuvaista transkriptiota, ilman mahdollisuutta armottoman vaikutuksia (kuva S2A, B).

(A) RMG- I ja JHOC-5-solut infektoitiin lentivirusvektoreita ilmentävät shRNA kohdistaminen

NIK

(shNIK-1) tai

GFP

(shCtl). Kokonais-RNA uutettiin näistä soluista ja altistettiin reaaliaikaisen RT-PCR kvantifioimiseksi

NIK

mRNA: n ilmentymisen.

NIK

mRNA-tasot normalisoituivat 18S RNA. Suhteellinen

NIK

mRNA-tasot ovat osoittaneet kertainen lisäys mRNA runsaasti suhteessa keskiarvoon shCtl (mielivaltaisesti 1). Yhden tähdellä kuvaavat merkitsevää laskua (

P

0,05) verrattuna shCtl soluihin. Samanaikaisesti, soluja käsiteltiin MG132 (20 pM) 6 tuntia ennen valmistusta sytoplasman otteita. Soluliman uutteita (30 ug) altistettiin immunoblottianalyysi kanssa mainituilla vasta-aineilla. (B) RMG-I ja JHOC-5-soluja, jotka on infektoitu lentiviruksen vektori, jossa NF-KB-riippuvaista tulikärpäsen lusiferaasi ekspressiokasetin ja että kantavat EF-1α-promoottori-riippuvainen

Renilla

lusiferaasin ekspressiokasetti. Vakiintuneista solu- altaat infektoitiin lentivirusvektoreita ilmentävät shRNA kohdistaminen

NIK

(shNIK-1) tai

GFP

(shCtl). Solut valitaan puromysiinin kanssa (4 ug /ml) 72 tunnin ajan ja altistettiin kahden lusiferaasi-määritys, jossa tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus oli normalisoitu

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus. Suhteellinen Lusiferaasiaktiivisuudet on ilmaistu valo yksikkö kontrolliin verrattuna (shCtl). Yang et ai.