Krooninen sairaus

tiivistelmä

Regulatory T-soluja (Tregs) on keskeinen rooli ylläpitämisessä Itsetoleranssiprosessi ja immuuni homeostaasiin. Huolimatta monista tutkimuksia korrelaatio Tregs kertymisen ja iän tai syöpäsairauksia, siihen liittyvä mekanismi ei ole hyvin tutkittu. Selvittää mekanismi Tregs kertymistä vuotiaiden virtsan virtsarakon syövän, selvitimme uusi solu biogerontologia geeni

Senex

ja asiaan apoptoosigeenin mRNA: n ekspression lajitellaan CD4 + CD25

hi Tregs vanhoista UBC luovuttajien, arvioitiin seerumin sytokiinien profiilit liittyvät kasvaimen immunopatologia, ja edelleen tutkia suhdetta

Senex

ilme, apoptoosin geenin ilmentymisen ja sytokiinien eritystä. Saatuaan vaiennetaan alas Senex geeniekspression RNA-interferenssi, me arvioitiin myös solun apoptoosin Tregs lajitellaan vuotiaiden UBC potilaiden vastauksena H

2O

2-välitteisen stressiä. Tuloksemme osoittivat, että ilmen- tymisen lisääntymisen

Senex

mRNA ilmaisun Tregs vuotiaiden UBC potilaiden korreloi proapoptoottisten geenin ilmentymisen ja sytokiinien pitoisuus. Hiljentäminen

Senex

geenin ilmentyminen lisääntyi solujen apoptoosia ja pro-apoptoottisen geenin ilmentymisen Tregs, vastauksena H

2O

2-välitteisen stressiä. Voimistunut

Senex

mRNA ilmaisun yhdessä vähentynyt proapoptoottisten geenien ilmentyminen ja häiriöt sytokiinien synteesi voidaan edistää Tregs lisääntymistä ja edistää kasvaimen kehittymisen ja etäpesäke. Kaiken säätelyä solun vanhenemisen geenin

Senex

, liittyi sääntelyn T-solujen kerääntyminen vuotiaiden virtsarakon syöpään. Tutkimuksemme tarjoaa uuden käsityksen ymmärtäminen oheislaitteiden Tregs kertymisestä vuotiaiden syöpäsairauksia.

Citation: Chen T, Wang H, Zhang Z, Li Q, Yan K, Tao Q, et al. (2014) romaani Cellular Vanheneminen Gene,

Senex

, osallistuu Peripheral Regulatory T Cells Kertyminen ikäinen Virtsarakon syövän. PLoS ONE 9 (2): e87774. doi: 10,1371 /journal.pone.0087774

Editor: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 syyskuu 2013; Hyväksytty: 30 Joulukuu 2013; Julkaistu: 05 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun, ja lisääntyminen tahansa mediassa, kunhan alkuperäinen kirjoittaja, ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nr 81141104, nro 81272259), ja Natural Science Foundation of Anhuin maakunnassa (Item No.11010402168). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Regulatory T-solut (Tregs) on keskeinen rooli ylläpitämisessä Itsetoleranssiprosessi ja immuuni homeostaasiin tukahduttamalla monenlaisia ​​fysiologisia ja patologisten immuunivasteiden itsensä ja nonself sekä lähes itsestään tuumoriantigeenit [1 ], [2]. Rekrytoidaan tuumorikudoksissa, Tregs laajentaa ja aktivoituvat kasvaimen kudoksissa ja tyhjennys imusolmukkeet, tukahduttaa kasvaimen kasvua estävän immuunivasteen [3]. On havaittu, että perifeerisen veren CD4 + CD25 + Tregs kerääntyä dramaattisesti terveiden iäkkäiden ihmisten ja jyrsijöiden [4] – [5]. Kasvu Tregs suhteessa edistää ikään liittyvien immuuni-tukahduttaminen, lisää alttiutta infektiotautien ja syövän [6]. Edelleen lisääntynyt määrä Tregs on havaittu potilailla, joilla on virtsarakon syöpä (UBC), kasvaimen ilmaus FoxP3, tietyn Tregs markkeri, korreloi kliinisten ennusteeseen [7]. Kasvaimensisäistä kertyminen Tregs on havaittu myös peräsuolen syöpä, gliooma ja maksasyövän [8] – [10]. Tukahduttamaan kasvaimen vastainen vaste, nämä kertynyt kasvaimeen Tregs on todettu liittyvän huonoon ennusteeseen [8] – [10]. Huolimatta kaikista edellä tutkimushankkeilla, yksityiskohtaisia ​​mekanismeja ei tunneta selvitetty. Tuoreessa tutkimuksessa lähestyy Tregs kertymistä uudesta näkökulmasta, raportoivat, että solujen apoptoosi Tregs kertymistä ikääntymisen prosessia. 24 tunnin kuluttua kulttuurin, Tregs vanhoista eläimet kuolivat merkittävästi vähemmän aikana Tämän määrityksen kuin teki Tregs nuorista hiiristä, mikä viittaa siihen, että Tregs vanhoista hiiret ovat vastustuskykyisiä apoptoosin [11]. Kuitenkin mekanismeista niiden vastustuskyky apoptoosin vuotiaiden ihmisillä, erityisesti vuotiaiden syöpäpotilaiden vielä löytäjäänsä.

Viimeaikaisissa tutkimuksissa on esitetty, että voimistunut solujen biogerontologia voivat edistää apoptoosin vastus senescent ihmissoluja. Tutkimus on tehty tunnistamisen uusi geeni,

Senex

, joka säätelee stressiä ennenaikaista vanhenemista reittejä (SIPS) endoteelisolujen (EC) [12]. Mielenkiintoista on, että nämä senescent indusoiman

Senex

ovat resistenttejä tuumorinekroositekijän (TNF-α) indusoiman apoptoosin [12]. Lisäksi tietyissä olosuhteissa jotkut senescent solut voisivat jopa muuttaa niiden fenotyypit vastakkaisiin suvusta. Tuntematon mekanismi paljastaa, että ihmisen Tregs voivat aiheuttaa vanhenemista mutta ei apoptoosin vaste naiivi ja T-soluja [13]. Nämä senescent vastaaja-T-solujen aiheuttama Tregs muuttaa fenotyyppien ja sytokiinien profiileja, ja on voimakas ehkäisevästä toiminto. Suurta huomiota on viime aikoina maksettu solujen vanhenemista kuitenkin mahdollista roolia vanhenemisen geeniekspression vuotiaiden syöpäpotilailla mukana Tregs kertymiseen edelleen suurelta osin tuntemattomia.

analysoimiseksi mahdollisen panoksen vanhenemista ja apoptoosin geeniekspression syrjäisten Tregs kertymistä vuotiaiden maligniteettien, me ensin lajitellaan CD4 + CD25

hi Tregs ikääntyneillä UBC potilaille, ja sen jälkeen tutkinut transkription tasot asiaankuuluvien geenin mRNA: n ekspression lajitellaan CD4 + CD25

hi Tregs. Lisäksi seerumin sytokiinien profiileja liittyvät kasvaimen immunopatologia arvioitiin epäsuora arviointi T-solujen toimintaa. Olemme myös arvioinut suhdetta Vanheneminen geeni

Senex

mRNA ilmaisun ja sytokiinien eritystä. Sitten arvioimme solujen apoptoosin lyhytaikaisten viljellyt Tregs vanhoista UBC potilaiden vastauksena H

2O

2-välitteisen stressi jälkeen

Senex

geenin ilmentyminen hiljennettiin RNA häiriöitä. Meidän tiedot osoittivat, että voimistunut

Senex

mRNA ilmaisun Tregs vuotiaiden UBC potilasta korreloivat sytokiinin pitoisuuden ja proapoptoottisten geenin ilmentymistä. Hiljentäminen

Senex

geenien ilmentyminen lisääntyi solujen apoptoosia ja pro-apoptoottinen geeniekspressiota lyhytaikaisissa viljelty Tregs, vastauksena H

2O

2-välitteisen stressiä. Voimistunut

Senex

mRNA ilmaisun yhdessä vähentynyt proapoptoottisten geenien ilmentyminen ja häiriöt sytokiinien synteesi voi selittää leviämisen Tregs ja edistää kasvaimen kehittymisen ja etäpesäke. Lopuksi todettakoon, että tutkimus tarjoaa uuden käsityksen ymmärtäminen oheislaitteiden Tregs kertymisestä vuotiaiden syöpäsairauksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki osallistujat allekirjoittivat selvitys kirjallisen ilmoitti suostumusta. Menettelyt on kuvattu tässä tutkimuksessa hyväksyi eettinen komitea toisen sairaalan Anhui lääketieteellinen yliopisto.

Potilaiden ja terveiden luovuttajien

Perifeerisen veren (PB) yksilöt 38 vuotiaiden UBC potilasta (62 79 vuotias, keski-ikä 70.13), 34-vuotiaiden terveisiin kontrolleihin (60 ja 74 vuotta vanha, keski-ikä 68,72) ja 37 nuorta tervettä verrokkia (22 kohteeseen 56 vuotias, keski-ikä 43.25) tutkittiin Second sairaalan Anhui Medical University 2010-2013. Kukaan potilaista ei saanut syöpähoitoa ennen kirjoilla. Samanaikaisuus autoimmuunisairaus, ihmisen immuunikatovirus (HIV) ja syfilis jätettiin kaikkia rekisteröityjä yksilöitä. Kliiniset lavastus suoritettiin jälkeen preoperative röntgentutkimukseen ja kliinisten parametrien kanssa patologinen tutkimus höyläysleikkaus yksilöitä mukaan TNM luokittelu 1997 (Union Internationale Contre le Cancer).

Vasta-aineet ja virtaussytometria

seuraavat monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), jotka ovat spesifisiä ihmisen pinta-antigeeneille hankittiin Beckman Coulter-Immunotech (Marseille, Ranska): fykoerytriini (PE) konjugoidulla anti-CD4–vasta-aineita (13B8.2 klooni); fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidulla anti-CD25 (B1.49.9 klooni); Peridinin klorofylli Protein-Cychrome5.5 (PerCP-Cy5.5) konjugoitua anti-CD127 (SK3 klooni); kolme värillistä reagenssipakkauksen Tregs sisältävät PE-konjugoitu anti-CD4, FITC-konjugoitu anti-CD25, ja PerCP-Cy5.5-konjugoitu anti-127 (UCHT1, 13B8.2 ja B911-klooni); ja sen isotyyppikontrolli-vasta-ainetta. BU-anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Biouniquer Nanjing, Kiina) käytettiin Treg solujen apoptoosin arviointi. Solut analysoitiin ja lajitellaan käyttäen Coulter Epics XL virtaussytometrillä (FCM) järjestelmän II ohjelmiston ja COULTER EPICS ALTRA HyPerSortTM System expo 32 multicomp Software (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

Examination of Peripheral CD4 + CD25 + CD127

alhainen Solut

Noin 2-5 ml PB kerättiin. Kaikki näytteet antikoaguloitu hepariinilla ja ne tutkitaan 4 tuntia. Noin 100 ui antikoaguloidusta verta inkuboitiin 25 ° C: ssa 15 min 5 ul FITC-konjugoitua CD25-spesifinen mAb, 5 ul PE-konjugoidulla CD4-spesifinen mAb, 5 ul PerCP-Cy5.5-konjugoitua anti-127 mAb ja niiden asianmukaisesta isotyyppikontrolleja. Inkubaation jälkeen, punasolut hajotettiin ja pestiin PBS: ssä kaksi kertaa. Stained solut nopeasti havaittiin käyttäen FCM ja analysoitiin käyttämällä järjestelmän ii ohjelmistoa. Kuten aiemmin on kuvattu [14], taajuus CD4 + CD25 + CD127

alhainen Tregs ilmaistiin prosentteina CD4 + T-solujen peräkkäisellä gating lymfosyyteissä ja CD4 + T-soluja.

eristäminen CD4 + CD25

korkea ja CD4 + CD25 Cells

Noin 15-20 ml PB kerättiin solujen lajittelua. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) eristettiin tiheysgradienttisentrifugoinnilla erottaminen käyttäen CAPPEL LSM Lymfosyyttien Separation Medium (MP Biomedicals, Solon, OH). Eristetyt PBMC: t pestiin 3 kertaa PBS: llä. Noin 1 x 10

7 PBMC pinta värjättiin PE-konjugoidulla anti-CD4 ja FITC-konjugoitua anti-CD25. Sitten CD4 + CD25

korkea ja CD4 + CD25-solut lajiteltiin käyttämällä portit Becton Vastavirtalämmönsiirrin-metrimittausmenetelmille cell-lajittelija (ALTRA HyPerSortTM System). Kuten aiemmin on kuvattu [15], johdonmukainen puhtaus 93% on saatu sekä CD4 + CD25

korkea T-solujen ja CD4 + CD25-Solufraktioiden.

Soluviljely ja hoito

Virtaussytometria järjestetty CD4 + CD25high Tregs ja CD4 + CD25 Teffs maljattiin 24-kuoppaisille levyille (Wuxi Nest Biotechnology Co., Ltd, Wuxi, Kiina), ja niitä viljeltiin RPMI-1640 (HyClone), joka sisälsi 10% FBS: ää ( Gibco) ja antibiootteja 24. Sitten soluja käsiteltiin subcytotoxic pitoisuudet H

2O

2 (100 uM) 2 tunnin ajan, kuten stressin indusoija. Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä inkubaattorissa.

siRNA transfektio

Lajiteltu CD4 + CD25

korkea ja CD4 + CD25-solut vuotiaiden UBC potilaiden ja terveiden luovuttajien transfektoitiin siRNA: lla käyttämällä Lipofectamine 2000 -reagenssia (Invitrogen) valmistajan mukaan protokollia. Lopullinen pitoisuus siRNA oli 33 nM. Dupleksit siRNA kohdistaminen

Senex

mRNA (sekvenssit lueteltu Tab 1) ja ohjaamaan siRNA (salattu sekvenssi) syntetisoitiin Invitrogen (Shanghai, Kiina).

Examination of Cellular apoptosis

Virtaussytometria lajitellaan CD4 + CD25

korkea Tregs ja CD4 + CD25 Teffs värjättiin anneksiini V-fluoreseiini (anneksiini V-FITC) ja propidiumjodidilla (PI, Biouniquer, Nanjing, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Sitten soluja inkuboitiin 15 minuuttia pimeässä ennen kuin niitä on analysoitu virtaussytometrillä (FACSCalibur, Becton Dickinson).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-analyysi

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen). cDNA syntetisoitiin kanssa SuperScript III (Invitrogen) käänteistranskriptaasi synteesi kit. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) käyttäen Mesagreen qPCR Master Mix Plus SYBR Assay (Takara). Käytetyt alukkeet ja niiden sekvenssit on lueteltu taulukossa 1.

seerumin sytokiinien

Seeruminäytteitä UBC potilaiden ja terveiden kontrollien kerättiin. Konsentraatio IL-2, IL-10, IL-17, TNF-α: n ja TGF-β määritettiin käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-pakkauksia), (eBioscience) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Statistical Analyysit

tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 15.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL). Tilastollinen merkitys erot määritettiin parametritonta parittomia Mannin-Whitneyn

U

-testin ja parametrinen Opiskelijan

t

testiä pariksi tai parittomia näytteitä tarvittaessa. Korrelaatiot arvioitiin käyttämällä Pearsonin kerroin testi. Eroja pidettiin merkittävinä p-arvot alle 0,05.

Tulokset ja keskustelu

huomattavasti suurentunut CD4 + CD25 + CD127

alhainen Treg Taajuus ja transkriptiotekijä FoxP3 mRNA ilmentäminen ikäinen UBC Potilaat

Koska kriittinen rooli perifeerisen Tregs kertymistä vuotiaiden syöpäsairauksia, CD4 + CD25 + CD127

matalan Treg taajuus tutkittiin ääreisveren vuotiaiden UBC potilaita, vuotiaiden terveiden kontrollien ja nuorten tervettä verrokkia. Aikaisempien tutkimusten lisääntyminen Treg esiintymistiheys havaittiin molemmissa vuotiaiden UBC potilaiden ja vuotiaiden terveillä verrokeilla, verrattuna nuoriin terveisiin verrokkeihin. Samaan aikaan Tregs taajuus oli merkittävästi suurempi vuotiaiden UBC potilailla kuin vuotiaiden tarkastukset (kuvio 1). Lisääntynyt Tregs taajuus vaikuttaa ikääntymiseen liittyvien immunosuppressio, lisää infektioiden esiintyvyyden ja syövän, ja aiheuttaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta vanhukset [4] – [6]. Eräs tutkimus osoitti ikäriippuvainen viallinen kasvain tila, joka korreloi Tregs korkeus [16]. Tärkeää on, että CD25-ehtyminen johti kasvaimen tila, mikä viittaa siihen, että aged Tregs raja kasvaimen vastaisen immuniteetin [16].

Treg taajuus havaittiin käyttäen virtaussytometrialla. Lisääntynyt CD4 + CD25 + 127

alhainen Tregs taajuudella (10,67 ± 0,58%) havaittiin ikäinen UBC Potilaat verrattuna ikäinen terveisiin kontrolleihin (7,14 ± 0,41%) ja Young terveillä verrokeilla (5,09 ± 0,37%). Ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, tiedot analysoitiin muuttujien Studentin t-testiä. ▴ vs. Young Healthy Controls, P 0,05; △ vs. Ikäinen Terve Controls, P 0,05.

transkriptiotekijä FoxP3 on tärkeä rooli ylläpidossa Itsetoleranssiprosessi ja korkea FoxP3 ilmaisua tarvitaan ehkäisevästä toiminnon ihmisen CD4 + Tregs [17] – [19]. Tässä tutkimuksessa, FoxP3 mRNA ilmaisu sekä vuotiaiden UBC potilaiden ja terveiden yksilöiden tutkittiin. Kuten odotettua, FoxP3 mRNA lisääntyi merkittävästi CD4 + CD25

hi Tregs lajitellaan vuotiaiden UBC potilaiden ja vuotiaiden terveillä verrokeilla, verrattuna nuoriin terveisiin verrokkeihin. Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa FoxP3 mRNA ilmentymisen välillä Tregs vanhoista UBC potilaiden ja vuotiaiden terveiden kontrollien (kuvio 2). Ristiriita Tregs taajuus ja Foxp3 mRNA ilmaisu on saattanut aiheutua toiminnallisten erojen, kuten aiemmat tutkimukset demostrated jotka FoxP3 + T-solut ihmisillä ovat toiminnallisesti heterogeeninen [1]. Voimistunut FoxP3 mRNA ilmaisun yhdessä lisääntynyt Tregs taajuutta, voi lisätä kasvaimet paeta, immuunisuppression ja johtaa tehottomaan kasvain puhdistumaan ikäisten UBC potilailla.

Tregs lajiteltiin FACS, FoxP3 mRNA-tasolla havaittiin reaali kvantitatiivinen PCR. FoxP3 mRNA ekspressio lisääntyi Tregs sekä ikääntynyt UBC potilasta (2

– △△ CT = 0,0272 ± 0,0081) ja ikääntynyt terveillä verrokeilla (0,0184 ± 0,0059) verrattuna Young terveisiin kontrolleihin (0,0097 ± 0,0039) (p = 0,035 , 0,021 vastaavasti). Mitään eroa ei havaittu Tregs FoxP3 mRNA ilmaisun välillä ikäinen UBC Potilaat ja ikääntynyt Terveet verrokit. Ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, päivämäärä analysoitiin Mann-Whitney

U

-testissä. ▴ vs. Tregs järjestetty nuorten terveiden Controls, P 0,05.

voimistunut

Senex

mRNA Expression ja vaimentua Gene Expression of

P53

,

P16

,

P21

ja

kaspaasi-3

CD4 + CD25

hi Tregs Aged UBC Potilaat

arvioimiseksi voidaan tukea reuna-Tregs kertymistä,

Senex

mRNA-ekspressiota CD4 + CD25

hi Tregs ja CD4 + CD25 efektori-T (Teff) soluihin tutkittiin. Merkittävä lisäys

Senex

mRNA ekspressiota havaittiin CD4 + CD25

hi Tregs verrattuna CD4 + CD25 Teffs vanhoilla UBC potilaille, ja tämä lisäys ei havaittu muissa ryhmissä. Samaan aikaan,

Senex

mRNA ilmentymistä Tregs vuotiaiden UBC potilailla oli signicantly korkeampi kuin ikäiset ja nuoret terveillä verrokeilla (kuva 3). Lisäksi mRNA tasot apoptoosin säätelygeenillä Caspase-3, P53, P16 ja P21 (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 ja 2415,85 ± 863,72, vastaavasti) olivat merkittävästi vähentyneet CD4 + CD25

hi Tregs lajitellaan aged UBC potilaista, verrattuna CD4 + CD25 Teffs (kuvio 4). Mitään merkittäviä eroja apoptoosin sääntelyn geeniekspression havaittiin CD4 + CD25

hi Tregs lajitellaan ikäiset ja nuoret terveillä verrokeilla verrattuna Teffs.

Tregs lajiteltiin FACS,

Senex

mRNA-tasolla havaittiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä. Liittyy merkittävä kasvu

Senex

mRNA: n ekspressio havaittiin CD4 + CD25

hi Tregs (2

– △△ CT = 0,8532 ± 0,1078) verrattuna CD4 + CD25 Teffs (0,1564 ± 0,0731 ) in ikäinen UBC potilailla (

p

= 0,027), ja tämä lisäys ei havaittu muissa ryhmissä. Tregs

Senex

mRNA ilmaisun ikäinen UBC potilailla oli signicantly korkeammat kuin ikäinen terveillä verrokeilla (0,0923 ± 0,0519) ja Young terveillä verrokeilla (0,1455 ± 0,0792) (p 0,05 jokaista Mann-Whitney

U

-testi). Data ilmaistiin keskiarvo ± SD. ▴ vs. Teffs lajitellaan Aged UBC potilaista, P 0,05; △ vs. Tregs in ikäinen terveiden verrokkien ja nuorilla terveillä Controls, P 0,05.

Tregs lajiteltiin FACS, mRNA tasot havaittiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä. Vuonna ikäinen UBC Patiens, apoptoosin säätelygeenit kaspaasi 3, P53, P16 ja P21 mRNA: n ilmentymisen (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 ja 2415,85 ± 863,72, vastaavasti) väheni Tregs Aged UBC potilaista (

p

0,05 kutakin U-testi). Data ilmaistiin keskiarvona ± SD. ▴ vs. Teffs lajitellaan Aged UBC potilaista, P 0,05.

Senex

geeni on osoittautunut tarjota ainutlaatuisen portinvartija toiminto SIPS ja apoptoosin reittejä hankittua [12 ]. Yliekspression

Senex

geeni voi aiheuttaa hankittua vanhenemista, ja nämä

Senex

indusoimaan senescent solut olivat resistenttejä tuumorinekroositekijän (TNF-α) indusoi apoptoosin, kun hankittua altistettiin subcytotoxic pitoisuuksia H

2O

2. Lisäksi

Senex

yli-ilmentyminen indusoi kasvua sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot p16 ja oli lasku proteiinin ilmentymisen hyperfosforyloidun Rb. Nämä tulokset osoittivat, että

Senex

aktivoituu p16 /pRb-reitin [12]. Vaikka kriittinen rooli

Senex

geeni suojella hankittua vastaan ​​cellular apoptoosin on hyvin osoittanut, ilmaus

Senex

geenin Tregs edelleen suurelta osin tuntemattomia. Esillä olevassa tutkimuksessa,

Senex

geenin mRNA: n ekspressio havaittiin merkittävästi yliaktiivista reuna CD4 + CD25

hi Tregs lajitellaan aged UBC potilaista, verrattuna Teffs. Ylös säädelty

Senex

geeni voi olla sama tehtävä aiheuttamaan Tregs senescenc ja heitä suojellaan solujen apoptoosin. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että senescent kasvun pidätys on perustettu ja ylläpitää p53 /p21 ja /tai p16 /pRB tuumorisuppressoriproteiinia reittejä [20] – [22]. On tunnettua, että villityypin p53-proteiini voi indusoida solujen apoptoosin [23]. Kaspaasi 3 on alavirtavaikuttajainhibiittorit kysteiiniproteaasin apoptoottisessa reitissä ja sitä pidetään yhtenä tärkeimmistä toimeenpanijoina apoptoosin [24]. P16 geeni ja P21 geeni voi estää sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) ja aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G0-G1 vaiheessa [25] – [26]. Me perusteltu, että solusyklin säätelymolekyyleja, kuten p53, p21, ja p16 saattaa olla mukana Tregs kertymistä vuotiaiden UBC potilailla. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen apoptoosin säätelygeenillä

P53

,

P16

,

P21

ja

kaspaasi-3

, joka voisi edistää solujen apoptoosin aiemmin kuvattu [23] – [26], vaimentua vuonna Tregs vuotiaiden UBC potilaista. Ylös säädelty

Senex

geeni yhdessä alassäädetty proapoptoottisten geeni saattaa heikentää apoptoosin Tregs, ja Tregs kertymistä kehittymistä ja etenemistä vuotiaiden virtsarakon syöpään.

Lisääntynyt tasot TGF-β1, IL-10, IL-17 ja TNF-α seerumin ja alentuneesta IL-2 seerumin in ikäinen UBC Potilaat

epäsuora arviointi T-solujen toiminta, arvioimme seerumin sytokiinien profiileja liittyvät kasvaimen immunopatologia. Verrattuna vuotiaiden terveiden verrokkien ja nuorten terveiden verrokkien (

p

0,05 jokaiselle T Test), oli selvä pitoisuuden kasvu IL-10 (13.03 ± 2,16 pg /ml), IL-17 ( 18,29 ± 3,45 pg /ml), TGF-β1 (16,22 ± 3,35 ng /ml) ja TNF-α (25,18 ± 5,74 pg /ml) seerumissa vuotiaiden UBC potilailla. Samaan aikaan oli lasku IL-2 seerumissa sekä vuotiaiden UBC potilailla (165,29 ± 26,45 pg /ml) ja vuotiaiden terveiden verrokkien (196,69 ± 32,38 pg /ml), kuten verrattuna nuoriin terveisiin kontrolleihin (409,24 ± 90,81) . Kuitenkaan mitään tilastollisesti merkitsevää eroa IL-2 seerumissa ei havaittu vuotiaiden UBC potilaiden ja vuotiaiden terveillä verrokeilla (p = 0,243) (kuvio 5).

ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, tiedot analysoitiin kanssa parametrinen Studentin t-testiä. ▴ vs. ikäinen terveiden verrokkien ja Young terveillä verrokeilla, P 0,05; △ vs. Young Terve Controls, P 0,05.

Koska ensisijainen lähde TGF-β1 ja IL-10 ylläpidossa Itsetoleranssiprosessi ja T-solujen homeostaasin, säätelijä-T-solujen estää T-soluja pääasiassa kautta sytokiinien, kuten TGF-β1: n ja IL-10 [27]. Tutkimus osoittaa, että pitoisuudet seerumissa sekä TGF-β1 ja IL-10 lisäsi merkittävästi vanhoilla UBC potilailla. Kohonneita TGF-β1 ja IL-10 viittaavat siihen, että kertyneet Tregs iäkkäillä UBC potilailla saattaa olla korkea tukahduttava kapasiteetti, estävät antitumor immuunivasteita ja edistää kasvaimen immuunijärjestelmän paeta. TNF-α on prototyyppinen proinflammatorinen sytokiini. Vaikka alun perin osoitettu olevan myrkyllisiä kasvainsolujen suurina annoksina, TNF-α on osoitettu olevan kasvaimen edistäviä toiminto [28]. Samoin, Cytokine IL-17, erittämä Th17 soluja, on yleensä edullista tuottaa T-solujen anti-kasvain immuniteetin, mutta nämä vaikutukset varjoon niiden roolit kasvainten kasvua [29]. Esillä olevassa tutkimuksessa, korkeita TNF-α IL-17-vuotiaiden UBC potilailla voi edistää kasvaimen kehittymisen, kuten aiemmat Tutkimus osoittaa, että ne voivat edistää kasvaimen angiogeneesiä.

interleukiini-2: ta tuotetaan pääasiassa CD4 + T auttajasolujen ja CD8 + T-solujen toisen imukudoselimissä, ja IL-2-tuotanto indusoituu voimakkaasti aktivaation antigeeni [30]. Voi aktivoida useita immuuni-solualaryhmiä, mukaan lukien T-solut, interleukiini-2 on kehityksen kannalta olennaisen tärkeää, selviytyminen, ja toiminta Treg solujen [30] – [31]. Supistuu merkittävästi IL-2 ikä on kuvattu, perustuu pääasiassa ex vivo, jossa T-solujen IL-2 vaikuttaa olevan puutteellinen [6]. IL-2 vaikuttaa soluihin, jotka ekspressoivat joko suuren affiniteetin trimeeristen IL-2R tai matalan affiniteetin dimeerinen IL-2R. Korkea trimeerisen IL-2R lyhytaikaisesti ilmaistaan ​​CD4 + ja CD8 + T-solujen seuraavat TCR aktivaation whileTreg solut ekspressoivat konstitutiivisesti korkeita rimeric IL-2R [30]. Tutkimuksessamme ilmeinen väheneminen IL-2 seerumissa sekä vuotiaiden UBC potilaiden ja vuotiaiden terveillä verrokeilla ei havaittu. Pieninä pitoisuuksina IL-2 voi edullisesti stimuloida Treg solujen läpi suuren affiniteetin Trimeeristä IL-2R, ja edistää syrjäisten Tregs kerääntymistä iäkkäillä potilailla.

Senex

Ekspressio korreloi P53, TGF-β1 ja IL-2: n ilmentymisen in ikäinen UBC Potilaat

tutkia edelleen mahdollisia suhdetta vanhenemista geenin

Senex

mRNA-tasolla ja seerumin sytokiinien profiileja tai apoptoosin säätelygeenillä mRNA ilmentyminen . Käyttämällä Pearson korrelaatio analyysi, meidän tiedot osoittivat, että

Senex

-mRNA korreloi negatiivisesti P53 mRNA: n ilmentymisen (p = 0,012) ja IL- 2 pitoisuus (p = 0,026), kun taas positiivinen korrelaatio

Senex

mRNA ilmaisun ja TGF-β1 pitoisuuden (p = 0,001) oli tajunnut Ikääntyvät UBC Potilaat.

Senex

geenin ilmentyminen korreloi negatiivisesti

P53

mRNA ilmaisu (kuva 6A), mikä tarkoittaa, että

Senex

geeni voi tarjota erikoistoiminnon alaspäin säätäminen pro-apoptoottinen geeni

P53

ilme. Lisäksi

Senex

geenin ilmentyminen korreloi positiivisesti TGF- β1 tason (kuvio 6B), mikä viittaa siihen, että sääteli ilmentymä

Senex

geeni voi selittää suuren tukahduttava kapasiteetti kertynyt Tregs vanhoilla UBC potilailla. Lopuksi,

Senex

geeni korreloi negatiivisesti IL-2 seerumissa (kuvio 6C). Leviämisen Tregs voi suuresti estää CD4 + auttaja-T-solujen ja CD8 + T-solut, ja eritystä estämään IL-2: n ikäisten UBC potilailla.

käyttäminen Pearsonin kerroin testi,

Senex

ekspressio oli korreloi negatiivisesti (A) P53 mRNA ilmaisu (Pearson korrelaatiokerroin = -0,405, p = 0,012) ja (B) IL-2-pitoisuus (Pearson korrelaatiokerroin = -0,362, p = 0,026) on ikääntynyt UBC Potilaat. (C) Positiivinen korrelaatio

Senex

ilmaisun ja TGF-β1 pitoisuus (Pearsonin korrelaatiokerroin = 0,507, p = 0,001) oli tajunnut Pearsonin kertoimella testi.

Äänenvaimennus Down

Senex

gene expression Lisääntynyt Tregs apoptoosi vastaus H

2O

2-välitteisen Stress in vitro

edellä tiedot osoittivat, että voimistunut Senex geenin ilmentyminen korreloi negatiivisesti

P53

mRNA ilmaisun CD4 + CD25

korkea Tregs, mikä merkitsi sitä, että

Senex

geeni voi estää Tregs solujen apoptoosia alaspäin säätelemällä proapoptoottisten geenin ilmentymistä. Sen tutkimiseksi, Tregs vanhoista UBC potilailla on pienempi suhde solun apoptoosin CD4 + CD25

korkea Tregs ja CD4 + CD25 Teffs lajiteltiin, sen jälkeen virtaussytometrianalyysillä jälkeen värjätään anneksiini V-FITC ja PI. Anneksiini V: sitoutuu spesifisesti paljaana fosfatidyyliseriini apoptoottiseen solun pinnalla, kun taas PI voi tunkeutua kuolleet solut ja interkalatoituu nukleiinihapolla [32]. Meidän tiedot raportoitu, että Tregs vanhoista UBC potilailla oli vähemmän anneksiini V + apoptoottisia soluja (0,84 ± 0,34%) verrattuna Teffs (9,27 ± 3,66%) (kuvio S1). Tämä vastaa edellisessä tutkimuksessa [11], mikä viittaa siihen, että Tregs vanhoista UBC potilaat ovat vastustuskykyisempiä apoptoosin.

lisätutkimuksia mahdollista roolia

Senex

geenin Tregs apoptoosin vuotiaiden UBC potilaat, me vaiennetaan alas

Senex

geenin ilmentymisen RNA häiriöitä lyhyellä aikavälillä viljelty Tregs vastauksena H

2O

2 aiheuttamaa oksidatiivista stressiä. H

2O

2 on tunnettu indusoija oksidatiivista stressiä kun toimitetaan subcytotoxic annoksen [33]. Esillä olevassa tutkimuksessa, lajitellaan CD4 + CD25

korkea Tregs ja CD4 + CD25 Teffs altistettiin subcytotoxic pitoisuuksia H

2O

2 (100gM) 2 tuntia. Tuloksemme osoittivat, että 100 uM H

2O

2-hoito lisäsi anneksiini V + apoptoottisten solujen sekä CD4 + CD25

korkea Tregs (11,2 ± 2,6%) ja CD4 + CD25 Teffs (13,1 ± 4,3%), ja mitään merkittävää eroa ei havaittu H

2O

2 indusoi solujen apoptoosin välillä Tregs ja Teffs. Hiljentäminen alas

Senex

geenin siRNA altaan transfektiolla 24 h, follwed 100 uM H

2O

2 hoitoa 2 tuntia, lisääntynyt Anneksiini V + apoptoottisten solujen CD4 + CD25

korkea Tregs ( 21,5 ± 3,4%), mutta joille samoja menettelyjä, anneksiini V + apoptoottisia soluja ei havaittu lisäävän CD4 + CD25-Teffs (13,9 ± 3,1%) (kuvio 7). Ei myöskään havaittu merkittävää eroa solujen apoptoosia sekä Tregs ja Teffs kun soluja vain hoidettiin siRNA transfektion ilman H

2O

2 käsittelyä (kuva 7). Lisäksi hiljentäminen alas Tregs

Senex

geeniekspression johti säätelyä proapoptootti- geeni

P53

,

P16

,

P21

ja

Caspase -3

mRNA-ekspressio vasteena stressille (kuvio 8). Transfektion tehokkuus oli 45 ± 7,2%, joka vahvistettiin fluoresenssileimattuja FAM-siRNA.

Senex

mRNA: n ilmentymisen esto oli yli 90% verrattuna ei-koodaavaa RNA: ta (ncRNA) (kuvio S2).

Lajiteltu CD4 + CD25

korkea Tregs värjättiin anneksiini V -FITC ennen virtaussytometrinen analyysi. -Solujen apoptoosin havaittiin, kuten anneksiini V + apoptoottisia soluja. 100pM H

2O

2 hoitoa 2 tuntia kasvoi apoptoottisia soluja sekä Tregs (11,2 ± 2,6%) ja Teffs (13,1 ± 4,3%), jossa ei ole merkittävää eroa havaittu H

2O

2 indusoiman apoptoosin välillä Tregs ja Teffs. Hiljentäminen alas

Senex

geenin RNA-interferenssin (RNAi) 24 h, follwed H

2O

2 hoitoa 2 tuntia, lisääntynyt apoptoottisten solujen Tregs (21,5 ± 3,4%), mutta käymässä läpi samoja menettelyjä, apoptoottisten solujen ei todettu kasvavan Teffs (13,9 ± 3,1%). Ei havaittu eroja solun apoptoosi Tregs ja Teffs, kun soluja käsiteltiin siRNA transfektion yksin.

Gene mRNA-tasot havaittiin reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää. Sen jälkeen

Senex

geeni hiljennettiin alas 24 tuntia, jonka jälkeen H

2O

2 hoitoa: ssa 2 tuntia, apoptoosin säätelygeenit

kaspaasi-3

,

P53

,

P1

6 ja

P21

mRNA: n ilmentymisen (2

– △△ CT = 6705,73 ± 1124,07, 253,08 ± 16,01, 154,58 ± 35,12 ja 5135,79 ± 985,47, vastaavasti) upregulated CD4 + CD25

hi Tregs (

p

0,05 kutakin U-testi). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. ▴ vs. H

2O

2-käsiteltyjä soluja, P 0,05.

Aiemmat tutkimus osoitti, että

Senex

geeni osaltaan apoptoosiresistenssiin ihmisen EC [ ,,,0],12]. Esillä olevassa tutkimuksessa, hiljentäminen alas

Senex

geenien ilmentyminen lisääntyi Tregs apoptoosin vastauksena H

2O

2 aiheuttamaa oksidatiivista stressiä.