Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

mitokondrio-DNA (mtDNA) mutaatioita on raportoitu eri kasvaimissa. Kuitenkin, ei ole tietoa niiden ajallisesta kehityksestä mtDNA mutaatioita /sisällön muutos ja niiden laajuus on normaalin ja epänormaalin limakalvon jatkuvasti alttiina tupakansavulle keuhkosyöpäpotilaiden.

Menetelmät

Tutkimme rakenteessa mtdna muutos (mtDNA mutaatio ja sisällysluettelo) 25 hengitysteiden limakalvojen koepaloja, vastaavat kasvaimet ja normaali imusolmukkeet saatiin kolmesta primaarisessa keuhkosyövässä. Lisäksi tutkimme rakenteessa mtDNA mutaation vastaavat kasvaimia ja normaali imusolmukkeet saatu kahdeksan muun primaarisessa keuhkosyövässä. Koko 16.5 kb mitokondrion genomin sekvensoitiin Affymetrix Mitochip v2.0 sekvensointialustamme jokaisessa näytteessä. Tutkia mtDNA sisällysluettelo, suoritimme reaaliaikainen PCR-analyysi.

Keskeiset havainnot

hengitysteiden limakalvon koepaloja saatiin kolmesta keuhkosyöpäpotilaita olivat histopatologisesti negatiivisia mutta näytteillä useita klonaalisia mtDNA mutaatioita havaittavissa vastaavat kasvaimia. Yksi potilaista operoitiin kahdesti poistamaan kasvain oikean ylä- ja vasen alempi lohko vastaavasti sisällä span kaksi vuotta. Molemmat kasvaimia esiintyi kaksikymmentä identtiset mtDNA mutaatioita. Mtdna sisältö kasvoi merkittävästi (P ​​ 0,001) keuhkosyöpä ja kaikki histologisesti negatiivinen limakalvon biopsiat paitsi yksi kontrolliin verrattuna imusolmuke.

Johtopäätökset /merkitys:

tulokset dokumentoida määrin massiivinen klonaalisia laikkuja, jotka kehittyvät elinaikanaan tupakoitsijoita ja lopulta aiheuttaa kliinisesti merkittäviä syöpiä. Nämä havainnot valottavat sairauden laajuuden hengitysteiden tupakoijien jäljitettävissä mtDNA mutaation. MtDNA mutaatio voisi olla luotettava työkalu molekyyli- arviointiin hengitysteiden epiteelin altistuu jatkuvasti savua sekä taudin havaitsemista ja seurantaa. Toiminnallinen analyysi patogeenisten mtDNA mutaatiot voivat olla hyödyllistä ymmärtää niiden merkitys keuhkojen kasvaimien syntyyn.

Citation: Dasgupta S, Yung RC, Westra WH, Rini DA, Brandes J, Sidransky D (2009) jälkeen mitokondrioiden jalanjäljet ​​kautta Long Limakalvon Polku Lung Cancer. PLoS ONE 4 (8): e6533. doi: 10,1371 /journal.pone.0006533

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 16, 2009; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2009; Julkaistu: 06 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Dasgupta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat EDRN apurahan UO1CA084986. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen mitokondriaalisen DNA (mtDNA) on 16,5 kb kaksijuosteiseen suljettu rengasmainen molekyyli, joka koodaa 12S ja 16S rRNA, 22 tRNA ja 13 proteiinien olennaisia ​​mitokondrioiden hengitysteiden monimutkainen [1] – [2]. Suurin osa ihmisen solut sisältävät satoja kopioita mitokondriaalisen DNA (mtDNA) ja lähes kaikki nämä mtDNA kopiot ovat identtisiä eli homoplasmic syntyessään [1] – [2]. Mutaatio korko mtDNA on noin 10 kertaa suurempi kuin ydinvoiman genomista DNA (nDNA) [1]. Tähän mennessä klonaalinen mtDNA mutaatioita on raportoitu eri kasvaimissa [3]. On vain vähän tietoa ajan myötä näistä mutaatioista ja niiden laajuus on normaalin ja epänormaalin limakalvon altistuvat tupakansavulle.

Keuhkosyöpä kuolee yli miljoona ihmistä maailmanlaajuisesti tupakointi on tärkein riskitekijä [4] . Yhdysvalloissa oli yli 215020 keuhkosyöpää ja arviolta kuoleman 161840 vuonna 2008 [4]. Vaikka merkittävää parannusta hoitomuodot kirurgia, platina kemoterapian ja sädehoidon yksin tai yhdistelmänä, koko 5 vuoden pysyvyys on vain 15% [4]. Kahdeksankymmentä viisi prosenttia keuhkosyövässä esiintyy tupakoijien [4]. Lisäksi vaikuttaa potilaat ovat merkittävä riski kehittämistä varten toisen primaarikasvaimen koko niiden elinkaaren ajan. Siten kehittäminen sopivia menetelmiä varhaisen taudin havaitsemista, seurantaa ja jatkuvan arvioinnin hengitysteihin primaarisessa keuhkosyöpä ovat ensiarvoisen tärkeitä.

Tässä tutkimuksessa tutkimme rakenteessa mtdna muutos (mutaatio ja DNA-pitoisuuden) hengitysteiden limakalvon koepaloja saatu seurata primaarisessa keuhkosyövässä. Vastaavat kasvaimet ja normaali imusolmukkeet tutkittiin myös näistä potilaista. Kaikki koepaloja ilmestyi epäilyttävä ja epänormaali alle auto-fluoresenssi bronkoskopia, mutta ne olivat histologisesti negatiivisia. Mutta kartta mtDNA muutoksia näissä koepaloja oli silmiinpistävää ja tarjosi ainutlaatuisen käsityksen laajuuden mitokondriohäiriöitä ja kasvava riski pahanlaatuisten kasvainten potilailla, jotka jatkavat tupakointia.

Tulokset

Rakenteessa mtDNA mutaatio potilailla

Kuvio 1 esittää rakenteen mtDNA mutaatioita potilaan 1. Tämä potilas käyttää kahdesti span kahden vuoden sekä keuhkoihin. Ensimmäinen kasvain (T1) poistettiin kirurgisesti vuonna 2002 oikeassa ylä koru, jonka jälkeen poistamalla toisen kasvaimen (T2) vuonna 2004 vasemman alemman koru. Viisi hengitysteiden limakalvon koepaloja otettiin tärkeimmistä carina (M1), oikea alempi (M2 ja M3) ja vasen ylempi lohko (M4 ja M5) ympäröivä primaarikasvaimen sivustoja sekä keuhkoihin kuin kuvattu. Limakalvon koepaloja otettiin aikana seuranta tämän potilaan kirurgisen poiston jälkeen toisen kasvain vasemmalta alempi koru. Kaikki viisi limakalvon koepalat histopatologisesti ilman todisteita dysplasia, ja kuitenkin oli merkittävää 3-11 mtdna mutaatioiden (Fig. 1). Yhteensä 16 mtdna mutaatioita havaittiin limakalvon tämän potilaalle. Ensimmäinen koepalan päässä carina näytteillä 3 mtdna mutaatioita (M1, Fig. 1A). Toinen Biopsia osoitti 5 mutaatioista, myös 2 päällekkäiset mutaatiot M1 (

A2249C

,

A8341C

, yhtenäisen värin, Fig. 1A-B). Kolmas Biopsia osoitti 7 mtDNA mutaatioita, mukaan lukien 3 päällekkäiset mutaatiot M2 (

A3742C

,

G8836C

ja

T15982G

, yhtenäisen värin, Fig. 1B-C). Neljäs koepala kanna 7 mtDNA mutaatioita, kuten päällekkäiset mutaatiot M3 (

A3742C

,

T3756C

,

G6035C

,

G8836C

ja

T15402A

, yhtenäisen värin, Fig. 1A-D), M2 (

A3742C

,

A8341C

ja

G8836C

, yhtenäisen värin, kuviot. 2B ja D) ja M1 (

A8341C

, yhtenäisen värin, Fig. 1A-D). Biopsia otettu vieressä kasvain vasemmassa alempi lohko näytteillä 11 mtDNA mutaatioista, myös päällekkäiset mutaatiot M1 (

A2249C

,

T2516C

ja

A8341C

), M2 (

A2249C

,

A8341C

,

G8836C

ja

T15982C

), M3 (

C4014A

,

G8836C

ja

T15982G

) ja M4 (

A8341C

ja

G8836C

) koepaloja (Fig. 1A-E, yhtenäisen värin). Sekä invasiivisia kasvaimet (T1 ja T2) oli 20 identtiset mtDNA mutaatioita, mukaan lukien kaikki 16 mutaatiot havaitaan ympäröivän 5 normaali limakalvo (Fig. 1 E-F) (Odds-suhde 6,9 ​​x 10

10:01). Kolmetoista näistä 20 (65%) mutaatioita oli koodaavat alueet (COI, COII, ATP6, ND1, ND4 ja CYTB) ja 7 (35%) esiintyi ei-koodaavat alueet (12SrRNA, 16SrRNA, tRNA-lysiini, D-loop ) (Fig. 1, F, pohja suorakulmio). Ylimääräiset 4 mutaatiot havaittiin kasvaimia olivat edustettuina kuvassa. 1E (Pohja suorakaide, musta, alleviivattu). Kaksi (

G8836C

ja

A8341C

) kolmeen mtDNA mutaatioita (

A2249C

,

A3742C

ja

T15982G

) olivat läsnä 4/5 ja 3/5 limakalvon vastaavasti ja molemmissa kasvaimet (Fig. 1). Edustava histologinen mikrovalokuvia limakalvon ja kasvaimen esitetään kuvioissa. 1A ja 1F. Eri värikoodeja vastaavat tiettyä mutatoitunut mtDNA kuvio osoittaa klonaalisen leviämisen mtDNA mutaation kautta limakalvon ja lopulta synnyttänyt geneettisesti liittyviä kasvaimia (ympäröity).

Potilas leikattiin kahdesti 2002 ja 2004 poisto kasvaimet oikean ylä- (T1) ja vasen alempi lohko (T2) vastaavasti. Viisi bronchoscopically epänormaali hengitysteiden limakalvon koepaloja saatiin seuraavat toinen leikkaus (T2) Tämän potilaan main carina (M1), oikea ylempi lohko (M2 ja M3) ja vasen alempi lohko (M3 ja M4) ympäröivä molemmat kasvaimet kuten kuvataan (paneeli A -E). Limakalvon koepaloja oli merkittävää 3-11 mtDNA mutaatioita kuin edustettuina eri väriä (paneeli A-E). Identtiset mutaatiot näkyvät samanvärisiä eri koepaloja ja kasvain. Eri väri-koodia käytetään myös kunkin limakalvon osoittaa klonaalisen etenemistä vauriot sekä keuhkojen kertynyt mtDNA mutaatioita. Edustavia histologista mikrovalokuva limakalvolla että kasvain on esitetty paneeli A ja F. Sekä kasvaimet T1 ja T2 näytteillä kaksikymmentä identtiset mtDNA mutaatioita (E-F, Pohja suorakaide), mukaan lukien kaikki 16 mutaatiot näytteille viisi limakalvon koepaloja (Hyväksytty väri). Ylimääräiset 4 mtDNA mutaatioita havaittiin kasvaimia edustettuina alleviivattu mustalla värillä pohjassa suorakulmion (paneeli E-F). Kaksi mtDNA mutaatioita (

G8836C

ja

A8341C

) oli läsnä 4/5 ja 3 muuta mutaatiota (

A2249C

,

A3742C

ja

T15982G

) oli läsnä 3/5 limakalvon koepaloja. Kasvaimia ympäröi ilmoittamaan kehittämiseen klonaalinen limakalvon laastaria. T1: Kasvain oikean ylä koru; T2: Kasvain vasemman alemman koru; M: Mucosa.

Potilas leikattiin 2005 kirurginen poisto kasvaimen oikealta ylempi koru. Viisi bronchoscopically epänormaali hengitysteiden limakalvon koepaloja saatiin main carina (M1), oikea alempi lohko (M2 ja M3) ja oikea ylempi lohko (M3 ja M4), joka ympäröi kasvaimet kuten kuvataan (paneeli A-E). Limakalvon koepaloja oli merkittävää 2-5 mtDNA mutaatioita kuin edustettuina eri väriä (paneeli A-E). Identtiset mutaatiot näkyvät samalla värillä eri koepaloja ja kasvain. Eri värikoodi käytettiin myös jokaista limakalvon osoittamaan klonaalisen etenemistä vaurioita kertynyt mtDNA mutaatioita. Edustavia histologista mikrovalokuva kasvain ja normaali limakalvo on esitetty paneeli A ja D. kasvain näytteillä 9 mtdna mutaatioita (edustettuna Bottom suorakaide), mukaan lukien kaikki 8 mutaatiot näytteille viisi limakalvon koepaloja (Hyväksytty väri). Ylimääräinen mtDNA mutaatio (

T7001C

) havaittiin kasvain on alleviivattu mustalla pohjalla suorakulmio. Kasvaimen ympäröivät osoittamaan sen kehittämiseen klonaalinen limakalvon laastaria. M: Mucosa.

potilas 2, viisi limakalvon koepaloja saatiin tärkeimmistä carina (M1), oikea alempi lohko (M2 ja M3) ja oikea ylempi lohko (M3 ja M4), joka ympäröi ensisijainen kasvain oikea keuhko, kuten on esitetty kuviossa 2. Kaikki 5 vauriot olivat histopatologisesti normaalia katsottuna potilas 1 mutta esillä erilaisia ​​2-8 mtDNA mutaatioita. Ensimmäinen vaurio näytteillä 2 mutaatiot jossa sillä toinen näytteillä 3 yhdellä samanlainen mutaatio jaettu M1 (

A10995C

, Fig. 2A-B, yhtenäisen värin). Kolmas leesio (M3) oli 3 mtDNA mutaatioita yhdellä päällekkäisiä mutaatio M2 (

A14917C

) ja M1 (

G8836C

) (Fig. 2A-C, yhtenäisen värin). Neljännessä leesio (M4), 3 mutaatioita havaittiin yhdellä päällekkäisiä mutaatio (

G8836C

) M3 ja M1 (Fig. 2A-D, yhtenäisen värin). Viides limakalvon vaurio (M5) osoitti 5 mutaatioista, myös päällekkäiset mutaatiot M4 (

A3984C

ja

G8836C

), M3 (

A6831C

,

G8836C

ja

A14917C

), M2 (A14917C) ja M1 (

G8836C

) (Fig. 2A-E, yhtenäisen värin). Primaarikasvaimen resekoitu oikealta ylempi koru tämän potilaan näytteillä 9 mtDNA mutaatioita, mukaan lukien kaikki 8 mutaatiot havaitaan ympäröivään 5 normaalisti limakalvo yksilöitä. Kaikki nämä mutaatiot (9/9) olivat mitokondrion koodaavat alueet (ND1, COI, ATP6, ND4, ND5 ja CYTB) on mtdna (Fig. 2E, pohja suorakulmio). Ylimääräiset mutaatio (

T7001C

) havaittiin kasvain on kuvassa 2E (alhaalla oikealla suorakulmion, musta, alleviivattu). Yksi mtDNA mutaatio (

G8836C

) oli läsnä 4/5 ja toisen mutaation (A14917C) oli läsnä 3/5 limakalvon kudosnäytteistä (Fig. 2). Molemmat mutaatiot havaittiin myös vastaavan kasvain (Fig. 2E). Edustava histologinen mikrovalokuvia limakalvon ja tuumorin on esitetty kuviossa. 2A ja E). Eri värikoodeja vastaavat tiettyä mutatoitunut mtDNA kuvio osoittaa klonaalisen leviämisen mtDNA mutaation kautta limakalvon ja lopulta synnyttänyt geneettisesti liittyvä kasvain (ympäröity). Neljä mtDNA mutaatioita (

G8836C

,

T3756C

,

A3984C

ja

A7251C

) olivat samanlaiset potilailla 1 ja 2 (Fig. 1-2) .

Potilas 3 oli tupakoi kanssa bronchoalveolar syöpä ja esillä ainoastaan ​​2 mtDNA mutaatioita kasvain (taulukko 1). Mutaatio ei havaittu normaalissa limakalvolla. Yksi marginaali metaplasiaa tästä potilas ei myöskään osoittanut mitään mtdna mutaatio (taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, perustavanlaatuinen ero alan cancerization ja laajuus klonaalisen laastarit keskuudessa tupakoi kasvain. Sekvensoimme 8 muiden potilaiden mtDNA mutaation ja löysi erilaisia ​​1-9 mutaatioiden primäärikasvaimissa kontrolliin verrattuna, joista useimmat olivat koodausalueissa mtdna (taulukko 2). Muut kuin somaattiset mtDNA mutaatioita, me myös havainneet muutamia iturataa mtDNA sekvenssivariantit kasvaimissa ja vastaava limakalvon koepaloja kaikista potilaista (taulukko 3).

muuttaminen mtDNA sisältöä keuhkoissa syöpäpotilailla

suoritetaan kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR määrittämiseksi mitokondrion sisällön potilaiden limakalvolle, vastaavat kasvaimet, ja ei-neoplastisia imusolmukkeet. Vain yksi poikkeus yhden biopsia (potilas 1, M1) mtdna-pitoisuus oli merkittävästi korkeampi (P 0,001) keuhkosyöpä ja kaikki histologisesti normaalin limakalvon koepaloja kontrolliin verrattuna imusolmuke (Fig. 3). Tämä oli myös totta limakalvolla ja metaplastiset marginaali tunnistettu potilas 3, ei-tupakoitsija (Fig. 4). Mtdna pitoisuus nostettiin ilman vastaavaa mtdna mutaatio (Fig. 4). Siten lisääntynyt mtDNA sisältö on ominaisuus laaja limakalvon kentät sekä tupakointi ja savuttomia keuhkosyöpäpotilaiden.

mtDNA pitoisuus mitattiin multiplex reaaliaikainen PCR käyttäen ydinvoiman koodattua β-aktiini ja mitokondriot koodattu COI-geenin . Suhde COI /β-aktiini vastaa kertainen ero verrattuna kontrolliin. Mtdna sisältö kasvoi merkittävästi (P ​​ 0,001) limakalvon biopsiat ja vastaavat kasvaimia verrattuna normaalia ohjausta sekä potilailla, kuten on osoitettu. N: Normaali imusolmuke; M: limakalvon; T: Kasvain. * P-arvo 0,05 verrattuna normaaliin imusolmuke.

mtDNA sisältö kasvoi merkittävästi (P ​​ 0,05) limakalvon (M) vieressä normaali (NT) ja metaplastiset marginaali (MT) verrattuna normaaliin imusolmuke käytettiin kontrollina.

keskustelu

mitokondrio-DNA mutaatiot ovat yleisiä eri kasvaintyypeissä [3], ja havaittiin esineoplastiset vaurioiden siten ilmoittamaan niiden esiintymisestä varhaisessa vaiheessa monivaihepumppujen syövän etenemistä [5]. Havaitseminen mtDNA mutaatio on helpompaa ja luotettavampaa kuin tuman DNA: han, koska niiden suuren kopiomäärän syöpäsoluissa [6] – [7]. Siksi tarkastelemalla mtDNA mutaatioita pieni määrä solujen eri vaiheissa kasvaimen etenemistä on mahdollista. Voidakseen käyttää mtDNA mutaation puolueeton väline havaitsemiseen klonaalisen solupopulaatioiden, sekvensointi koko mitokondrion genomin on tarpeen ja on tehtävä yhdessä sopivan ei-neoplastisia ohjaus johtuen erittäin Monimuotoinen luonto on mtDNA [7]. Esillä olevassa tutkimuksessa, monistaminen huomattava määrä mtdna hyvin pieni limakalvon biopsiat, kasvain ja vastaavat normaalit kudokset meille mahdollisuuden skannata koko mitokondrion genomissa. Tämä toteutetaan helposti sen Affymetrix korkea suoritusteho Mitochip v2.0 sekvensointialustamme aiemmin osoitettu olevan luotettava työkalu havaitsemiseksi mtDNA mutaatio [5], [8]. Tämä uusin versio Mitochip (verrattuna Mitochip v1.0) ei ole vain korkea herkkyys mutaation havaitsemiseen, joka käsittää koko mitokondrion genomissa, mutta myös kykenee määrittämään heteroplasmic mtdna mutaatio [8] – [9]. Havaitut mutaatio voidaan todentaa tavanomaisin sekvensoimalla. Kuitenkin Mitochip v2.0 ei voi havaita pieni lisäys /poisto, koska se on suunniteltu ensisijaisesti havaitsemaan mtDNA mutaatio. Mutaatiot havaittu tässä tutkimuksessa olivat somaattiset tai ituradan luonteeltaan ja vahvistettiin johdu mitään haplotypic vaihtelu [5], [8] – [9]. Näin ollen kaikki de novo mutaatiot havaitaan ja tässä tutkimuksessa liittyvät kasvaimen fenotyypin.

potilas 1, pieni seurata koepaloja otettiin alueilla hengitysteiden limakalvon joka ilmestyi epänormaali alle autofluoresenssi-Bronkoskopia. Vaikka kaikki koepaloja olivat histopatologisesti negatiivisia ja ilman dysplastic muutoksia, niillä oli useita mtDNA mutaatioita joista osa jaettiin laajoilla raitoja hengitysteiden epiteelin. Nämä tulokset osoittavat klonaalinen leviämisen useita mtDNA mutaatioita koko hengitysteiden limakalvolla. Clonal leviämisen p53-mutaation ja microsatellite muutoksia (LOH ja MA) useilla pesäkkeitä normaalissa esiintyvät keuhkoepiteeliverrokkiin on raportoitu aikaisemmin [10] – [12]. Esillä olevassa tutkimuksessa, dramaattinen laajeneminen mutantti keuhkoputkien epiteelin klooneista jäljitettävissä mtDNA mutaation suurella tarkkuudella ja puolueettomasti sekvensoimalla koko mitokondrion genomin jokaisessa näytteessä.

On todennäköistä, että koepaloja sisälsi heterogeeninen laastaria solujen klonaalisia muutoksiin hankkimat satunnainen mitokondrioiden geneettinen ajautuminen [7]. Kuten potilas 1, suurin osa klooneista jaettu useasta samanlaisesta mtdna mutaatioita sekä muita mutaatioita tarpeen klonaalisen ekspansion (Fig. 5). Fittest kloonien edullisempaa mtDNA /nDNA mutaatioita edennyt limakalvon ja lopulta johti kahteen ilmeisesti riippumatonta ensisijainen kasvaimia, jotka ovat kuitenkin varmasti yhdistää samanlainen mtDNA mutaatioita [7], [13]. Detection kaikkien limakalvon mtDNA mutaatioita sekä kasvaimet resektoitiin sisällä span 2 vuoden tukee voimakkaasti niiden kloonialkuperää. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että kaksi erillistä kasvaimia vastakkaiselta keuhkot osoittivat useita identtisiä mtDNA mutaatioita; kertoimet tämän esiintyminen sattumalta ovat häviävän pieni. Ensimmäinen kasvain todennäköisesti kehittynyt yksi hallitsevampi klooneja hajallaan oikealla keuhkoissa hankittuaan tarvittavat mtDNA /nDNA muutoksia riittävät edistämään kasvaimien syntyyn. Toinen kasvain todennäköisesti kehittynyt samalla tavalla vasen keuhko mutta hankittu nDNA mutaatiostatuksesta osumia useita kuukausia myöhemmin tai muuten se voisi olla keuhkojen etäpesäke. Tiedot potilas 2 tukee myös laaja klonaalinen leviämisen mtDNA mutaatioita ja myöhemmän kasvainten kehittymiseen saatuaan riittävät mtDNA ja /tai nDNA muutoksia. Korkean resoluution genomin laajuinen analyysi näistä koepaloja ja vastaavat kasvaimet paljasti klonaalinen muuttaminen useiden keskeisten nDNA koodattu geenit näillä potilailla (julkaisematon havainto), jotka edelleen tukevat tätä käsitystä. Kuitenkin, koska ei ole saatavilla, ei voitu tutkia, kuvio mtdna muutoksen taajuuksien suhteellisen suuri määrä potilaita.

Mahdollinen klonaalisen kehittyminen ja keuhkojen kasvainten on kuvattu. Jokainen limakalvon koepala (Circled, M1-M5) jakoi identtiset mtDNA mutaatioita (Hyväksytty väri) sekä muita mutaatioita heterogeeninen limakalvon kenttään. Fittest klooneja syntyi primäärikasvaimissa (T1-T2) kanssa valikoivampi mtDNA mutaatioita (Yhteensä 20 mtDNA mutaatioita, 16 oli jaettu M1-M5 kuten kuviossa 1).

Läsnäolo usein ituradan mtDNA kvenssivariantit ehdotettiin indikaattorina korkean herkkyyden geneettinen tausta, jotka saattavat helpottaa samanaikainen somaattinen mutaatio mtDNA ja nDNA [14]. Havaitseminen klonaalisen ituradan sekvenssivariantit ja samanaikainen somaattiset mtDNA mutaatioita kasvaimissa ja limakalvon keuhkosyöpäpotilaita voimakkaasti tukevat tätä käsitystä.

Patogeenisia mtDNA mutaatioita voivat ilmoittaa niiden toiminnallinen panos etenemistä kasvaimia. Niistä mtDNA mutaatioita havaittu näillä potilailla koodaus G8836C (ATP6) mutaatio on äskettäin raportoitu potilailla, joilla leberin tauti (LHON) kaltaista oireyhtymää ja kilpirauhasen kasvaimet [15] – [16]. Lajien välinen säilyttäminen Tämän nukleotidin on korkea ja tämä mutaatio on ennustettu olevan patogeeninen [15]. Erityisesti tämä mtDNA mutaatio havaittiin 8/10 limakalvon biopsiat ja kaikki 3 kasvaimet tarkastellaan sekä potilaiden tukevat toiminnallinen panos kasvainten synnyssä. Kuitenkin edelleen toiminnallinen analyysi on tarpeen kiinnittää enemmän lopullista johtopäätöstä. MtDNA mutaatio sama nukleotidipaikasta eri keuhko- ja munuaissyövän potilaat raportoitu aiemmin [16]. Kun otetaan huomioon patogeenisen /myötävaikuttaa mtDNA mutaatio, tietyn mtDNA mutaatio vaikutti on valittu eri kasvaintyypeissä. Teimme samanlainen havainto tässä esillä olevassa tutkimuksessa ja siten esiintyminen patogeenisten G8836C ja muut samanlaiset mtDNA mutaatioita havaittiin eri keuhkosyöpäpotilaita tuskin johtua näytteen saastuminen. On huomattava, että G8836C patogeeninen mitokondrion mutaatio havaitaan LHON ja kilpirauhasen syöpä [15] – [16], ja usein myös tutkimus osoittaa, ja toiminnallinen rooli keuhkosyövän etenemiseen.

Useimmat näistä mutaatioista havaittiin koodaavan alueet mtDNA jotka saattavat johtaa häiriöitä hengitys- monimutkainen ja johtaa lisääntymiseen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että mtDNA mutaatiot johtavat kasvuun ROS ja edistää kasvainsolujen kasvua, lisääntymistä ja etäpesäkkeiden [17] – [20]. Eräs tutkimus on osoittanut kasvua mtDNA kopiomäärän keuhkojen fibroblasteista kuin varhainen tapahtuma vastauksena oksidatiivista stressiä [21]. Äskettäin kasvu mtDNA sisällön tunnistettiin ikääntymiseen ja tupakointi liittyy keuhkojen-kudosten ja ensisijaisen pään ja kaulan okasolusyöpää [22] – [23]. Histologisesti negatiivinen limakalvojen koepaloja samoin kasvaimia sekä potilaiden eläintutkimuksissa merkitsevästi kohonnut mtDNA sisältöä. Siten näyttää siltä, ​​että kehitys homoplasmic mtdna mutaation ja klonaalisen leviämistä, mitokondrion sisältö kasvaa. Huomattavaa on, että jotkin mutaatiot (mukaan lukien

G8836C

) oli sama sekä potilailla, jotka olivat säännöllisiä tupakoitsijoita, mikä viittaa vaikutukset yhteisten tavoitteiden tupakan syöpää aiheuttaville aineille on mtDNA. Tiheä mtDNA mutaatioita tupakoitsijoiden ehdottaa myös keskeinen rooli varhaisen mitokondrioiden geneettisiä muutoksia etenemistä niiden kasvaimia.

Tässä tutkimuksessa klonaalis- etenemistä histologisesti normaalin näkymisen hengitysteiden limakalvon läpi kasvain oli jäljitettävissä mtDNA mutaatioita. Tämä on kaikkein lopullinen tutkimus osoittaa, että 2 kasvaimia vastakkaiseen paikoissa yhdellä potilaalla (potilas 1) polveutuvat samasta kloonista. Emme kuitenkaan voi tutkia enemmän seurata potilaita puutteen bio-yksilöitä. Dokumentointi näitä laajoja klonaalisia populaatioita kanssa mtDNA mutaatioita valottaa haasteet varhaisen havaitsemisen lähestymistapoja. Lisäksi kohdentamalla mtDNA mutaatiot voivat olla avuksi perustuu molekyylien havaitsemiseen ysköksen ja veren DNA kemopreventatiivisesti lähestymistapoja ja uusia biologisia hoitomuotoja. Edelleen toiminnallinen analyysi yhteisen mtDNA mutaatiot ansiosta voimme ymmärtää paremmin niiden erityinen rooli syövän etenemiseen ja chemoresistance.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden historiasta ja keuhkojen näytteet

kolme seurannan keuhkosyöpäpotilaita tutkittiin mtDNA mutaation kanssa allekirjoitettu suostumus on Johns Hopkins IRB hyväksytty protokolla. Potilas 1 oli 75-vuotias nainen, joka tehtiin oikeaan ylä lobectomy vuonna 2002 vaiheessa II B huonosti eriytetty levyepiteelisyöpä (T3N0MX). Vuonna 2004 hän koki lähti alempi lobectomy toisen vaiheen IIB (T2N0MX) levyepiteelikarsinooma. Potilas 2 oli 58-vuotias mies, joka vuonna 2005 tehtiin oikea ylempi lobectomy varten vaiheessa IA (T1N0MX) kohtuullisesti erilaistunut okasolusyöpä. Molemmat potilaat olivat säännöllisiä tupakoitsijoita yli 10 vuotta. Potilas 3 oli 48-vuotias nainen, joka tehtiin oikea ylempi lobectomy varten vaiheessa IA (T1N0MX) bronchioloalveolar syöpä. Tämä potilas oli tupakoi. Seuranta-aikana, hengitysteiden limakalvon koepalat otettiin alueilta epäilyttäviä lievää tai kohtalaista -kar- tai karsinooma in situ (CIS), joka perustuu Auto-fluoresenssi-Bronkoskopia (R.Y. ja J. B.). Kaikki biopsianäytteistä otettiin samanaikaisesti. Koepalat histologisesti arvioitiin keuhkojen patologi (W.H.W). Kirurgisesti lei- kattu keuhkokasvaimet saatiin myös kunkin potilaan. Kontrollina vastaaviin normaaleihin imusolmuke free kasvaimen käytettiin kussakin tapauksessa. Lisäksi olemme myös sekvensoida vastaaviin normaaleihin ja kasvaimen kudokset 8 muista keuhkosyöpäpotilaita (taulukko 4).

Mitokondrioiden koko genomin monistamisen ja sekvensointi

Genominen DNA uutettiin saamiemme standardi protokolla mikropaloitelluista kasvain kudosten ja muut yksilöt [5]. Olemme monistettiin koko mitokondrion genomista DNA: ta 10 ng genomista DNA: ta templaattina käyttäen REPLI-g mitokondrio-DNA: n monistuksen mukainen pakkaus valmistajan protokollan, kuten on kuvattu aiemmin [8]. Monistettu DNA puhdistettiin sitten käyttäen DNA MINIAMP Cleaning (Qiagen, Valencia). Olemme tutkineet puhtaus monistetun mtDNA ja tuman DNA: n kontaminaation PCR-analyysillä käyttäen aluketta, joka on spesifinen mitokondrioita koodatun COXI /COXII ja ydin- koodattu β-aktiini. Neljä viiteensataan nanogrammaa puhdistettua mtDNA käytettiin sekvensointiin sen Affymetrix MitochipV2.0 platform [5], [8].

Mitochip v2.0 sekvensointi erilaisia ​​analyysi

Suoritimme pirstoutuminen, merkinnöistä ja Chip hybridisaatio mtdna kohti Affymetrix protokollan asianmukaiset tarkastukset kuten aiemmin on kuvattu [5], [8]. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Affymetrix GSEQ ohjelmiston ja tarkistettu Cambridge Reference Sequence (RCRS) käytettiin viite-sekvenssi [24]. MitoAnalyzer ohjelmisto hyödynnettiin myös tarkistaa mtDNA mutaatioita eri nukleotidiasemista kuten aiemmin on kuvattu [5], [8] .Somatic mutaatioita tunnistettiin emäsparin muutokset mtDNA verrattuna normaaliin mtDNA sekvenssi löytyy imusolmukkeiden vapaa kasvaimen. Ituratamutaatiot tunnistettiin emäsparimuutoksia läsnä normaalissa lymfosyyttien sekä kasvain kudosten ja /tai marginaali näytteitä verrattuna RCRS [14]. Itu linja sekvenssivariantti nimettiin novel kun poissa ihmisen mitokondrioiden tietokanta ja muiden asiaan tutkimuksessa samalla haplogroups [14], [25]. Sekvenssivariantit aiemmin raportoitu eri sairauksia kuten syöpää on nimetty patogeenisia [14], [25].

Quantitative real-time PCR

tutkia mtDNA sisältöä, käytimme 7900HT sekvenssi tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA) monistamiseen tuman DNA (nDNA) koodattuja β-aktiini ja mtDNA koodattu sytokromi C oksidaasi I (COI) käyttämällä genomista DNA templaattina kuten aiemmin on kuvattu [26].

tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

-testi suoritettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi. P-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki P-arvot tuotetaan olivat kaksipuolisia.

Ristitulosuhde

Todennäköisyys 20 satunnaista identtiset mtDNA mutaatioita esiintyy sattumalta kahdessa erillisessä kasvaimia lokalisoitu vastakkaiseen keuhkoissa samasta potilaasta laskettiin [ ,,,0],(genomin koko) x (mutaatiot)] x [(genomin koko) x (mutaatiot)] eli [16,499:1 × 20] x [16,499:1 × 20] = 6,9 x 10

10:01 [27].