Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

LC-MS /MS fosfo-proteomiikan on olennainen tekniikka auttaa purkaa monimutkainen molekyyli tapahtumia, jotka johtavat ja levittää syöpää. Olemme kehittäneet globaalin fosfo- proteomic työnkulku aktiivisuuden määrittämiseksi signalointipolkujen ja huumeiden tavoitteet haimasyöpä kudosten kliiniseen käyttöön.

Methods

Peptidit johtuvat tryptiselle hajottamalla proteiinit uutetaan kudosjääleikkeitä haiman adenokarsinooma ja taustan haiman (n = 12), leimattiin tandem massa tunnisteet (TMT 8-plex), erotettu vahva kationinvaihtokromatografialla, sitten analysoitiin LC-MS /MS suoraan tai ensin rikastetaan fosfopeptidejä käyttämällä IMAC ja TiO

2, ennen analysointia. In-house, kaupalliset ja freeware bioinformatiikan alustoja käytettiin tunnistamaan tulevien biologisten tapahtumia monimutkainen aineisto.

Tulokset

2,101 proteiinit tunnistettu, 152 osoitti merkittävää eroa runsaasti välillä kasvaimen ja ei- kasvainkudoksessa. Ne sisältyvät proteiinit, joiden tiedetään olevan säädellään ylöspäin haimasyövän (esim Mucin-1), mutta suurin osa oli uuden ehdokkaan markkereita, kuten HIPK1 MLCK. Niistä 6543 ainutlaatuinen fosfopeptidejä tunnistaa (6284 ainutlaatuinen fosforylaatiopaikkaa), 635 osoitti merkittäviä sääntely, etenkin niillä, proteiinit, jotka osallistuvat solujen vaeltamiseen (Rho guaniininukleotidiä vaihto tekijät MRCKα) ja muodostumista paikallisia tarttumista. Activator fosforylaatio sivustoja FYN, AKT1, ERK2, HDAC1 ja muiden huumeiden tavoitteet havaittu olevan erittäin moduloitua (≥2 kertainen) eri tapauksissa korostamalla niiden ennusteita.

Johtopäätös

Täällä tarjotaan kriittiset tiedot, joiden avulla voimme tunnistaa yhteiset ja ainutlaatuinen molekyylitason tapahtumia todennäköisesti edistää syövän kussakin tapauksessa. Näitä tietoja voidaan käyttää auttaa ennustamaan paremmin mittatilaustyönä terapia soveltuu yksittäistapauksessa.

Citation: Britton D, Zen Y, Quaglia A, Selzer S, Mitra V Lößner C, et al. (2014) kvantifiointi haimasyövän Proteome ja Phosphorylome: Osoittaa Molecular Tapahtumat todennäköisesti edistäminen Syöpä ja aktiivisuus Drug Targets. PLoS ONE 9 (3): e90948. doi: 10,1371 /journal.pone.0090948

Editor: Jon CD. Houtman, University of Iowa, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 elokuu 2013; Hyväksytty: 05 helmikuu 2014; Julkaistu: 26 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Britton et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kaikki työt toteutettiin tässä tutkimuksessa rahoitetaan yhdessä Institute of Maksa Studies, Kings College Hospital ja Proteome Sciences plc. Rahoittajat palveluksessa tutkijat ja kliinikot jotka oli merkittävä rooli tutkimuksessa suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Meillä on seuraavat edut. Tutkimus rahoitettiin osittain Proteome Sciences plc, työnantaja David Britton, Stefan Selzer, Vikram Mitra, Christopher Lößner, Stephan Jung, Gitte Böhm, Peter Schmid, Petra Prefot, Claudia Hoehle, Sasa Koncarevic, Malcolm Ward, Hans Dieter Zucht ja Ian Pike. Kaikki työntekijät Proteome Sciences plc (paitsi rekrytoitaville Vikram Mitra) pitää varastossa tai optioita Proteome Sciences plc. Proteomi Sciences tuottaa myös TMT reagenssit tässä tutkimuksessa käytetyt ja nämä reagenssit ovat nyt lisensoitu jakelun Thermo Fisher Scientific. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Proteiini fosforylaatio on yleinen prosessi moduloimalla onkogeeninen ja tuumorisuppressori proteiinit [1] – [3]. Monissa tapauksissa, fosforylaatio johtaa kytkentä kuten muutoksia proteiinien toimintaa, koska modulaatio proteiinin taitto, alustan affiniteetti, vakautta, ja toiminta sen substraattien puolestaan ​​vaikuttavat signalointipolkujen ohjaamalla solujen lisääntymistä, migraatiota, ja apoptoosin, säätelyhäiriö jotka edistävät syövän fenotyyppi [4]. Haimasyöpä on yksi aggressiivinen pahanlaatuisten kasvaimien kanssa mediaanielossaolosta 6 kuukautta. Merkittävä osa potilaista diagnosoidaan myöhäisessä vaiheessa, kun hoitovaihtoehdot ovat hyvin rajalliset [5]. Kuten on asianlaita muiden syöpien, molekyyli- kohdistaminen terapia on lupaava hoitoon levinneen tai toistuvia haimasyövän [6]. Vaikka erilaisia ​​molekyylien kohdistaminen lääkkeitä on ollut saatavilla viimeisen vuosikymmenen aikana ja monet muut odotetaan myös lähivuosina, läpimurto tarvitaan vielä ennustamiseen lääkkeen vaikutuksia ja lääkkeen valinta. Esimerkiksi sorafenibi, multi-estäjä, joka vaikuttaa hyperaktiivinen verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptorin, verihiutaleiden kasvutekijän reseptorin ja Raf, on osoittautunut tehoa joillakin potilailla, joilla on edennyt maksasyövän [7], mutta emme voi tällä hetkellä ennustaa sen vaikutusta yksittäisen potilaan ennen hoidon aloittamista. Näiden vaikeuksien voittamiseksi, näyttää ratkaisevan perustaa analyyttinen lähestymistapa, jonka avulla lääkkeen valintaan, missä ilmentyminen ja toiminta useiden lääkkeiden tavoitteet kattavasti arvioidaan tapauskohtaisesti tapauskohtaisesti. Fosforylaation keskeinen tapahtuma moduloiva proteiinin aktiivisuutta, siis mittaamalla proteiini fosforylaatio on hyödyllinen indikaattori aktivoinnin tilan.

On satoja syöpälääkettä tavoitteet ja onkogeenisten signalointi proteiineja, jotka ovat merkityksellisiä terapeuttisen valintaan siis mittaus- ilmaisun ja aktivoinnin tilan kaikki käyttää nykyistä kultakantaan analyysi, immunohistokemia (IHC), ei ole mahdollista. Tässä suhteessa IHC ylläpitää rooli vahvistustyökalu. Käänteisfaasi proteiini mikrosiruja (RPMA) olla rajoituksia rajallisen vasta-ohjelmistoa ja huono spesifisyys /ristireaktiivisuutta. Lisäksi genomiikka-pohjainen teknologia ei salli fosfo-signaloinnin mittausta. Nestekromatografia – tandem massaspektrometria (LC-MS /MS), joka proteomic lähestymistapoja on kehitetty tunnistamaan ja määrittämään tuhansia proteiineja ja niiden fosforylaatiopaikat [8], [9]. Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet LC-MS /MS perustuu fosfo-proteomic työnkulku (SysQuant) voitettava monia teknisiä ja Bioinformatiiviset vaikeuksia tehokkaasti määrällisesti ilmaisun ja toimintaa signaloinnin proteiineja, joista monet ovat lääkekohteita kello maailmanlaajuinen tai järjestelmän tasolla kasvainkudoksessa. Vertasimme jäädytetty resektoitiin kudoksen (kasvain vs. ei-kasvain tausta) kahdentoista tapauksia haiman pään adenokarsinooma ja lisääntynyt läpimeno hyödyntämällä reportteri ioni isotopologeja TMT, jolloin 8-Plex reagenssien ja siksi mahdollisuus suorittaa kahdeksan näytettä samanaikaisesti [10], [11]. Molecular tapahtumia, jotka voivat edistää syövän tunnistettiin yhteisiä kaikissa tapauksissa kuitenkin jotkut olivat ainutlaatuisia yksittäistapauksessa tai alaryhmä. Siellä myös näytti olevan suhde aika toistumisen ja ryhmittely tapauksista seuraavien Pääkomponenttianalyysin T /NT suhteet fosfopeptidit. Phosphopeptide analyysin avulla SysQuant voi tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita ja auttaa myös kerrostuvat potilaita eri hoito-ohjelmat perustuvat aktivoinnin tilasta signalointipolkujen ja tunnettu huumeiden tavoitteet.

Materiaalit ja menetelmät

Eettiset näkökohdat ja tutkimus protokolla oli hyväksynyt biopankkia komitean Institute of Maksa Studies, Kings College Hospital (viite 08 /H0704 /117). Kaikki osallistujat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen käyttämään kudosnäytteiden tutkimusta. Kaksitoista tapausta haiman pään adenokarsinooma valittiin (taulukko S1 taulukoissa S1). Muita ei ole luottamuksellinen kliinisiä tietoja, kuten kasvain vaiheessa, sukupuoli ja toistumisen nähdään kunkin tapauksen taulukoissa S2 S3 taulukoissa S1. Kasvain (T) kudosnäytteet otettiin haimakasvaimesta massat, kun taas ei-kasvain (NT) näytteet olivat haima pois kasvainmassan. Kaikki kudosnäytteet jäädytettiin 30 minuutin kuluessa poistettu kirurgisella ja varastoidaan [-80 ° C], kunnes analyysi SysQuant (mediaani varastointi [18,5 kuukautta] vaihtelevat [4-28 kuukautta]. T versus NT verrattiin käyttämällä SysQuant ja kokeellinen yksityiskohdat kuvataan menetelmät S1 asiakirja. Yhteenvetona, tämä merkitsi proteiini uuttamalla kudosnäytteiden (ug summat käytetään kunkin näytteen on esitetty taulukossa S4 taulukoissa S1), trypsiinihajotuksen proteiinien peptideiksi, TMT 8-plex merkintöjä peptidien (kasvain ja ei-kasvainkudoksen 4 tapausta TMT 8-plex) jälkeen sekoitetaan yhdeksi 8-plex näyteseos (katso taulukko S5, taulukoissa S1). Jokainen TMT 8-plex näyte sitten jakaa kolmeen itsenäiseen erät, joista jokainen oli edelleen jaettu 12 jakeet voimakas kationinvaihto (SCX) kromatografia (taulukko S6, taulukoissa S1). ensimmäiset 12 SCX jakeet analysoitiin sitten suoraan LC-MS /MS: llä käyttäen päällekkäiset tiedot riippuvainen hankinta kulkee seuraa kolmas ajo käyttäen aikariippuvainen kantaa kaikkia ominaisuuksia tunnistettu ajojen 1 2. Loput kaksi 12 fraktioita ensimmäinen rikastettiin fosfopeptidejä joko immobilisoitu metalli affiniteettikromatografiaa (IMAC) tai TiO

2 (taulukko S6, taulukoissa S1). Saatu 24 fosfopeptidi rikastettu fraktiot analysoitiin myös LC-MS /MS: llä. Kaikkiaan 108 erillistä LC-MS /MS-ajoja tehtiin jokaiselle TMT 8-Plex näyte. Raaka massaspektrometria tiedot etsittiin ihmisen UniProtKB /Swiss-Prot-tietokannan avulla Mascot ja Sequest (via Proteome Discoverer). Peptidi spektri ottelut (PSMS) hylättiin, jos se tunnistetaan vain alhaisen luottamuksen (≥5% FDR), osoitti ≤75% fosfo-RS todennäköisyys pisteet, ja oli puuttuva kvantifiointiin kanavia (esim. Ei kaikki piikit isobaaristen tunnisteet näkyvät spektrit). Raaka intensiteetti arvot isobaaristen tageja PSMS kulkee suodattimia käytettiin kvantifiointiin, mutta ensimmäinen normalisoitui käyttäen sum-skaalaus (kuten kuvassa S1) vähentää mahdollisia kokeellinen /systemaattista harhaa. Log

2-suhteet laskettiin isobaaristen tag intensiteettiä, joka esittää asetuksen välillä T yli NT tapauskohtaisesti. Phosphopeptide T /NT log

2 suhde on mediaani T /NT log

2-suhde kaikista PSMS ainutlaatuinen kyseiseen peptidisekvenssi. Proteiini T /NT log

2 suhde on mediaani T /NT log

2-suhde kaikista ainutlaatuinen fosforyloimattomat peptidejä ainutlaatuinen kyseiseen proteiiniin. Yksipuolinen t-testi (yhden otoksen sijainti testi) käytettiin laskettaessa p-arvot. P-arvot piirrettiin log

2 T /NT tunnusluvut Volcano tonttien tunnistaa huomattavasti säännelty peptidejä. Proteiinitasolla, merkintä käyttämällä GO-termejä, Kegg-reittejä ja drugbank tiedot lisättiin, ja proteiinit myös kartoitettu polkuja käyttäen resursseja, kuten DAVID ja STRING. Tällä fosforylaatiokohdan taso merkintä käyttäen PhosphoSitePlus lisättiin, myös tunnetut toiminnallisten ja biologisten /patologinen rooli fosforylaatiokohdan. Osittainen pienimmän neliösumman Diskriminanttianalyysi (PLS-DA) käytettiin mallintaa ja tutkia monimuuttuja aineisto tunnistamaan poikkeavia arvoja ja ryhmille kaikista peptidi isobaaristen tag intensiteetit kustakin suodattimen kulkee PSM sekä log

2 T /NT suhteet (fosfopeptidejä ) kaikista aseiden työnkulun (IMAC, TiO

2 ja ei-rikastettu). SysQuant työnkulku yhdistyvät fosfo- proteomic näytteenvalmistus, LC-MS /MS-analyysia ja bioinformatiikan analyysi, käytettiin tunnistamaan tärkeä molekyyli tapahtumia uskomme edistää haimasyövän tapauksissa tässä analysoitavissa.

Tulokset ja keskustelu

Kaikki peptidit tunnistetaan Sequest ja Mascot tässä tutkimuksessa vietiin Proteome Discoverer ja voi katsella zip tiedostot S1, S2 ja S3. Tiedoston S1 sisältää kaikki peptidit (fosforyloidun ja ei-fosforyloitu) tunnistaa yksilöitä TMT 8-Plex-1, tiedosto S2 sisältää kaikki peptidit tunnistaa yksilöiden TMT 8-Plex-2, ja File S3 sisältää kaikki peptidit tunnistaa yksilöt TMT 8-plex-3. Nämä Supplemental zip tiedostot näyttää yksityiskohtaisia ​​tietoja, kuten Sequest Xcorr, Mascot ionit tulokset, DM [ppm], aromikeitin q-arvoja, ja muita tärkeitä tietoja. Tiedot näistä Excel asiakirjat olivat syötetään talon bioinformatiikan välineitä tunnistaa biologisesti merkittäviä tapahtumia.

Kaikkiaan tunnistettu 6543 ainutlaatuinen fosfopeptidejä sekvenssit (6284 ainutlaatuinen fosforylaatiopaikkaa), alkaen 2101 proteiineista (taulukko 1). Kuvassa 1 identifioitu peptidi (fosforyloidun ja ei-fosforyloituu) jakautuminen kaikkien kolmen aisan (Non-rikastettu, TiO

2, IMAC) on SysQuant työnkulun kunkin TMT 8-Plex. Kuvassa 1 on esitetty myös useita peptidien havaittiin yhteensä kaikkien kolmen analyyttisen toistoa (yhdistämisen jälkeen numerot eri jakeita) kussakin ja kaikissa TMT 8-Plex näytettä. Kun tulokset kustakin rinnakkaisten osien (TiO

2, IMAC, ei-rikastettu) verrataan edut yhdistettyä rikastamiseen lähestymistapa ja useita analyyttisiä toistoja (mukaan lukien hyödyntäminen ajasta riippuva hylkäämisen lista), ovat ilmeisiä. Suurin kokonaismäärä fosfo-peptidien nähtiin käyttämällä IMAC rikastamiseen jonka osuus 79% kaikista ainutlaatuinen fosfopeptidejä tunnistettu. Kuitenkin TiO

2 jakeet yksilöidä lähes 19% kokonaismäärästä, joka jäisi yhdellä fosfo-peptidi rikastus strategia (Kuva 1: TMT 8-Plex-ALL: A). Sama pätee kolme analyyttistä kulkee suoritettiin kullekin näytteelle. Jos yksittäinen data riippuvainen ajo suoritettiin vain 20318 ainutlaatuinen peptidejä nähdään (kuvio 1: TMT 8-Plex-ALL: D). Toinen data-riippuvainen run lisää 5868 peptidit taas käyttää ajasta riippuvaisten hylkäämisen alalta run 3 sallitaan vielä 3257 peptidejä voidaan tunnistaa yleistä. Yhdessä (run 2 3) tämä merkitsee vielä 45% yli ajaa 1 yksin ja 31% kokonaismäärästä ainutlaatuisia peptidejä. Tärkeää peptidit tunnistetaan kolmannella aikavälillä ovat yleensä alhaisemmat runsautta. Olemme myös kuvaavat (kuva S2) ainutkertaisten fosfopeptidejä ja ei-fosfopeptidejä yksilöity kunkin raaka-tiedoston, kustakin SCX fraktion, kussakin varren työnkulun (non-rikastuttaa, TiO

2, ja IMAC), kustakin TMT 8-plex näyte (TMT 8-plex-1, 2, 3).

Venn kaaviot osoittavat lukumäärä; V: Ainutlaatuinen Phosphopeptide sekvenssit, B: ainutlaatuinen kuin Phosphopeptide sekvenssit, ja C: kokonaismäärä ainutlaatuisia peptidisekvenssejä tunnistettu TiO

2, IMAC, ja /tai ei-rikastuttaa käsivarsi SysQuant työnkulun, kaikissa kolmessa TMT 8-plex näytettä yhteensä (TMT 8-plex-ALL) ja erikseen per TMT 8-plex (TMT 8-plex 1, TMT 8-plex 2, TMT 8-plex 3). D: osoittaa päällekkäisyyttä, vietämme peptidin tunnisteiden analyyttisestä ajaa 1, analyyttinen ajaa 2, ja analyyttinen run 3 (mukaan lukien aika riippuvainen hylkäämisestä lista kootaan tunnisteiden Ajossa 1 ja 2).

Niistä 6543 fosfopeptidejä tunnistettu, 5409 olivat mitattavissa. Koska suuri määrä mitattavissa fosfopeptidejä ne on nähtävissä erilliseen Excel-tiedosto (File S4), pikemminkin kuin osa tärkeimmistä asiakirjan. Tiedoston S4 näyttää Phosphopeptide sekvenssit, fosforyloidun tähteet ja proteiinin nimi ja UniProt liittyminen numero, johon peptidi kuuluu. Tiedoston S4 näyttää myös kaikki määrälliset ja tilastotietoja, jotka liittyvät fosfopeptidit kasvaimen vs. ei-kasvain kaikista tapauksista, ja myös antaa huomautus tietoja kuten tunnettua toiminnallista vaikutukset fosforylaation tapahtuman. Tämä tieto uutettiin PhosphositePlus tietokantaan ja voidaan havaita sarakkeisiin BM-CP. Tiedoston S4 tarjoaa myös toiminnallisia tietoja, jotka liittyvät proteiini, saatujen tietojen GO termejä (sarakkeet CQ-DC) ja ovatko tällaiset proteiinien tiedetään lääkekohteita (sarakkeet DD-DG) uutetaan Drug pankin tietokannasta. Saat lisätietoja suhteellinen proteiinin runsauden ja normalisoitu Phosphopeptide tasolla (Phosphopeptide normalisoidaan proteiinin taso) viittaavat tiedostoon S5. Suhteellinen runsaus fosfopeptidejä tuumorin vs. ei-kasvainkudoksen muuttuu tapauskohtaisesti pääasiassa johtuen muutoksista ilmentymistason fosforyloidun proteiinin tai johtuu moduloitu aktiivisuudesta kinaasien ja fosfataasien aiheuttavien tai käännetään fosforylaation proteiinin alustan, vastaavasti. Vuonna Tiedoston S5 normalisointimenetelmistä suhteellinen runsaus on Phosphopeptide suhteellinen runsaus vastaavan proteiinin. Suhteellinen proteiinin runsaus lasketaan vain fosforyloimattomat peptidit siis olemassa tapauksia, joissa emme pysty toteuttamaan normalisoinnin puuttumisen vuoksi ei fosforyloimat- peptidejä joitakin proteiineja.

PLS-DA

ensimmäinen Principal Component (PC1) esittää vaihtelevuutta käyttöön johtuen kolme eri aseita työnkulun. Nämä kolme aseita IMAC, TiO

2 ja Total Protein (so ei-rikastettu), kuten kuvassa 2A ja kuvassa S3, ovat erillään muuttujat 3 erillisessä klustereita. Kiinteä musta ympyrä kuviossa 2A kuvaa T2 Hotellingin tila perustuu 95%: n luottamusväli. PC1 selittää 13,6% koko varianssi aineisto. Toinen Principal Component (PC2) esittää vaihtelevuutta käyttöön eri TMT 8-Plex kanavaa. Tämä vaihtelevuus korostaa ensisijaisesti potilaasta varianssi, joka on 10,56% koko varianssi aineisto. Välillä luokka vaihtelu, ts kasvain (T) vs Ei-kasvain (NT), näkyy kolmannen pääasiallinen komponentti (PC3) mikä selittää 14,36% koko varianssi aineisto. Kuva 2B ja kuvio S4 esittää ryhmittely muuttujat kahteen eri klusterit, eli T ja NT. Eroja eri aseita työnkulun on vaikuttanut myös PC3, joka on kuvattu ryhmittymältä TotalProtein (ei-rikastettu) peptidejä yhdessä klusterin kuvassa 2B. Vain potilas 12 ei osoita eroja T verrattuna NT mukaan kuviossa 2B. PLS bi-tonttien osoittavat, että ei ollut poikkeavia havaintoja tällä aineisto, kuten näkyy Hoteling T2-Range juoni (kuva S3). PLS vahvisti, että kokeilu oli onnistunut, ja että on olemassa huomattavia eroja T ja NT. Eroja kolmen eri aseita työnkulun olemassa, mutta TiO

2 ja IMAC on lähes yhtä suuri korrelaatio. Yhdessä PC1, PC2 ja PC3 selittää 38,52% koko varianssi aineisto. Loput vaihtelu aineisto johtuu sekoittaa vaikutusten analyyttistä ja biologisen vaihtelevuuden.

V: PC1 ja PC2 pisteet juonta ensimmäisen kahden pääkomponentit kuvaavat 13,6% (PC1) ja 10,6% (PC2) ja koko varianssi data (raaka isobaaristen tunniste intensiteetit kustakin PSM ohimennen sarja suodattimia). Ympyrä kuvaa T2 Hotellingin tila perustuu 95%: n luottamusväli. B: PC2 ja PC3 pisteet juoni seuraavan pääkomponenttien kuvaava 10,6% (PC2) ja 14,4% (PC3) koko varianssia tiedot. C: PC1 ja PC2 pisteet juonta ensimmäisen kahden pääkomponentit kuvaavat 25,8% (PC1) ja 19,3% (PC2) koko varianssi datan (mediaani log

2 T /NT suhteet kaikkien mitattavissa fosfopeptidejä kulloinkin ). Täällä myös näyttää aika uusiutumisen kuukautta kussakin tapauksessa leikkauksen jälkeen.

Lisäksi tutkinnassa raaka isobaaristen tag intensiteetit T NT yksilöt tunnistaa vieraat havainnot ja ryhmiä, PLS-DA käytettiin myös tutkimaan log

2 T /NT suhteet kaikilta fosfo-peptidit (mediaani alkaen IMAC, TiO

2, Non-rikastettu) kussakin tapauksessa, kuten on esitetty kuviossa 2C. Hienovarainen suhde ryhmittely tapauksissa ja aika toistumisen näyttää poistua, mutta määrä biologisen toistojen olisi lisättävä, ennen kuin mitään lopullisia johtopäätöksiä. Tästä huolimatta on mielenkiintoista havaita tapaukset 14 ja 9 ryhmitelty tiiviisti ja molemmissa tapauksissa ollut hyvin varhain toistuminen 2 ja 5 kuukauden kuluttua leikkauksesta, vastaavasti. Kotelot 10 ja 8 myös ryhmitellä, mutta kaukana kaikissa muissa tapauksissa. Asia 10 osoitti uusiutumisen 31 kuukautta tapauksessa 8 ei ollut merkkiäkään toistuminen jopa 23 kuukautta leikkauksen jälkeen. Kotelot 4, 12, 1, 7, 5, ja 13 kootaan yhteen ja nämä osoittivat toistuminen välillä 10-21 kuukautta leikkauksen jälkeen. Mielenkiintoista tapauksessa 6, joka on vielä osoittaa toistumisen, myös ryhmittää tapaukset, jotka osoittivat toistuminen 10 ja 21 kuukautta. Case 11 ei ryhmän muihin tapauksiin.

Merkittävästi säädellä proteiinin ilmentymisen

määrittää suhteellinen runsaus proteiinien kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen käyttäen mediaani log

2 T /NT suhde ei-fosforyloitu peptidien ainutlaatuinen jokaiselle proteiinia korvikkeita laskea suhteellinen runsaus vastaavat proteiinit. Yksipuolinen t-testiä käytetään laskettaessa p-arvot ja nämä piirrettiin log

2 T /NT suhteellisista osuuksista tulivuoren juoni havaita merkittäviä (Log

2 T /NT≥0.3 tai ≤-0.3 ja p≤0.05) asetukset yli kaikissa tapauksissa (kuva 3A). Oli yhteensä 152 proteiineja merkittävästi säätelevät perustuu Log

2 T /NT≥0.3 tai ≤-0.3 ja p≤0.05 (File S6_Sheet ’Pro_TvNT tai 0.3_p 0,05). Taulukossa 2 on esitetty 12 merkittävimmin yliaktiivista proteiineja kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen, ja tarjoaa myös kuvauksen kaikista tunnetuista tehtävä kunkin proteiinin tai yhdessä syövän [13] – [31]. Yli-ilmentymisen Mucin-1 liittyy usein syövän ja löysimme myös Mucin-1 on merkittävästi säädellään ylöspäin haiman kasvainkudoksessa. Mielenkiintoista löysimme merkittävämpi sääteli proteiineja kuin Mucin-1, joista osa voi osoittautua spesifisten haimasyöpä, ehkä jopa uusia terapeuttisia kohteita esim. Homeodomain-vuorovaikutuksessa proteiinikinaasin 1 (HIPK1). HIPK1, joka on koholla kasvain verrattuna ei-kasvain kaikissa tapauksissa (mediaani log

2 T /NT = 1,00; p = 1,59 E -04), on yksi neljästä HIPK seriini /treoniini-kinaasien tiedetään olevan vuorovaikutuksessa ja säätelevät lukuisten solun proteiinien, mukaan lukien useita transkriptiotekijöitä ja kofaktoreita [32], [33], [34]. HIPKs ovat sekaantuneet valvonnassa erilaisia ​​solureiteillä säännellä eri prosessien kuten DNA-vaurioita vastaus, kudosspesifikaatios-, ja leviämisen [34].

Volcano tontteja osoittavat -log

10 P-arvot suhteessa log

2 T /NT suhteet; V: suhteellinen proteiini runsaus (määritetty mediaani kuin Phosphopeptide log

2 T /NT-suhteet), B: fosfopeptidit mitataan IMAC, C: TiO

2, D: ja ei-rikastettu varren SysQuant työnkulun . Punaiset ympyrät huomauttaa merkittävästi moduloitu proteiineja (log

2 T /NT suhteet ≥0.3 tai ≤-0.3 ja p-arvot ≤0.05) ja fosfopeptidit (log

2 T /NT suhteet ≥0.75 tai ≤-0,75 ja p -arvot ≤0.05). E: on Venn-kaavio, joka kuvaa jakauman 635 fosfopeptidejä kaikkien kolmen varret työnkulun, joita on huomattavasti moduloitu.

Ymmärtääksemme paremmin biologisten prosessien ja Kegg signalointireitteihin eroavat välillä kasvain ja ei-kasvain valitsimme hakunumerot kaikkien merkittävästi moduloidun proteiinit ja ladataan nämä on DAVID Bioinformatiiviset resurssi. Focal Adhesion Kegg signalointireitin oli vaikuttaa eniten antaa Benjamini pisteet 1.0e-3. Merkittävästi moduloitu Focal Adhesion proteiinien mukana; Talin-1, filamiini-A, filamiini-B, filamiini-C, vinkuliini, fibronektiinin, Zyxin, ja myosiinikevytketjua kinaasi, sileän lihaksen (kuva 4 tiedosto S6_Sheet, FA lamellipodium). Talin-2, Focal tarttuvuus kinaasi 1 (FAK1), Proteiinifosfataasi 1 säätelyalayksikön 12A olivat myös polttovälin tarttuvuus proteiineja ja merkittävästi moduloitu vaan ainoastaan ​​nähdä File S6, koska nämä proteiinit eivät olleet mitattavissa joissakin tapauksissa ja kuvio 4 on esitetty vain proteiineja mitattavissa kaikissa tapauksissa (esim no N /A). Kaikki nämä fokaalisen adheesion proteiineihin kuin FAK1, oli merkitsevästi säädellään ylöspäin kasvain vs. ei-kasvaimen viittaa kasvanut koko ja /tai tiheys paikallisessa tarttumisessa soluissa sisällä kasvain. Paikallisessa tarttumisessa tiedetään rooli kulkeutumista monissa solutyypeissä [35], [36], [37]. Muuton aikana paikallisiin tarttumisiin voidaan ankkuroida solujen solunulkoiseen matriisiin jälkeen muodostumista solun ulokkeita tai ulkonemia; kuten pseudopodium, filopodium, ja lamellipodium [37]. Keskipiste adheesioproteiineja vinkuliini ja myosiinikevytketjua Kinase tiedetään myös olevan osallisena muodostumiseen lamellipodioihin ja edistää solun liikkuvuus. Kuviossa 4 on luettelo proteiineja tiedetään liittyvän muodostumiseen kasvuennusteiden ja paikallisia tarttumista, nähdään merkittävästi moduloidaan ja mitattavissa kaikissa tapauksissa. Solukalvon ulottuvat soluväliaineen reseptorit (Integriinit) ovat olennaisia ​​osia paikallisessa tarttumisessa kuitenkaan emme tarkkailla tilastollisesti merkitsevä modulaatio tahansa integriinin ilmentymisen mutta tarkkailla merkittävä modulaatiota integriiniä fosforylaation, kuten käsitellään myöhemmin. Kokoonpano paikallisessa tarttumisessa liittyy myös aktivoinnin Rho signaloinnin sekä myosiinin aiheuttama contractility [37]. Kuvassa 4 on esitetty myös myosiinin 9, 10, 11, ja 14 olivat merkittävästi koholla kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen.

Kaikki proteiinit tässä kuviossa osoitettiin liittyvän GO termejä ”lamellipodium” ”Fokaalisen adheesion” ja myös merkitsevästi (p≤0.05) ylä- tai alaspäin säännelty kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen ja mitattavissa kussakin tapauksessa (esim. Kaikki proteiinit, jotka sisältävät NA tapauksessa jätettiin taulukko). Log

2 T /NT suhteet fosforyloimattomat peptidit kustakin proteiinia käytettiin malleina laskea suhteellinen runsaus vastaavat proteiinit. Log

2 T /NT suhteet fosforyloimattomat peptidit keskiarvona kolmen aisan työnkulun (IMAC, TiO

2, Non-rikastuttaa).

toiminnallinen roolit neljän proteiinit kuvassa 4 (LIM ja SH3 meeniproteiinia 1, moesiini, Palladinin ja PDZ ja LIM meeniproteiinia 7) on jo käsitelty taulukossa 2, mutta Alpha-aktiini-4 (ACTN4) on aktiini-sitovan proteiinin kanssa useita rooleja eri solutyyppejä. Ei-lihassoluissa, on havaittu pitkin hehkulangan nippuja ja adherens-tyypin risteyksissä, joissa se on mukana sitoutumisessa aktiini kalvoon. Uskotaan olevan mukana metastaattisen prosesseissa Li Fu et al [38] osoitti, että yli-ilmentyminen ACTN4 yhdistettynä 67 LR liittyy ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) eteneminen. He osoittivat, että ACTN4 oli differentiaalisesti ilmaistu ESCC kudoksessa verrattuna normaaleissa kudoksissa ja että ekspressiotasot ACTN4 olivat asteittain kasvoi vaiheen I-III. Kliinis korrelaatio käyttäen TMA paljasti, että yli-ilmentyminen ACTN4 oli merkitsevästi yhteydessä kehittynyt kasvain vaiheessa (P = 2.6E-2) ja imusolmuke etäpesäke (P = 4.9E-02) [38]. Plectin on myös ehdotettu syövän biomarkkeri, erityisesti haimasyövän [39]. Vaikka normaalisti sytoplasminen proteiini, plectin ilmentyy solukalvossa haiman adenokarsinooma (PDAC) ja siksi sitä voidaan käyttää kohdentamaan PDAC soluihin [39]. Tutkimuksemme osoittaa, että molemmat syöpä biomarkkereita ovat merkittävästi yli ilmaistu kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen haiman syöpäpotilailla (mediaani log

2 T /NT = 0,29 ja p-arvo = 3.33E-02 ACTN4, ja mediaani log

2 T /NT = 0,32 ja p-arvo = 1.63E-03 Plectin).

kateniinin delta-1 on välttämätön muodostumista solun soluadheesiota (vyöliitos) kautta vuorovaikutuksessa sytoplasmisen hännän klassisen ja tyypin II kadheriineja. Kateniinin delta-1 moduloi myös toimintaa Rho perheen GTPaaseja (RhoA, Rac, ja Cdc42), mikä viittaa siihen, että yhdessä muiden Src substraattien, kateniinin delta-1 säätelee aktiini dynamiikkaa. Siten kateniinin delta-1 on master säätelijä vyöliitos muodostumisen, ja todennäköisesti osallistuu säätelevät tasapainoa liiman ja liikkuvia solu fenotyyppien [40]. Täällä tarkkailla merkittävästi vähentynyt tasoja kateniinin delta-1 kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen (mediaani log

2 T /NT = -0,29 ja p-arvo = 1.34E-02). Kun otetaan huomioon tärkeä rooli kateniinin delta-1 pelaa muodostettaessa /ylläpitää vyöliitos välillä epiteelisolujen, ja harkitsee meidän havaittu lasku ilmaisun ja fosforylaation tämän proteiinin se viittaa siihen, että nämä tapahtumat voivat edistää dissosiaatiota epiteelisolujen, joten epiteeli- ja mesenkymaalitransitioon haimasyövän.

erityisen mielenkiintoista on paljastunut, että myosiinikevytketjua kinaasi (MLCK) on merkittävästi yli-ilmentyy kasvain verrattuna ei-kasvainkudoksen (mediaani log

2 T /NT = 0,5 p- arvo = 2.95E -02). MLCK on Ca

2 + /kalmoduliinista riippuvan proteiinikinaasi, joka säätelee erilaisia ​​solun toimintoja, kuten, lihaksen supistuminen ja solujen vaeltaminen, kautta fosforylaation myosiinin kevyen ketjun proteiineja. Koska kasvain solujen vaeltamiseen on keskeinen vaihe kasvaimen leviäminen, myosiinikevytketjua kinaasi (MLCK) voidaan pitää terapeuttisena kohteena estämiseksi kasvaimen leviäminen. Itse asiassa, MLCK aktivointi ja ilmaisun on todettu olevan positiivinen yhteys metastasoitunutta taipumus. Lisäksi MLCK estäjien on osoitettu vähentävän invasiivisuus erilaisten syöpäsolujen [41]. Mielenkiintoista tapauksissa 14, 9, 4, ja 13 ovat korkeimmat MLCK ja kolme neljästä näistä tapauksista osoittavat myös hyvin varhain toistumisen (2 kuukautta, 5 kuukautta, 10 kuukautta, pisin kanssa 21 kuukautta toistuminen, vastaavasti) . Ehkä nämä neljä tapausta hyötyisivät MLCK estäjähoidosta jos potilas kerrostuminen perustuivat korkea ilmentymisen lääkkeen kohde kasvaimen vs. ei-kasvain. Asia 10 osoitti alhaisin MLCK kasvainsoluissa verrattuna ei ollut kasvainta korreloi tässä tapauksessa osoittaa pisimpään ennen toistuminen oli 31 kuukautta. MLCK myös tärkeä rooli p38 MAPK signalointi koulutusjakson osoittavat lisääntynyt aktiivisuus useita kasvaimia tässä tutkimuksessa, joita käsitellään jäljempänä.

Havaintoja kasvoi myosiinin ilmentyminen kasvainkudoksessa on myös erityisen kiinnostava kuin MYH9 (mediaani log

2 T /NT = 0,29 ja p-arvo = 5.93E-03), MYH10 (mediaani log

2 T /NT = 0,23 ja p-arvo = 2.18E-02), MYH14 (mediaani log

2 T /NT = 0,35 ja p-arvo = 2.03E-02) ovat kaikki solun myosiinien jotka ovat kriittisiä sytokineesi, solun muoto, ja erikoistuneita toimintoja, kuten erityksen ja ylärajan. Aikana solu leviää näistä kolmesta tärkeä rooli tukirankansa uudelleenjärjestely, paikallisissa kontakteissa muodostuminen (keskiosassa, mutta ei marginaalissa leviämisen soluja), ja MYH10 indusoi lamellipodial laajentaminen tämän toiminnon ollessa mekaanisesti antagonisoi MYH9, jonka uskotaan aiheuttavan lamellipodial sulkeutuminen.