Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant glykosylaatiota musiinien ja muiden solunulkoisten proteiinien on tärkeä tapahtuma karsinogeneesissä ja tuloksena syöpään liittyvän glykaanien on ehdotettu kohteina syövän immunoterapiassa. Arvioimme rooli O-sidottu GalNAc glykosylaation antigeenin oton, käsittelyn, ja esityksen MHC-luokan I ja II molekyylejä. Vaikutus GalNAc O-glykosylaatio seurattiin malli järjestelmä, joka perustuu ovalbumiinin (OVA) -MUC1 fuusiopeptidien (+/- glykosylaatio) ladattiin dendriittisoluja viljeltiin yhdessä IL-2 erittävät OVA-peptidin spesifisten T-solujen hybridoomia. Arvioida

in vivo

vastauksena syöpään liittyvät kasvaimen antigeeni, Balb /c tai B6.Cg (CB) -Tg (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 siirtogeenisiä) hiirissä immunisoitiin ei-glykosyloitu tai GalNAc-glykosyloituneen MUC1 peräisin oleva peptidi, jota seuraa vertailu T-soluproliferaation, IFN-γ vapautumisen, ja vasta-aineen induktio. GalNAc-glykosylaatio edistää esittely OVA-MUC1 fuusiopeptidien MHC-luokan II molekyylien ja MUC1-antigeenin esiin erityisiä Ab tuotantoa ja T-soluproliferaatiota sekä Balb /c ja HLA-A2-siirtogeenisiä hiiriä. Sen sijaan GalNAc-glykosylaatio esti esittämiseen OVA-MUC1 fuusiopeptidien MHC luokka I ja poistettava MUC1 CD8 + T-solujen vasteita HLA-A2 siirtogeenisiä hiiriä. GalNAc glykosylaatio MUC1-antigeenin näin ollen helpottaa sisäänottoa, luokan II MHC-esittely, ja vasta-ainevaste, mutta se saattaa estää antigeenin esittelyn CD8 + T-soluihin.

Citation: Madsen CB, Petersen C, Lavrsen K, Harndahl M, Buus S , Clausen H, et al. (2012) Cancer Associated Poikkeava proteiini O-glykosylaatio muokata antigeeni käsittely ja immuunivastetta. PLoS ONE 7 (11): e50139. doi: 10,1371 /journal.pone.0050139

Editor: Isaac Yang, UCLA, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2012 Hyväksytty 17. lokakuuta 2012 Julkaistu: 26 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Madsen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat Novo Nordisk Foundation, Tanskan Medical Research Council, Tanskan Cancer Research Foundation, Agnes ja Poul Friis Foundation, Tanskan Cancer Society, Kööpenhaminan yliopisto (Program of Excellence), EU-FP7, tanskalainen Agency for Science ja teknologia ja innovaatio (FTP). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer rokotteita hyvin lupaavilta pitkäkestoisen terapeuttinen teho [1]. Nykyiset kokeelliset syöpärokotteita ensisijaisesti pyritään saamaan aikaan soluvälitteisen immuniteetin induktion kautta spesifisten CD8 + T-solujen [2] – [5]. Kuitenkin yhä enemmän näyttöä osoittaa arvoa vasta kasvaimen poistamisen [6], [7]. Näin ollen on kasvavaa kiinnostusta suunnittelussa rokotteita, jotka voidaan aktivoida sekä CD4 + ja CD8 + T-solujen ja siten samanaikaisesti synnyttää humoraalisia ja solutason syöpä immuniteetti [8]. Muuttaa proteiinien esitetty syöpäsolut ovat tärkeitä kasvaimen antigeenejä, jotka voidaan kohdistaa rokotteita ja terapeuttisia vasta-aineita. Useimmat solun pinnan proteiinit ovat glykosyloituja, ja pahanlaatuisten solujen transformointi liittyy aina muutokset translaation jälkeinen muutoksia proteiinien [9]. Poikkeava musiini-tyyppinen O-glykosylaatio on yksi runsaimmin translaation jälkeinen liittyvän syövän muutoksia luodaan monipuolinen kokoelma molekyylirakenteiden löytyy syöpäsolujen pinnalla, mutta ei normaaleissa soluissa [9], [10]. Tämän seurauksena, erityisten kuvio syöpään liittyvän lyhyen glykaanirakenteet on syöpään liittyvien proteiinien tuottaa uusia glykopeptidi epitooppeja, jotka voidaan kohdistaa immuunijärjestelmä [11], [12].

Cancer liittyy glykaanien vaikuttaa syövän immuniteetti monella tavalla. Poikkeava glykaanien ovat immunogeenisiä itse, ja katkaistun O-glykaanien (Tn: GalNAc-S /T; STN: NeuAcα2,6GalNAc-S /T, ja T: Galβ1,3 GalNAc-S /T) tunnustetaan yleiseurooppalaisen karsinooma antigeenit, joihin kiertävän vasta-aineita löytyy korkealla tasolla syöpäpotilailla. Poikkeava glykaanien voi myös aiheuttaa uusia epitooppeja proteiineihin aiheuttamalla konformaation muutoksen tai uusien O-glykopeptidien epitoopit [13], [14]. Lisäksi syöpään liittyvää glykaanien voidaan sisällyttää suunnitteluun immunogeenisten epitooppien, jotka voivat aiheuttaa

in vivo

anti-kasvain immuunivasteet [15]. Tärkeän perustan glykaani aiheuttama immuniteetti on, että poikkeava glykaanien voivat sitoa lektiini reseptoreihin. Esimerkiksi makrofagin galaktoosia sitova lektiini (MGL) -mediates ottoa spesifisten O-glykoproteiinien dendriittisoluissa [10], [16]. Todellakin dendriittisolut ovat voimakkaimpia antigeeniä esittelevien solujen esikäsittely naiivien CD8 + ja CD4 + T-soluja. Ne kantavat erilaisia ​​hiilihydraatteja reseptorien C-tyypin lektiinin perhe (tarkistetaan [17]) ja on ainutlaatuinen kyky rajat läsnä solunulkoisen antigeenejä CD8 + T-solujen [18]. Selektiivisen oton GalNAc-glykosyloidun antigeenejä (Tn-antigeenit) yhteisen ihmisen ja hiiren dendriittisolujen (DC) C-tyypin lektiini MGL, [19], [20], tekee mahdolliseksi aiheuttaa syöpää erityisiä glykopeptidien vasta-aineita hiirissä ja ihmisen induktion kautta CD4 + Th-solujen [11], [13], [14], [21]. Tällaiset Tn-glykopeptidi spesifisten vasta-aineiden välittävät vasta-riippuva sytotoksisuus [11], [12], [22], [23], ja esiintyminen luonnon glykopeptideihin spesifisten vasta syöpäpotilailla ehdotetaan liittyvän elonjäämisetua [21]. Sitä vastoin, hyvin harvat CD8 + T-solut kohdistuvat glykopeptidien epitooppien solunulkoisen kasvaimen antigeenejä (esimerkiksi musiini 1 (MUC1)) on kuvattu [24], [25].

syöpään liittyvä glykoproteiini MUC1 on tärkeä malli molekyyli syövän immunoterapiassa ja on poikkeuksellisesti glykosyloitu useimmissa adenokarsinooman [26]. N solunulkoinen domeeni MUC1 koostuu 20-120 tandem-toistojen (VNTR), joista kukin sisältää 20 aminohappoa 5 mahdollisten O-glykosylaatiokohtia [27]. Immunisointi B6.Cg (CB) -Tg (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 siirtogeeniset hiiret) [28] ja simpanssit [29] ei-glykosyloidun MUC1-antigeenejä on herättänyt MUC1-peptidi CD4 + ja CD8 + T-soluvasteiden ja useita CD8 + T-soluepitooppeja on tunnistettu solunulkoisen ja solunsisäisen alueen MUC1 [28], [30] – [33]. Vuonna MUC1 siirtogeenisiä hiiriä vastetta ei-glykosyloituja MUC1-peptidi rokotteiden on kuitenkin ollut hyvin alhainen pieniä tai havaita CD4 + ja CD8 + T-soluvasteiden [34], [35]. Ei-glykosyloituja MUC1-peptidi, joka on konjugoitu immunogeeniseen glykokonjugaatti mannaania esiin voimakkaita immuunivasteita, mukaan lukien CD8 + T-solujen [31]. Ihmisillä ei-glykosyloidun MUC1-peptidi rokotteet ovat ensisijaisesti herätti humoraalisen ja CD4 + T-soluvasteiden [36] – [38], kun taas virus ja DC rokotteita ovat myös aiheuttaneet sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) vasteita [39] – [44] . Induktion CD8 + T-solujen havaittiin vain muutamilla potilailla tai käyty useita uudelleen stimulaation

in vitro

[39] – [44], mutta useat rokotteet ovat osoittaneet tehoa, vaikkakin rajallinen [38 ] – [41], [44] – [57]. Kaksi virusrokotteiden ilmentävät MUC1, joko yhdessä IL-2 (TG4010) [41], [48] – [51] tai yhdessä syöpä -antigeeni (PANVAC) [52], ovat osoittaneet kliinistä vaikutusta potilailla, joilla ei pieni- keuhkosyövän ja haimasyövän [39] – [41], [48] – [52]. Lisäksi kliininen vaikutus on myös osoitettu liposomaalisen rokote (BLP25), joka koostuu 25 mer ei-glykosyloituja peptidi MUC1-tandem-toistoalueen [53] – [57]. Mielenkiintoista on, että pienessä kliinisessä tutkimuksessa alkuvaiheen rintasyöpäpotilailla immunisoitu mannan-MUC1, rokote indusoi sekä humoraalisia ja T-soluvasteita glykosyloimattomiin MUC1 ja poistaa toistumisen tauti [45].

Useimmat edellinen rokotteita suunnattu glykosyloimaton MUC1, vaikka tämä ei ehkä ole kaikkein syöpä erityistä tavoitetta. Kohdistaminen syöpään liittyvä glykopeptideihin epitooppeja MUC1 kuten GalNAc-MUC1 [11], [12], [58] olisi myönteinen, mutta biosynteesissä MUC1 glykopeptideihin epitooppien ilmaiseman kasvaimia on vaikeuttanut puute liittyvistä teknologioista ja korkeat kustannukset. Niinpä tällä hetkellä ei ole selvää, miten glykaanien vaikuttaa käyttöönottoa, esitys, tunnustamista, ja induktio immuunivasteiden CD8 + T-soluepitooppeja. Vaikka läsnäolo glykaanien saattaa olla positiivinen vaikutus ottoa glykosyloidun antigeenejä [19], [20], [59], glykaanien voisi vaarantaa tuloa immunologiseen proteasomin [60], proteasomaalisten pilkkominen, TAP-välitteistä translokaatio, ja peptidi lastattu MHC-luokan I molekyylien [60], [61].

tässä tutkimuksessa olemme tutkineet seuraus MUC1 GalNAc-glykosylaation tunnettujen CD8 + ja CD4 + T-solujen aktivoimiseksi antigeenejä. Otimme etuna ovalbumiinin mallin järjestelmän avulla OVA-MUC1 fuusiopeptideillä sisältävä immunodominantille MHC-luokan I (SIINFEKL) ja MHC-luokan II (ISQAVHAAHAEINEAGR) OVA epitooppeja lukema antigeenin oton ja käsittelyn. Epitoopit olivat reunustaa GalNAc glykosyloituja tai ei-glykosyloituja MUC1 peräisin peptidisekvenssejä. Lisäksi olemme tutkineet vaikutusta GalNAc glykosylaation fysiologisen kasvaimeen liittyvän MUC1 glykopeptidi tiedetään aiheuttavan CD4 + ja CD8 + T-solujen vasteita. Tämä peptidi (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV) on läheinen sekvenssihomologia tandem repeat MUC1, mutta sisältää HLA-A2-epitoopin puuttuu tandem-toisto. Esitämme data viittaa siihen, että GalNAc tähteet tuki antigeenin oton ja MHC-luokan II esitys sukupolven voimakas syövän vasta-ainevasteen, ja lohko esitys CD8 + T-soluihin.

Tulokset

GalNAc- glykosylaatio parantaa CD4 + T-solu-vasteet

ensin tutkittiin miten GalNAc-glykosylaation peptidiantigeeni käsittelyä ja peptidin esittely MHC-luokan II molekyylejä (kuvio 1). Voimakas I-A

b: tä sitovaa OVA-peptidillä oli fuusioitu MUC1 peräisin oleva sekvenssi ja ilman GalNAc-glykosylaation (taulukko 1), ja ladattiin DC jotka viljeltiin yhdessä ovalbumiinin peptidi /MHC-luokan II kompleksin T-solun, hybridoomien. DC ladattu glykopeptidien lisäsi OVA CD4 + T-solujen hybridooman vastauksena OVA peptidiä verrattuna ei-glykosyloitu peptidi, riippumatta siitä, missä OVA epitooppi sijaitsi peptidisekvenssi (kuvio 1 B). Peptidejä, jotka sisältävät neljä GalNAc-tähteet indusoi suuremman vasteen kuin peptidit, jotka sisältävät kaksi GalNAc jäämiä [62], [63] (kuvio 1 B). Jopa hyvin pieninä pitoisuuksina (30 nM) ja glykopeptidien stimuloi CD4 + T-solu-hybridoma, kun pieninä pitoisuuksina ei-glykosyloidun peptidi indusoi mitään vastetta (tuloksia ei ole esitetty).

A) O-glykaanin synteesin yleiskuva. B) IL-2 tuotannon OVA CD4 + T soluhybridoomasoluissa (BO.97.10) viljeltiin yhdessä luuytimestä peräisin DC pulssitettiin kahden peptidivariantteja kanssa ja ilman 2 ja 4 glykaanitähteen jäännökset (GalNAc). Täyspitkä OVA käytettiin positiivisena kontrollina. Yksilöllisesti viljellyt T-solut ja DC oli OD-arvo yhtä suuri kuin tausta.

GalNAc glykosylaatio Estää käsittely ja esittely MHC-luokka I sitojapeptidi

in vitro

samaa mallia järjestelmää käytettiin vaikutuksen selvittämiseksi GalNAc glykosylaation MHC-luokan I esitys.

In vitro

syntyy, sekä puhdistettua CD11 c + pernan DC, ladattiin GalNAc glykosyloituja tai ei-glykosyloituja MUC1-SIINFEKL fuusiopeptidien (taulukko 1). Toisin kuin tulokset, jotka saatiin luokan II MHC-esittely, GalNAc glykosylaatio MUC1-SIINFEKL vähensi aktivointi SIINFEKL /H2-K

b spesifisten T-solujen hybridoomia verrattuna ei-glykosyloituja peptidien riippumatta alkuperästä DC: iden (kuvio 2A-B). Seuraavaksi testasimme, miten sijainnin glykaanin tähteiden suhteen MHC-luokan I sitova epitooppi vaikuttaa CD8 + T-solujen vasteen. DC-soluja stimuloitiin käyttäen fuusio peptidien SIINFEKL joko reunustaa glykosylaatiokohtia tai paikallistettu C-pään peptidin. Fuusiopeptidien liittimen SIINFEKL osoitti lisääntynyttä T-solujen hybridooman vaste verrattuna fuusio- peptidi SIINFEKL lokalisoitu sisällä MUC1 toista riippumatta siitä, onko peptidien glykosyloitu vai ei. Virtaussytometrinen analyysi SIINFEKL /H2-K

b monimutkaista DC jälkeen peptidi jalostuksen vahvisti alemman MHC-luokan esittely GalNAc-glykosyloidun peptidejä verrattuna glykosyloimattomalla peptidit (kuvio 2C-E).

IL-2-tuotannon OVA CD8 + T-solujen hybridooman (RF 33,70) viljeltiin yhdessä luuytimestä peräisin DC (A) tai CD11 c + DC: iden puhdistettiin hiiren pernasta (B). DC pulssitettiin kahden peptidivariantteja kanssa ja ilman 2 ja 4 glykaanitähteen jäännökset (GalNAc). Täyspitkä OVA käytettiin positiivisena kontrollina. Yksilöllisesti viljellyt T-solut ja DC oli OD-arvo yhtä suuri kuin tausta. C, D) Surface ilmentymistä virtaussytometrialla on SIINFEKL että H2kb peptidin sitovan uran DC jälkeen sykkii kaksi peptidivariantteja (ei-glykosyloitu peptidi (ohut violetti katkoviiva), peptidi 2 GalNAcs (paksu vihreä viiva), tai 4 GalNAcs (vaaleanpunainen viiva)). E) Pinta ilmentymä SIINFEKL että H2kb peptidin sitovan uran DC: issä ilman sykkivä (sininen viiva) ja jälkeen sykkii OVA ohjaus (violetti viiva). Harmaat histogrammit edustavat soluja, värjätä ainoastaan ​​sekundaarisella vasta-aineella.

GalNAc glykosylaatio MUC antigeeniä herättää spesifisillä IgG-ja T-soluproliferaatiota

in vivo

Amino- happosekvenssi 24 mer synteettinen MUC1-peptidi (degMUC1) muistuttaa MUC1 tandem-toisto, mutta sen aminohapposekvenssi on hieman muutettu tuloksena on HLA-A2-epitoopin (ALGSTAPPV) [28]. DegMUC1 on siis optimaalinen sisällyttää ihmisen syöpärokotteissa jonka tavoitteena on saada MUC1 spesifisiä CTL-vasteita. Tutkia roolia GalNAc glykosylaation

in vivo

tämän MUC1 mallin tuumoriantigeeni, immunisoimme Balb /c-hiiriä ja HLA-A2-transgeenisissä hiirissä, joilla degMUC1 ja ilman GalNAc glykosylaatiota. Balb /c-hiiret, jotka oli immunisoitu GalNAc-glykosyloidun degMUC1 kehittynyt vahva IgG-vasteen, joka on spesifinen degMUC1, kun taas ei ollut mitään vastetta hiirillä, jotka on immunisoitu ei-glykosyloitu degMUC1 (kuvio 3A). Immunisaatiot KLH-konjugoituja glykosyloidun ja ei-glykosyloidun degMUC1 johti IgG-vasteen, sekä hiiren kantoja, vaikka glykosyloidun variantin johti näkyvämpi vastetta (tietoja ei esitetä). Yhteisymmärryksessä humoraalinen IgG-vaste, Balb /c-hiiret immunisoitiin GalNAc degMUC1 herättänyt merkittävää T-soluproliferaatiota jälkeen uudelleen stimulaation joko GalNAc tai ei-glykosyloitu degMUC1 (P≤0,0004). O T-soluproliferaatiota havaittiin immunisoitujen hiirten ei-glykosyloitu degMUC1 (kuvio 3B). Variantit, suurempi proliferatiivinen vaste todettiin HLA-A2-siirtogeenisiä hiiriä immunisoitiin glykosyloitunut verrattuna ei-glykosyloituja degMUC1 tarkastaa myönteisiä vaikutuksia GalNAc glykosylaation CD4 + T-solujen reaktiivisuus ja humoraalisen immuunivasteen (kuvio 3C). Kontrollina tuberkuliinin puhdistettu proteiinijohdannainen (PPD) stimulaatio johti samanlainen T-soluproliferaatiota molemmissa ryhmissä HLA-A2 siirtogeenisiä hiiriä.

A) Seerumin reaktiivisuus eri musiinia glykomuodoiksi Balb /c-hiirten, jotka oli immunisoitu degMUC1 + /- GalNAc ELISA. Tiedot edustavat vähintään 4 Balb /c-hiiret on immunisoitu kullekin antigeenille. (B) T-solujen lisääntymisen hiiristä Balb /c-hiiriä tai (C) HLA-A2: lla immunisoiduista hiiristä GalNAc degMUC1 (valkoiset pylväät) ja ei-glykosyloitu degMUC1 (harmaat pylväät) ja kunkin peptidin käytetään

in vitro

uudelleen stimulaatio (100 ug /ml), kuten x-akselilla. D) Lymfosyytit immunisoitujen HLA-A2-hiiriä, jotka oli pulssattu 9 mer degMUC1 peptidi, ALGSTAPPV, ja ilman glykosylaatiota. DegMUC1 CD8 + T-solut valitaan perustuen anti-CD8 Ab: n (x-akseli) ja anti-IFNy Ab (y-akseli) 4 tuntia ja Golgin lopettaa hoito. E) pernasoluja jälkeen 24 päivää ja uudelleen stimulaation ei-glykosyloitu ALGSTAPPV peptidi. Kaikki T-solu generoidaan pernasta tai imusolmukkeista vähintään 4 hiirtä, mutta useimmissa tapauksissa 6-hiirissä.

GalNAc glykosylaatio MUC1-antigeeniä Block CD8 + T-solujen vaste

vuonna vivo

vieressä tutki CD8 + T-solujen vastetta immunisaation jälkeen HLA-A2 siirtogeenisiä hiiriä degMUC1 (+/- GalNAc glykosylaatio) ja sen jälkeen uudelleen stimulaation kanssa degMUC1 9 mer CD8 + epitoopin ALGSTAPPV (+ /- GalNAc glykosylaatio). Ainoastaan ​​hiiret, jotka oli immunisoitu ja uudelleen stimuloitiin ei-glykosyloidun degMUC1 peptidi syntyy IFN-γ tuottavat, ALGSTAPPV erityisiä, CD8 + T-solut, kun taas mitään vastetta ei havaittu hiirissä, jotka on immunisoitu GalNAc glykosyloidun degMUC1 (kuvio 3D). T-solut immunisoitujen hiirten laajennettiin uudelleen stimulaation

in vitro

yhteensä 24 päivää kanssa ALGSTAPPV vahvistetaan, että ainoastaan ​​hiiret immunisoitiin ei-glykosyloidun degMUC1 vastasi uudelleen stimulaatio ALGSTAPPV (kuvio 3E) . Seuraavaksi analysoidaan stabiilius ja affiniteetti HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV kompleksin kanssa ja ilman GalNAc glykosylaatiota. HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV kompleksi oli puoliintumisaika 19 tuntia ja affiniteetti 100 nM, kun taas HLA-A * 0201-ALGST [GalNAc] APPV kompleksi oli puoliintumisaika 11 tuntia kanssa affiniteetti 300 nM. Näin ollen, ALGST [GalNAc] APPV on edelleen kiinteä väli sideaine ja olisi voitava saada aikaan CD8 + T-solujen toimintaa, joka perustuu MHC-sitovaa tietoja.

High Density GalNAc glykosylaatio Lisäykset otto MUC1 ja MUC2 Derived Peptides, mutta Estää MHC-luokka I Presentation

tiheys glykosylaation voi vaikuttaa otto välittämä lektiiniblottianalyysillä reseptorit, kuten MGL. Siksi me arveltu, että puute CD8 + T-solujen vasteita GalNAc degMUC1 peptidejä voi johtua heikosti käyttöön lyhyen GalNAc muutettu MUC1 peptidejä. Vaikka rajoitettu määrä GalNAc jäämiä ei riitä aiheuttamaan voimakas I-Ab vastausta, se saattaa olla riittämätön rajat esityksen tarvitaan indusoimaan H-2K

b vastausta. Testaamiseksi vaikutuksen GalNAc tiheys me pulssi DC: iden GalNAc-glykosyloidun biotinyloitu 60 merMUC1-peptidi, joka kattaa kolme MUC1 peräkkäistoistot (60 merMUC1). Vaikka GalNAc sisällyttäminen ei lisännyt otto monomeerin muodossa 60 merMUC1, lisääntynyt sisäänotto nähtiin, kun kompleksin muodostus indusoitiin streptavidiini (tuloksia ei ole esitetty). Seuraavaksi testasimme otto fluoresoivien helmien päällystetty MUC1 ja ilman glykosylaatiota. Helmet on päällystetty GalNAc MUC1, jotka tarjoavat erittäin suuren tiheyden GalNAc MUC1, johti selvästi lisääntynyt otto verrattuna ei-glykosyloitu MUC1 (kuvio 4A). Vaikutus useiden GalNAc tähteiden DC otto sai meidät testata, onko synteettisiä peptidejä, jotka sisältävät monia GalNAc jäämiä saattaa puutetta rajat esittämistä CD8 + T-soluepitooppeja havaittu lyhyempi MUC1 peptidejä. MUC2 Fuusiopeptidi sisältävät useita GalNAc glykosylaatiot sivustoja suunniteltiin ja

in vitro

glykosyloituneen tuottaa peptidin kanssa ja ilman 9-10 GalNAc jäämiä lokalisoitu MUC2 järjestyksessä. GalNAc MUC2 fuusiopeptidiä helposti tarttunut DC (kuvio 4B). Kuitenkin GalNAc glykosylaatio estetään edelleen pinnan ilmentyminen SIINFEKL /H2-K

b kompleksit ja T-solujen hybridooman aktivointi oli pienempi (kuvio 4C-D). Imaging internalized MUC2 fuusiopeptidin ja ilman GalNAc vahvisti suosia GalNAc-glykosyloitu peptidi, jonka DC (kuvio 4E-F). GalNAc MUC2 peptidi pääasiassa yhteistyössä paikallistaa lysosomaalisen merkki LAMP-2, kun taas ei-glykosyloitu MUC2 fuusiopeptidin pääasiassa yhteistyössä paikallistaa varhainen endosomaalisiin merkki ETA-1 (kuvio 4E-F, kuva S1). Lopuksi GalNAc glykosylaatio lisää ottoa, mutta estää käsittely kaksi fuusiopeptideistä sisältävien MHC-luokan I sitoutumisepitoopit.

A) DC oton päällystämättömän fluoresoivia helmiä, MUC1-fluoresoivia helmiä tai GalNAc MUC1 fluoresoivia helmiä. DC ilman helmiä käytettiin viitteenä. B) sisäänottoa MUC2 fuusiopeptidin +/- GalNAc arvioitiin virtaussytometrillä jälkeen 48 tuntia peptidin sykkivä. Unstained DC (violetti täynnä) ja DC ilman peptidin kuormitusta (vihreä) käytettiin taustavertailuna. C) arviointi pinnan ilmaisun virtaussytometrialla on SIINFEKL että H2kb peptidin sitovan uran. DC: itä pulssitettiin MUC2 fuusiopeptidin (korkein pitoisuus D) kanssa GalNAc (vihreä viiva) ja ilman GalNAc (violetti täynnä) 48 tuntia ennen värjäystä. D) IL-2 tuotannon SIINFEKL CD8 + T soluhybridoomasoluissa (RF 33,70) viljeltiin yhdessä luuytimestä peräisin DC pulssi

in vitro

kaksi päivää MUC2 fuusiopeptidiä sekä ilman glykosylaatiota pitoisuutena kaltevuus . Täyspitkä OVA käytettiin positiivisena kontrollina. Edustavat tiedot ainakin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. E, F) konfokaali kuvantaminen DC sisäistetty GalNAc MUC2 fuusio (E, vihreä) ja MUC2 fuusio (F, vihreä) yhteistyössä värjätty endosomaalisiin merkki ETA-1 (punainen) ja lysosomaalisen merkki LAMP-2 (punainen).

keskustelu

Syöpä liittyy poikkeava glykaanien edustavat voimakas kasvaimen antigeenejä [11], [12]. Käyttämällä MUC1 ja ovalbumiini kuin mallimolekyylien esitämme tiedot viittaa siihen, että GalNAc glykosylaatio lisää antigeenin sisäänottoa, MHC-luokka II esitys, ja CD4 + T-solujen aktivaation indusoimaan voimakkaita vasta-ainevasteita. Sen sijaan, GalNAc glykosylaatio voi estää MHC-luokan I antigeenin esittelyä ja aktivointi antigeenispesifisten CD8 + T-soluja.

On selvää, että GalNAc glykosylaatio voimistaa vasta-ainevasteita ja T-solujen proliferaatiota immunisoinnin jälkeen GalNAc modifioitu MUC1-peptidi ( degMUC1) (kuvio 3A). Selitys tälle GalNAc indusoi vasta- ainevasteen

in vivo

on todennäköisesti kasvu antigeenin esittelyyn, ja seuraava T-solujen stimulaation huomioitava GalNAc glykosylaatiota mallin peptidin degMUC1 sisältää OVA johdettu IA

b sitovaa peptidiä (kuvio 1). Tämä on sopusoinnussa edellisessä toteaminen voimakas IgG vastausten GalNAc MUC1 ihmisen MUC1 siirtogeenisiä hiiriä [11], [12] ja syöpäpotilaiden [13], [14]. Lisäksi se on yhdenmukainen parantunut CD4 + T-soluvasteita OVA konjugoitu GalNAc tähteet muissa tutkimuksissa [59]. Kyky GalNAc rikkoa immunologisen toleranssin ja tukea sukupolven CD4 + T-solu-riippuvaista humoraalisen immuunivasteen, on erityisen tärkeää syövän immunoterapiassa, jonka tarkoituksena on tuottaa IgG-vasta-aineita. Lisäksi erityinen induktio CD4 + T-solujen on ehdotettu johtavan kasvaimen hävittämiseksi viivästyneen tyypin yliherkkyys vasteet [64] ja viime aikoina syöpäpotilailla on kovettunut adoptiivisen siirron CD4 + T-solujen kasvaimen reaktiivisuus [65].

Immu- H2-K

b sitovaa peptidiä SIINFEKL, peräisin OVA, käytettiin lukema MHC-luokan I esitys. Tässä GalNAc glykosylaatio reunustavat MUC1-peptidi inhiboi MHC-luokan I esittämisestä SIINFEKL DC: issä sekä aktivoinnin CD8 + T-solujen vaste (kuvio 2). Mukaisesti Näiden havaintojen GalNAc glykosylaatio estyy CD8 + T-soluvasteiden

in vivo

immunisaation jälkeen HLA-A2 siirtogeenisiä hiiriä, joilla on GalNAc glykosyloitu degMUC1 sisältävän peptidin HLA-A * 02:01 sitova epitooppi (ALGSTAPPV ) verrattuna ei-glykosyloidun variantin (kuva 3D-E). Tämä voidaan osittain selittää vähentynyt stabiilius HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV monimutkainen, kun peptidi on GalNAc-glykosyloitu. Vaikka HLA-A * 02:01 sitoutumisaffiniteetti ja vakauden GalNAc-glykosyloidun peptidi on hieman vähensi edelleen näyttää sitoutuvan tasolla, joka on riittävä immunogeenisyys. Täten havaintomme ehdottaa vaihtoehtoisia selityksiä. Yksi mahdollisuus on, että glykopeptidien muuttaa DC aktivointia, mikä muuttaa T-solun aktivoitumista. Tämän tukemiseksi on osoitettu, että valikoiva MUC1 glykomuotojen T-solutoleranssin aikaansaamiseksi [66]. Kuitenkin estävä vaikutus todennäköisimmin tapahtuu käsittelyn aikana, koska vähemmän peptidi /MHC-komplekseja saavuttanut pinnan DC. Näin ollen, vaikutusta GalNAc on CD8 + T-solujen vaste voi johtua esto proteasomaalisten pilkkominen. Tämä selitys on myös vahvistettu biokemialliset tutkimukset pilkkomisen MUC1 johdettujen peptidien puhdistetaan immunoproteosomal entsyymit [60]. Tässä tutkimuksessa glykosylaatio sekä -VTS- ja -GST- sivustoja MUC1 tandem toistosekvenssistä (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) johti yhteenlasketut antigeenin käsittely, kun taas GalNAc glykosylaatio vain yhdessä näistä sivustoista estivät antigeenin käsittelyyn. Tämä selittäisi myös osittainen esittäminen CD8 + epitooppi, SIINFEKL, kun vain kaksi GalNAcs olivat läsnä SIINFEKL-MUC1 fuusiopeptidin, kun glykosylaatio neljä GalNAcs kohti toista johtaa lähes täydellinen lohko esitys. Kanssa meidän

in vitro

havaintojen perusteella on osoitettu, että CD8 + T-solujen toiminta on korreloi käänteisesti laajuus glykosylaation MUC1-proteiinin, jota käytetään esikäsittely on CD8 + T-solujen [67]. Tämä tukee käsitystä, että glykosylaatio voi edustaa ongelma CD8 + T-solujen induktio.

Lisääntynyt antigeenin sisäänottoa APC: itä on suuri merkitys määritettäessä T-soluvasteiden [19], [20]. On osoitettu, että GalNAc MUC1 päällystetty fluoresoiva mikrohelmet sisäistetään ihmisen DC: itä kautta sitoutumisen makrofagien galaktoosi-tyypin C-tyypin lektiinin (MGL) ja toimitetaan HLA luokan 1 ja 2 osastojen sisällä DC [19], [20] . On myös osoitettu, että GalNAc konjugoitu OVA-proteiinia tavoitteet MGL ja antaa paremman sisäänottoa ja CD8 + T-solujen vaste [59]. Tämä on päinvastoin kuin havaintomme pieniä peptidiantigeenien. Glykosylaatio tiheys saattaa osittain selittää tätä. Meidän tulosten perusteella on selvää, että tiheästi glykosyloituja 60 mer MUC1 monimutkaisissa streptavidiinilla ja päällystettiin mikrohelmiä aiheuttama selvästi suosia (kuvio 4A). Jotta voidaan testata, jos käyttöön useita GalNAc jäämien lisääntynyt CD8 + T-solujen aktivaation, loimme tiheään glykosyloitu MUC2 fuusiopeptidin katkaistava liitosyksikkö kahden peptidin osia [68], [69]. MUC2 valittiin, koska se on useita glykosylaatiokohtia paljon suurempi tiheys kuin MUC1 tuloksena peptidi, jossa on yli kaksi kertaa niin paljon GalNAc tähteiden 25 aminohapon sekvenssin. Kuten odotettua, GalNAc MUC2 fuusio vietiin tehokkaammin kuin ei-glykosyloitu vastine (kuvio 4B). Kuitenkin, tämä ei heijastunut aktivointiin CD8 + T-solujen tai peptidi /MHC pinta ilmaisu (kuvio 4C-D). Oletettavasti, tiheä GalNAc glykosylaatio lohkot CD8 + T-solujen aktivaation, joko estämällä antigeenin prosessointia tai ohjaamalla immunogeeninä ei-MHC-I osastoja. Tukeminen jälkimmäinen, konfokaalimikroskoopin kuvantaminen osoitti kolokalisaation sisäistetty GalNAc MUC2 fuusioproteiinin LAMP-2. Sitä vastoin ei-glykosyloitu MUC2 co-paikallistaa alussa endosomaaliseen markkeri EAA-1 (kuvio 4E-F, kuvio S1). On huomattava, kuitenkin, että vankkaa induktio GalNAc-MUC1 ja MUC1 spesifisten CTL: ien on raportoitu hiiren tutkimukset käyttäen TLR-2-agonisti adjuvantti liittyy polion peräisin auttaja-T-epitoopin, ja yhden GalNAc glykosyloitu tandem toista MUC1 [70 ]. Aste ja lokalisointi glykaanien, sisällyttäminen auttajaepitooppeja, ja reitin oton ovat erittäin tärkeitä immuunivasteen.

Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että poikkeavaan GalNAc O-glykosylaatio voi estää sukupolven syöpä CD8 + T-solujen vaste kasvusta huolimatta antigeenin otto DC. Tämä voisi olla mahdollinen sudenkuoppa suunnittelun MUC1 kohdistaminen syövän rokotteita. Luominen fuusiopeptidien, jossa on kaksi tai useampia CD4 + ja CD8 + T-solujen antigeeneille, jossa spesifinen katkaisukohta ja käsittely sivustoja on otettu käyttöön, voi ratkaista tämän ongelman. Tällaiset lähestymistavat saattaa osoittautua vaikeaksi, koska esto CD8 + T-soluvasteiden on havaittu myös silloin, kun GalNAc tähteet erotettiin CD8 + T-solu-epitoopin kanssa, linkkeri sekvenssin. Lopuksi GalNAc glykosylaatio peptidin antigeenit voivat lisätä sukupolven CD4 + T-soluvasteiden, mutta estää CD8 + T-soluvasteita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinten kokeet hyväksynyt paikallinen eläin laitoksen ja Tanskan eläinlääkintä- ja elintarvikevirasto kanssa hyväksynnän numero: 2008 /561-1460. Eläimiä tarkkailtiin päivittäin injektion jälkeen voidaan havaita ei-toivottuja sivuvaikutuksia ja tapettiin murtamalla niska lopussa kokeen.

Peptidit

MUC1 60 mer-peptidi (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG

)

3 kanssa ja ilman biotinylaatio (Bio) saatiin kuten aiemmin on kuvattu [19], MUC2 (ITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTP), MUC2 fuusiopeptidin (Biotin-PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTAAAAAAPSIINFEKL), degeneroitunut (deg) MUC1 24 mer (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV), 9 meerinen peptidi ALGSTAPPV ja OVA-MUC1 fuusiopeptidien (taulukko 1) ostettiin Schafer-N (Tanska) ja glykosyloituneen

in vitro

käyttäen ihmisen rekombinantti-glykosyylitransferaasien GalNAc-T2, -T4 ja -T11 kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Pitoisuudet kaikki peptidit tasapainotettiin HPLC standardikäyriä ja hajoaminen peptidien seerumissa vähäinen kyseiselle 48 h aikana (tuloksia ei ole esitetty). KLH konjugoituja peptidejä valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [11].

mittaaminen peptidi-MHC-I Affinity vakaus- ja

peptidi-HLA-A * 0201-affiniteetin mittaukset suoritettiin käyttäen homogeenista AlphaScreen perustuvaa määritystä [71]. pMHC-I vakautta mitattiin käyttäen homogeenista scintillation proximity assay [72].

Cell Lines

Seuraavat OVA peptidi /MHC kompleksin erityisiä hybridoomien käytettiin: ISQAVHAAHAEINEAGR /IA

b monimutkaisia erityiset soluhybridoomasoluissa BO-97.10 [73] oli ystävällinen lahjoitus John Kapplerin ja Philippa Marrack ja SIINFEKL /H-2K

b monimutkainen erityisiä b soluhybridooma- 25- D1-16 [74] oli ystävällinen lahjoitus Ronald D Germain (NIH). SIINFEKL /H-2Kb kompleksin rajoitettu soluhybridoomasoluissa RF33.70 [75] käytettiin myös. Kaikki solut pidettiin RPMI 1640 glutamax, 100 U /ml penisilliiniä ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä sekä 10% FCS: ää (standardi medium). Lisäksi 5% rikastamiseen täydennys lisättiin T-solujen hybridoomia. Rikastamista täydennys sisältää: glukoosia, välttämättömiä ja ei-välttämättömiä aminohappoja, etanoliamiini, Na.pyrovat, insuliini, testosteroni, 2-ME: tä ja linolihappoa. B-soluhybridoomamenetelmän 5% FCS, 0,1%: n SSR-3 ja 5% väkevöimisen täydentää lisättiin.

Hiiret ja Immunisointimenettely

Kaikki hiiret pidettiin eläintilat tilat tiedekunnan terveys Sciences (Kööpenhaminan yliopisto). Kaikki kokeet ovat hyväksyneet Tanskan viranomaiset.