Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmiskudoksen kallikreiinien (KLKs) ovat jäseniä monigeeniperheeseen seriiniproteaasien poikkeuksellisesti ilmaistu monissa syöpätyyppeihin. Munasarjasyövän, 12 KLKs ovat voimistunut, ja näiden KLK5, 6 ja 10 ovat olleet painopiste tutkinnan uusia diagnostisia ja prognostisia biomarkkereita. Kuitenkin tiedetään vähän panosta KLK5, 6 ja 10 munasarjasyöpään patofysiologiaan.

Tässä tutkimuksessa paneeli 13 ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa seulottiin ELISA eritystä KLK5, 6, 8 , 10, 13, ja 14. ES-2-solulinjan, puuttuu näistä kallikreiinien, transfektoitiin ekspressiovektoreilla ja KLK5, 6 ja 10 erikseen tai pareittain. Co-ilmentyminen KLK5, 6 ja 10 korreloi vähentynyt aggressiivisuutta munasarjasyövän solulinjoissa on määritelty vähentää pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa ja karvattomille hiirille kasvaimien synnyttämiskyvyn. ES-2 klooneja yliekspressoivia KLK5, 10/5, 10/6, 5/6 tehty huomattavasti vähemmän pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Verrattuna kontrollihiiriin, selviytyminen injektoitujen hiirten kanssa ES-2 klooneja yliekspressoivia KLK10, 10/5, 10/6, 5/6 oli huomattavasti pidempi, kun taas KLK6 oli lyhyempi. Kaikki ryhmät näytetään säilyä myös erosivat määrällisesti että laadullisesti niiden esittämistä askites, jossa on sekä vähentänyt vatsaonteloon sekä puuttuminen soluaggregaateiksi näissä askites. Selviytyminen johtuvan edun KLK10 yli-ilmentyminen voitiin toisteta kanssa ulkoisten hallinnon rekombinantti KLK10. Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että KLK5, 6 ja 10 voivat moduloida etenemisen munasarjasyöpä, ja vuorovaikutuksessa yhdessä muuttamaan kasvaimen patofysiologiaan. Lisäksi tulokset tukevat otaksuttu rooli KLK10 tuumorisuppressorina ja ehdottaa niitä voi pitää terapeuttista potentiaalia munasarjasyöpä.

Citation: Pépin D, Shao ZQ, HUPPE G, Wakefield A, Chu CW, Sharif Z, et ai. (2011) kallikreiinien 5, 6 ja 10 Differentially Alter patofysiologia ja Kokonaiselossaoloaika käytettäessä munasarjasyöpä ksenograftimallissa. PLoS ONE 6 (11): e26075. doi: 10,1371 /journal.pone.0026075

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2011; Hyväksytty: 19 syyskuu 2011; Julkaistu: 15 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Pépin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain apurahan Ontario Graduate Scholarship Science and Technology D. Pépin. Tällä rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Keskeiset rahoitus tutkimuksen tarjosi IBEX Pharmaceuticals, Inc., joka työllisti jotkut kirjoittajat, jotka ovat osallistuneet suunnitteluun tutkimukset ja kerääminen ja analysointi. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Z.-Q. Shao, G. HUPPE, A. Wakefield ja C.-W. Chu oli työntekijöitä IBEX Pharmaceuticals, Inc., ajankohtana tiedonkeruun. D. Pépin, Z. Sharif ja eKr Vanderhyden työskentelee tällä hetkellä IBEX Pharmaceuticals, Inc. Ei ole patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS ONE politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Äskettäin löydetty kudos kallikreiinien ovat perheen erittyvä seriiniproteaasien käsittää 15 jäsentä (KLK1- 15), joiden geenit (KLK1-15) ovat ryhmittyneet peräkkäin on 300 kb kromosomi 19q13.4 [1]. KLK proteiinit havaitaan monissa biologisissa nesteissä, kuten veressä, siemennesteen plasmassa, hiki, sylki, aivo-selkäydinnesteen, maito ja välitilojen, jossa ne voidaan aktivoida ja /tai inaktivoida entsymaattisella katkaisulla [2]. KLKs lohkaista laaja valikoima substraatteja, kuten soluväliaineen (ECM) proteiineja, insuliinin kaltaista kasvutekijää sitovat proteiinit, proteaasi-aktivoitu reseptorit (PAR), muut kallikreiinien ja jopa itse [2]. Lisäksi KLKs ilmaistaan ​​usein ryhmiin, kuten KLK3, 4, 5, 6, 8, 10, 13 ja 14 rinnan tai KLK2, 3, 4, 5, 11, ja 15 eturauhasen [2]. Nämä havainnot ovat johtaneet olettamukseen, että kallikreiinien voi toimia limittäin välittää niiden biologiset vaikutukset, tunnetaan myös KLK activome [3]. Esimerkiksi, alustavat todisteet viittaavat siihen, että KLK5 voi olla aloittaja KLK kaskadeja, joka kykenee aktivoimaan pro-KLK2, 3, 6, 7, 11, 12, 14, jolloin hajoamista ECM komponenttien siemennesteen, ja nesteyttäminen [4] .

kallikreiinien on liitetty useita sairauksia, kuten Alzheimerin tauti ja multippeliskleroosi [5], [6], tulehduksellinen suolistosairaus [7], niveltulehdus [8], sepsis [9], diabetes [10 ], ihotaudit [11] ja syöpä [12]. Koska KLKs erittyy, ja helposti havaittavissa biologisissa nesteissä, ne ovat nousseet mahdollisesti arvokkaiden biomarkkereita, erityisesti syövän, jossa KLK3 (tunnetaan myös prostataspesifisen antigeenin) on osoittautunut olevan käyttökelpoinen eturauhassyövän seurantaa. Useimmat KLK ilme on alle hormonaalista valvonnan, ja reagointikykyä KLK2 ja 3 androgeenien eturauhassyövän solulinjoissa [13], ja KLK6 ja 10 estrogeenien rintasyövän solulinjoissa on dokumentoitu hyvin [14], [15]. Rakenteessa ilmaisun KLKs sekä hormonaalisen sääntelyä, vihjaa, että he voivat olla mukana sisäeritykseen liittyviin adenokarsinoomia synnytyskanavassa kuten eturauhasessa, kiveksissä, rinta-, kohdunkaulan, ja munasarjojen syöpien.

Kertyvät todisteita ehdottaa, että vähintään 12 15 kallikreiinien ovat yläreguloituja munasarjasyöpä. Näiden, KLK4, 5, 6, 7, 10, ja 15 liittyy epäedullinen ennusteeseen, kun taas ekspressio KLK8, 9, 11, 13, ja 14 on yhdistetty suotuisa ennusteeseen [12]. Tämä tutkimus keskittyy KLK5, 6 ja 10, jotka ovat usein yli-ilmennetään munasarjasyövän ja todettu kohonneita pitoisuuksia vatsaonteloon sekä potilaiden seerumissa [16] – [18]. Erityisesti seerumin KLK6 ja KLK10 ovat indikaattoreita huonoon ennusteeseen [19], [20], ja korkea KLK6 liittyy lyhyempi uusiutumista elinaika ja alhaisempi kokonaiselossaolo [21]. Korkea KLK10 seerumissa liittyvät pitkälle vakavien kasvainten suuret jäljellä sairaus ja huono vaste kemoterapialle [22], kun taas alhainen KLK10 kasvaimen ennustaa huono eloonjäämiseen [23]. Histologinen alatyyppejä epiteelin munasarjojen syöpien, kuten vakavien, mucinous, endometroid, kirkas solu ja erilaistumaton kasvaimet voivat heijastaa erillisiä ontogenies ja ovat yhä tärkeämpiä räätälöintiä hoidossa [24]. Ilmaisu on KLKs on hämmästyttävän samankaltainen eri puolilla histologisia alatyyppejä. Esimerkiksi kaikki alalajit ilmaista KLK6, jossa ehkä hieman suurempi osuus selvä kasvainten että näyttää vahva immuunivärjäykseen KLK6 [21], [25]. Samoin potilailla, joilla on kasvaimia kunkin alatyypin on havaittavia määriä KLK10 niiden sytosoleissa, lievästi mutta merkitsevästi suurempi määrä KLK10 korkea potilaiden vointia vakavien alatyypin [26]. Lopuksi KLK5 ilme näyttää olevan yleisempää serous ja erilaistumaton kasvaimissa [27], [28].

Vaikka tiedetään vain vähän biologisen perustan panosta KLK5, 6 ja 10 Munasarjasyövän kyky KLK5 ja 6 pilkkovan ECM proteiinit [4], [29], ja aktivoi PAR signalointi [30] viittaavat siihen, että ne ovat suoraan sekaantunut eri osa syövän synnyn. Hajoamista ECM osat voivat helpottaa irtoaminen pahanlaatuisten solujen kasvain ja hyökkäys normaaleissa kudoksissa, kun taas jotkut vapautuu ECM peptidit voivat olla sekä pro ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia [29], [31]. Lisäksi PAR signalointi on tärkeä rooli vasoregulation, solujen kasvuun ja tulehduksen [32], [32,33]. KLK10 tunnistettiin otaksutun tuumorisuppressori rintojen [34] ja syöpien [35], ja on usein vaiennettu munasarjasyövän solulinjoissa ja kasvaimia [36], vaikka sen ilme seerumissa on epäsuotuisa ennustetekijöiden merkki. Tämä näennäinen paradoksi on esimerkki kahtiajako kallikreiinien koska sekä positiivisia että negatiivisia säätelijöitä prosessien karsinogeneesissä kuten angiogeneesin, kasvu, invaasio, ja etäpesäkkeiden [37].

Vaikka näyttöä poikkeava ilmentyminen useiden kallikreiinien munasarjasyövän on asennus, vähän tiedetään niiden vaikutus taudin patofysiologia. Tässä raportoimme ensimmäinen yritys purkaa panosta KLK5, 6 ja 10 ksenograftimallia munasarjasyöpä, ja ensimmäinen terapeuttinen käyttö rekombinantin KLK10 proteiini

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

alkuperä [38], ja tyyppi kasvainten muodostettu ksenografteissa [39] varten munasarjasyövän solulinjoissa Caov-3 (adenocacinoma [40]), OVCAR -3 (lievästi eriytetty serous adenokarsinooma [41]), OVCAR-4 (adenokarsinooma [42]), OV2008 (endometreoid adenokarsinooma kanssa levyepiteelikarsinooma erilaistuminen [39]), C13 (endometreoid adenokarsinooma kanssa levyepiteelikarsinooma erilaistuminen [39]), OVCA433 (adenokarsinooma [ ,,,0],43]), SKOV-3 (kirkas adenokarsinooman [39]), OVCA429 (kirkas adenokarsinooman [39]), Hei (eriytymättömiä [39]), ES-2 (erilaistumaton [39]), OCC-1 (erilaistumaton [ ,,,0],39]), A2780cp (eriytymättömiä [39]), ja A2780s (eriyttämätön [39]) tässä tutkimuksessa käytettiin sekä niiden viljelyolosuhteita on kuvattu aikaisemmassa julkaisussa [39]. Solulinjat HT1080 ja NIH3T3, käytettiin kontrolleina, hankittiin ATCC (Manassas, VA, USA) ja viljeltiin mukaan niiden suosituksia.

Rakentaminen stabiilisti transfektoitujen ES-2 solulinjoista yli-ilmentävät kallikreiinien

plasmidit pcDNA3.1D /V5-His /lacZ (Invitrogen, Mississauga, ON, Kanada) genetisiinillä vastus, ja pIRESpuro-2 (Clontech, VWR, Mississauga, ON, Kanada) kanssa puromysiiniresistenssin käytettiin runkoverkkoihin ja vakaasti transfektoitiin ES-2 solulinjassa vektorin valvontaa. Lyhyesti, useita klooneja stabiilisti transfektoitu pIRESpuro-2 käytettiin yhtenä vektori valvontaa, ja useat kloonit peräkkäin transfektoitiin pcDNA3.1.1D /V5-His /lacZ ja pIRESpuro-2 käytettiin kaksinkertainen vektorisäädön. CDNA: t KLK5, KLK6 ja KLK10, sekä pcDNA-KLK5 ekspressiorakenne on pcDNA3.1D /V5-His-TOPO selkäranka, oli ystävällisesti toimittanut Dr. E.P. Diamandis (Toronto, ON, Kanada). KLK10 ekspressiovektori pCMV-neo tarjosi Goyal et al. ja on kuvattu aiemmin [44]. Lyhyesti, PCR-monistus, restriktiodigestiolla ja DNA-fragmenttien ligaatio, jotka edustavat cDNA: KLK5, 6, ja 10 osaksi ilmentämisvektorit pIRESpuro-2 suoritettiin, ja tuloksena konstruktit transfektoitiin stabiilisti ES-2-soluissa. Vähintään 3 kloonien kunkin poimittiin ja yksi valitaan satunnaisesti johtaa vastaaviin solulinjoja ES-2-KLK5, ES-2-KLK6, ja ES-2-KLK10 varten

in vivo

kokeissa. Kaksoisindikaattorimenetelmissä transfektantit, vähintään 3 itsenäisen kloonin pCMV-neo ilmentävät KLK10 oli edelleen transfektoitu pIRES-puro-2 ilmentävät KLK5 tai KLK6 ja yksi kutakin oli satunnaisesti valitun tuottaa vastaavasti ES-2-KLK5 /10 ja ES -2-KLK6 /10 solulinjat. Solulinja ES-2-KLK5 /6 muodostettiin yksi 3 kloonien transfektoimalla ES-2-KLK6 solulinjan pcDNA-KLK5 rakentaa. Transfektio ES-2-soluissa suoritettiin käyttäen Lipofectomine ™ 2000 (Invitrogen, Mississauga, ON, Kanada) protokollan mukaisesti valmistajan antamia. Kloonit kuvattu edellä valittiin ja ylläpidettiin DMEM (Thermo Scientific, Waltham MA, USA), joka sisälsi genetisiiniä (400 ug /ml) ja /tai puromysiiniä (10 ug /ml) (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA).

proliferaatiomääritystä

arvioimiseksi lisääntymistä, solujen kasvua analysoitiin vanhempien ES-2-solujen linjat ja 3 tai enemmän klooneja transfektoitu stabiilisti konstrukteja KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10 tai Vector hallinnan käyttämällä 12-kuoppalevyille alkuperäisen maljatiheyksiin 10000 solua /kuoppa. 96 tunnin jälkeen solut trypsinoitiin ja sen jälkeen laskettiin Coulter Counter (Beckman Coulter Inc., Fullerton CA, USA).

Anchorage riippumattomaan kasvuun

käytetty protokolla on aiemmin kuvanneet M. Pace et ai [45]. Lyhyesti, 5 x 10

3 solut suspendoitiin 3 ml: aan täydellistä väliainetta, joka sisälsi 3,5% alhaisen sulamispisteen agaroosia ja kaadetaan päälle pohjakerroksen 7% agaroosia samassa väliaineessa kuopissa 6-kuoppalevylle. Media (0,5 ml), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja vaihdetaan joka 2-3 päivä. Liuosta, jossa oli

p

-iodonitrotetrazolium violetti (1 ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan päivänä 7 ja pesäkkeet värjättiin 24 tuntia, lasketaan, ja valokuvattiin.

Invasion määritys

invaasiomääritys on kallikreiini yli-ilmentävät kloonit, käytimme HTS transwell 96 System® (Corning, Lowell, MA). Lyhyesti, The siirtoaltaat päällystettiin tyvikalvon otteita ohjeiden mukaisesti valmistaja, ja 5 x 10

4 solua 50 ul seerumittomassa alustassa lisättiin sitten ylä- kammioon, kun taas 150 ui elatusainetta, jossa oli 10% seerumia oli lisätään säiliöön. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä 24 tunnin ajan. Solut, jotka siirtynyt insertin pohjaan värjättiin hematoksyliinillä mukaisesti valmistajan protokollan, ja kalvot kiinnitettiin objektilaseille, skannataan ScanScope (Aperio, Vista, CA), ja sinisen määrää pikseliä kvantifioitiin käyttäen Aperio ohjelmisto (Aperio, Vista, CA). Tiedot piirrettiin% invaasio, verrattuna määrään solujen kontrollina transwell kalvo ei päällystetty tyvikalvon otteita.

Vieraslajisiirteen

Kaikki eläinkokeet suoritetaan tässä tutkimuksessa olivat noudattaen

suuntaviivat hoito ja käyttö Animals

perustama kanadalainen neuvoston Animal Care, ja hyväksyi ne Animal Care komitea yliopistossa Ottawa (Protocol ME-196). Nainen CD-1 nu /nu-hiiriä (Charles River Laboratory, Wilmington, MA, USA) iältään 5-6 viikkoa asutettiin ruokaa ja vettä

ad libitum

, on 12 tunnin päivänvaloa sykli. Kasvainsolun IP ksenografti menetelmää kuvattiin aiemmin [39]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun yhden viikon sopeuttamiseen, hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (IP) 10

7 ES-2-soluihin, tai jonkin sen johdannaisen klooneja valitaan satunnaisesti stabiilisti transfektoitujen solulinjojen kanssa KLK5, KLK6, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, Vector yksittäinen ohjaus, tai Vector kaksinkertainen ohjaus, uudelleensuspendoitiin 0,8 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta. Ryhmät Sitten sokaissut ionvestigators loppuun saakka kokeen päivänä 56. Sairauden etenemistä seurattiin päivittäin, joka perustuu joukko yleistä hyvinvointia asettamat kriteerit eläinten hoito komitea, ja painoindeksi kirjattiin kahdesti viikossa, kunnes ennalta määrätty päätepiste oli saavuttanut. Aika, jolloin taudin oireita ensimmäisen kerran, kuten lievä vatsan turvotus, tai pieni palpoitavissa massa kirjattiin. Päätetapahtumia olivat: nestehukka ja /tai laihtuminen on yli 15%, vaikka nestehoitoa, mitään todisteita hengitysvaikeuksia, kehon painon nousu yli 5 g keskimääräisestä kehon painon valvonnan hiiriä samanikäisiä samalla väestön läsnäolo kouraantuntuva vatsan massa, joka heikentää liikkuvuutta, ruokinta tai vaikuttaa hyvinvointi ja lopuksi läsnä vatsan turvotus, joka heikentää liikkuvuutta tai vaikuttaa hyvinvointi tai aiheuttaa merkittävää värimuutoksia ilmenevään selkä tai vatsanpuoleisten ihoa.

Kun ruumiinavauksessa, kasvain näytteet punnittiin ja jaettiin olla joko välittömästi flash-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -20 ° C: ssa, tai kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin (VWR, Mississauga, oN, Kanada) 24 tuntia ja säilytettiin 70% etanolilla ennen jalostamista parafinoidut lohkot, jotka leikattiin 5 um: n leikkeiksi ja hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05.

Tulokset

eritys kallikreiinien 5, 6 ja 10, korreloi alentunut aggressiivisuus paneelissa munasarjasyövän solulinjoissa, mutta on havaittavissa askites on munasarjasyöpä potilaat

ilmentäminen kallikreiinin klusterin lukien KLK4 on KLK14 on aikaisemmin raportoitu munasarjasyövän [37]. Kuitenkin se on myös raportoitu, että eri kallikreiinien voivat ovat täysin vastakkaisia ​​vaikutuksia potilaan ennusteeseen erilaisia ​​syöpiä [37]. Sen varmistamiseksi, että kallikreiinin ilmentyminen on toisteta munasarjasyövän solulinjoissa, paneeli kolmentoista munasarjasyövän solulinjoissa (CAOV-3, OVCAR-3, OVCAR-4, OV2008, C13, OVCA433, SKOV-3, OVCA429, Hey, ES- 2, OCC-1, A2780cp, A2780s) seulottiin eritystä KLK 5, 6, 8, 10, 13 ja 14 elatusaineeseen ELISA (taulukko S1). Pohjalta kallikreiinin ilmaisun, solulinjat voidaan jaotella ei-ilmentävien (SKOV-3, OVCA429, Hey, ES-2, OCC-1, A2780cp, A2780s) ja ilmentävillä (CAOV-3, OVCAR-3, OVCAR -4, OV2008, C13, OVCA433). Jälkimmäisessä ryhmässä, kaikki yhteisiin ilmaus KLK5 /6, ja 5 6 ilmaisi KLK10, 4 6 KLK8, 3 6 KLK13 eikä kukaan ilmaissut KLK14. Tutkia mitään yhteyttä kallikreiiniin ilmaisun ja aggressiivisuus solulinjojen, nämä kaksi ryhmää verrattiin kykyä hyökätä osaksi Matrigel, muotoon pesäkkeitä pehmeässä agarissa ja kehittää kasvaimia vatsaonteloon nude-hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). Löysä korrelaatio havaittiin, vaikkakin joitakin poikkeuksia, jotka toisin kuin ilmentävien solut ilmentävät kallikreiinien ei hyökätä matrigeeliä, eivät muodostaneet pesäkkeitä pehmeässä agarissa, ja kuten aiemmin raportoinut meille [39], oli erittäin huono on muodostaa kasvaimia nude-hiirissä (taulukko 1).

Stable yliekspressio KLK 5, 6 ja 10, yksin tai pareittain, ja klooneja kallikreiinin puutosta ES-2 solulinja, tuloksia muuttunut ankkurista riippumattomaan kasvuun, mutta ei vaikuta solujen lisääntymisen tai invasiiviseen mahdollisia

KLK5, 6 ja 10 olivat yleisimmin ilmaistuna kallikreiinien vähemmän aggressiivinen munasarjasyövän solulinjoissa viittaa korrelaation ilmaisu näiden kallikreiinien ja tuumorisoluja potentiaali. Kiusaa erilleen rooleja kallikreiinin ja niiden vuorovaikutusta tumourigenicity, ES-2-solut, jotka eivät ilmennä mitään tutkittua kallikreiinien (taulukko 1) transfektoitiin stabiilisti ekspressiovektoreilla KLK5, 6, 10 yksin tai pareittain. 3 tai enemmän klooneja KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10, 6/10 yhdessä tyhjällä plasmidilla ohjaus ja modifioimattoman ES-2-soluja verrattiin kiinnittymisestä riippumatonta kasvua, lisääntymistä ja invaasiota (Fig. 1). Expression of KLK5, 5/6, 5/10, ja 6/10 riitti merkittävästi heikentää ES-2-solut muodostavat pesäkkeitä pehmeässä agarissa verrattuna vain vektorin sisältävään ohjaus, mutta ei muuttanut määrä leviämisen yli 96 h tai moduloida kyky kloonien hyökätä on transwell määrityksessä.

Kolme tai useampia klooneja ES-2-solulinjan, jotka yliekspressoivat KLK5, 6 tai 10 tai paria KLK5 /6, KLK5 /10 ja KLK6 /10 verrattiin vanhempien ES-2-solut tai vektorin transfektoitujen valvonta

in vitro

niiden tuumorigeeninen potentiaali. A) Kloonit kasvatettiin pehmeässä agarissa ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin ja esitetään prosentteina solut, jotka muodostivat pesäkkeitä. B) klooneja kasvatettiin 96 h seerumia sisältävällä elatusaineella ja solumäärät laskettiin. C) Klonaaliset solut uudelleensuspendoitiin seerumittomassa alustassa talletettiin inserttiä päällystetty tyvikalvon uutetta ja annettiin hyökätä siirtokuoppaan uiminen median kanssa 10% seerumia 24 tuntia ja vaeltavat solut määrällisesti. Tulokset esitetään keskiarvona 3 tai enemmän klooneja +/- SEM, ja merkitys on päätellä yksisuuntaisella ANOVA kokeen jos p 0,05. Erilaiset pienet kirjaimet Kunkin pylvään yläpuolella tilastollisesti merkitseviä eroja arvojen (p 0,05). C, tiedot on normalisoitu lapsilukon.

Stable yliekspressio KLK 5, 6 ja 10, yksin tai pareittain, ja klooneja kallikreiinin puutosta ES-2 solulinja, tuloksia muuttuneessa selviytymisen hiiren ksenograftimallia

sen tutkimiseksi, ero kallikreiini ilmaisu voisi säädellä aggressiivisuus munasarjasyöpäsoluja

in vivo

, sisäisestä vatsakalvon (IP) ksenograftimallissa käytettiin. Tätä tarkoitusta varten ES-2 munasarjasyövän solulinja on ihanteellinen, koska se ei ilmaista kallikreiinien 5, 6 ja 10 (taulukko 1) ja muodostaa helposti nopeasti etenee kasvaimia IP nude-hiirissä, joihin on liitetty askites, jossa täten jäljitellään taudin etenemistä ihmisellä [39]. Kloonit johdetut solulinjasta, vakaasti erittävä KLK5, 6, 10, 5/6, 5/10 ja 6/10 in elatusaineet sekä asianmukaiset tyhjän vektorin valvontaa (taulukko 2) injektoitiin IP immuunivajaissa nu /nu -hiirten . Hiiret injektoitiin 10

7 solua kutakin kloonia kohti eläimen ryhmissä 8, jotka sitten sokaissut, ja seurattava tarkasti päätepisteitä. Mediaani eloonjäämisajasta vanhempien linja oli 16d taas yksittäinen ekspressöija ohjaus oli 19.5d ja kaksois ekspressöija ohjaus oli 15d. Survival ryhmän ilmentävien KLK5 (24.5d) ei eronnut kontrolliryhmän (Fig. 2), kun taas selviytymisen ryhmien ilmentävien KLK10 (32.5d), KLK5 /6 (25,5), KLK5 /10 (23,5), ja KLK6 /10 (23,5) oli merkitsevästi pidempi kuin niiden asianmukaista valvontaa logrank testi (Fig. 2). Survival ryhmän yli-ilmentävät KLK6 (15d) yksinään oli huomattavasti lyhyempi kuin kontrolli solulinjaa muttei vanhempien linjaa. Ryhmät KLK5, KLK10, KLK5 /6 ja KLK5 /10 kukin oli yksi taudista vapaan elossa olleen hiiri, kun taas ryhmä KLK6 /10 oli kaksi, kun tutkimuksen päättymisen päivänä 56, kun taas kaikki hiiret kontrolliryhmässä ryhmää kehitti tautia.

A) kloonit ES-2-solulinjan, jotka yliekspressoivat KLK5, 6 tai 10 tai B) paria KLK5 /6, KLK5 /10 ja KLK6 /10 injektoitiin IP nude-hiirissä, ja eloonjääminen verrattuna verrokkihiiriin ksenosiirrettyjä sopivan vektorin rungon klooneja. Tulokset esitetään Kaplan-Meier juoni, ja merkitystä käyttäen logrank testi vs. sopiva kontrolli oli päätelty p 0,05. * Osoittaa p 0,05, ** tarkoittaa p 0,01 ja *** p 0,001.

Hiiret ksenosiirrettyjä kallikreiinilla erittävät kasvaimet näyttää muutokset patofysiologiassa

selventää yhteys KLK eritystä ja selviytymistä, useat sairauteen liittyvien mittareita verrattiin kaikissa ryhmissä upon ruumiinavauksessa (taulukko 3). Yleisin päätepiste oli vatsan turvotus (82%), joka saadaan askites kertymistä, jota seurasi hengitysvaikeudet (8%) vamma Pleuraeffuusiot, nestehukka ja laihtuminen (7%), ja lopuksi liikuntaesteisyys (3%). Jotkut eläimet ei mitattu päätepisteen tilastoihin, koska ei ole sairauden yhteydessä tutkimuksen päättymisen (N = 8), tai koska he kuolivat tautiin ennen niiden endpointed (N = 6). Kasvain histologia, levittää ja sivustoja etäpesäkkeitä olivat samanlaisia ​​joukossa ryhmiä, joiden parempana omentum, vatsakalvon kalvo, kalvo, sukupuolielimet, maksa ja suolisto. Sekä kasvaintaakkaa ja askitesta tilavuus kirjattiin eläimillä, jotka pääsivät päätepisteen, ja ei-nolla-arvot käytettiin laskettaessa keskiarvo (taulukko 3). Mean askites tilavuus ei ollut eroa ryhmien kanssa poikkeuksena valvonnan kaksinkertainen joka eteni viime heidän pullistuma päätepiste ennen uhrataan, koska niiden nopeaa taudin etenemisen. Tilastollisesti merkitsevästi laskenut esiintymistiheys askites ruumiinavauksessa ei havaittu eläinten ryhmissä KLK5 /10 (p 0,01) ja KLK6 /10 (p 0,01) vain 37,5% ilmaantuvuus verrattuna kontrolliryhmiin, jotka kaikki on kehitetty askites. Paradoksaalisesti KLK6 /10 ryhmässä oli myös keskimäärin korkeampi tuumorikuorma (p 0,01), todennäköisesti siksi, että pidemmän askites elinaika. Joukossa eläimistä, joissa ei kehittää askites sisällä ryhmissä KLK5, KLK10, KLK5 /6, KLK5 /10, KLK6 /10, huomattavasti harvemmin monisoluisten vapaasti kelluvan aggregaatteja askites tallennettiin (taulukko 3). Aggregaatit läsnä askites olivat kompakti aloilla solujen tasakokoisia (~ 1 mm

3) nähtävissä paljaalla silmällä. Kallikreiinia pitoisuudet mitattiin ELISA vuonna askites osoitti tasot KLK6 (taulukko 3) olevan verrattavissa tasoille potilaan askites, vaikka tasot sekä KLK10 ja KLK5 olivat koholla verrattuna potilaaseen näytteitä, erityisesti yhdistelmä ryhmissä.

elinaika kunkin ryhmän hiiret voidaan jakaa ajan ennen oireiden alkamisesta, jota seuraa oireiden ajan joka huipentuu päätepiste. Vaihtelevuus ryhmien välillä on jo läsnä, kun tarkastellaan oireiden alkamisesta (taulukko 3), mikä viittaa kallikreiinien voi vaikuttaa varhaisen sairauden etenemistä. Voit seurata varhain taudin etenemistä, plasman kallikreiinin tasot mitattiin ELISA: lla kussakin eläimessä viikoittain ja kun ruumiinavauksessa, palvelemaan korvikemarkkerilta kasvaintaakkaa. Kallikreiinien oli havaittavissa plasmassa hyvin ennen puhkeamista ensimmäiset oireet kaikkien hiirten, mikä viittaa siihen, että oireeton jälki tauti on havaittavissa mittaamalla verenkierrossa kallikreiinien.