Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) välittävät metastaattinen leviäminen monet kiinteiden kasvainten ja luettelointi CTC käytetään nykyisin ennustetyövälineenä indikaattorina selviytymisen metastaattisen eturauhassyövän potilailla. Jotkut viittaavat siihen, että se on mahdollista johtaa lisätietoja kasvaimia ilmentymisen analyysi CTC, mutta tekninen vaikea erottaa ja analysoida yksittäisiä CTC on rajallinen edistystä tällä alalla. Arvioida kykyä uuden sukupolven MagSweeper eristää ehjänä CTC jatkoanalyysille, suoritimme mRNA-Seq yksittäisistä CTC eristetty verestä Metastasoivassa eturauhassyöpä ja yksittäisistä eturauhassyövän LNCaP-solut piikkeinä vereen terveiden luovuttajien. Huomasimme, että MagSweeper tehokkaasti eristetty CTC kanssa talteenottotehokkuutta joka vastasi CellSearch alustalla. Toisin CellSearch, The MagSweeper helpottaa eristämistä yksittäisten elävien CTC saastuttamatta valkosoluja. Tärkeää on, että mRNA-sekvenssi-analyysi osoitti, että MagSweeper eristäminen prosessi ei ole havaittavissa vaikutusta transkription profiilin yhden LNCaPs eristetty piikki ihmisen verestä, mikä viittaa siihen, että häiriöiden aiheuttamat MagSweeper prosessin transkription allekirjoitus eristettyjä soluja ovat vaatimattomat. Vaikka RNA potilaasta CTC osoitti merkkejä merkittävää hajoamista, sopusoinnussa raportteja lyhyet puoliintumisajat ja apoptoosin keskuudessa CTC, transkription allekirjoitukset eturauhasessa ja syövän oli helposti havaittavissa yhden CTC mRNA-Seq. Nämä tulokset osoittavat, että MagSweeper tarjoaa pääsyn ehjänä CTC ja että nämä CTC täyteen kapasiteettiin kliinisesti merkittävää tietoa.

Citation: Cann GM, Gulzar ZG, Cooper S, Li R, Luo S, Tat M, et al . (2012) mRNA-sekvenssi on Single Eturauhassyöpä verenkierrossa olevia kasvainsoluja paljastaa kertaus Gene Expression ja Väylät Löytyy eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (11): e49144. doi: 10,1371 /journal.pone.0049144

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 04 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Cann et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain puolustusministeriön myöntää W81XWH-10-1-0510 (ja JDB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: GMC, SC, RL, SL, MT, SS, GS, MR, ja AT työskentelee tällä hetkellä Illumina. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) ovat soluja, jotka osittain ensisijainen kasvain tai etäpesäke ja anna verenkiertoon kautta vuotava verisuoniston, joka syntyy noin kasvava kasvain. Kun veressä, CTC kohdata vahingollisia rasituksia liittyy hemodynaaminen leikkaus-, alhainen happiolot, puute ankkurointi sivustoja, ja immuunijärjestelmän hyökkäys [1], [2]. Pieni määrä CTC hengissä kuitenkin ja ekstravasoitumaan ympäröiviin kudoksiin siemeniin etäpesäke tai reseed primaarikasvaimen [3]. Kuvattu yli sata vuotta sitten [4], CTC voidaan nyt luetella käyttämällä FDA hyväksyi CellSearch foorumi antaa prognostista tietoa selviytymisen metastasoituneen rintasyövän, paksusuolen ja eturauhasen syöpä potilaiden [5] – [7]. Moving pidemmälle luettelointi, useat ryhmät ovat ehdottaneet, että geneettinen ja transkription analyysi yksittäisten CTC voisivat hyötyä tehdä yksilöllisiä lääketieteellisiä päätöksiä syöpähoidon ja toimittamaan tietoa biologisten prosessien etäpesäkkeitä [8] – [10].

useita menetelmiä on hyödynnetty eristää CTC punaista ja valkosolujen (WBC: t). Eriyttäminen fysikaaliset ominaisuudet ja pinnan merkkiaineiden CTC on hyödynnetty niiden eristämistä suodattamalla [11], mikrofluidinen siru [12], [13], kelluva tiheyssentrifugoimalla [14] immu- valinta [15], [16], toiminnallinen rikastus ja havaitseminen [17], [18], ja automatisoituja immuunijärjestelmän mikroskopia [19], [20]. Immunomagneettihelmiä rikastamiseen anti-EpCAM-helmiä, jota seuraa fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelua on äskettäin osoitettu olevan tehokas lähestymistapa eristämiseksi CTC suhteellisen vapaa hematopoieettisten solujen [21]. Laiturien nykyisin käytössä eristämiseen CTC The MagSweeper teknologia tarjoaa suuria helppokäyttöisyys ja pääsy erittäin puhdas, ehjä, yksittäiset CTC soveltuvat geneettisten ja proteomiikka-analyysi [22], [23].

CTC ovat yleensä läsnä pieniä määriä potilaassa verinäytteistä (tyypillisesti 1 per 10

7 tumallisia soluja veressä) niin talteen maksimaalisen tietoja yksittäisistä tai saatavissa CTC eristää potilaan verinäytteestä on välttämätöntä. Seuraavan sukupolven DNA sekvensointi on erityisen hyvin syvä kuulusteluun syövän genomien ja transcriptomes [24], vaikka sovellettava yksittäisen solun tasolla [25]. Tässä tutkimuksessa olemme validoitu suorituskyvyn uuden sukupolven MagSweeper käyttää spiked LNCaP eturauhasen syöpäsolujen normaalissa veressä. Sitten toteutettiin kaapata herkkyys vertailun eturauhassyövän CTC välillä CellSearch ja MagSweeper on jäljitellä potilaalle näytteistä. Koko transcriptome sekvensointi tutkimuksissa yhden LNCaP paljasti, että MagSweeper eristäminen on vähäinen vaikutus geenien ilmentymisen. Lisäksi mRNA-sekvenssi välitteisen transcriptome profiileja yksittäisen eturauhasen CTC eristettiin metastaattista potilaan verestä verrattiin normaaliin eturauhasen kudosnäytteitä ja yhden eturauhassyövän solulinjoissa. Vaikka solusta toiseen heterogeenisuus ja laajan valikoiman CTC RNA laatu, suurempi ekspressio eturauhasen liittyviä geenejä, kuten androgeeni- reseptorin (AR), KLK3 (PSA) ja TMPRSS2 voidaan erottaa eturauhasen CTC. Bioinformatiikan näytöt geenien ilmaistuna 100 kertaa suurempi CTC verrattuna normaaliin eturauhasen näytteistä löytyi muita tunnettuja geenin väyliä ja allekirjoitukset odotettu eturauhassyövän ja vastaanottavan hoitohistoriaan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Stanfordin ihmiskoe noudattaminen hallituksen ja kiinni HIPPA määräyksiä. Kaikki ihmisillä allekirjoitettu suostumus ennen verinäytteen kokoelma.

Patient näytteitä ja veren kerääminen

Patient kerättiin 10 ml EDTA-putkiin (Becktonin Dickenson) ja käsitellä 12 tunnin kuluessa kokoelma. Näytteitä kerättiin suuntaviivojen mukaisesti määritellyt ja hyväksynyt ne Institutional Review Board ja jälkeen tietoon perustuvan suostumuksen. Välisiä vertailuja MagSweeper ja CellSearch, toisen 7,5 ml: n verinäyte kerättiin CellSave putkeen. CellSearch määritykset suoritettiin Quest diagnostiikkaa. Kokonais-RNA kolmesta histologisesti normaalin eturauhasen kudoksia saatiin kirurgisesti poistaa eturauhanen erillisen IRB-hyväksytty protokolla.

Soluviljely ja Cell Analyysin

LNCaP, PC-3, ja T24 soluja hankittiin ja viljeltiin mukaan määrittelemissä American Type Culture Collection (ATCC). Sen jälkeen dissosiaatio elävät ja kuolleet solut määritettiin trypaanisiniekskluusiolla. Sillä lisäystasot, solut laimennettiin noin 3 x 10

3 solua millilitraa kohden ja solupitoisuus tarkistaa tiputtelua ja laskemalla kuusi, kymmenen mikrolitran alikvootit soluja laikullinen lasi objektilasille. Ei korjaus kuolleita soluja perustuu trypaanisiniekskluusiolla käytettiin ennen lisäystasot soluihin.

Helmi Sidonta ja Cell Surface värjäys

Custom 1,5 um streptavidiinipinnoitettuja magneettihelmet funktionalisoitu mukautetun biotinyloidulla monoklonaalisella vasta-aineella suunnattu solunulkoisia ihmisen EpCAM epitooppi. Kaksi 3,75 ml: n tilavuutta verta näytettä kohti suoritettiin punasolujen hajoamista 10 tilavuudella 1 x PharmLyse (BD Biosciences) 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Jäljelle jääneet solut pelletoitiin 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan 300 x g. Solusakat siirrettiin 2 x 1 ml eriä 1% BSA /PBS /5 mM EDTA osaksi 2 ml: n tasapohjaiseen mikrosentrifuugiputkeen (VWR International). Sitten soluja pelletoitiin 5 minuutin ajan 510 x g. Solupelletit suspendoitiin uudelleen kaikkiaan 1 ml 1% BSA /PBS /5 mM EDTA: ta, joka sisälsi 15 ui Alexa 488 anti-humaani CD45 (Life Technologies) ja 30 ul yksilöllisistä anti-EpCAM-helmiä. Näytteitä pyöritettiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin 20 ui fykoerytriini (PE) anti-humaani-EpCAM-monoklonaalinen vasta-aine (BD Biosciences 347198). Näytteet olivat sitten pyöritettiin 4 ° C: ssa vielä 30 minuuttia ja siirrettiin sitten kuoppa 6-kuoppaiselle levylle, joka sisälsi 6 ml 1% BSA /PBS /5 mM EDTA: ta. Näytteet sekoitettiin kerran pipetoimalla ylös ja alas 10 ml: n pipetti, ja levyjä sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 400 rpm, minkä jälkeen inkuboitiin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ennen MagSweeper eristämistä. Joissakin tippakokeilla, LNCaP-solut merkitty ennen pisteväkevöimällä CFDA (Life Technologies) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

MagSweeper ja Single Cell eristäminen

Oletetut CTC eristettiin käyttäen kahta kierrosta MagSweeper eristäminen. Solut eristetään jälkeen ensimmäisen kierroksen MagSweeping vapautettiin ja värjättiin kuoppaan 6-kuoppalevylle, joka sisälsi 500 nM kalvo läpäisemätön DAPI (Life Technologies), niin että kalvo vaarantuu solut voitiin tunnistaa. Sen jälkeen toinen kierros MagSweeping soluja dispergoitiin ja pelletoitiin 400 rpm 1 minuutin ajan hyvin 6-hyvin alhainen tarttuvuus levy 10% Superblockilla (ThermoFisher) /PBS. Kuopat katsella Olympus käänteismikroskooppi varustettu epiflouresence. Putatiiviset CTC tunnistettiin soluissa, jotka värjäytyivät positiiviseksi PE anti-EpCAM ja negatiivinen Alexa 488 anti-CD45. Otaksutun CTC jotka olivat DAPI + jätettiin pois lisäanalyysistä. DAPI negatiivinen oletetun CTC eristettiin 1 ul 10% Superblock /PBS, jossa on pipetteman osaksi 0,2 ml PCR-putkeen, joka sisälsi 2,5 ui 5% ribonukleaasi-inhibiittori (Life Technologies) /0.2% Triton X-100 (10% liuos, Sigma) valmistettu nukleaasia vapaaseen veteen. Kerätyt solut flash jäädytettiin kuivajäässä ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Solujen puhtaus mitattiin lukumäärä spiked solujen talteen jaettuna teräviä solujen talteen plus leukosyyttien.

Yhden solun mRNA-Seq

Yhden solut hajotettiin ja RNA käänteistranskriboitiin käyttämällä älykkäämpiä Ultra Low Input RNA Illumina Sequencing kit (Clontech). cDNA monistettiin käyttäen Advantage 2 PCR Kit (Clontech) ja 18-25 kierrosta ennen muuntamista Illumina yhteensopivaan DNA sekvensointi kirjastossa olevia NextEra DNA Sample Prep Kit (Illumina) ja 12 sykliä PCR monistaa kirjastoon. Kirjastot kvantifioitiin käyttäen Bioanalyzer (Agilent) ja qPCR käyttäen Kappa Syber Green PCR Kit (Kappa Biosciences) kantaa IIlumina ECO qPCR kone. Parilliset end virtaus solut valmistettiin käyttäen kaksikymmentä of NextEra kirjaston kaistaa kohti on CBOT (Illumina) ja sekvensoitiin käyttämällä yhden 50 bp lukee koskevasta Illumina GAIIx.

Tasaus

Sekvensointitiedot kerättiin RTA versio 1.9 ja fastq tiedostot tuotettiin Casava 1.8. Lukee, että ei läpäissyt Illumina vakio laatusuodatinta poistettiin oletusarvoisesti. Lukee linjattu hg19 kanssa tophat v1.3.3 ja iskuina transcript laskettiin hg19 vuonna iGenomes käyttäen kalvosinnapit v1.1 kanssa vaihtoehdoista: -GTF genes.gtf -max-bundle-frags 20000000. Gene-by-geeni raaka laskee ja fragmentteja kohti kiloemästä eksonin miljoonasosaa fragmentteja kartoitettu (FPKM) muodostettiin kalvosinnapit isoform.fpkm_tracking tiedosto tunnistamalla kaikki transkriptit kanssa saman geenin nimi ja ottaen, vastaavasti, summa kattavuutta kerrottuna transkriptio pituus /lukea pituus kunkin otteen ja summa FPKM kunkin transkriptio. Raaka laskee ja FPKMs käytettiin kaikissa loppupään analyysi, paitsi QC askel.

RNA-Seq Data laadunvalvonta

Laadunvalvonta (QC) tehtiin käyttäen sisäistä Illumina RNA-Seq QC script. Base-by-perustakuuaika laskettiin poikki käsin poimittuja joukko 600 laadunvalvonnan geenejä, jotka valitaan RefSeq ja ovat erittäin siirrettävissä kartalle ja erittäin runsas yleismaailmallisia ihmisen RNA (UHR) näytettä (Agilent). Helposti siirrettävissä kartalle keinot, 90% emäksistä valitun transkriptio on 100% mappability. Voimakasta ilmentymistä UHR tarkoittaa, että vain geenit keskimääräinen kattavuus 1 x valittiin. Joten tietyn transkriptin 1000 emäsparin pituinen on vähintään 20 lukee 50 bp kartoitettu sitä. Geenit tässä asetettu yli 1 FPKM laskemiseen käytettiin lisää tilastotietoja. Mediaani kattavuus kaikissa pituus-normalisoitu QC geenien kanssa yli 1 FPKM piirrettiin. Kutakin laadunvalvonta geeni, jossa on yli 1 FPKM, variaatiokerroin laskettiin koko geeniä, ja mediaani kaikkien ansioluettelot määritettiin.

valvomaton Clustering

valvomaton hierarkkinen klusterointi [26 ] tehtiin kanssa heatmap toiminto R, jossa oletuksena euklidinen etäisyys käytettiin erilaisuus metristä. Kunkin näytteen 100-geenien korkeimman FPKM valittiin ja tuloksena allas 312 geenien käytettiin klusterointi.

LNCaP ilmentymisen analyysi

EDGER [27] ajettiin käyttäen valvottu tagwise dispersiot kanssa raaka iskuina geenin syötteenä. Korrelaatio näytteiden laskettiin raaka määrä lukee kartoitettu kutakin geeniä.

Geenit yliekspressoitu CTC

Koska luontainen vaihtelu yhden solun tiedot, yhdessä vaihtelevasti näennäinen mRNA hajoamisen havaittiin CTC, yksinkertainen kynnystys menetelmää käytettiin tunnistamaan yli-ilmentyvien geenien. Kunkin geenin suhde 2

nd korkein FPKM arvo joukossa joukko CTC on FPKM normaalissa eturauhasessa RNA laskettiin. Geenit, joiden suhde on vähintään 100 x ja yhteensä vähintään 10 lukee yksi CTC valittiin. GO ontologiat luotiin käyttäen Panther Classification System (https://www.pantherdb.org/) [28].

Tulokset

MagSweeper mittarit CTC eristämistä

uusi prototyyppi Magsweeper [22] kehitettiin joka on yhteensopiva operaatio useimmilla Bioturvallisuuskaapit (kuvio 1A). Suorituskyvyn arvioimiseen tämän foorumin, yli 11 kuukauden aikana, 100 LNCaP-soluja toistuvasti oli lisätty 3,75 ml normaalia veren ja eristettiin MagSweeper (n = 54 kokeita ja 11 verenluovuttajien). Ennen lisäystasot, LNCaP solujen elinkelpoisuus mitattiin trypaanisinieksluusiolla oli 89% ± 8%. Aikana erillään piikki verestä LNCaP-solut fluoresoivasti leimattu vasta-aineiden EpCAM ja CD45 erottaa LNCaP solut WBCs, ja kalvo läpäisemätön tumaväriä DAPI käytettiin tunnistamaan kuollut (kalvo vaarannu) soluja. Post-eristäminen me talteen keskimäärin 81% ± 16% elävien piikki LNCaP (EpCAM + /CD45- /DAPI-) (kuvio 1 B, sininen viiva), kun taas DAPI värjäys paljasti vielä 12% ± 6% eristetyistä LNCaP jotka olivat kalvo vaarantuu (EpCAM + /CD45- /DAPI +). Koska alkuperäinen solu piikki sisälsi 11% kuolleita soluja (mitattuna trypaanisinieksluusiolla) talteenotto 12% DAPI positiivisia soluja seuraavat MagSweeping osoittaa, että vahinkoa terästetty LNCaP menettelyn aikana on minimaalinen. Normaali, unspiked verinäytteitä ei saatiin EpCAM-positiivisiin soluihin (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Kuva huppu prototyypin MagSweeper. (B) Prosenttia pyydystäminen 100 LNCaP oli lisätty 3,75 ml normaalia veren (N = 54 kokeita ja 11 luovuttajien). Sininen ympyrä osoittaa tarkoittaa prosenttia saannot elävien EpCAM (+) /CD45 (-) /DAPI (-) solut ja punaiset ympyrät osoittavat keskimääräistä palautuneet kalvon vaarantuu EpCAM (+) /CD45 (-) /DAPI (+) soluja. Virhe pylväät edustavat +/- 1 S.D. (C) Prosenttiosuus talteenotto ja puhtaus 10 LNCaP eristettiin lisäystasot osaksi 7,5 ml normaalia verta. Siniset palkit ovat keskiarvo prosenttia elpymistä solut jälkeen MagSweeper eristäminen (Cell Capture) ja poimia ja manuaalinen paikka yksittäisen solun eristys (Cell Isolation), kun taas violetti palkit osoittavat puhtaus LNCaP jälkeen MagSweeper ja yksittäisen solun eristys (N = 6 kokeiluja ja 4 luovuttajien ). Solujen puhtaus laskettiin määrä spiked solujen eristetty jaettuna teräviä solujen laskettiin plus valkosolujen laskettiin. Virhe pylväät edustavat +/- 1 S.D. (D) Helotaustanäkymä (BF) ja kuvien fluoresoivasti värjättyä CTC eristetyn eturauhasen syöpä potilaan verinäytteestä, ja saastuttavia WBC jälkeen havaitut MagSweeper eristämisen. Asteikko bar = 20 mikronia. (E) MagSweeper versus CellSearch vertailu potilaan näytteistä. Näytteet, joissa 0 CTC jaettiin arvo 1 piirtämistä varten.

arvioimiseksi puhtauden ultra-harvinainen solujen jälkeen MagSweeping, 7,5 ml normaalia luovuttajan vereen lisättiin 10 CFDA-leimattuja soluja (n = 6 kokeita ja 4 luovuttajien) ja käsitellään meidän protokollaa CTC eristämistä. Captured LNCaP-solut tunnistettiin loisteputki havaitseminen CFDA, kun taas saastuttaen WBCs tunnistettiin positiivinen CD45 värjäystä. Sen jälkeen magneettinen lajittelu keskimääräinen prosenttiosuus LNCaP talteenotto 63% ± 25% havaittiin. Leimaus CD45-positiivisten solujen tuotti aluksi puhtautta eristetty LNCaP jälkeen MagSweeper solujen eristäminen 10% ± 6% ja 100% post yksisoluiset eristäminen käyttäen pick ja paikka menetelmällä (Fig. 1 C).

seuraavaksi suoritetaan vertaileva analyysi MagSweeper versus CellSearch vuonna luettelointi CTC verinäytteistä Metastasoivassa eturauhassyöpää. Tuolloin piirtää kaksi 7,5 ml verinäytteestä kerättiin, yksi näyte standardin EDTA putki MagSweeper solujen eristykseen ja toinen on CellSave putkessa analysoitavaksi riippumaton laboratorio (Quest Diagnostics) käyttäen CellSearch määritystä. Immunofluoresenssivärjäyksellä of MagSweeper eristettyjä soluja tunnistettu CTC kuin EpCAM positiiviset ja CD45 negatiivinen. CTC oli helppo erottaa WBC jotka olivat CD45 positiivisia, EpCAM negatiivinen (Kuva. 1 D). Numerot täysin puhdistettua CTC luetella MagSweeper eristäminen ja CellSearch verrattiin ja havaittiin olevan kohtuullisen samanlaisia, miedolla havaittua suuntausta kohti paremmin CTC talteenotto käyttämällä MagSweeper näytteissä alhainen CTC numeroita (kuvio 1 E).

MagSweeper eristäminen on vähäinen vaikutus yksittäisen solun transcriptomes

Kun arvioidaan MagSweeper eristysprosessissa vaikuttanut maailmanlaajuinen transkription profiilia eristettyjä soluja, suoritimme yksisoluisia mRNA-Seq 4. tuore LNCaP juuri ennen lisäystasot vereen, ja 4. LNCaPs jälkeen MagSweeper eristämisen piikki normaali veren. Yksittäisiä soluja säilytettiin jäässä vähintään kuukauden simuloida varastointiolosuhteet. Bioanalyzer jälkiä monistettu cDNA tuoreesta ja MagSweeper eristetty solu paljastui samanlainen molekyylipaino huiput monistustuotteiden keskitetty noin 1000 emäsparia (Fig. 2A).

(A) Bioanalyzer jälkiä monistettua cDNA yksinkertaisesta LNCaP soluja pre (Single LNCaP (pre)) ja post MagSweeping (Single LNCaP (post)), ja positiivinen kontrolli (12 pg LNCaP kokonais-RNA) ja negatiivinen kontrolli (negatiivinen vertailu). (B) Heatmap korrelaatioiden tuoreita ja MagSwept yksisoluiset RNA-Seq tiedot ja taulukko korrelaatioita tuoreita ja MagSwept näytteitä. Keltainen tarkoittaa suurempia korrelaatioita ja punainen alempi korrelaatioita. (C) edustaja bioanalysaattorin jälkiä hyvä, väli-, ja huono CTC cDNA monistustuotteita. (D) Prosenttia purkautuminen CTC RNA laatu perustuu luokitteluun cDNA amplifikaatiotuotteiden – vihreä tarkoittaa hyvä laatu, keltainen näytteet ovat osittain hajonnutta RNA: ta ja punaisella hajonnutta RNA: ta näytteistä. (E) Sequenced CTC, niiden RNA laatu ja% linjaus kulkee suodattimen mRNA-Seq lukee ihmisen genomiin rakentaa hg19. Potilaan CTC ID osoittaa yhden potilaan CTC tunnistettu potilasnumero. CTC numero (P1.1). RNA Laatu perustuu bioanalysaattorin jälkiä monistettu cDNA ja Kohdista% on linjaus% mRNA-sekvenssi lukee.

tutkia geenien ilmennetty eri tuoreen ja MagSweeper eristetty yksittäisiä soluja, ensin käytetty Bioconductor särmäysautomaatin paketti. Havaitsimme vain 1-geeni ilmentyy differentiaalisesti välillä MagSweeper-eristetty ja hallita LNCaP-solujen väärä löytö määrä (FDR) cutoff 0,05 ja ei yhtään sulku 0,01.

Meillä on myös tutkittu useita muita menetelmiä tunnistaa eroja välinen tuore ja MagSweeper eristettyjä soluja. Ensinnäkin luonnehtia aste solu-solu vaihtelua, kysyimme, kuinka monta geenit oli hyvin korkea FPKM ( 10) ainakin 1 näyte ja hyvin alhainen FPKM ( 0,1) vähintään yksi näyte. Me pidetään kolmea eri näytteiden: (1) 4 tuoreisiin soluihin (2), 4 MagSwept solut ja (3) 2 tuoretta ja 2 MagSwept soluja. Määrä vaihtelee suuresti geenien neljä tuoreisiin soluihin (215), neljä MagSwept soluja (268) ja yhdistelmä 2 tuoretta ja 2 MagSwept soluja (239) oli samankaltainen kaikissa ryhmissä ja heijastaa todennäköisesti solusta toiseen heterogeenisuus. Toisessa verrattuna laskimme korrelaation määrän lukee kohden geenin välillä kunkin parin näytteet, ja totesi, että sisällä ryhmän korrelaatioita ei ollut vahvempi kuin välinen ryhmä korrelaatioita – eli solut eivät klusterin perustuu eristäminen menetelmä ( Kuvio 2B). Lopuksi erillisessä tutkimuksessa olemme oli yhteinen Illumina ilmaus mikrosiru siitä altaat 10000 LNCaP ennen ja jälkeen MagSweeper eristäminen. Jälleen oli korkea ristikorrelaatio (R

2 = 0,985) välillä MagSweeper eristettiin solujen ja valvonta osoittaa, että MagSweeper tuottaa mahdollisimman pienen muutokset geenien ilmentyminen (dataa ei esitetty).

mRNA-sekvenssi yhden eturauhasen syöpä CTC

valmistimme monistettu cDNA 67 CTC eristettiin 13 eturauhassyöpäpotilaalla. CTC eristettiin jälkeen MagSweeping perustuu immunofluoresenssivärjäyksellä soluja, jotka olivat (EpCAM + /CD45- /DAPI-). Toisin kuin viljellyt LNCaP-soluja (kuvio 2A), huomasimme, että oli olemassa laaja valikoima kokoja monistetun cDNA: iden potilaasta johdettujen CTC, heijastava alkuperäisen RNA laatua. Olemme tunnettu jälkiä monistustuotteiden 3 ryhmään: 1) ne, joilla on huiput keskitetty noin 1000 bps (hyvä laatu), 2) jäljet ​​väli pituus vahvistus tuotteet (huonontunut), ja 3) jäljet ​​pääasiassa pienimolekyylipainoisen amplifikaatiotuotteita (hajonnut ) (Fig. 2C). Etsii kaikkien 67 CTC, 21%: lla oli hyvä laatu RNA, 37% oli osittain hajonnut, ja 42% näytteistä hajosivat (Fig. 2D). RNA laatu oli taipumus olla hieman kärsivällinen erityinen – esimerkiksi potilaan 2 tuotti eniten (8/12) hyvälaatuista RNA-näytteet. Käyttämällä RNA laatu oppaana, sekvensoimme kirjastojen 24 CTC johon osallistui kaikkien kolmen RNA laatuluokitukset, ja linjassa sekvenssit ihmisen genomiin (rakentaa hg19). Perustuen sekvenssikohdistuksen pisteet yli viisi prosenttia, sekvenssi tiedot 20 CTC kerätty 4 potilasta (P1, P2, P3 ja P4) valittiin edelleen perusteellisen tutkimuksen (Fig. 2E).

mRNA- seq tietojen laatua

arvioimiseksi mRNA-seq tietojen laadun, kattavuuden laskettiin käyttäen laadunvalvonta käsikirjoitus ja handpicked joukko 600 laadunvalvonta geenejä, jotka ovat erittäin siirrettävissä kartalle ja ilmaistaan ​​yleismaailmallisia ihmisen RNA: ta (katso Methods, RNA -Seq Data Quality Control määritelmä). Sekvensointi tietoja yksittäisen LNCaP, PC-3, ja T24 soluja läpäissyt laadunvalvontaa standardeja 60% linjaus ja 65% mediaani linjaus CV sovelletaan tyypillisesti suuria RNA panos mRNA-Seq tietojoukkoja (Fig. 3A) . Sen sijaan CTC näkyy korkeammasta tasosta mediaani ansioluettelot ja pienempi osuus linjaukset kuin soluviljelmässä. Tyypillisiä kattavuus koealojen solulinjat, normaalit eturauhasen kudoksia, ja CTC on esitetty kuviossa 3B. Solulinjat näytetään tasainen peitto koko pituudelta transkriptio, samalla kun normaali eturauhasessa oli lievä 3 ’bias, tyypillinen kudosnäytteiden (Fig. 3B). CTC oli monenlaisia ​​kattavuuden bias, kuten on esitetty. Koska oligo-dT käytettiin prime cDNA-synteesi, 3-prime bias peittoalueella tiedot osoittavat mRNA: n hajoamisen.

(A) Osuus kulkee suodattimen (PF) lukee että liittoutumattomien, prosenttiosuus linjauksia joka karttaa koodaavat alueet, mediaani kattavuus CV, ja prosenttiosuus lukee että kartan viiden geenien kanssa eniten kartoitettu lukee. Laskea ”mediaani CV”, ensimmäinen CV kattavuuden laskettiin poikki kukin 600 geenien käsin poimittuja joukko laadunvalvonta geenien ilmaistu yleismaailmallisia ihmisen RNA (Agilent), ja sitten mediaani näiden ansioluettelot on otettu (harkitsee ainoastaan ​​geenit, joilla on vähintään 1 x kattavuus). ”% Linjassa” on prosenttiosuus PF lukee että align genomiin tai on silmukointikohtaemäsasemasta ilman mitokondrioita ja ribosomaalisen RNA. Historiatietojen perusteella, odotusarvot mediaani CV ja% linjassa ovat 65% ja 60%: lla. Coding rinnastukset ovat% ja lukee että karttaa eksonit. Että% of lukee tasataan top 5 geenit kullekin näytteelle on esitetty (B) Esimerkkejä keskipituuden-normalisoitu kattavuus poikki 600 laadunvalvonta geenejä, näytteistä LNCaP.3, N.1, P2.1, P3.4 . Asento 0 on 5′-päähän selostukset ja 100 on äärimmäinen 3′-päähän transkriptin.

mRNA-Seq tietosisältö

Ymmärtääksemme transkriptio runsaus, vaihtelu ja alue CTC vertasimme jakaumat FPKM arvojen kaikkien RefSeq RNA: iden havaittu CTC ja LNCaP-soluja (taulukot S1 ja S2). Mittaukset RefSeq selostukset kanssa ≥10 FPKM paljasti LNCaP (n = 4) 4622 ± 136,2 selostukset (vaihteluväli 4485-4786 selostukset). Sen sijaan CTC (n = 20) lukumäärä RefSeq selostukset kanssa ≥10 FPKM 2362 ± 865 selostukset (vaihteluväli 1233-3987 selostukset).

Seuraavaksi tarkastelimme ekspressiotasot useiden eturauhasen päättäjät ja leukosyyttien merkki vahvistaa, että potilaasta peräisin solut eturauhasen alkuperä: androgeenireseptorin (AR), eturauhasen antigeenin (PSA, KLK3), TMPRSS2, ja leukosyyttien merkki CD45 kaikissa CTC näytteissä. Kuvio 4A esittää FPKM kaikkien näiden markkereiden potilaan CTC, kudosviljelmäsolulinjoissa, ja normaalissa eturauhasessa, ja arvot 1 FPKM varjostettu vihreä. Kaikki paitsi yksi CTC oli positiivinen ainakin yhden eturauhasen markkereita. LNCaP ja normaalissa eturauhasessa osoitti odotettavissa ilmentymistä näiden eturauhasen markkereita. PC-3 puuttui KLK3 ja AR ilmaistuna, odotetusti [29] mutta ei ilmaista TMPRSS2. Mikä tärkeintä, kaikki CTC ja solulinjat olivat negatiivisia WBC merkki CD45. Normaali eturauhanen, joka koostuu monista solutyypeistä mukaan lukien WBCs, oli positiivinen CD45 ilmaisun kuten oli yksittäinen WBC joka alistettiin mRNA-Seq. Lopuksi, T24, joka on virtsarakon syöpä solulinja ei ilmaissut näistä merkeistä. Ymmärtää, miten potilas CTC liittyvät toisiinsa, teimme valvomattoman ryhmittely analyysi kaikista potilaan CTC. Analyysi paljasti, että lukuun ottamatta kahta CTC (P2.9 ja P1.2), kaikki CTC yksittäisten potilaiden ryhmitelty potilaan erityisellä tavalla (Fig. 4B).

(A) Expression of eturauhassyövän liittyvien geenien. Jokaista geeniä, fragmentteja kohti kiloemästä eksonin miljoonasosaa fragmentteja kartoitettu (FPKM) kunkin CTC ja ohjaimet näkyvät. FPKM arvot ovat yli 5 varjostavat vihreitä ja ne, joiden arvot välillä 1 ja 5 varjostavat vaaleanvihreä. AR (androgeenireseptorin), KLK3 (prostataspesifisen antigeenin), ja TMPRSS2are markkereita eturauhasessa. CD45 on valkosolujen merkki. Eturauhassyövän solulinjoja ovat LNCaP-ja PC-3, kun taas T24 on virtsarakon syöpä, ja WBC on yksi valkosolujen. Normaali tarkoittaa normaalin eturauhasen kudosta. (B) valvomaton klusterointi yliekspressoitujen geenien potilaan CTC. Värilliset palkit yläosassa luku osoittaa erilaisia ​​potilaita, kun yksittäisen potilaan CTC on lueteltu alareunassa klusterin. (C) Toiminnallinen luokittelu geenien yli-ilmennetään CTC käyttämällä Gene ontologia (GO) luokituksia. Kunkin toiminnallisen ryhmitellään% geenien yli-ilmaistaan ​​kussakin GO luokassa on merkitty.

CTC Pathway Analysis

Voit etsiä geenejä ja polkuja, jotka aktivoituvat eri tavalla vuonna CTC vertasimme transkriptio profiilit CTC niille normaalista eturauhasen kudosten ja keskittyi geenejä, jotka olivat yli ilmaistu CTC. Normalisoida RNA-Seq tiedot perustuvat geenin koot ja määrä kartoitettu fragmentteja, käytimme tophat ja kalvosinnapit määrittää FPKM. Päättelimme, että vaihtelevalla RNA: n hajoamisen, että CTC johtaisi väärä positiivinen laskenta alle ilmaistuna geenien CTC, varsinkin kun puoliintumisaika RNA vaihtelee geenistä toiseen. Käytimme manuaalinen kynnystys menetelmää tunnistaa geenejä, jotka yli-ilmennetään CTC. Tarkemmin sanottuna valitaan geenit, jotka olivat vähintään 100-kertainen vähintään 2 CTC verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta ja joka sisälsi vähintään 10 kartoitettu kuuluu vähintään yksi näyte.

tunnistaa 181 geenejä yli -expressed in CTC verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksen (taulukko S3). Saadakseen yleiskuvan eri biologisia toimintoja, jotka liittyvät näihin selostukset, Gene ontologia merkinnät me johdettu GoSlim tietokantaan käyttäen Panther Classification System selaimella [28] (Fig. 4C) ja luokiteltu haluttu biologisten prosessien. Out of 181 geenien, 110 tuotti 173 prosessi osumia jotka luokiteltiin 14 biologisiin prosesseihin. Nämä näytetään käyttäen Panther Pie Cart ominaisuus (Fig. 4C). Niistä loput 71 geeniä merkintöjä ei ole luokitellut GoSlim 37 oli ei-koodaavat RNA: t, mukaan lukien jäsenten MIR, SCARNA, SNAR, SNORA, SNORD ja VTRNA perheitä. Loput 34 selostukset voitiin tunnistaa käyttämällä GeneCards. Tutkiminen transkriptien luokiteltu biologisissa prosesseissa paljastui, että kolmasosa liittyivät joko aineenvaihduntaa (23%, GO: 0008152) tai solusyklin (10%, GO: 0007049), sopusoinnussa mitoosiin soluja (Fig. 4C). Solusyklin ja mitoosia liittyvän transkriptien erittäin ilmaisi geenin setissä TPX2, CCNA2, CCNB1 ja B2, CDC20, CSK2, cdc2, CDKN3, CENPE, CD28, TOP2A, ORC1L, NUF2, CDK1, KIF2C, PTTG1 ja TTK.

Mielenkiintoista, lista sisältää monia selostukset germane eturauhassyövän biologian. Esimerkiksi kaikki 3 CTC potilaasta 1 ilmensivät runsaita tasoja SPINK1, transkriptio ja proteiini tunnistettiin koholla TMPRSS2-ERG fuusio negatiivinen eturauhasen syöpiä ja liittyy aggressiivinen eturauhassyöpä [30]. CTC potilaiden 1 ja 2 ilmensivät runsaita tasoja BIRC5 (surviviinin), anti-apoptoottisen ilmentyvän korkeina tasoina kastraatio kestävä eturauhassyöpä. CTC ilmaisi myös syöpään liittyvät selostukset (BAGE, BAGE3, CT45A1, CT45A4, CT45A5, CT45A6, CTAG18, CTAG2, MAGEA12, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA6, MAGEC1, MAGEC2, ja PTTG1) ja selostukset tärkeitä säätelyssä kehittämiseen (HOXB7, HOXB8, HOXB9