Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain solut ovat luonnostaan ​​heterogeeninen ja esiintyy usein heikentynyt tarttuvuus, jolloin irtoaminen kasvainsolujen verenkiertoon muodostaa kiertävä kasvainsoluja (CTC). Pieni osa näistä ovat eläviä CTC mahdollisten metastaattisen kolonisaation taas toiset ovat eri vaiheissa apoptoosin tekee niistä todennäköisesti vähemmän merkitystä ymmärtämiseksi tauti. Eristäminen ja karakterisointi elävien CTC voi lisätä tietoja, jotka on saatu standardi luettelointi auttaa lääkäreitä tarkemmin vahvistaa diagnoosin, valitse hoito, tarkkailla reaktio, ja antaa ennustetta. Raportoimme aikaisemmin on ryhmä lähi-infrapuna (NIR) heptamethine carbocyanine värejä, jotka on erityisesti ja aktiivisesti kuljetetaan eläviä syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa tämä elinkelpoisten kasvainsolujen-spesifinen käyttäytymistä käytettiin havaitsemaan elävän CTC eturauhassyöpäpotilailla. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) 40 potilaalla, joilla oli paikallinen eturauhassyöpä yhdessä 5 metastasoivaa tautia sairastavaa potilasta värjättiin IR-783, prototyypin heptamethine syaniiniväriaineeseen. Stained solut altistettiin virtaussytometria analyysi tunnistaa live (NIR

+) CTC varastoalueelta koko CTC, joka tunnistettiin EpCAM värjäystä. Potilailla, joilla on paikallinen kasvain, live CTC laskee vastasi yhteensä CTC numeroita. Korkeampi live CTC lukumäärät potilailla esiintyi suurempia kasvaimia ja ne on aggressiivisempaa pathologic ominaisuuksia, kuten positiivista katetta ja /tai imusolmuke hyökkäystä. Jopa korkeampi CTC numeroita (live ja koko) havaittiin potilailla, joilla oli etäpesäkkeitä. Elävät CTC määrät laskivat, kun potilaat saivat tehokkaita hoitoja, ja kääntäen laskee taipumus nousta aikaan taudin etenemistä. Tutkimuksemme osoittaa edellytyksiä soveltaa tätä värjäystekniikka tunnistaa eläviä CTC ja luo mahdollisuuden edelleen molekyyli- kuulusteluun entistä biologisesti relevantteja CTC väestöstä.

Citation: Shao C, Liao CP, Hu P, Chu CY Zhang L, Bui MHT, et ai. (2014) havaitseminen Elävät Kiertävä kasvainsolujen luokan Near-Infrared Heptamethine Carbocyanine Väriaineet potilailla, joilla on paikallisia ja metastasoituneen eturauhassyövän. PLoS ONE 9 (2): e88967. doi: 10,1371 /journal.pone.0088967

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 19 syyskuu 2013; Hyväksytty: 14 tammikuu 2014; Julkaistu: 14 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Shao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusmäärärahat päässä Eturauhassyöpä Foundation, National Institutes of Health /National Cancer Institute (2PO1CA098912 ja 1RO1CA122602) sekä johtokuntaa Cancer Research Chair (LWKC), ja jonka ohjelma kansainvälisen tiede- ja teknologiayhteistyön Kiina (nro . 2011DFA33110). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Solid kasvaimet ovat jatkuvassa evoluution progressiivisen heterogeenisyys [1], [2]. Prosessi metastasointiin liittyy useita fenotyypin vaihtelussa, jotka johtavat laski tarttuvuuden ja lisääntynyt solujen liikkuvuutta muun muutokset [3]. Jotkin liikkuvia syöpäsolut on kyky levittää kaukaisiin kohtiin kautta verisuonistoon ja imusuonten kanavia ja tunkeutua kudokseen ja muodostuu metastaattinen vaurio [4]. Kiertävä kasvainsolujen (CTC) muodostavat siten keskeinen yhteys ensisijaisen kasvaimia ja niiden etäispesäkkeitä, rajataan peruuttamaton sairauden etenemistä. Eristäminen ja luonnehdinta näiden elävien ja aktiivinen syöpäsoluja voidaan parantaa taudin ennustetta, kuten on osoitettu eturauhassyöpä (PCA) [5].

variseminen CTC on dynaaminen prosessi, joka tapahtuu sekä ensimmäisen ja metastaattinen kasvaimia. Se, että levitettävä kasvainsolut voidaan havaita veressä PCa potilaiden jälkeen eturauhasen [6] osoittaa, että CTC voi irtoa joko jäljellä kasvain eturauhasessa sängyssä tai metastaattisen talletukset. Molecular tutkimus näiden solujen voivat tarjota reaaliaikaista tietoa tilasta pahanlaatuinen etenemisen. Koska kokoelma CTC vaatii tyypillisesti pienet standardin flebotomiasta, jotkut ovat ehdottaneet, että CTC voidaan hyödyntää ihanteellisena korvike kudoksen tai nesteen koepala arvioida tautinsa [7]. Tällainen lähde kudoksen tarjoaisi yksinkertaisen, vähän invasiivisia kudoksen lähde, jota voitaisiin käyttää sarjoittain tarjoamaan korkean ajallinen määritelmä kehittymisen taustalla oleva sairaus.

ennustearvo CTC vetoaa tekninen kehitys mahdollistaa luotettavan havaitseminen ja eristäminen. CTC muodostavat vain minuutin murto-osa perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PMBCs). Monet uudet teknologiat ovat parhaillaan testataan CTC ilmaisun ja eristyksen [8]. Yleisimmin käytetty strategia perustuu epiteelin linjaa erityisiä markkereita, kuten EpCAM [9] tai kokoerot nähden PBMC [10]. Ainoa FDA-hyväksytty CTC määrityksessä käyttää immu- perustuvan erotustekniikan ilmentymisen epitheial pintamarkkereiden [11], [12]. Suhteellisen alhainen herkkyyttä yhdistettynä vaatimus ennalta kiinnitys tekee isolaateista sopimattomia molekyylitason analyysia siitä immunofluoresenssimenetelmällä. Riippuvuus merkki ilmaisua ei salli kokonaisvaltaista havaitsemisen heterogeeninen CTC allas. Tiedetään myös, ettei jokainen CTC johtaa uuteen metastaattisen vaurion. Allas on CTC koostuu elävän ja aktiivisesti metastasizing soluja ja sivullisten, jotka passiivisesti irtoa verenkiertoon [5], [13] – [15], yhdessä apoptoottisten kasvainsolujen roskat [16] – [18]. Vaihtoehtoiset CTC havaitseminen strategioita tarvitaan, eristämiseksi metastasizing jae, joka on todennäköisimmin löytyy live CTC allas.

Kehitetään kustannustehokas tapa tunnistaa eläviä CTC, arvioimme mahdollisuutta käyttää ryhmä synteettisen lähi-infrapuna (NIR) heptamethine carbocyanine väriaineita. Olemme aiemmin osoittaneet, että nämä orgaaniset väriaineet ovat nimenomaan kuljetetaan kasvainsoluihin ja pystyy erottamaan pahanlaatuiset alkaen pahanlaatuisissa soluissa ksenograftimalleissa tai spontaanit kasvaimet

in vivo,

ja kirurgiset Tuumorinäytteet

in vivo

tai

ex vivo

[19], [20]. Nämä väriaineet otetaan käyttöön ja kertynyt syöpäsolujen kautta aktiivisen liikennejärjestelmää riippumaton tavanomaisesti käytetään epiteelin pintamerkkiaine (EpCAM). Lisäksi otto väriaine edellyttää aktiivista (ATP-ajettu) liikenne ja täten ne voidaan nähdä toiminnallisena määritys kasvainsolujen elinkelpoisuuden. Tulokset nykyisestä aiheen olettaa, että IR-783, prototyyppi tämän ryhmän valittujen NIR väriaineita, voidaan sisällyttää useisiin havaitsemismenetelmät tunnistaa live CTC. Nämä elävät CTC voitiin eristää syöpäpotilaista ennen ja sen aikana hoitointerventio annetaan suhteellisen ei-invasiivisia hankintamenettelyä. Lisäksi molekyyli- kuulustelua voitaisiin sitten seurata edes yksisoluiset tason [21].

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidun hiiri monoklonaalinen vasta-aine (mAb) ihmisen EpCAM (klooni 9C4) ja fykoerytriini (PE) -konjugoitu hiiren mAb: CD45, yhdessä puhdistetun isotyypin IgG1 ja IgG2b, ostettiin BioLegend (San Diego, CA). Lähde ja käyttää muita vasta-aineiden on aiemmin raportoitu, mukaan lukien ihmisen RANKL, HIF-1α, NRP-1, ja VEGF: n, samoin kuin ne, fosforyloitu c-MET ja p65-alayksikön NFKB [22]. Lähteistä ja puhdistus heptamethine carbocyanine väriaineiden on raportoitu aiemmin [19], [20]. Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 ostettiin GE Healthcare (Piscataway, NJ), ja Histopaque-1077 ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cell Culture

Ihmisen PC -3-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% naudan sikiön seerumia (FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml). Solut irrotettiin 0,05% trypsiiniä /EDTA: ta (Invitrogen, Carlsbad, CA), pestiin Ca

2 + – ja Mg

2 + vapaata fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, Invitrogen), ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen elatusaineeseen . Solut laskettiin TC10 Automated Cell Counter (Bio-Rad, Hercules, CA), jossa trypaanisinieksluusiolla vahvistaa solujen elinkykyä.

Kliininen verinäytteitä

Patient verinäytteistä käytettiin kirjallista tietoinen suostumus kautta Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review board-hyväksytty biopankkien protokollien (IRB # Pro00025217 ja # Pro00030418). Kliiniset kerättiin verinäytteet ennen leikkausta 40 PCa potilailla, joille tehdään eturauhasen Cedars-Sinai Medical Center. Useita verinäytteitä saatiin toistuvat vierailut 5 potilaalla on androgeenista riippumaton sairaus. Muita verinäytteitä 34 terveen miehen luovuttajien vuotiaita 32 ja 70 vuotta saatiin. Noin 7,5 ml laskimoverta kerättiin EDTA sisältävään laventeli top putki (BD, Franklin Lakes, NJ), ja sentrifugoitiin 1500 rpm 20 minuuttia huoneenlämpötilassa Heraeus CLINIFUGE sentrifugia (Thermo Scientific, Logan, UT). Kun plasma jae kerättiin diagnoosia varten, pakattu verisolujen fraktio kuljetettiin jäissä tutkimuslaboratoriossa 3 tunnin kuluessa kokoelma.

eristäminen PBMC

PBMC eristettiin vakio tiheys gradienttisentrifugoinnilla. Pakattu Verinäyte laimennettiin yhtä suurella tilavuudella tasapainotettua suolaliuosta, joka sisälsi 0,01% glukoosia (paino /tilavuus), 5 uM CaCl

2, 9,8 uM MgCI

2, 540 uM KCI, 126 mM NaCl, ja 14,5 mM Tris, pH 7,6. 2-ml: n erä laimennettua näytettä kerrostettiin 3 ml Ficoll-Paque tyyny ja sentrifugoidaan 400 x g huoneen lämpötilassa 40 minuuttia. Solujen tumallisten solujen fraktio otettiin talteen ja pestiin kahdesti PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS: ää jatkotutkimuksiin.

Tumor Cell lisäystasot ja värjäys

alikvootit PBMC tehtiin niin, että jokainen sisälsi vastaavan määrän soluja 1 ml luovuttajan verta, noin 2 x 10

6 solua /näyte. Piikki syöpäsolujen, tunnettu määriä eläviä PC-3-soluja RPMI 1640-väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS: ää lisättiin PBMC-näyte. Vuonna verrokkitutkimuksissa piikkeinä kuolleiden syöpäsoluja, PC-3 solujen yksisolususpensioon kuoli 75% etanolia ja talteen samalla välineellä. Piikitin näytteet värjättiin sitten 20 uM NIR väriaineita 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Pesun jälkeen kahdesti PBS: llä poistamaan vapaa väriaineita, solut kiinnitettiin formaliiniin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, pestiin kahdesti PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 400 ui Cell Värjäys Buffer (BioLegend). Edelleen tahra pinnan markkereita, näytteitä inkuboitiin ensin isotyypin IgG jäillä 10 minuutin ajan, ja sitten sen annetaan reagoida samanaikaisesti FITC-konjugoidulla mAb EpCAM ja PE-konjugoidulla mAb CD45: ssa 20 minuuttia. Työryhmä suhde mAbien oli 0,1 ug /10

6 solua. Pesun jälkeen kahdesti Cell Värjäys Buffer, solut värjättiin 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli (DAPI, Invitrogen) ennen kuin sille tehdään tunnistus.

havaitseminen CTC kanssa Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) B

Kaksi FACS välineet (BD Biosciences, MA) käytettiin tutkimuksessa. Eristää CTC, eli FACSAria III käytettiin lajitella positiivisesti merkityt solut päälle APINOIDEN päällystetyn sytologia slide (Bio-maailma, Dublin, OH). Luetella CTC, joka on LSRII Flow Cytometer käytettiin. Valmistaja suositeltava havaitseminen noudatettiin. Samanaikaisesti havaitsemiseen jokaisen ihmisen verinäytteestä, 1 x 10

4 PC-3-soluja käytettiin piikki 1 ml: n erä näytettä. Virtaussytometrisesti profiili spiked näytettä käytettiin ohjaamaan positiivisuutta gating. FACS tiedot analysoitiin lisäksi FlowJo ohjelmisto.

fluoresenssikuvantamisella

Mosaiikki soluja eristettiin FACS lajittelija lasilevyille suoritettiin sekä fluoresenssikuvantamisella ja lähi-infrapuna kuvantamisen kanssa aiemmin raportoitu menettelyä [19] , [20], [22], jossa on Nikon Eclipse Ti fluoresenssimikroskooppiin viritetään xenon kaari valonlähde. Lähi-infrapuna kuvat hankittiin Indo suodattimen (780-840 nm).

Multiple Quantum Dot Nimeäminen (mQDL) B

Mosaiikki solut kerättiin FACS lajittelija lasiliuskoille alistettiin edelleen värjäystä kanssa mQDL protokollan aiemmin raportoidun [22]. Lyhyesti, näytteet käsiteltiin ensin strippaus puskurilla poistaa mAb käytetään CTC eristämiseen, ja alistetaan sitten peräkkäisten värjäystä vasta-aineiden kanssa reagoivat ryhmä PCa liittyvät biomarkkerit, kuten RANKL, HIF-1α, NRP-1, VEGF , pc-MET, ja p-p65, kuten aiemmin raportoitu [22], jolla on sama värjäys protokollaa. Lopuksi näytteet vastavärjättiin DAPI ennen kuin sille spektrin kuvantaminen ja signaalin kvantifiointi on CRi spektrin kuvantamisjärjestelmä Nuance ohjelmisto (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).

Tilastollinen analyysi

keinot, keskihajonnat, ja mediaanit käytettiin tiivistää jatkuvia muuttujia. Taajuudet ja prosentit laskettiin kategorisen muuttujia. Spearman korrelaatioita laskettiin välillä jatkuvien muuttujien datan takia vinot jakaumat. Vertailut elävien CTC luokkien välillä kohteisiin tehtiin käyttäen Wilcoxonin Rank Sum testejä. Lineaarinen sekoitettu mallia käytettiin välisen suhteen arvioimiseksi solujen lukumäärä piikki ja haettuja, joissa toistuvat toimenpiteet luovuttajien mallinnettiin kanssa heterogeeninen yhdiste symmetrinen kovarianssi rakenne. Kaikki analyysit tehtiin käyttäen SAS versiota 9.3.

Tulokset

Olemme aiemmin osoittaneet aktiivisia ja kerääntyvä NIR väriaineiden viljellyillä ihmisen PCa LNCaP, C4-2, PC-3, DU-145 , ARCaP

E ja ARCaP

M-soluissa [19], [20]. Niin vähän kuin kymmenen PC-3-soluja, joka on lisätty 1 ml ihmisen luovuttajan verta voidaan havaita käyttäen IR-783. Dead PC-3-solujen piikki samalla tavalla jättänyt havaittavissa IR-783 ottoa. Koska ottoa IR-783 edellyttää ATP-vaativat orgaanisten anionien kuljettajaproteiini, väriaine ottoa itsessään on toiminnallinen määritys, joka osoittaa kohti kasvainsolujen elinkelpoisuuden. Arvioida soveltuvuutta tämän lähestymistavan havaitsemiseksi live CTC potilaan verinäytteestä, me sisällytetty NIR väriaine värjäystä osaksi FACS-analyysi. Laajalti käytetty EpCAM

+ CD45

profiililla [9], [12] annettiin vahvistamaan CTC luonnetta havaittujen NIR

+ solut.

1. Tunnistaminen ja eristäminen Live (NIR

+) Solut ihmisen verestä

Potilaan veren näytteet altistettiin gradienttisentrifugoinnilla sitten juokseva värjäys: ensin NIR väriaineen tahra live CTC, sitten fluoresenssileimattuja vasta-aineita EpCAM ja CD45 vahvistusta. Lopuksi näyte värjättiin DAPI visualisointiin solujen tumien.

Koska ohjaus kalibroida suorituskykyä tunnistusjärjestelmä, me testattiin ensin värjäyksen protokollan kanssa terveen luovuttajan verta, johon oli lisätty PC-3-solujen vaihteleva määrä. FACS-analyysi, värjättyä näytteet lajiteltiin eristää EpCAM

+ CD45

– väestöstä. Nämä solut olivat sitten turvautuneet lukumäärän määrittämiseksi NIR

+ DAPI

+ -soluista (kuvio 1A). PC-3-solut tunnistettiin tumallisia soluja (DAPI

+) ilmennetään EpCAM mutta ei CD45 (kuva S1). Vuonna erehdyksen kun lopullinen EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ lasketaan mallinnettiin funktiona piikki solujen määrä, merkittävä kasvava suuntaus havaittiin jonka korrelaatiokerroin 0,997 ( Kuvio 1B ja taulukko S1). Erittäin lineaarinen korrelaatio ehdotti, että tämä FACS protokolla oli käyttökelpoinen havaitsemiseksi CTC mitättömän vähän määrä epäspesifistä laskee. Olemme lisäksi todenneet, että palautetun PC-3-solujen objektilaseille voitaisiin helposti nähdä fluoresenssimikroskopialla (kuvio 1 C). Käyttämällä samaa protokollaa, havaitsimme 2,8 ± 1,7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ tapahtumia useissa tutkimuksissa verta kerätyt näytteet 34 terveestä luovuttajasta koehenkilöillä (kuvio 1 B). Tämä havaitseminen oli hyvin yhteistyössä toisen tutkimuksia EpCAM

+ solujen terveitä luovuttajan verinäytteistä analysoitiin seuraavan sukupolven CTC alustojen [23], ja luultavasti kuvastaa taustalla pitoisuudet verenkierrossa epiteelisolujen. Tärkeää on, että samalla tutkimuksissa, joissa kuolleita PC-3-soluja käytettiin lisäystasot, The EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ lukemat säilyivät taustalla tasolla, mikä viittaa siihen, että teräviä kuollut PC-3-solut eivät poimi väriaine (tuloksia ei ole esitetty). Nämä verrokkitutkimuksissa kollektiivisesti osoittavat soveltuvuus NIR väriaineen tahra ja havaita live CTC.

Ihmisen PCa PC-3-soluja käytettiin positiivisena kontrollina soluja. A, PC-3-solut värjättiin peräkkäin kaikki neljä havaitsemista aineet alistettiin FACS-analyysi. Ylempi paneeli: näyte havaittiin ensimmäisen positiivisen EpCAM (FITC), mutta negatiivinen CD45 (PE) tahra (aidatulla jae). Alempi paneeli: aidatulla jae tiedustellessa IR-783 (NIR) ja ydin- (DAPI) tahra. NIR

+ EpCAM

+ DAPI

+ CD45

– lasketaan katsottiin eläviä syöpäsoluja. PC-3 tunnistus käytettiin rinnakkain analyysin kustakin kliinisestä näytteestä ohjeena portti ympäristössä. B, tehokkuus havaitsemisstrategiaa arvioitiin vertaamalla määrä piikki ja havaittu PC-3-soluista FACS-analyysillä. Kukin datapiste oli keskiarvoa havaittujen PC-3-solujen terästetty 6 terveen luovuttajan näytteitä. C, Fluoresenssimikroskopia käytettiin visualisoimaan PC-3-solujen talteen päälle lasilevylle. Ylärivi näyttää kuvia edustavan alan alhaisella suurennoksella (40 x; bar = 250 um), jossa on kaksi solua (merkitty 1 ja 2) esitetään suurennos on suuri alemman kahdessa rivissä (400 ×; bar = 25 nm) .

2. Detection of live CTC potilailla, joilla Paikallinen PCa Undergoing eturauhasen

Käyttämällä toiminnallinen FACS määritys seuraavista NIR värjäystä, testasimme havaitseminen EpCAM

+ CD45

-DAPI

+ soluja, tästä lähtien nimitystä

koko

CTC, kliinisissä PCa potilailla painottaen EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ tapahtumat (tästedes kutsutaan

elää

tai

NIR

+

CTC). PBMC eristettiin ennen leikkausta verinäytteet 40 potilasta diagnosoitu paikallinen sairauksia. Yksityiskohtaiset ominaisuudet näistä potilaista on esitetty taulukossa 1.

Tämä sarja-analyysi paljasti, että elävien CTC laskee vaihteli huomattavasti potilailla. EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ laskee vaihteli 0-439 solua /ml (keskiarvo 25 solua /ml; mediaani 10 solua /ml) tämän kohortin perioperatiivisen potilaista (taulukko 1). Tässä tutkimuksessa lasken alle 5 katsottiin normaalia, koska meidän terve luovuttajien oli 2,8 ± 1,7 EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ laskee (kuvio 1 B). Värjäävä menetelmä toistettavasti havaittu yli 5 live CTC /ml 30 40 potilaalla. Edustavia tuloksia havaitsemiseen virtaussytometrialla on esitetty kuviossa 2A. Olemme lisäksi osoittaneet, että CTC voitiin eristää suoraan mikroskoopin, ja voidaan visualisoida fluoresenssimikroskopiaan (kuvio 2B). Näissä analyyseissä, live CTC oli erotettu kuolleita soluja perustuu ottoa NIR väriaine (kuvio 2B).

edustaja havaitseminen Tulokset esitetään. A, ylärivillä näkyy CTC tunnistus potilaasta 6, jossa 10 elävää CTC löytynyt. Alempi rivi esittää havaitseminen 148 elävää CTC potilaasta 14. Kunkin näytteen, portti asetus ohjasi rinnakkaisia ​​värjäystä PC-3-solut. B, CTC havaitaan potilaasta 14 eristettiin päälle objektilasille ja visualisoitu välittömästi fluoresenssikuvantamisella. Pieni suurennus kuvia edustavan kentän (40 ×; bar = 250 nm) esitetään ylärivissä. Alla korkea suurennus kuvia 2 live CTC (NIR

+) saman alan näkyvät seuraavassa kahdessa rivissä, verrattuna 2 kuollut CTC (NIR

-) viimeisessä kahdessa rivissä (400 x; bar = 25 pm).

live CTC laskee havaittu kohortin eivät korreloineet merkittävästi ennen leikkausta seerumin PSA (r = 0,12,

p

= 0,47, kuva S2), patologisen N-vaiheen (annetaan vain 1 solmu positiivinen potilas), Gleason pisteet, tai marginaali tila (kuva S3). Vertaamalla CTC laskee sen Stephenson ennustavan monogrammi, ei ollut tilastollisesti merkitsevä suhde elävien CTC laskee ja Stephenson ennustavan monogrammin.

oli 10 potilasta, joilla on 5 tai vähemmän elävää CTC /ml (taulukko 1), ja kaikki oli T2 varalta negatiivisin kirurgisen marginaalit. Vain yksi näistä potilaista (potilas 26) oli havaittavissa seerumin PSA-pitoisuus 2 viikkoa sen jälkeen, kun eturauhasen. Hänen seerumin PSA tuli huomaamaton 6 viikon toimenpiteen jälkeen. Potilas on sittemmin pysynyt uusiutumisen-ilmaiseksi. Oli 3 potilaille, joilla on positiivinen kirurgisen marginaalit (potilaat 2, 13, ja 25, taulukko 1). Nämä potilaat ovat myös pysyneet uusiutumisen-free yli kaksi vuotta toistaiseksi ilman ylimääräisiä syöpälääkkeiden.

oli 3 potilaalla oli havaittavissa seerumin PSA pitoisuudet 3 kuukauden kuluttua eturauhasen (taulukko 1). Potilas 26 oli pT2cN0 Gleason 3 + 3 syöpää Negatiivisia marginaaleja. Kiinnostavaa, hän oli vain 3 live CTC /ml verta. Seerumin PSA tässä potilasryhmässä tuli havaita myöhemmin ilman lisätoimenpiteitä. Potilas 29 oli pT3aN0 Gleason 4 + 5 syövän positiivista katetta, ja havaittiin 46 live CTC /ml. Hänen seerumin PSA tuli huomaamaton 6 kuukauden androgeenideprivaatio terapian, joka jatkuu tällä kertaa. Potilas 39 oli imusolmuke etäpesäke aikaan leikkauksen ja sen havaittiin olevan korkea ennen leikkausta CTC laskee (439 /ml). Muita tapauksia toistuminen on tutkittava, jotta voidaan määrittää, jos ennen leikkausta CTC laskee voitaisiin käyttää parametrina ennustamiseen taudin uusiutumisen.

Myös verrattuna live CTC laskee kirurgiseen marginaali tila. 25 potilaasta Negatiivisia marginaaleja oli keskimäärin 25 live CTC /ml (vaihteluväli 0-148), verrattuna 15 potilaalla positiivista katetta, joka oli keskimäärin 54 live CTC /ml (vaihteluväli 2-439). Ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä, mikä johtuu todennäköisesti merkittävä vaihtelu yksilöiden välillä ja rajallisen otoksen koko.

Vaikka suurin osa potilaista meidän kohortissa oli Gleason 6 tai 7 patologioita, ei korrelaatio löytyi Gleason pisteet ja elää CTC numeroita. Toisaalta, potilailla, joilla on korkeampi live CTC laskee tiettyjä kehityssuuntia kohti ottaa kehittyneempiä taudin tuumorin luokitus. Oli merkittävä yhdistyksen välillä elää CTC laskee ja T vaiheessa, jossa pT3 potilaat, joilla on suurempi määrä kuin pT2 tapauksissa (mediaani 8 vs. 19,

p

= 0,02). On huomattava, että ainoa potilaalle imusolmukkeisiin PN1 tauti oli korkein live CTC count (439 CTC /ml, potilas 39, taulukko 1). Korkea live CTC laskee siis tuntui korreloi pitkälle kasvaimen vaiheissa.

3. Arvioinnit Live CTC metastasoituneen Diseases

Peräkkäisen verinäytteitä saatiin 5 PCa potilaista, joiden sairaus oli uusiutunut ja metastasized seuraava aloitushoitona. Nämä potilaat, joille tehdään erilaisia ​​systeemistä hoitoa. Toisin kuin live ja koko CTC laskee potilailla, joilla on paikallinen tauti, suurempi epäsuhta koko ja elää CTC laskee nähtiin (taulukko 2), kun taas CTC laskee esille tapauksia ilmeni vähän korrelaatiota seerumin PSA-pitoisuus (kuva 3). Kuitenkin, kun analysoidaan ajan yksittäisille potilaille, tunnistimme mielenkiintoisia suuntauksia, joihin elävät CTC laskee näytti korreloivan käänteisesti havaitun kliinistä hyötyä vastauksena hoitoja.

CTC laskee havaita mCRPC potilaista analysoitiin yhdessä edistymistä hoitotoimenpiteitä. Kaksi edustavia tuloksia on esitetty. A, asteittainen lisäys CTC laskee potilaan 41 korreloi kliinisen metastasointiin. B, jatkuva alhainen CTC laskee potilaan 42 korreloivan hyödyllisten syöpähoitoihin.

Patient 41 alkoi bikalutamidi hoidon alussa näytekokoelmatodistuksen metastasoineeseen kastraatio kestävä PCa (mCRPC). Hän koki oireeton biokemiallinen (

so.

Seerumin PSA) eteneminen kaksi kuukautta, jonka aikana elävät CTC lukemia aluksi laski mutta elpyi nopeasti. Hoito muutettiin abirateronin asetaattia, joka ei saatu biokemiallinen reaktio. Potilas kehitti oireenmukaista luinen etäpesäkkeitä ja tarvittavat sädehoitoa. Aikana taudin etenemiseen, koko CTC lukemat pysyivät, mutta päivittyvä CTC osuus kasvoi yhdessä seerumin PSA (taulukko 2 ja kuvio 3A).

Patient 42 alistettiin CTC havaitsemista ennen ensimmäisen jakson doketakselihoidon, mikä johti erinomainen vastaus arvosteli jatkuva lasku seerumin PSA jälkeenkin hoidon loppui. Potilas pysyi oireeton vielä 4 kuukautta ennen tarvitsematta ryhtyä vielä 8 sykliä dosetakselin oireiden etenemisen. Hoidon aikana potilaan CTC laskee supistunut selvästi, 82 alas 6, ja live CTC laskettava vastaavasti, 37-0%. Tämä potilas koki rebound yhteensä ja elävien CTC aikana doketakselihoidon päivästä-20 päivän-139. Loppupuolella dosetakselihoidon (päivästä-102 päivän-139), havaitsimme live CTC palautumassa 14-94% (taulukko 2 ja kuva 3B).

Patient 43 aloitettin doketakselihoidon, jossa hän näytetään alustava biokemiallinen ja kliininen vaste. Toinen sykli doketakselihoidon kuitenkin seurasi nopea sairauden etenemisen kanssa etenevä kliininen tila huononee (

ts.

, Paheneva kipu ja painon lasku) ja nousua seerumin PSA. Totesimme dramaattinen nousu prosenttiosuuden elävien CTC (2% jopa 97%) ilman merkittäviä muutoksia koko CTC (vaihteli 36-44). Potilas vanhentunut yli 2 seuraavan kuukauden kunnon nopea heikkeneminen. Live CTC count nousi selvästi yhdessä heikkenemisen (taulukko 2).

Patient 44 käsiteltiin bikalutamidin varten mCRPC. Hoito ei aiheuttanut biokemiallisten hyötyä mutta äkillisestä CTC laskee 1052-54 todettiin. Tästä huolimatta dramaattiseen laskuun yhteensä CTC kuitenkin prosenttiosuus eläviä CTC ei oleellisesti muutu jäljellä välillä 63-88%. CTC laskee nousi 54-196 välillä päivä-25 päivää-73 silloin, kun bikalutamidi hoito lopetettiin. Tämä potilas tarvitsi lievittävä säteilyä ja kvaternäärisen hormonaalista liikkumavaraa (taulukko 2).

Patient 45 oli kastraatio herkkä PCa ja alistettiin ajoittainen androgeenireseptorin tukahduttaminen hoito, joka oli aloitettu 4 kuukautta ennen ensimmäistä CTC havaitsemiseen. Elävät CTC määrä oli alle kynnysarvon havaitsemista, hyvä kanssa hyvin tukahdutetaan seerumin PSA-pitoisuus (taulukko 2). Tässä tapauksessa myöhempi nousu elävien CTC laskee oli 4 kuukautta aikaisemmin kuin PSA rebound, joka myöhemmin tukahdutetaan androgeenien puute hoitoa. On syytä huomata, kuitenkin, että tällä potilaalla oli suuri osa elävää CTC (83-84%), vaikka hormonaaliset tukahduttaminen hoito.

4. Eristäminen Live CTC edelleen Molecular Characterization

NIR värjäys helpottaa tunnistamista ja eristämistä elävien CTC kliinisistä verinäytteistä (kuvio 2). Testasimme eristetty CTC tutkia tarkemmin PCa liittyvien molekyylien muutokset. Eräässä tällaisessa tutkimuksessa, CTC PCA potilaat eristettiin perustuen EpCAM

+ CD45

-NIR

+ DAPI

+ värjäys. Proteiinin ilmentyminen CTC havaittiin mQDL ja tehtiin ekspression varmistamiseksi paneelin proteiinia biomarkkerit liittyvät PCa etenemiseen ja etäpesäkkeiden että ryhmämme tutkii aktiivisesti [22]. Nämä määritykset osoittivat, että epänormaali ilmentyminen RANKL, HIF-1α, NRP-1: n ja VEGF-proteiinit kliinisissä PCa Tuumorinäytteet [22] voidaan helposti havaita eristetty CTC (kuvio 4A). Samoin kuin kliininen kasvaimia, parannettu fosforylaatiota c-Met: n, samoin kuin p65-alayksikköä ja NFKB, havaittiin samalla CTC väestöstä. Kiinnostavaa, signaalin kvantifiointi värjättyä CTC paljasti huomattavaa solujen välistä heterogeenisuutta, koska yksittäiset proteiinit havaittiin vaihtelevalla tasot CTC (kuvio 4B). Lisätutkimuksia kuitenkin tarvitaan laajuuden arvioimiseksi CTC heterogeenisyys geenin ilmentymisen taso.

Live CTC ensimmäisestä näytteestä potilaasta 44 (taulukko 2) eristettiin päälle objektilasille ja alistettiin mQDL värjäystä statusta paneelin proteiinien dokumentoitu liittyvän PCa etenemistä. A, Spectral kuvia kahden edustavan CTC näkyvät kaksi ylintä paneelien (8 kuvaa kukin, jotka edustavat ilmentymistason RANKL, pc-Met, HIF-1α, pp65, NRP-1 ja VEGF, 400 ×; bar = 50 pm ). B, kvantitointi spektrin kuvan intensiteetin kuuden proteiinien mainittu paneeli A viidestä värjätään solut samasta potilaasta. Suhteellinen taso geenin ilmentyminen oli laskettu ilmentymisen HIF-1α, joka nimitettiin 1.0.

Keskustelu

Olemme kehittäneet protokolla arvioitaessa on eläviä CTC perustuvan aktiivisen ottoa prototyyppi IR-783 heptamethine carbocyanine värjätä [19], [20]. Yhdessä vasta EpCAM, IR-783 värjäystä tunnistetun ihmisen PC-3-solut oli lisätty terveitä luovuttajan verta korkea toistettavuus ja korrelaatiokerroin (kuvio 1). Olemme määrittäneet, että aktiivinen kuljetus IR-783 kasvainsoluihin, voidaan käyttää funktionaalisena määritys osoittaa kasvainsolujen elinkelpoisuuden (kuvio 2B). Tämä havainto korostaa vielä puute IR-783 väriaine oton kuolleiden kasvainsolujen (jäädyttää ja sulattaa ja /tai etanoli kiinteä) terästetty terveitä luovuttajan verta (tuloksia ei ole esitetty). Olemme onnistuneesti havaita ja eristää live CTC kliinisistä näytteistä ensisijaisen PCa (kuvio 2 ja taulukko 1) ja mCRPC potilaat (kuviot 3 ja taulukko 2). Kun proof-of-concept tutkimuksessa eristettyinä elävinä CTC oli myöntyväinen multiplex havaita proteiinin tasot yksisoluvaiheessa tason vasta eristetyssä CTC käyttäen mQDL menetelmällä (kuva 4). Tulokset viittaavat yhdessä siihen, että: 1) IR-783 värjäys voivat erilaistua live CTC kokonaismäärästä luetelluissa CTC väestöstä tietyllä potilaalla reaaliajassa; 2) väliset korrelaatiot prosenttiosuuden elävien CTC ja kehittyy progressiivinen ja terapeuttisia-resistenttejä voidaan vahvistaa;