Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syöpien ja aiheuttaa 1380000 kuolemaa vuodessa, vuodesta 2008 maailmanlaajuisesti. Tunnistaminen luonnon anti-keuhkosyöpä aineet on tullut erittäin tärkeä. Gambogenic happoa (GNA) on yksi aktiivisten yhdisteiden Gamboge, perinteinen lääke, joka käytettiin rajuja purgative, oksetusaine tai vermifuge hoitoon lapamato. Viime aikoina yhä enemmän todisteita on ilmoittanut, että GNA kykenee lupaava antituumorivaikutuksia; kuitenkin taustalla olevaa mekanismia jää epäselväksi. Esillä olevassa paperin, olemme huomanneet, että GNA voisi indusoida vakuolien, joka liittyy autophagy A549 ja HeLa-soluissa. Lisäksi tutkimukset paljastivat, että GNA laukaisee aloittamisesta autophagy perustuu tuloksiin MDC värjäystä, AO värjäys, kertyminen LC3 II, aktivointi Beclin 1 ja fosforylaation p70s6k. Kuitenkin hajoaminen P62 häiriintyi ja vapaa GFP voinut vapautua GNA käsitellyissä soluissa, mikä osoitti lohkon autophagy muutostilassa. Lisätutkimukset osoittivat, että GNA estää fuusio välillä autophagosomes ja lysosomeihin estämällä happamoitumisen lysosomeihin. Tämä toimimattomia autophagy soittaa pro-kuolema rooli GNA käsiteltyjä soluja aktivoimalla p53, Bax ja halkaistut kaspaasi-3 väheni Bcl-2. Beclin 1 pudotus pieneni huomattavasti GNA-indusoidun solukuoleman ja vaikutukset p53, Bax, pilkottiin kaspaasi-3: n ja Bcl-2. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttäen ksenograftimallissa. Meidän havainnot osoittavat ensimmäistä kertaa, että GNA voivat aiheuttaa poikkeava autophagy aiheuttaa solukuoleman ja voi ehdottaa potentiaalinen sovellus GNA työkaluna tai elinkelpoisen lääkkeen syöpähoitoihin.

Citation: Mei W, Dong C Hui C, Bin L, Fenggen Y, Jingjing S, et ai. (2014) Gambogenic Acid osumalla Lung Cancer Cells kautta Aberrant Autophagy. PLoS ONE 9 (1): e83604. doi: 10,1371 /journal.pone.0083604

Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2013 Julkaistu: 10 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Mei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China, nro 81173600 (Q.-L. Li); National Natural Science Foundation of Anhui, Kiina, nro 11040606M190 (Q.-L. Li) ja keskeinen hanke National Science teknologia pilari Program 2009ZX09103-399 (Q.-L. Li, Co-PI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syöpien usean vuosikymmenen ajan ja osuus 15-20% kaikista syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1] – [2]. Vuoteen 2008 mennessä arviolta 1610000 uutta tapausta vuodessa raportoitu maailmanlaajuisesti. Keuhkosyöpä on yleisin kuolinsyy kehittyneissä maissa ja yleisin syöpä Kiinassa [3]. Kirurginen resektio on ensisijainen hoitomenetelmä keuhkosyöpään. Kuitenkin kemoterapia /sädehoito on edelleen tehokas hoito potilailla, joilla on pitkälle edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) tai pienisoluinen keuhkosyöpä [4]. Näin ollen uusia terapeuttisia strategioita ja lääkkeitä tarvitaan kiireellisesti hoitoon keuhkosyöpään.

Autophagy on fysiologinen itsestään ruoansulatus prosessi, joka hajoaa sytoplasmisen komponentit ylläpitämään solujen aineenvaihduntaa aikana ravinteiden puutteesta ja /tai metabolisen stressin. Aikana autophagy, makromolekyylit, pitkäikäisiä proteiinien ja vahingoittuneet soluelimiin (kuten endoplasmakalvoston ja mitokondriot) ympäröi autophagosomes. Autophagosomes sitten fuusioituvat lysosomeihin, joissa eristäytynyt sisällön hajota ja kierrätys kotimaisten hydrolaaseja. Autophagy on tärkeää kaikissa soluissa poistoon pitkäikäisen proteiinien tai vahingoittunut organelleja. Tämä kyky aiheuttaa autophagy olevan lupaava ehdokas tekemään selviytymismekanismi vastauksena useisiin rasituksia [5]. Kuitenkin, useat viimeaikaiset tutkimukset ovat ehdottaneet, että autophagy toimii myös pro-syöttämällä mekanismin aiheuttaman kasvaimen hoidon [6] – [9]. Todellakin, autophagic solukuolemaa pidetään ohjelmoidun solukuoleman tyyppi II, kun taas apoptoosi ohjelmoitua solukuolemaa tyypin I [10]. Nämä kaksi solukuoleman on kuvattu eri muodossa solun kuoleman; kuitenkin monet tutkimukset osoittavat cross-talk välillä kahdenlaisia. Esimerkiksi, p53, joka indusoi apoptoosin, voi myös indusoida autophagy lisäämällä ilmentymistä

DRAM

, suora p53 kohdegeenin [11]. Beclin 1 /Atg 6 on osa tyypin III PI3-kinaasi monimutkainen, että tarvitaan muodostumista autophagic rakkulat. Puuttumista Beclin 1 voi estää induktion autophagy. Häiriöitä vuorovaikutusta BH3-domeenin Beclin 1 ja Bcl-2-estäminen johtaa lisääntyneeseen autophagy [12] – [13].

Gambogenic happoa (GNA, C38H46O8, MW 631,32) (kuvio 1A) on yksi tärkeimmät aktiiviset komponentit Gamboge, hartsin exuded päässä Garcinia hanburyi puu [14]. Gamboge on perinteinen lääke, joka käytettiin rajuja purgative, oksetusaine, ja vermifuge hoitoon lapamato. Gamboge on käytetty syövän hoidossa, mukaan lukien rintasyöpä, keuhkosyöpä, imusuonten sarkooma ja karsinooma cutaneum [15], klinikalla Kiinassa ja on osoittanut jännittävä vaikutuksia [16]. Viime aikoina saatu todisteita on osoittanut, että tärkein vaikuttava ainesosa GNA on laajempi kirjo antituumorivaikutuksia ja alempi myrkyllisyys [17] – [19]. Molekyyli- ja biokemiallisia vaikutuksia GNA ovat apoptoosin erilaisissa syöpäsolulinjoissa ja eläinmalleissa syövän [20] – [24]. Yu et ai. ovat havainneet, että GNA voivat aiheuttaa GSK3b riippuvia G1 pidätys keuhkosyövän solujen ja ehdotti, että GNA voivat aiheuttaa solukuoleman kautta autophagy sijaan apoptoosin [25]. Kuitenkin molekyyli mekanismit vaikutuksia GNA edelleen epäselviä. Esillä tutkimukset paljastavat molekyylitason mekanismi ja roolia autophagy in GNA aiheuttama kasvain solukuoleman.

, kemiallinen rakenne GNA. B, GNA estää kasvua ja estää solukuolemaa syöpäsoluissa. A549 ja HeLa-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla GNA varten ilmoitettu aikoja, ja solujen lisääntyminen analysoitiin MTT-määritystä. C, Käsittelemättömät solut (kontrolli) tai solujen käsiteltiin 3 uM GNA: ssa 24 tuntia oli suoraan tarkkailtiin faasikontrastimikroskooppia (vasemmalla) ja solujen vakuolisaatiota kvantitoitiin (oikealla); vähintään 600-solujen havaittiin. Tarkoittaa ± SEM, n = 3.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret pidettiin tietyllä taudinaiheuttajista vapaassa ympäristössä. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eläinten hyvinvoinnin neuvottelukunta yliopiston Science and Technology of China (Luvan numero: 2010-11). Riittävä ryhdyttiin minimoimiseksi kipua ja epämukavuutta mukaisesti kansallisten määräysten.

1. Reagenssit ja vasta

Gambogenic happoa (GNA) (kuvio 1A), eristetty Gamboge, toimitti prof Xiaoshan Wangin lab. GNA puhtaus oli 99%, mikä määritettiin HPLC: llä-DAD. MTT, monodansylcadaverine (MDC), propidiumjodidia (PI), anneksiini V, akridiinioranssilla ja Hoechst 33342 hankittiin Sigmalta. Rapamysiini ja trehaloosi olivat ystävällisiä lahjoja prof Guanghui Wang. MitoTracker Red, LysoTracker punainen ja LysoSensor Green DND-189 saatiin Invitrogen. LC3 vasta-aineet hankittiin Novus (NB100-2220), p62-vasta-aineita olivat Biomol (PW9860), p70s6K (1494-1), p-p70S6K (3204-1) ja p-p38 (1229-1) vasta-aineet olivat peräisin Epitomics. GAPDH vasta-aine hankittiin Chemicon (MAB374). GFP (sc-9996), kaspaasi-3 (sc-7148), p53 (sc-6243), Bax (sc-7480), Beclin 1 (sc-11427), ja Bcl-2 (sc-7382) vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology. Reagenssit liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), lukuun ottamatta GNA ja rapamysiinin, jotka valmistettiin DMSO: hon.

2. Soluviljely

Ihmisen keuhkoadenokarsinooma A549 hankittiin Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology. Ihmisen epiteelikarsinoomasolulinja HeLa ja perustettu GFP-LC3 /HeLa-solut toimitti prof Guanghui Wang [26]. Perustamaan vakaan joka ilmentää EGFP-fuusioituneet LC3, Hela-solut transfektoitiin EGFP-LC3, ja yksittäiset kloonit ilmensivät stabiilisti GFP-LC3 valittiin käyttäen 0,2 mg /ml G418. Yksi kohtalainen ilmentyminen klooni resistenttejä G418 valittiin lisäkokeita. SPC-A-1, H460, GIC-82 ja 16-HBE toimitti prof Guang-Biao Zhou [25]. Soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Sigma), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

3. Solunelinkykyisyysmääritys

MTT-määritystä.

Solut maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 solua 100 ul: ssa väliainetta kaivoa kohti 24 tuntia ennen koe. Sitten soluja inkuboitiin sitten eri pitoisuuksilla GNA 37 ° C: ssa osoitetun ajan kuluttua. MTT-liuos lisättiin viljelyalustaan ​​(500 ug /ml lopullinen konsentraatio) 4 h ennen hoidon päättymisestä. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 10% tehtiin happamaksi SDS: ää (100 ui) kuhunkin kuoppaan. Absorbanssiarvo (A) 490 nm: ssä mitattiin käyttäen Automated Microplate Reader (Bio-Tek ELX 800uv, Bio-Tek Instrument Inc, Winooski, VT, USA). Solujen elinkelpoisuus ilmaistuna (Asample – Ablank) /(Acontrol – Ablank) x 100%, jossa A on absorbanssi. Soluille käsitelty reagensseilla, ajoneuvon käsiteltyjä soluja käytettiin kontrollina. Aihio edusti MTT lisättiin keskitason.

PI tai anneksiini V /PI virtaussytometria määrityksessä.

Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla GNA 24 tuntia, korjattu trypsinaatiolla, sitten pestiin kahdesti PBS: llä, inkuboitiin PI yksin tai yhdessä anneksiini V-fluoreseiini 10 minuuttia valolta ja arvioitiin virtaussytometrialla (Becton Dickinson, USA). Prosenttiosuus kuolleiden solujen määritetään perustuen solukalvon läpäisevyyttä PI.

Trypan blue -värjäyksellä määrityksessä.

Soluja (2 x 10

5 solua per kuoppa) siirrostettiin 24- -No tasapohjaisille levyille. Viljelyn jälkeen 24 tuntia, 3 uM GNA lisättiin osoitettujen ajanjaksojen ajan. Sitten solut irrotettiin alustasta trypsinisaatiolla ja värjättiin trypaanisinisellä liuosta (0,4% PBS: ssä). Kuolleiden määrä solujen laskettiin hemosytometrissä valomikroskoopilla (Olympus, Japani). Vähintään 400 solua laskettiin kullekin näytteelle, ja koe toistettiin kolme kertaa.

4. Autophagic markkeri värjäys

GFP-LC3 /HeLa-soluja, jotka oli käsitelty 3 uM GNA varten osoitti aikaa inkuboitiin 10 uM monodansylcadaverine tai 75 nM LysoTracker Red 15 min. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, solut tutkittiin fluoresenssimikroskopialla (Olympus, Japani).

5. Kvantifiointi hapan vesicular soluelimiin akridiinioranssilla

käsittelyn jälkeen, jossa on esitetty reagenssit, solut värjättiin akridiinioranssilla lopulliseen konsentraatioon 1 ug /ml 15 minuutin ajan valolta, niin havaittiin fluoresenssimikroskoopilla tai korjattu trypsinaatiolla ja analysoitiin virtaussytometrialla.

6. Transmissioelektronimikroskopia

Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja kasvainkudoksen resektoitiin, pestiin sitten kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä /2% glutaraldehydiä 0,1 M fosfaattipuskurissa (pH 7,4), jota seurasi 1% OsO

4. Sen jälkeen nestehukka, ohuet leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijy sitraatin havainnon alla JEOL TEM-100SX (JEOL, Japani).

7. Immunoblot-analyysillä

Solut tai kasvainkudoksen pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 4 ° C: ssa, sitten proteiinit valmistettiin, erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Millipore) . Kaivoa inkuboitiin 1 h PBS-Tween 20 (0,05%), joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa. Ensisijainen vasta-aineet havaittiin käyttämällä lampaan anti-hiiri-IgG-HRP: tä tai anti-kani-lgG-HRP-vasta-aineita (Amersham Pharmacia Biotech). Proteiinit visualisoitiin käyttämällä ECL havaitseminen (Amersham Pharmacia Biotech). Anti-GAPDH-vasta-aine (glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi; Chemicon) käytettiin tasapuolisen proteiinimäärän.

uudelleen koetin kalvon toisen primaarisen vasta-aineen, kalvo inkuboitiin ensin strippaus puskuri (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1 mM β-merkaptoetanolia, ja 20 mM SDS) 30 minuutin ajan 50 ° C: ssa, sitten suoritettiin western blot-analyysi sen jälkeen, kun protokollaa.

8. RNA-interferenssi

Double-oligonukleotideja kohdistaminen 5′-CCACUCUGUGAGGAAUGCACAGAUA-3 ’ihmisen Beclin 1-mRNA syntetisoitiin Shanghai GenePharma (Shanghai, Kiina), ja merkityksetön oligonukleotidi toimi negatiivisena kontrollina. Transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, siRNA ja Lipofectamine 2000 (Invitrogen) sekoitettiin Opti-MEM-elatusainetta (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jotta kompleksin muodostumisen. Sitten solut pestiin Opti-MEM-elatusainetta (Invitrogen), ja seos lisättiin. 12 h transfektion jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella täydellistä elatusainetta. Solut kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin edelleen.

9. Ksenografti hiirimallissa

BALB /ca nude-hiirten (30-40 päivää vanhoja ja painavat 18-20 g) jaettiin ryhmiin, jotka sisältävät kuusi hiirtä ryhmää kohti. A549-soluja injektoitiin s.c. (2 x 10

6 solua per hiiri) oikeaan takajalan hiiristä. Sen jälkeen, kun kasvaimet olivat vahvistettu (~ 50 mm

3), hiiret olivat i.v. ruiskutetaan kanssa tai ilman 16 mg /kg GNA kahdesti viikossa kolmen viikon ajan. 24 tunnin kuluttua viimeisestä i.v. injektio, kasvaimet eristettiin transmissioelektronimikroskopiaa ja western blotting-analyysi.

10. Arviointi pH lysosomeihin

hoidon jälkeen A549-soluja 3 uM GNA varten osoitti aikaa, soluja inkuboitiin 1 mM LysoSensor Green DND-189 15 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti PBS: llä, sitten tutkittiin fluoresenssimikroskopialla (Olympus, Japani).

Tulokset

1. GNA estää kasvun ja indusoi solukuolemaa syöpäsoluissa

Vaikutus GNA solujen kasvuun tutkittiin käyttämällä MTT-määritystä useissa ihmisen syöpäsolujen linjat. Ensin tutkittiin, mikä vaikutus GNA solun elinkelpoisuuden A549 ja HeLa-solut. Kuten kuviossa 1 on esitetty, GNA esti kasvun A549 ja HeLa-solujen pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1 B). Vaikutusten vahvistamiseksi GNA keuhkosyöpään solujen MTT-määritystä toistettiin useissa muissa keuhkosyövän solulinjat (H460, SPA-C-1, Glc-82 ja normaali keuhkoputken epiteelisolujen linja 16-HBE). H460, SPA-C-1 ja Glc-82 olivat kaikki herkkiä GNA, kun taas 16-HBE oli vähemmän herkkä GNA (kuvio S1A). Nämä tulokset osoittavat, että GNA voi tehokkaasti tappaa keuhkosyövän soluja, joilla on alhainen toksisuus.

Mielenkiintoista on, että kun teimme valomikroskoopilla kinetiikkakokeen, olemme huomanneet, että GNA-käsitellyt solut osoittivat progressiivisen kerääntymisen intracytoplasmic ontelot, jotka olivat samanlaisia niille usein havaittu soluissa olevien autophagy (kuvio 1C). Samaan aikaan, lisääntynyt solujen prosenttiosuus on suuri näkyvä vacuoles havaittiin GNA-käsiteltyjen solujen kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 1C), sopusoinnussa kanssa autophagy liittyvä mekanismi.

2. GNA lisätä autophagic markkereita A549 ja HeLa-soluissa

sarja kokeita suoritettiin sen määrittämiseksi, onko autophagy indusoidaan GNA. Ensimmäinen, käytimme monodansylcadaverine (MDC), joka on lysosomotropic tunnettu yhdiste merkitä happamia endosomeihin, lysosomeihin ja autophagosomes [27]. Kuten kuviossa 2A on esitetty, GNA-käsiteltyjen A549-solut osoittivat dramaattinen kasvu määrä MDC-leimatun rakkulat, mikä osoittaa, että GNA voisi indusoida happaman vesicular soluelimiin (AVO), joka on ominaista autophagy. Kvantifioitavissa Avós akridiinioranssin elintärkeä värjäys suoritettiin ja analysoitiin FACS: llä. Huomasimme, että akridiinioranssin-positiivisia Avos kasvoi GNA-käsiteltyjen A549-solut verrattuna kontrolliin soluihin (kuvio 2B, 2C); rapamysiiniä käytettiin positiivisena kontrollina.

, edustaja kuvia MDC värjäystä. A549-soluja käsiteltiin 3 uM GNA: ssa 24 tuntia, sitten värjättiin 10 uM monodansylcadaverine (MDC), ja niitä tarkkailtiin faasikontrastimikroskoopilla. B ja C, akridiinioranssivärjäyksellä. Solut altistettiin ilmoitetut pitoisuudet GNA: ssa 24 tuntia, sitten värjättiin 1 ug /ml akridiinioranssia (B, C), ja niitä tarkkailtiin faasikontrastimikroskooppia (B) tai analysoitiin virtaussytometrialla (C). Solut, jotka käsiteltiin 50 ug /ml rapamysiiniä käytettiin positiivisena kontrollina. Esitetyt tulokset edustavat vähintään 2 itsenäisestä kokeesta. D, edustaja elektronimikroskoopilla kuvia GNA käsiteltyjen A549-solut. Soluja käsiteltiin 3 uM GNA varten osoitetun aikaa ja analysoitiin elektronimikroskoopilla. Nuolet osoittavat onteloita yhteyttä ja rakkulat, jotka olivat tiheään täynnä monilamellaarisista rakenteita.

Läsnäolo autophagosomes, jotka näyttävät double-membraanivesikkeli rakenteet, pidetään tunnusmerkki autophagy. Tutkimme, onko tämä rakenne muodostuu GNA käsiteltyjen A549-solut elektronimikroskoopilla (EM). Kuten kuviossa 2D on esitetty, GNA-käsitellyt solut näytetä lisääntynyt muodostuminen autophagosomes suhteessa kontrollisoluihin.

3. GNA laukaisee muodostumista autophagic merkkiaineiden A549 ja HeLa-soluissa

Vahvista GNA välittämää induktion autophagy selvitimme ilmaus autophagy markkereita, mukaan lukien LC3. Aikana autophagy, LC3 muunnetaan vapaassa muodossa (LC3-1) on proteolyyttisesti pienemmässä (LC3-II). GFP-LC3 /HeLa-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti GFP-LC3, käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina GNA: ssa 24 tuntia; Näiden GNA-käsitellyistä soluista osoitti dramaattinen kasvu pistemäinen jakelu GFP-LC3 pitoisuudesta riippuvalla tavalla, kun taas käsittelemättömät solut näkyvät hajanainen GFP-LC3 ulkonäkö. Kvantitointi osoitti, että solujen lukumäärä, jotka sisälsivät vähintään 5 GFP-LC3 pistemäinen pisteitä lisääntynyt myös pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3A). Western blotting-analyysi GNA käsiteltyjen A549-solut osoittivat huomattavaa kasvua tason LC3-II: n pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 3B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin H460, SPA-C-1 ja Glc-82 keuhkosyövän solulinjat, kun taas normaali keuhkojen solu- linja 16-HBE oli vähemmän herkkä GNA (kuvio S1B).

, vaikutukset GNA jakamisesta GFP-LC3 punctuates. GFP-LC3 /HeLa-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla GNA tai 50 ug /ml rapamysiini-24 tuntia, sitten havaittiin fluoresenssimikroskopialla. Prosenttiosuus soluja, joissa on vähintään 5 GFP-LC3 pistemäinen pisteitä on laskettu; vähintään 600-solujen havaittiin, Keinot ± SEM, n = 3, ** tarkoittaa p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. B, vaikutukset GNA on LC3 proteiinia. A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla GNA: ssa 24 tuntia tai 3 uM GNA varten osoitti aikaa, sitten analysoitiin Western blot -menetelmällä käyttämällä anti-LC3 vasta-aineita. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää bändi voimakkuudet LC3-II suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, * tarkoittaa p 0,05, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. C, vaikutukset GNA on Beclin1 proteiinia. A549-soluja käsiteltiin 3 uM GNA varten osoitti aikaa, sitten analysoitiin Western blot -menetelmällä käyttämällä anti-Beclin1 vasta-aineita. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää bändi voimakkuudet Beclin 1 suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, * tarkoittaa p 0,05, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. D, vaikutukset GNA on p70S6K fosforylaatioon. A549-soluja käsiteltiin 3 uM GNA varten osoitti aikaa, sitten analysoitiin Western blot -menetelmällä käyttämällä anti-p70S6K ja anti-p-p70S6K-vasta-aineita. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää kaistaintensiteettejä p-p70S6K suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, * tarkoittaa p 0,05, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA.

tasot Beclin 1, ATG-geenin tuote, joka on välttämätön autophagy [ ,,,0],28], selvästi lisääntynyt ajan myötä GNA käsiteltyjen A549-solut (kuvio 3C). Ser /Thr-kinaasi mTOR toimii yksi portinvartijana on autophagy prosessissa, ja vähensi mTOR toiminta on liittynyt kohonneet autophagy. P70S6K on substraatti mTOR ja sen fosforylaatio riippuu mTOR toimintaa. Huomasimme, että p70S6K fosforylaatio selvästi väheni ajan kuluttua GNA hoidon (kuva 3D), osoittaa kevennettyä mTOR aktiivisuutta. Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että GNA laukaisee aloittamisesta autophagic merkkiaineiden A549 ja HeLa-soluissa.

4. GNA estää fuusio välillä autophagosomes ja autolysosomes

Koska GNA laukaisi aloittamisen autophagic markkereita, mietimme onko GNA voisi laukaista autophagic muutostilassa. Käsitellä tätä kysymystä, me arvioi tapahtunut muutoksia GFP-LC3, joka myös on käytetty seurata autophagic muutostilassa. Kun GFP-LC3 on toimitettu lysosomiin, LC3 osa kimeeran on herkkä hajoamaan, kun taas GFP-proteiinia on suhteellisen vastustuskykyinen hydrolyysille. Näin ollen, mittaamalla tasot pilkkoa GFP western blottauksella voi seurata vuon autophagy. Kuten kuviossa 4A, taso vapaan GFP muuttui hieman, kun GNA hoitoa, kun taas GFP-LC3-II selvästi lisääntynyt. Hyvin erilaisia ​​tuloksia havaittiin käsittelemällä trehaloosin (normaali autophagy induktori), jota käytettiin positiivisena kontrollina. Olemme edelleen seurata tasoa endogeenisen p62 /SQSTM1, joka on autophagy-lysosomifuusio alustaan, joka liittyy autophagy-lysosomaalisen proteiinin hajoamista. Kertymistä p62 pidetään markkeri inhibition autophagy tai häiriöitä autophagic hajoamista. GNA esti hajoamista p62 on pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuva 4B), mikä viittaa siihen, että GNA heikentää autophagic hajoamista. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin H460, SPA-C-1 ja Glc-82 keuhkosyövän solulinjat, kun taas normaali keuhkojen solu- linja 16-HBE oli vähemmän herkkä GNA (kuvio S1B).

, vaikutus GNA on vuon autophagy. GFP-LC3 /HeLa-soluja viljeltiin ilman (kontrolli) tai läsnä on 3 uM GNA varten osoitti aikaa, ja taso katkaistun GFP analysoitiin western-blottauksella käyttäen anti-GFP-vasta-aine; 100 mM trehaloosi käytettiin positiivisena kontrollina. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää kaistaintensiteettejä GFP-LC3-II tai lohkaistaan ​​GFP suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, * tarkoittaa p 0,05, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. B, ja ajasta riippuvia vaikutuksia GNA on P62 hajoamista. A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla GNA: ssa 24 tuntia tai 3 uM GNA varten osoitti aikaa, ja p62-proteiinin tasot analysoitiin western-blottauksella. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää kaistaintensiteettejä on p62 suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. C, inhibitio välisen fuusion autophagosomes ja lysosomeihin käsittelemällä GNA. GFP-LC3 /Hela-soluja käsiteltiin 3 uM GNA varten ilmoitettu aikoja ja sen jälkeen värjättiin 75 nM LysoTracker Red (LTR) 15 minuutin ajan. Edustavia fluoresenssimikroskopiaan kuvia näytetään. D, esto lysosomifuusio happamoitumisen käsittelemällä GNA. A549-soluja käsiteltiin 3 uM GNA varten osoitetun aikaa tai 500 uM bafilomysiini A1 8 tuntia ja sen jälkeen värjättiin 1 mM LysoSensor Green DND-189 15 minuutin ajan. Edustavia fluoresenssimikroskopiaan kuvia näytetään.

Yhdessä nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että GNA voivat häiritä hajoamista autophagy myöhäisessä vaiheessa.

Seuraava kyseenalaiseksi joka prosessi vaikuttaa GNA. Olemme tutkineet vaikutus GNA on rinnakkaispaikantumisen on autophagosomes ja lysosomeihin. Kuten on esitetty kuviossa 4C, on lukuisia pieniä, voimakkaasti värjäytyneitä GFP-LC3 pisteitä (autophagosomes) ja LysoTracker Red (LTR) -stained pistettä (lysosomeihin) on colocalized 6 tunnin sisällä GNA hoidon. Kuitenkin tämä rinnakkaispaikantumisen keskeytyi klo 12 ja 24 tunnin kuluttua GNA hoidon; pieni, intensiivisesti värjätään GPF-LC3 pisteitä näytti kerääntyä ja tuli suuri, voimakkaasti värjätään alueilla, mikä viittasi siihen, että fuusio välillä autophagosomes ja lysosomeihin oli tukossa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkin lääkkeet, kuten CQ ja bafilomysiini A1, voidaan nostaa pH lysosomeihin estämiseksi fuusio autophagosomes. Me epäilivät GNA on samankaltaisia ​​vaikutuksia. Olemme arvioineet vaikutusta GNA on lysosomifuusio happamoitumista värjäämällä LysoSensor Green DND-189, joka on acidotropic fluoresoiva koetin voidaan loukkuun happamassa organelles. Bafilomysiini A1 käytettiin positiivisena kontrollina. Kuten kuviossa 4D, lysosomifuusio merkintöjä häiriintyi 12 tunnin kuluessa GNA hoidon ja oli paljon ilmeisesti vaikuttanut 24 ja 36 tuntia (samanlainen vaikutukset bafilomysiini A1), joka ilmaisee esto lysosomien happamoitumista. Tämä havainto saattaa selittää GNA estoa fuusio välillä autophagosomes ja lysosomeihin. Näin ollen, vaikka GNA laukaisee muodostumista autophagosomes, GNA myös estää etenemistä autophagic prosessin tukahduttamalla fuusio autophagosomes ja lysosomeihin, estäen siten hajoamisen sisällön.

5. Knockdovvn Beclin 1 vähenee GNA aiheuttama syöpä solukuoleman

aiemmat tiedot osoittavat, että GNA voi aiheuttaa solukuoleman kautta apoptoosin. Sen määrittämiseksi, oliko solukuoleman aiheuttama GNA korreloi huonosti autophagy, me käytettiin edelleen pieniä häiriöitä RNA (siRNA) kaataa ilmaus Beclin 1, olennainen geeni autophagy. Transfektio RNA oligonukleotidit vastaan ​​Beclin1 (Beclin 1 siRNA) A549-solut onnistuneesti tukahdutti proteiinin endogeenisen Beclin 1 verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA, joka osoittaa, että Beclin 1 siRNA on tehokas (kuvio 5A). Kun oli kulunut 24 tai 36 tuntia hoidon 3 uM GNA, Beclin 1 pudotus soluilla huomattavasti vähemmän solukuolemaa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 5B), mikä viittaa siihen, että GNA-solukuolema on yhteydessä huonosti autophagy.

A, RNA oligonukleotidit vastaan ​​Beclin 1 (Beclin 1 siRNA) tehokkaasti tukahduttaa Beclin 1 ilme. A549-solut transfektoitiin siRNA: t vastaan ​​Beclin 1 tai negatiivinen kontrolli, ja proteiini taso Beclin1 analysoitiin western-blottauksella. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää bändi intensiteettejä Beclin1 suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. B, A549-solut transfektoitiin siRNA: t vastaan ​​Beclin 1 tai negatiivinen kontrolli. Solut käsiteltiin sitten 3 uM GNA varten osoitetun ajanjakson ajan, värjättiin 2 uM Hoechst 33342 ja tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla; prosenttiosuus kuolleet solut kvantifioitiin trypaanisini värjäystä. Keskiarvo ± SEM, n = 3, * tarkoittaa p 0,05, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA.

6. GNA indusoi muutoksia tasot apoptoosiin liittyvien proteiinien

Seuraavaksi tutkimme reitti, jolla vahingollinen autophagy solukuolema tapahtuu, kun GNA hoitoon. Lisääntyvä todistusaineisto on osoittanut, että ylikuuluminen välillä autophagy ja apoptoosin on erityisesti hankaloittaa se, että nämä prosessit on monia yhteisiä säätelymolekyyleja, kuten p53 ja Bcl-2-perheen jäsentä [29] – [30]. GNA aiheutti lisääntymisen proteiinin tasot Bax ja pilkottiin kaspaasi-3 ja lasku tasot Bcl-2 ja LC3-II ajan myötä, mikä viittaa siihen, että GNA käsittely aktivoi Bax. Koska Bax on yksi merkittävimmistä loppupään tavoitteet p53, arvioimme vaikutus GNA on p53. Kuten on esitetty kuviossa 6A, GNA aiheutti huomattavan kasvun taso p53. Koska p38 MAPK edistää aktivointi p53, me seurasimme myös tasoja p38. GNA aiheutti huomattava nousu tasoa fosforyloidun p38 (kuvio 6A). Lisäksi virtaussytometria-analyysillä käyttämällä anneksiini V /propidiumjodidivärjäys osoitti, että GNA hoito lisäsi selvästi osa kuolleita soluja ja myöhäinen apoptoottisten solujen verrattuna NC. Näin ollen päättelemme, että GNA voi indusoida apoptoosia A549-solut ainakin osittain läpi tämän reitin kautta.

A, A549-solut transfektoitiin siRNA: t vastaan ​​Beclin 1 tai negatiivinen kontrolli. Solut käsiteltiin sitten 3 uM GNA varten ilmoitettu aikoja. Suhteellinen proteiinin taso analysoitiin western-blottauksella. GAPDH-proteiinia käytettiin lastaus ohjaus. Pylväsdiagrammi näyttää kaistaintensiteettejä näyttämän proteiinin suhteessa kuin GAPDH. Keskiarvo ± SEM, n = 3, * tarkoittaa p 0,05, ** p 0,01, yksisuuntainen ANOVA. B, A549-solut transfektoitiin siRNA: t vastaan ​​Beclin 1 tai negatiivinen kontrolli. Solut käsiteltiin sitten 3 uM GNA varten osoitti aikaa, ja solut värjättiin anneksiini V /propidiumjodidi ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. Prosenttiosuus vasemmassa yläkulmassa neljänneksessä ilmaisee solujen osuus leimattu propidiumjodidilla (kuolleita soluja), kun vastaava luku oikeassa yläkulmassa neljänneksessä ilmaisee solujen populaatio leimattu sekä anneksiini V ja propidiumjodidi (myöhäinen apoptoottiset ja kuolleet solut).

7. GNA estää autophagy in vivo

GNA on osoittanut tehoa kasvaimia kasvaa nude-hiirissä. Meidän lab on aiemmin osoittanut, että suhteellisen kasvaintilavuudet (RTV) hoidetuilla hiirillä 16 ja 32 mg /kg GNA oli 12,16 ± 7,39 ja 7,65 ± 2,84, vastaavasti, kun taas RTV ajoneuvojen käsiteltyjen negatiivisten kontrollien oli 26,36 ± 14,10; suhteellinen kasvaimen kasvu suhteet (T /C,%) oli 46,1% ja 29,0%. Määrittää mekanismi, jonka GNA heikentää kasvaimen kasvu

in vivo

perustimme ksenograftin hiiren keuhkojen kasvain malli. Kuten kuviossa 7 on esitetty, GNA indusoi kertyminen autophagic vesikkelit (kuvio 7A), nostivat LC3-II (kuvio 7B) ja blokattiin p62 hajoamista (kuvio 7B) kasvaimissa. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että mekanismi, jolla GNA toimii

in vivo

myös autophagy liittyviä.

A549-soluja injektoitiin s.c. (2 x 10

6 /hiiri) osaksi 30-40 päivän ikäiset BALB /ca nude-hiirissä. Sen jälkeen perustettiin kasvaimet oli muodostunut (-50 mm

3), hiiret olivat i.v. ruiskutetaan kanssa tai ilman 16 mg /kg GNA kahdesti viikossa kolmen viikon ajan.