Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hormonit, kuten estrogeenin ja progesteronin, ja niiden reseptorien tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen munasarjasyövän. Androgeenireseptorin, sen reseptori ja koaktivaattoreiden on myös liitetty näissä prosesseissa. p44 /Mep50 /WDR77 tunnistettiin alayksikköä methylosome monimutkainen ja tapahtumat luonnehtia steroidireseptoriperheen koaktivaattorikompleksien, joka parantaa androgeenireseptorin sekä estrogeenireseptorin välittämän transkriptionaalista aktiivisuutta ligandista riippuvalla tavalla. Olemme aiemmin kuvattu erillisten ilmentymistä ja toimintaa p44 eturauhasessa, kiveksissä, ja rintasyöpiä. Tässä raportissa tarkastelimme ilmentymistä ja toimintaa p44 munasarjasyövän. Toisin kuin havaintoja eturauhasen ja kivessyöpä ja samanlainen rintasyövän, p44 osoittaa vahvaa sytoplasman lokalisointiin morfologisesti normaalin munasarjan pintaa ja munanjohtimen epiteelissä, kun taas ydinvoiman p44 havaitaan invasiivisia munasarjasyöpäpotilailla. Havaitsimme, että p44 voi toimia koaktivaattorikompleksien sekä androgeenireseptorin (AR) ja estrogeenireseptori (ER) munasarjojen soluissa. Lisäksi yli-ilmentyminen ydin–lokalisoitu p44 stimuloi proliferaatiota ja hyökkäyksen munasarjasyöpäsoluja läsnäollessa estrogeenia tai androgeenisesti. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että p44 on rooli vaikutukset välittyvät hormonien aikana munasarjojen kasvaimien syntyyn.

Citation: Ligr M, Patwa RR, Daniels G, Pan L, Wu X, Li Y, et al. (2011) Expression ja toiminta androgeenireseptorin koaktivaattorikompleksien p44 /Mep50 /WDR77 munasarjasyövässä. PLoS ONE 6 (10): e26250. doi: 10,1371 /journal.pone.0026250

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2011; Hyväksytty 23. syyskuuta 2011; Julkaistu: 13 lokakuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Northwestern Memorial Hospital Dixon Translational Research Fund apuraha JJW. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on viidenneksi yleisin kuolinsyy syöpään naisilla, ja toiseksi tappavin gynekologiset syöpään Yhdysvalloissa [1]. Epiteelin munasarjasyöpä osuus on noin 3% kaikista syöpätapauksista naisilla. National Cancer Institute arvioi, että vuonna 2010, 21880 naisten diagnosoidaan ja 13850 naiset kuolisi munasarjasyöpä [2].

Munasarjasyöpä on ryhmä heterogeeninen sairauksien ja koostuu eri histologisia tyyppejä, jotka voivat helposti eriytetään histologista arviointia varten [3]. Nykyinen kliininen ohjearvojen mukainen Maailman terveysjärjestö erottaa kahdeksan histologiset kasvain alatyypeistä: papillaarisen vakavien karsinooma (PSC), endomet- karsinooma (EMC), mucinous karsinooma (MUC), kirkas cell carcinoma (CCC), siirtymäkauden cell carcinoma (TCC), levyepiteelisyöpä , sekoitettu epiteelin, ja erilaistumaton, jossa vakavasta kohdunkaulan näyttämällä kaikkein pahanlaatuinen fenotyyppi [4], [5]. Genominlaajuisia globaalin geenin analyysi määrittää lisäksi erillisiä ilmentymisen profiilit eri munasarjasyöpä [6]. Eri histologisia tyyppejä munasarjasyövän näyttävät säädetään eri patogeenisten reittejä [7]. Useimmat EMC ja PSC läsnä kohtalainen tai korkea ER [8], [9], [10] ja AR ilmaisun [11], [12].

steroidihormonireseptoreihin, kuten ER, progesteroni reseptorin ( PR), ja AR ovat mukana kehittämässä endokriinisten elinten syövät, mukaan lukien munasarjasyöpä [12], [13], [14]. Estrogeenit ovat tunnetusti säätelijöinä kasvua ja erilaistumista normaalissa munasarjat, sekä kehittämiseen munasarjasyövän mutta mekanismia hormonaalisen säätelyn edelleen epäselvä. Estrogeeni säädökset kahdella tumareseptoreista, estrogeenireseptori alfa (ERa) ja estrogeenireseptorin beta (ER), jotka sitoutuvat estrogeenin vaste-elementin (ERE) promoottorialueella kohdegeenien, jotka säätelevät niiden transkription aktiivisuus [15]. Vastaavasti, AR on myös ligandi-aktivoidun transkriptiotekijän. Sitominen androgeenin AR tuloksia ydinvoiman lokalisoinnin hormonireseptori- kompleksin yhdessä koaktivaattoreiden ja pohjapinta transkription koneita. Kun tumaan se sitoutuu sitten androgeenin vaste-elementtiin (ARE), ekspressiota sääteleviä kohdegeenien [16].

AR on vallalla sukupuolihormonien reseptori ilmaistaan ​​munasarjasyövistä. Kahdeksankymmentä-neljä prosenttia kasvainten ilmaista AR, kun taas vain 74% ilmentävien kasvainten ER ja 41% ilmentävien PR [17]. On suurempi riski munasarjasyövän postitse vaihdevuodet, jolloin androgeenit ovat ensisijainen steroidit erittämät munasarja [18]. Korkea ekspressio PR liittyy hyvä ennusteeseen multivariant analyysi munasarjasyöpä [19]. Kuitenkin tulokset ovat ristiriitaisia ​​korrelaation näiden kolmen reseptorin kanssa ennustetta ja eloonjäämisaste potilailla, [12], [20].

p44 on 44 kDa: n AR-vuorovaikutuksessa proteiini, joka on osoitettu lisäävän AR transkription aktiivisuutta. Se sisältää 342 aminohappotähdettä, ja neljä oletetun WD40 toistoa [21]. Lisäksi p44 ole jossakin methylsome monimutkainen arginiini metyylitransferaasin 5 (PMRT5), ja on myös alayksikköä selviytymisen liikehermosolujen (SMN) kompleksi [22]. Johtuen fosforylaation sen alayksikön, SMN kompleksi on aktiivinen sytoplasmassa, jossa se edistää U snRNP kokoonpano [23]. Ilmaisu ja toiminta p44-proteiinin on raportoitu eturauhas-, kives-, ja rintasyöpiä. Mielenkiintoista, havaitsimme erillisiä malleja ilmentymistä ja toimintaa näissä sukupuolielimet [21], [24], [25]. Löysimme erillinen intrasellulaarinen lokalisaatio p44 hyvänlaatuista (kuten ydin- proteiini) ja pahanlaatuinen (kuten sytoplasmaproteiinin) eturauhasessa. Nuclear ilmaus p44 estää eturauhassyövän kasvua vaikutuksen alaisena androgeenireseptorin [21]. Sen sijaan, p44 ilmennettiin sytoplasmisen proteiinin hyvänlaatuisia rinnan epiteeli ja tumaproteiini rintasyövän. Nuclear p44 edistää rintasyövän solujen kasvua, kun läsnä on estrogeenin [21], [24]. Tuloksemme osoittavat, että p44 toimii kofaktorina vaikuttavat elinspesifiseen tuumorigeneesiä sukupuoleen steroidi hormoni-säännelty kasvaimia.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmentymistä p44 in hyvän- että pahanlaatuisia ihmisen munasarjan soluja. Olemme havainneet, että p44 on ekspressoituu differentiaalisesti eri munasarjojen syöpien. In endomet- ja vakavien munasarjasyövät, p44 ilmennettiin tumaproteiini. Kuitenkin p44 ilmaistiin sytoplasmaproteiinin hyvänlaatuista munasarjan (OSE), munanjohtimen (FT), ja kohdun limakalvon (EM) epiteelin. Tuloksemme osoittivat myös, että AR ja ER rooli sääntelyn ydin–sytoplasmista translokaatiota p44 munasarjasyövän ja myöhemmin syöpäsolujen kasvua ja invaasiota.

Tulokset

Expression ja sijainti solun AR koaktivaattorikompleksien P44 ihmisen munasarjasyöpä: Mahdollista asetusta lokalisoinnin androgeenien ja estrogeenin

Voit selvittää p44 liittyy munasarjasyöpiä, tarkastelimme p44 ilmentymistä hyvänlaatuisia munasarjan, kohdun limakalvon, ja munanjohtimen kudosten ja eri histotypes of munasarjakarsinoomat immunohistokemiallisesti. Voit selvittää sijainti solun p44, ilmentymistä p44 sytoplasmassa ja ytimet olivat puolittain määrällisesti arvostellaan erikseen (katso materiaalit ja menetelmät).

p44 oli immunoreaktiivisia sekä sytoplasmassa ja ytimeksi. Normaaleissa kudoksissa, kuten FT, EM, ja OSE oli korkeampi p44 immunoreaktiivisia sytoplasmassa kuin ytimet (sytoplasmisen ydin- suhde oli noin 02:01, kuvio 1 B). Kaikissa 5 tyyppisiä munasarjojen karsinoomat, kuten MUC, CCC, EMC, vakavien rajatapaus (SBT), ja PSC, lisääntyi ydinvoiman immunoreaktiivisuus p44 verrattuna sytoplasmaan (kuvio 1A, taulukko 1), vaikka ydin- p44 tasot vaihtelivat eri histologisia tyyppejä munasarjasyövän. SBT oli korkein immunoreaktiivisuus p44 in ytimet ja MUC oli alhaisin (kuvio 1 B, S1). Useita ANOVA paljasti, että oli merkittäviä eroja p44 immuunivaste ytimet välillä hyvänlaatuinen (FT: 0,89 ± 0,17; EM: 0,55 ± 0,15; OSE: 0,54 ± 0,14) ja pahanlaatuinen (CCC: 1,64 ± 0,13; EMC: 1,71 ± 0,16; PSC: 2,06 ± 0,14, ja SBT: 2,67 ± 0,17) epithelia (p 0,01). Parillista t-testi osoitti, että oli merkittävä ero p44 immuunivaste ytimet pareittaiset välillä FT ja PTK, OSE ja PTK, EM ja EMC, vastaavasti (p 0,05). PSC, EMC, ja CCC karsinoomat osoittivat samanlaisia ​​immunointensity of p44 in ytimille ANOVA (p 0,05, kuvio 1 B, S1). Sen sijaan, oli minimaalinen ero sytoplasmisen immunoreaktiivisuus p44 kunkin hyvän- laatuisia ja pahanlaatuisia epiteeli (p 0,05, kuvio 1 B). Yleensä EMC, PSC, ja SBT oli suhteellisen runsaasti ER ilmaisun ja näistä kasvaimista oli suhteellisen korkeampaa p44 immuunivaste ytimet (kuvio 1A, 1B, kuva S1). Havainnot ero sijainti solun p44 välillä normaaleissa kudoksissa ja munasarjasyöpä voi ehdottaa rooli p44 kuten estrogeenireseptorin välittäjänä kasvainten synnyssä munasarjasyövän.

. Esimerkkejä P44 ilmaisun immunohistokemiallisesti 4 eri histologisia tyyppejä munasarjasyövän ja normaali munanjohtimen ja kohdun limakalvoa (suurennos 200x). B. semikvantitatiivinen analyysi p44 immunointensity ja sen sijainti solun neljässä eri histologisia tyyppejä munasarjasyövän ja normaali munanjohtimen ja kohdun limakalvoon. Tummanharmaa palkit ovat ydin- p44 ja vaaleanharmaa palkit ovat sytoplasminen P44. Pieni t-palkit kuvaavat keskivirhettä. C. Western blot-analyysi AR, ERa ja ER sen erilaisissa solulinjoissa, kuten T29, SKOV-3, OVCAR-3. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Ensisijainen vasta-laimennus käytettiin p44 oli 1:5000, AR 1:1000 varten ERa ja ER 1:2000 ja β-aktiini 1:5000.

Arvioida suhdetta of P44 AR ja ER munasarjasyövän, ensin tutkinut ekspressiotasot näiden reseptorien valitussa munasarjojen solulinjoissa. Western blot-analyysi paljasti, että p44: n ilmentyminen oli suurempi munasarjasyövän solulinjoissa OVCAR-3 ja SKOV-3 kuin hyvänlaatuinen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (OSE) solulinjassa T29. Tasot p44 ilmaisun korreloi positiivisesti ERa /β ja AR ilmaisu (kuvio 1 C). Erityisesti olemme havainneet, että ERa ilmaisu oli suurempi SKOV-3 ja päinvastoin, ER isoformi osoitti korkeimmalla tasolla OVCAR-3 cells.To määrittää p44 solusijaintipaikan ja sääntelyn estrogeenin ja androgeenin hyvän- ja pahanlaatuisten OSE soluja, selvitimme lokalisointi P44 kolmen eri viljelyliuosolosuhteissa: hormonitonta keskikokoisten ja joille on määritelty tasojen joko androgen tai estrogeeni immunofluoresenssimikroskopialla. Kuten kuviossa 2 on esitetty, hyvänlaatuinen T29-soluissa oli korkeammat tasot sytoplasmisen p44 ja, jossain määrin, ydin- p44 kaikissa kolmessa väliaineessa olosuhteissa. In SKOV-3, p44 paikallistettiin pääasiallisesti tumaan hormonitonta, androgeenireseptorin (10 nM synteettistä androgeenireseptorin R1881) ja estrogeenin (10 nM 17β-estradioli) media (kuva 2). In OVCAR-3 soluja, p44 paikannettiin sekä tumassa ja sytoplasmassa hormoneja media, ja sijoitettu ytimen läsnä ollessa joko androgeenien tai estrogeenin (kuvio 2).

p44 primäärisen vasta-aineen ja rodamiini konjugoitua kanin polyklonaalista sekundääristä vasta-ainetta käytettiin. DAPI käytettiin värjäämään ytimet. (Suurennus: 400x)

AR koaktivaattorikompleksien p44 toimii sekä AR ja ER koaktivaattorikompleksien munasarjan soluissa

p44 on koaktivaattorikompleksien AR ja ER ja on selvä ilmentyminen eturauhas- ja rintasyövän solujen linjat [21], [24]. Sen määrittämiseksi, onko p44 toimii transkription aktivaattorina munasarjasyövän solulinjoissa, teimme in vivo transkription määrityksessä käyttäen dual lusiferaasireportterisysteemillä. Olemme transfektoitiin lyhytaikaisesti T29-solujen ilmentävän p44 ja joko pari ilmentävät AR ja lusiferaasireportteri- valvonnassa neljä androgeenin vaste-elementtien (kuvio 3A), tai ERa ja lusiferaasireportteri- valvonnassa estrogeenin vaste-elementtien (kuvio 3B). Kun läsnä on androgeenin, p44 aktivoituu androgeenireseptorin jentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä johtaa niin paljon kuin 2,6-kertainen reportteri aktiivisuus verrattuna kontrolliin. Vastaavasti, kun läsnä on estrogeeni, p44 aktivoituu estrogeenireseptori-riippuvaisen transkription annoksesta riippuvalla tavalla: toimittaja signaali lisääntyi yhtä paljon kuin 4,5-kertaiseksi verrattuna kontrolliin. Kun P44 ilmaistiin yksin, ilman joko AR tai ER, ei ole vaikutusta toimittaja vaikutus havaittiin, sekä läsnäollessa ja ilman hormoneja media (tuloksia ei esitetty), joka vahvistaa p44 aktivaation kautta hormonireseptorit. Nämä havainnot osoittivat, että p44 todellakin toimii koaktivaattorikompleksien sekä androgeenin ja estrogeenin reseptorien munasarjojen soluissa.

. Vektoreita, jotka sisältävät p44: n ja AR transfektoitiin T29-soluissa yhdessä toimittaja vektorilla, joka sisältää lusiferaasigeenin ohjauksessa promoottorin, joka sisälsi 4 androgen vaste-elementit. B. Vektorit, jotka sisältävät p44 ja ERa transfektoitiin T29 soluihin yhdessä ER-luc-reportterin vektori. Reportteri aktiivisuus ilmaistiin suhteellisena yksikköä.

AR koaktivaattorikompleksien p44 edistää munasarjasyövän solujen kasvua ja invaasiota

leikellä vaikutuksen p44 on munasarjasyövän solujen lisääntymistä, ensin transfektoituja retrovirusvektoreilla ilmentävät NLS-p44 osaksi SKOV-3-soluissa. NLS-P44 on rakennettu tumalokalisaatiosignaalin (NLS) fuusioitu kehyksessä N-päähän P44. SKOV-3-solut eivät kykene vastaamaan estrogeenin aktivointi [26], [27]. Vahvistettuaan, että transfektoitu p44 ilmennettiin, jatkoimme analysoida proliferatiivisen tilan soluja (kuvio 4A). Sekä hormoneja ja estrogeenin kasvatusalustaan, yliekspressio NLS-p44 ei ollut vaikutusta kasvuun SKOV-3-soluja (p 0,05). Kuitenkin, kun läsnä on androgeenin, yliekspressio NLS-p44 johti noin 33%: n vähennys solujen kasvun (p 0,01). Vähentämällä tasot p44 käsittelemällä SKOV-3-solujen kanssa vastaavan siRNA johti samanlaisiin tuloksiin. Vaikka media, joka sisältää androgeenireseptorin knockdovvn p44 johti -25% laskua kasvuvauhti (p 0,05), ja -15%: n vähennys solujen kasvua in hormonitonta media (p 0,05), ei ollut tilastollisesti merkitsevä vaikutus siRNA hoidon solujen kasvua väliaineessa, joka sisältää estrogeenin (kuvio 4C). Koska estrogeeni reseptorin SKOV-3-soluissa on ei-estrogeeniherkkiin tulokset validoitu menetelmämme tutkimuksen.

A, B: SKOV-3-solut (A) ja OVCAR-3-solut (B) transfektoitiin joko pBabe-NLSp44 yliekspressio vektori tai kontrollivektorilla, ja viljeltiin joko hormoni-väliaineessa tai läsnä ollessa androgeenin tai estrogeenin. Yli-ilmentyminen p44 varmistettiin western blot (näytteet otetaan joka toinen päivä) ja solut laskettiin joka päivä. C, D: SKOV-3-soluja (C) ja OVCAR-3-soluja (D) käsiteltiin p44 siRNA käyttäen Hiperfect ja viljeltiin joko hormoni-väliaineessa tai läsnä ollessa androgeenin tai estrogeenin. SiRNA käsittely toistettiin joka toinen päivä. Yli-ilmentyminen ja pudotus on p44 varmistettiin western blot (näytteet otetaan joka toinen päivä) ja solut laskettiin joka päivä.

Toisin SKOV-3-solulinjassa OVCAR-3 solujen on vasteellinen estrogeenin stimulaatio [28]. Todellakin, kun OVCAR-3 soluja kasvatettiin väliaineessa, jota oli täydennetty estrogeenia tai androgeenien (kuvio 4B ja D, avoimet kolmiot ja neliöt), ne molemmat osoittivat lisääntyvän leviämisen verrattuna kasvatettujen solujen hormoni-free Media (55% ja 40%, vastaavasti ). Toisin kuin tilanne SKOV-3-soluissa, havaitsimme vahva positiivinen vaikutus ydinvoiman p44 yli-ilmentymisen kasvuun OVCAR-3 solujen alusta täydennettynä wither joko androgeenien tai estrogeenin. Läsnäollessa androgeenin, yliekspressio NLS-p44 johti 1,5-kertainen kasvu, ja kun läsnä estrogeenin havaitun kasvun induktio oli 1,6-kertainen. Ei ollut merkittävää vaikutusta solukasvun p44 yli-ilmentymisen hormonitonta media (kuva 4B).

Havaitsimme myös vahva, mutta kielteinen, vaikutus ehtymiseen p44 in OVCAR-3-soluihin käyttämällä siRNA vahvistettiin proteiinin tason western blot -analyysillä. Vaikka yli-ilmentyminen p44 ei ollut merkittävää vaikutusta kasvuun hormoneja väliaineessa, knock-down of p44-proteiinin tasot johtivat 25% alenema kasvuvauhti hormoni väliaineessa. Hormonin täydennetty median kasvua vähentäminen liittyy p44 ehtyminen näytti entisestään. Estrogeenin media, p44 ehtyminen aiheutti 40% vähennys kasvaimen solujen kasvu, kun taas läsnä ollessa androgeenireseptorin tämä ero oli 33% (kuvio 4D).

lisäksi testattiin p44 vaikutuksia soluinvaasiota kyky käyttämällä

in vitro

Matrigel invaasiomääritys. Havaitsimme lisääntynyt invasiivisuus solujen alusta täydennettynä androgeenin verrattuna hormoni-väliaineessa. Solujen käsittely estrogeenin ei muuttaa solujen rajan kalvon (kuvio 5A). Kun yli-ilmentynyt NLS-p44 in SKOV-3-soluissa ei havaittu muutosta solujen kyky hyökätä läpi matrigeelin kalvon joko hormoni väliaineessa tai alusta täydennettynä androgeenin tai estrogeenin. Jos haluat estää endogeenisen p44 ilmaus toimme p44 siRNA osaksi SKOV-3-soluissa. Vuonna media puuttuu hormonit, ehtyminen p44 ei vaikuttanut kasvainsolun invaasiota läpi Matrigel, koska se ei vaikuttanut kasvaimen invaasio, että estrogeenia sisältävä media. Vuonna alusta täydennettynä androgen puute p44 ilmentymisen merkittävästi vähentynyt soluinvaasiota jopa 3-kertaiseksi (kuvio 5C).

A, B: SKOV-3-solut (A) ja OVCAR-3-solut (B) oli transfektoitu joko pBabe-NLSp44 yliekspressio vektori tai ohjaus vektorin; C, D: SKOV-3-soluja (C) ja OVCAR-3-soluja (D) käsiteltiin p44 siRNA käyttäen Hiperfect ja viljeltiin joko hormoni väliaineessa tai läsnä ollessa androgeenin tai estrogeenin. Yli-ilmentyminen ja knockdovvn p44 varmistettiin western blot (katso kuva 4). Solut ympättiin Matrigel kalvot hormonitonta media. Androgeenien tai estrogeeni käytettiin chemoatractants sisään alaosaan.

Testasimme myös vaikutusta p44 on hyökkäyksen OVCAR-3-soluissa. Samanlainen SKOV-3-soluissa, lisäämisen tai vähentämisen p44 ilmaisua ei vaikuttanut solujen invaasion hormonitonta media (kuvio 5B, D). Androgeeni tai estrogeeni-täydennettyä elatusainetta, enemmän kuin kaksi kertainen Matrigel invaasio huomattava (kuvio 5B). Tasaisen, knockdovvn p44 in OVCAR-3 solujen johti dramaattiseen vähenemiseen invaasion kyky hormoneja täydennetty media.

Keskustelu

Steroidihormonien ovat tärkeitä tekijöitä kehittymistä ja etenemistä munasarjojen syöpä. Hormoni reseptorit ja niiden kofaktoreita ovat välttämättömiä hormonien toimintaa. Useimmat munasarjojen karsinoomat, kuten serous ja endomet- tyypit, näyttää vaihteleva taso ER, PR, ja AR ilme [12], [27]. Expression of sex steroidihormonireseptoreihin ja niiden kofaktoreita munasarjasyövän tarjoavat tavoitteita anti-hormoni hoitoja. Näin ollen on keskeinen luonnehtia roolia sukupuolihormonien ja niiden kofaktori välittämä tuumorigeneesiä munasarjasyöpä. On raportoitu, että AR on tärkeä merkki munasarjasyövän [29], kuitenkin, molekyylitason mekanismeja AR liittyy aggressiiviseen munasarjasyöpä käytös [30], [31], [32] tunnetaan edelleen huonosti.

Aiemmissa tutkimuksissa, huomasimme, että AR koaktivaattorikompleksien p44 on tärkeä rooli sekä eturauhas- ja rintasyöpiä, osoittaa osallistuminen AR reitin kasvainten synnyssä näistä umpierityselinten. Tässä tutkimuksessa käytimme samankaltaisia ​​periaatteita määrittämiseksi osuus p44 kasvaimia toimintoja munasarjasyövän kasvainten synnyssä, suhteessa androgeenin tai estrogeenin. Olemme havainneet, että sytoplasminen p44 ilmentyy erittäin hyvänlaatuisia endometriumin ja munanjohtimen pinnan epiteelisolujen. Kuitenkin eri kasvaintyypeissä, p44 on ero solun ilmaisun kuvioita, heijastuu eri soluliman ja ydinvoiman lokalisointi. P44 on yliekspressoituvat merkittävästi korkealaatuisesta vakavien karsinooma, endomet- karsinoomat, kirkas cell carcinoma, ja vakavien rajatapaus kasvaimet (kuvio 1A). Erityisesti ydinvoiman p44 ilme on huomattavasti suurempi munasarjasyövän kudoksissa kuin heidän Hyväksytty hyvänlaatuinen kollegansa, tukee toiminnallista roolia ydinvoiman p44 kasvainten synnyssä munasarjasyöpään. Vastaavasti, western blot-analyysi paljasti vertailukelpoisia p44 välillä OVCAR-3 ja SKOV-3 (kuvio 1C), kun soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa (fenoli punainen ja ei-puuhiilellä puhdistettua seerumia), kuitenkin, androgeeni-täydennetty väliaine, immunofluoresenssivärjäyksen paljasti, että p44 on ilmaistu korkeimmalla tasolla tumassa (kuvio 2). Se on suurta kiinnostusta määrittää tulevissa tutkimuksissa, onko taso ER, AR ja p44 ilmaus liittyy erityisiä histologisia tyyppejä munasarjasyövän, kasvaimen, vaiheet ja selviytyminen.

määritellä tarkemmin toiminnallinen roolit P44, tutkimme p44 hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia OSE solulinjojen läsnä ollessa ja puuttuessa androgeenin tai estrogeenin. Käytimme hyvänlaatuinen kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja T29 ja kaksi pahanlaatuisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV-3 ja OVCAR-3 tässä tutkimuksessa. Kerrottiin, että SKOV3 ei reagoi estrogeenin kun OVCAR-3-solut reagoivat estrogeenihoito. Yhteisymmärryksessä, huomasimme, että estrogeeni ei vaikuttanut p44 lokalisointi, soluproliferaatioon tai hyökkäyksen SKOV-3-soluissa, kun taas estrogeeni parannettu p44 ydinvoiman lokalisointi, solujen lisääntymistä, ja hyökkäyksen OVCAR-3-soluissa. Vaikka sekä ERa ja ER ilmaistaan ​​SKOV-3-soluja (kuvio 1C), SKOV-3 reagoimattomuus estrogeenin voi johtua mutaatiosta ERa [27], mikä osoittaa, toiminta p44 saattaa välittää ERa, sen sijaan, että ER.

p44 merkittävästi parannettu pahanlaatuinen OSE soluproliferaatiota ja invaasiota läsnäollessa androgeenin tai estrogeenin, mikä osoittaa, että ilmaus AR tai ER vaaditaan p44 stimuloimaan mitogeneesiä ja invaasiota (kuvio 1 C). p44-välitteisen tuumorigeenisia toiminto näyttää olevan erilaiset eturauhas- ja munasarjasyöpä. Eturauhasen syöpä, ydin- p44 inhiboi soluproliferaatiota in androgeeni-riippuvaisella tavalla. Vuonna munasarjasyöpä OVCAR-3, ydin- p44 edistää solujen kasvua. Erityisesti on huomattava, että ydin- p44 edistää invaasio sekä androgeeni ja estrogeeni media. Tulokset munasarjasyöpä ovat samankaltaisia ​​kuin mitä havaittiin rintasyövän. Rintasyövän, ydin- p44 edistää kasvainsolujen proliferaatiota in estrogeenin riippuvalla tavalla [24]. Vaikka siRNA-välitteisen knockdovvn kokeet osoittivat, että meidän p44-vasta-aine tunnistaa spesifisesti yhden proteiinin lajin eturauhasen, rinnan, ja munasarja, emme voi täysin sulkea pois mahdollisuutta, että erittäin liittyvä mutta toiminnallisesti erillisiä proteiineja (esim liitos muunnoksia p44) toimivat erilliset hormonin reseptorin kofaktoreita kussakin näistä kudoksista. Tämän varoitus, meidän havainnot viittaavat siihen, että p44 voi toimia läpi ER välittämää toimivien reittien munasarjakudoksessa.

Yhteenvetona tietomme osoitti ydinvoiman p44 on osallisena munasarjasyövän leviämisen ja invaasion. Nämä prosessit säätelevät androgen ja estrogeeni. P44 voi olla potentiaalinen kohde hoitoon munasarjasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Case valinta, TMA ja IHC

Tapaukset kerättiin leikkauksen jälkeen Northwestern Memorial Hospital ja New York University vuodesta 1996 vuoteen 2009. hyväksynnät Institutional Research Board (IRB) sekä laitosten saatiin (vapautettu). Yhteensä 105 tapausta munasarjasyövän kerättiin tätä tutkimusta varten (taulukko 1). Kaikki PSC ja EMC tapauksissa haettiin NYU kudospankki ja kaikkia muita munasarjasyövän, sekä normaali kontrollisilkkipaperia, haettiin NWU kudospankille. Tämä olivat histologinen diagnosointiin korkealaatuisesta papillaarinen vakavien karsinooma (PSC, N = 32), vakavien rajatapaus kasvain (SBT, N = 9), endomet- munasarjakarsinooman (EMC, N = 34), mucinous munasarjakarsinooman (MUC, N = 15 ) ja selkeä cell munasarjakarsinooman (CCC, N = 15). Normaali kontrollisilkkipaperia käytetty tässä tutkimuksessa olivat: 30 normaali munanjohtimet (FT, lähin tavanomaista valvontaa varten korkealaatuista vakavien karsinooma), 20 normaalia endometria (EM, lähin tavanomaista valvontaa varten endomet- syöpä), ja 28 normaalin munasarjat (OSE, munasarjojen pinta epiteeli, koska yleinen ohjaus kudosta).

Kaikki karsinoomat olivat munasarjojen ensisijainen. Tissue mikrosiru (TMA) Valmiste on kuvattu edellisessä tutkimuksessa [33]. Lyhyesti, 0,6 ja 1 mm kudoksesta ytimiä kerättiin kussakin tapauksessa hyvin säilynyt tuumorisektioiden ja korkean tiheyden TMA valmistettiin kahdessa kuitteja lohkoissa.

tuotanto, affiniteettipuhdistuksella, ja spesifisyys kanin polyklonaalista p44 käytetty vasta-aine on kuvattu aikaisemmin [34]. Esi-seerumia käytettiin kontrollina. Spesifisyys p44-vasta vahvistettiin siRNA määritystä, joka osoitti alentunut p44 ilmaisutapoja p44 RNA-interferenssi [21]. Suhteelliset tasot p44 ilmaisun pisteytettiin semi-kvantitatiivisesti yhdistelmällä immunointensity [0 (negatiivinen), 1+ (heikko), 2+ (heikko), 3+ (kohtalainen), ja 4+ (voimakas) ilmaisun] ja immunopercentage ( 1 kuten 0-10%, 2 kuten 10-50%, 3 50-75% ja 4 kuten 75-100%)]. Tilastolliset analyysit tehtiin t-testillä.

Soluviljely ja solujen lisääntymisen määrityksessä

solulinjat SKOV-3 [35] ja OVCAR-3 [28] saatiin American Type Culture Kokoelma. Hyvänlaatuinen kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja T29 [36], kuten aikaisemmin on kuvattu yksityiskohtaisesti, ylläpidettiin alustassa 199 ja MCDB105 (Sigma). Kaksi munasarjasyövän solulinjoissa SKOV-3 ja OVCAR-3 viljeltiin McCoyn 5a väliaineessa (Invitrogen) ja RPMI 1640 (Gibco), vastaavasti, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1 U /ml penisilliiniä ja 1 ug /ml streptomysiiniä. Mitata proliferaationopeus, 2 x 10

4 solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Sopivana ajankohtina solut käsiteltiin 0,25% trypsiiniä ja 0,38 mg /ml EDTA: ta (Gibco) ja laskettiin hemosytometrillä (Reichert).

Western blot-analyysi

Western blot analyysi oli käytetään tarkistamaan p44, AR, ERa ja ER ilme täydellisessä väliaineessa, knockdovvn p44, ja yli-ilmentyminen p44 plasmidien (pBabe vektori ja pBabeNLSp44) munasarjojen solulinjoissa. Solut joko kasvatettiin 10 cm ruokia, 6 hyvin tai 24-kuoppalevyille. Hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-cocktail-inhibiittori (Sigma) 1:100 suhde lisättiin pelletit sekoittamisesta. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä ja sopiva määrä proteiinia ladataan elektroforeesilla SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Proteiini siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle ja western blot -analyysillä. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa Tris puskuroidussa suolaliuoksessa ja Tween 20: tä (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, ja 0,1% Tween 20). Blotteja inkuboitiin sitten vasta-aineiden kanssa AR, ERa, ER (Santa Cruz Biotechnology), p44 ja β-aktiini 2 tuntia huoneenlämpötilassa, pestään Tris-puskuroidulla suolaliuoksella Tween 20 kolme kertaa. Pesujen jälkeen blotit inkuboitiin 2 tunnin asianmukaiset piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (GE Healthcare). Proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia kit (GE Healthcare).

Immunofluoresoivat mikroskopia

T29, SKOV-3 ja OVCAR-3 soluja kasvatettiin kaksi densities- 3 x 10

4 ja 1 x 10

4 kuoppaa kohti kolmelle eri medioiden olosuhteissa (hormoneja, androgen, ja estrogeenin) on Chambered dioja. Solut huuhdeltiin ensin kolme kertaa PBS: ssä ja kiinnitettiin 20 minuutin ajan 4% paraformaldehydillä PBS: ssä huoneen lämpötilassa. Kiinnityksen jälkeen solut läpäiseviksi metanolilla ja asetonilla (01:01) ja inkuboitiin -20 ° C: ssa 20 min. Solut pestiin 3 kertaa PBS: ssä ja blokattiin 1 tunnin ajan liuoksella, jossa oli 5% BSA TBS-T: llä. Sitten soluja inkuboitiin p44 primääristä vasta-ainetta (1:250) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen primaarisessa vasta-ainetta, solut värjättiin rodamiini-konjugoidun kaniinin polyklonaalista vasta-ainetta (1:500) (Abcam) 1 tunnin ajan pimeässä huoneen lämpötilassa. Laskuri värjäys DAPI levitettiin (1:1000) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 min pimeässä. Solunsisäinen lokalisaatio p44 jälkeen tutkittiin käyttämällä Nikon Digital DXM1200 F mikroskooppi Nikon-ACT ohjelma.

RNA-interferenssi määritys

kolme siRNA tehokkaimmin vähentää tasoa p44-proteiinin munasarjan soluissa yhdistettiin ekvimolaarisina määrinä ja käytetään seuraavissa kokeissa yleensä pitoisuus on 100 nM (taulukko 2). Salattu siRNA (Ambion) käytettiin kontrollina.

Soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä haluttuun konfluenssiin 2 ml sopivaa seerumia sisältävää elatusainetta ilman antibiootteja. 100 nM siRNA laimennettiin 423 ui Opti-MEM-media (Gibco) ilman seerumia, jota seuraa 75 ui HiPerfect reagenssia (Qiagen) ja inkuboitiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa muodostumisen mahdollistamiseksi transfektion komplekseja. Sitten soluja inkuboitiin transfektion komplekseja niiden normaaleissa olosuhteissa 48 tunnin ajan.

elektroporaatio

kolme plasmidit – pBabe vektori, pBabeNLSp44 [21], ja GFP (kontrolli) – transfektoitiin soluihin käyttäen elektroporaatiota. Soluja kasvatettiin kolme edellytystä – hormoni-free, androgeeni (10 nM), ja estrogeeni (10 nM). Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin. Pelletoidut solut suspendoitiin sitten uudelleen 100 ul: aan Nucleofactor liuosta (82 ui liuosta +18 ui täydentää liuos) (Lonza) ja kunkin reaktion. Neljä ng plasmidia yhdistettiin sitten ja solu /DNA suspensio siirrettiin elektroporaatiokyvetissä. Nucleofactor suosittelemaa kunkin solulinjan valmistajan on valita ja soveltaa. Elektroporaation jälkeen kyvettiä poistettiin ja solut siirretään välittömästi 10 ml: aan vastaavaa väliainetta, jossa FCS: ää ja inkuboitiin 48 tunnin ajan normaaleissa kasvuolosuhteissa.

lusiferaasianalyysissä

In vivo toimittaja transkription analyysi suoritettiin käyttämällä Dual-reportteri Luciferase Assay System (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Valoteho mitattiin Lumat LB9507 luminometrillä (Berthold). Vektorit pcDNA-FAR, pcDNA-ERa ja reportterivektoreita ER-luc ja pGL3-ARE4 hankittiin Addgene.

Matrigel invaasiomääritys

Solut suspendoitiin keskipitkällä ilman seerumia at