Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MUC1 on tyypin I läpäisevä glykoproteiini poikkeuksellisesti yli-ilmennetään erilaisissa syöpäsoluissa kuten haimasyöpä. Sytosolin pää MUC1 (MUC1-c) on laajasti mukana useissa signalointireittien. MUC1-c on raportoitu estävän apoptoosia useissa syöpäsolujen, mutta Estomekanismis- on epäselvä.

Menetelmä

Expression of MUC1-c tutkittiin haimasyövän solulinja MiaPaca -2 RNA-tasolla käyttämällä qRTPCR ja proteiinitasolla Western-blottauksella. MUC1-c ilmentyminen estyi joko siRNA tai tietyn peptidi estäjä, GO-201. Effect of MUC1-c estoa elinkelpoisuutta ja lisääntymistä ja lysosomaalisen läpäiseväksi tutkittiin. Association of MUC1-c kanssa HSP70 havaittiin samanaikainen immunosaostus MUC1-c ja HSP70. Lokalisaatio MUC1-c in soluorganellit seurattiin immunofluoresenssilla ja immuno- blottaus by MUC1-c-vasta jälkeen subsellulaarifraktiointikokeet.

Tulokset

Inhibition MUC1-c jota estäjä (Go- 201) tai siRNA vähensivät elinkelpoisuutta ja vähentää leviämisen haiman syöpäsoluja. Lisäksi GO-201, peptidi estäjä MUC1-c, vähensi tehokkaasti tuumoritaakka haimasyövän hiirimallissa. MUC1-c havaittiin myös liittyvän HSP70 sytosoliin, vaikka huomattava määrä MUC1 nähtiin myös olla läsnä lysosomeihin. Esto MUC1 ilmentymistä tai aktiivisuutta osoittautui paremmaksi katepsiini B toimintaa sytosoliin, joka osoittaa lysosomaalisen läpäiseväksi. Sen vuoksi tämä tutkimus osoittaa, että MUC1-c vuorovaikutuksessa HSP70 sytosolissa haimasyövän soluja ja lokalisoitu lysosomeihin näissä soluissa. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että MUC1-c suojaa haimasyövän soluja solukuoleman vakauttaa lysosomeihin ja estää vapautumisen katepsiini B sytosoliin.

Citation: Banerjee S, Mujumdar N, Dudeja V, Mackenzie T, Krosch TK, Sangwan V, et ai. (2012) MUC1c Säätelee Cell Survival in Haimasyöpä estämällä Lysosomaalinen läpäiseväksi. PLoS ONE 7 (8): e43020. doi: 10,1371 /journal.pone.0043020

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2012; Julkaistu: 13 elokuu 2012

Copyright: © Banerjee et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke rahoittivat National Institutes of Health R21 5R21CA131663-02, R01 5R01CA124723-05 ja Catherine ja Robert Goodale perustan AKS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan sekä miehillä että naisilla Yhdysvalloissa. Useimmat haimasyöpä ovat adenokarsinooma. 5 vuoden eloonjäämisaste potilaiden, joilla oli paikallinen sairaus jälkeen kirurgisen resektion on 20% ja niille, joilla on etäpesäkkeitä, eloonjäämisaste on erittäin alhainen. Vaikka huomattavia resursseja on sitoutunut parantamaan potilaiden selviytymiseen haimasyöpä viime vuosikymmeninä ei ole merkittävää parannusta nämä luvut [1]. Köyhät eloonjäämisaste johtuu myöhään havaitseminen haimasyövän ja äärimmäinen kestävyys kasvainsolujen mihinkään kemoterapeuttisten strategioita. Tästä syystä selvittäminen mekanismi vastus haimasyöpäsoluissa on alkuluku tutkimuksen painopiste, koska se voi johtaa kehittää uusia hoitomuotojen.

Musiinit ovat transmembraani- glykoproteiineja, läsnä pinnalla eri limakalvon epiteelin ja hematopoieettisten solujen, ja ne on raportoitu yli-ilmentynyt useissa adenokarsinoomat [2]. MUC1 on yksi musiineja, joka liittyy huono prognoosi, pahanlaatuisiin kasvainsolujen, ja kestävyys genotoksisten syövän aineet [3], [4]. MUC1 liittyy myös hyökkäys [5] – [7], [8], joka ohjaa useita solusignalointi reittejä [9] ja syövän etenemistä [10]. Puute MUC1 on korreloi vähentynyt proliferaatio, invaasio, ja mitoosi hinnat sekä

in vivo

ja

in vitro

haimasyövän [11].

MUC1 syntetisoituu yksi peptidi, joka käy läpi katkaisun kahteen alayksiköstä, sen jälkeen muodostamaan stabiilin ei-kovalenttisen heterodimeerin, joka koostuu solunulkoisen domeenin ja sytoplasminen häntä [12], [13]. N solunulkoinen domeeni MUC1 koostuu vaihtelevasta määrästä tandem-toistojen (VNTR) modifioitu laaja O-glykaanien, ja toimii fyysisenä esteenä solunulkoiseen ympäristöön. Sytoplasmisen hännän MUC1 (MUC1-c) koostuu 58 aminohapon solunulkoinen domeeni, 28 aminohapon transmembraanidomeeni ja 72 aminohapon sytoplasminen domeeni. Tämä sytoplasminen (nimetty MUC1-c) on vuorovaikutuksessa β-kateniinin, suuret efektori kanonisen Wnt-signalointireitin [14], [15], ja indusoi ankkurista riippumaton kasvu ja tuumorigeenisyystesti [16], [17]. Vuorovaikutus β-kateniinin edistää lokalisointi MUC1 tumaan, jossa MUC1-c vuorovaikutuksessa eri transkriptiotekijöiden ja aktivoi useita kasvu- ja selviytymisreittejä [18] – [24], mikä tukahduttaa useita solukuolemareittejä [25] – [ ,,,0],29].

yli-ilmentymisen MUC1, kuten ihmisen kasvaimista löydetyistä, liittyy lokalisointia MUC1-c mitokondriot [3]. Toiminnallinen merkitys mitokondrioiden MUC1-c lokalisointi tukee sen osoittaminen, että MUC1 vaimentaa DNA-vaurioita aiheuttama vapautuminen mitokondrioiden apoptogenic tekijöitä ja apoptoottisen vasteen [3]. Koska MUC1 ei ole klassinen mitokondrioiden lokalisointi allekirjoitus, mitokondrio kohdentamista MUC1-C välittyy sen vuorovaikutus sytosolin chaperones kuten HSP70 ja HSP90 [30]. Koska vasta-syntetisoitiin ja -cleaved MUC1-c on sytosolissa, jossa on alttiina hydrofobinen transmembraanidomeeni [31], [30], nämä chaperones pystyvät sitomaan sen ja toimittaa sen mitokondriot [32]. Association of MUC1-c lämpöshokkiproteiineihin aktivoimisen jälkeen hereguliinin ja sen myöhempi kohdistamista mitokondrion ulkokalvon on raportoitu [33]. Osana mitokondrion ulkokalvon, MUC1-c vaimentaa menetys transmembraanisen potentiaalin vasteena genotoksinen stressi [34], [3], ja antaa resistenssin kuolemaan soluvasteen DNA-vaurion, reaktiivisen hapen, hypoksia, tai aktivoitumista kuoleman superperheen [34].

Vaikka alavirran polut solukuoleman seurauksena MUC1 inhibition on tutkittu useita syöpiä, mekanismi aloittamisesta mitokondrion depolarisaatio (seuraavat MUC1 esto ) aktivoitumiseen johtavat apoptoottisen reittejä ei ole selkeä haimasyöpä. Mitokondrioiden kalvon depolarisaatio voi johtua useita tapahtumia. Vahinko on tuman DNA tai Endoplasmakalvosto molemmat indusoivat apoptoottista solukuolemaa, joka on riippuvainen mitokondrion Depolarisaatio ja kaspaasin aktivaatio [35]. Samanlaisia ​​depolarisaation ja aloittamisen solukuoleman polkuja voi myös laukaista lysosomeihin. Lysosomaalisen vaurioita vastauksena genotoksisten aineiden on raportoitu aloittaa solukuoleman vapautumisen hydrolyyttisten entsyymien tämän organelle sytoplasmaan [36], [37]. Lysosomeihin sisältävät monia erilaisia ​​hydrolyyttisiä entsyymejä, kuten proteaaseja, lipaaseja, nukleaasit, glykosidaasit, fosfolipaasit, fosfataasit ja sulfataaseja, jotka yleensä saavat aikaan maksimaalinen entsymaattinen aktiivisuus matalassa pH: ssa. Lysosomaalinen proteaasien ovat sekaantuneet solukuoleman ovat ne katepsiinit jotka pysyvät aktiivisina neutraalissa pH: ssa, kuten katepsiini B, katepsiini D ja katepsiini L. Nämä proteaasit aktivoivat apoptoottisia efektoreja kuten mitokondrioita ja /tai caspases, mikä johti apoptoosin [38] , [39].

Yksi proteiinin tyyppien edistää eloonjäämistä haiman soluja on perheen lämpösokkiproteiinit, erityisesti HSP70 [37], [40] – [42]. On raportoitu, että downregulation HSP70 tuloksia haimasyövän solukuoleman indusoimalla lysosomaalisissa läpäiseväksi, [37], mutta tarkka mekanismi suojaa ei ole tutkittu.

Nykyisessä tutkimuksessa, osoitamme, että HSP70 assosioituu C-terminaaliseen päähän MUC1-proteiinin (MUC1-c), ja siirtää sen lysosomiin, mikä estää lysosomaalisen läpäiseväksi ja solun eloonjäämisen edistämisessä näissä kasvainsoluissa. Me osoittavat lisäksi, että Inhibiittoripeptidi MUC1 (GO-201) inhiboi MUC1-c pienentäen solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuus kasvainsolujen sekä

in vivo

ja

in vitro.

tulokset

haimasyöpäsoluissa Näytä Lisääntynyt ilmentyminen MUC1 verrattuna Normaali haima

Expression of MUC1 tutkittiin useissa haimasyövän solulinjoissa sekä RNA ja proteiini tasolla . Ilmentyminen MUC1-mRNA: n havaittiin olevan merkittävästi korkeampi kaikissa haimasyövän solulinjoissa kuin ei-tuumorigeenisen ihmisen haiman ductal soluja (HPDEC) (Fig. 1A). Variantit kohonnut ilmentyminen MUC1-c-proteiinin havaittiin kaikissa tuumorisolulinjoja verrattuna ei-tuumorigeenisiä HPDECs. Korrelaatio havaittiin välillä aggressiivisuus solulinjan ja ilmentyminen MUC1 haimasyövän (Fig. 1 B). Korkeampi ilmentymä MUC1 havaittiin enemmän invasiivisia ja metastaattinen solulinjoissa S2-013 ja S2-VP10 tai AsPC1 (peräisin askites) kuin saatujen solulinjojen primaarikasvainten (MiaPaca-2, BXPC3 ja Hs776T).

mRNA: n ekspression tasojen MUC1 useissa haimasyövän solulinjoissa suhteessa ei-tuumorigeenisiä HPDEC (A). Data ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SEM 3 riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05 (

t

testi) verrattuna kontrolleihin. Proteiinin ekspressiotasoja MUC1-c eri haimasyövän solulinjaa ja ei-tuumorigeeniset HPDEC (B).

esto MUC1 johtaa vähentyneeseen leviämisen ja solukuolema

Tutkia jos MUC1 oli olennainen proteiini ohjaamalla solujen selviytymistä haimasyövän, sen ilmentyminen estyi käyttämällä siRNA vastaan ​​MUC1 in MiaPaca-2 (Fig. 2A-C) ja AsPC1 (Fig. 2G-I) soluissa. Samanaikaisesti myös käyttää GO-201, peptidifragmentin, joka estää aktiivisuutta MUC1-c, mikä johtaa vapauttamiseen alavirran signalointia toiminnan ja käynnistää solukuoleman haimasyövän solulinjoissa MiaPaca-2 (Fig. 2D-F) ja AsPC1 ( Kuva. 2J-L). Sekä esto MUC1 ekspression siRNA (Fig. 2 A, G) sekä inhibition MUC1-c aktiivisuus GO-201 vähentänyt proliferaatio ja lisääntynyt solukuolema haiman syöpäsoluissa. MiaPaca-2-solut nähty vastata enemmän esto MUC1 joko siRNA tai GO-201 (Fig. 2A-F) verrattuna AsPC1 soluihin (kuvio. 2G-L). Kuten odotettua, GO-201, peptidi estäjän MUC1-C, ei muuttanut ilmentymistason proteiinin (Fig. 2D, J). Solukuolemaa nähtiin kaspaasivälitteinen (Kuva S1).

MUC1 ilmentyminen estyi siRNA MiaPaca-2 (A) kaistat 1-3 esittävät ohjaus MiaPaca-2, MiaPaca-2 transfektoitu ei- erityiset siRNA ja MUC1 siRNA vastaavasti. Sekä proliferaatio (B) ja elinkelpoisuuden (C) pelkistettiin vähentynyt ilmentyminen MUC1 in MiaPaca-2-soluissa. Käsittelemällä MUC1-C-aktiivisuuden inhibiittorina GO-201, joka estää signaloinnin tämän proteiinin, mitään muutosta ei havaittu ilmentymistaso MUC1 in MiaPaca-2-soluissa (D). Kaista 1 oli käsittelemätön MiaPaca-2-soluissa ja kaista 2 oli MiaPaca-2 käsitelty GO-201. Proliferation (E) ja elinkelpoisuuden (F) katsottiin liittyvän vähentynyt. Vastaavasti toisessa solulinjassa, AsPC-1, transfektiolla siRNA osoitti vähentynyt proteiini tasolla (G) jossa Kaista 1 on ohjata AsPC-1, kaista 2: ei-spesifisten siRNA transfektoiduissa AsPC-1 ja Lane 3 on MUC1 siRNA-transfektoiduissa AsPC1 . Sekä leviämisen (H) ja elinkelpoisuuden (I) väheni. Käsittelemällä estäjä GO-201, ei ollut mitään muutosta proteiinin tasot (J): Kaista 1 oli käsittelemätön AsPC-1-soluissa ja kaista 2 oli AsPC-1 käsitelty GO-201. Proliferation (K) ja elinkelpoisuuden (L) nähtiin vähennettävä. Data ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SEM 3 riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05 (

t

testi) verrattuna kontrolleihin.

MUC1 Associates kanssa HSP70 sytosoliin ja paikantuu lysosomeihin

lämpöshokkiproteiini 70 (HSP70) on erittäin yli-ilmennetään haimasyövän ja sen downregulation estäjät ja siRNA on nähty aiheuttavan haimasyövän solukuoleman [37]. Kuitenkin tarkka rooli HSP70 eloonjäännin haimasyöpäsoluissa on tuntematon. Samalla, MUC1 tiedetään yliekspressoituvan haimasyövän ja rooli solun eloonjäämistä useissa syöpäsolulinjoissa, mutta tarkka mekanismi on ollut vaikeasti [11], [43], [44]. Koska HSP70 on chaperone, sillä on kyky sitoutua ja eristää sytosolin MUC1-c siten kohdistamista sen eri soluorganellit, jossa MUC1-c voi säädellä erilaisia ​​anti-apoptoottisia reittejä suojata haimasyövän soluja apoptoottisen solukuoleman. On osoitettu aikaisemmin, että MUC1 sitoutuu HSP70 ja HSP90 ja on suunnattu mitokondrion ulkokalvon [33]. Onko MUC1-c liittyy HSP70 haiman syöpäsoluissa, me testattiin rasaostamalla MUC1 ja HSP70 haiman syöpäsoluja. MUC1-c ja HSP70 havaittiin yhteistyössä immuunisaostumassa, onfirming että HSP70 ja MUC1 todellakin vuorovaikutuksessa haimasyöpäsoluissa (Fig. 3A).

Immunosaostus MUC1 ja HSP70 osoitti kaksi proteiinia liittyvän (A) . Kaistat 1, 2 ja 3 osoittavat kokonaisproteiinin tasossa, HSP70 ja MUC1 että läpivirtaus ja kaksi proteiinit immunosaostettiin HSP70-vasta vastaavasti. Kaistat 4 ja 5 esittävät läpivirtaus ja immunopresipitaateista mukaan MUC1-vasta. MUC1-c todettiin lokalisoitu lysosomeista MiaPaca-2-soluissa, mutta lähes yhtä suuria määriä MUC1-c olivat myös sytosolin (B). Lamp2 asuva lysosomaalisen proteiinin, ja aktiini, pääasiassa sytosoliproteiiniin, käytettiin fraktioinnin markkereita. Kaista 1 on sytosolifraktion. Kaista 2 on karkea lysosomaalinen jae, joka on edelleen rikastunut Lane 3. HSP70, joskin liittyy MUC1, nähtiin olevan läsnä pääasiassa sytosoliin. Immunofluoresenssimenetelmällä vahvisti kolokalisaation MUC1-c ja Lamp2 lysosomeihin (C).

MUC1 on laajalti läsnä solun pinnalla haiman soluja. Kuitenkin 72 aminohapon C-terminaaliseen päähän proteiinia, tapahtuu automaattinen lohkominen ja paikantuu eri soluelinten vastauksena ero signaloinnin avulla. Voit tarkistaa MUC1-c todellakin kuljetettiin HSP70 solujen eri osastoihin, suoritimme immunofluoresenssilla organelle spesifisten yhdessä subsellulaarifraktiointikokeet seurasi immunoblottauksella anti-MUC1-vasta etsimään sen lokalisoinnin. Eheyden eri jakeiden ja puhtauden organellar valmisteiden vahvistettiin käyttämällä erilaisia ​​markkereita (Lamp2 varten lysosomeihin ja Actin varten sytosoliin). Vaikka HSP70 nähtiin yhteistyöhön saostua kanssa MUC1-c (Fig. 3A), se nähtiin lokalisoitu sytosoliin eikä lysosomeihin, kun taas MUC1-c havaittiin lokalisoitu sekä sytosoliin ja lysosomeihin (Fig. 3B). Lokalisaatio MUC1 lysosomeihin vahvistettiin edelleen yhteistyötä värjäämällä haimasyöpäsoluissa kanssa lysosomaalisen merkki Lamp2 (Fig. 3C). Immunofluoresenssikoe osoitti, että MUC1 ja Lamp2 kolokalisoituvat kanssa Pearson korrelaatio 0,75 (Fig. 3C). Tämä osoitti, että MUC1-c liittyvät HSP70 sytosoliin ja lokalisoitu lysosomeihin. Jotkut MUC1-c nähtiin myös paikallistaa mitokondrioissa, mikä vahvistaa aikaisemman tutkimuksen Ren et al, että MUC1-c on kohdistettu mitokondriot, jonka HSP70 [3] (kuvio S2).

esto MUC1- c tai HSP70 tulokset Lysosomaalinen läpäiseväksi Johtavat solukuolemaan

Lysosomaalinen läpäiseväksi usein ajatellaan ennen solukuolemaa ärsykkeen vapauttamalla useita hydrolyyttisen entsyymien sytosoliin, mikä vähentää pH sytosoliin ja aiheuttaen asidoosi [45]. Release lysosomaalisten entsyymien, kuten katepsiini B ja katepsiini D puolestaan ​​aiheuttaa mitokondrioiden Depolarisaatio tuloksena vapautumisen sytokromi C ja aktivointi apoptoottisten reittien [45]. Koska merkittävä osa MUC1 paikallistettiin lysosomeihin, etsimme vaikutusta lysosomaalisen läpäiseväksi mittaamalla menetys katepsiini B-Lamp2 kolokalisaation lysosomeihin inhiboitu MUC1. Olemme edelleen vahvistaneet tätä ilmiötä mittaamalla sytosolin aktiivisuutta katepsiini B soluissa jälkeen eston MUC1 siRNA. Meidän immunofluoresenssitutkimukset tulos oli selvästi tappiollinen yhteistyössä lokalisointi CathepsinB ja Lamp2 co-värjäytymisen MUC1-vaiennetaan soluja (Fig. 4A). Meidän biokemialliset tutkimukset osoittivat, että esto ilmentymisen MUC1 kasvoi soluliman katepsiini B aktiivisuus osoittaa, että lysosomaalisen kalvon eheys on vaarantunut (Fig. 4B). Lähes yhtä suuret sytosolin katepsiini B vaikutus havaittiin, kun HSP70 estyi käyttämällä siRNA (kuva S3). Tämä oli samankaltainen kuin aikaisempi tutkimus [37] meidän lab ilmoittaa, että downregulation HSP70 haimasyövän johti solukuoleman lysosomaalisen läpäiseväksi. Tämä osoitti, että esto joko HSP70 tai MUC1 johti lysosomaalisen läpäiseväksi. Sen määrittämiseksi, onko tämän läpäiseväksi liittyi suoraan solukuolemaan, käytimme solun läpäisevä katepsiini B: n estäjä (CA-074-Me) ja mitataan elinkelpoisuuden solujen läsnä ollessa MUC1-inhibiittorin (Fig. 5C). Vaikka solujen elävyys laski lähes 40% käsittelemättömien solujen läsnä ollessa GO-201 soluja käsiteltiin CA-074Me yhdessä GO-201 nähtiin toipua ja osoitti elinkelpoisuus lähes 98% käsittelemättömien solujen ( kuva 4C). Havaittiin, että solut, joita käsiteltiin vain GO-201 oli vähentynyt kasvun ja lisääntymisen jälkeen 3 päivää hoidon, kun taas ne, jotka oli käsitelty katepsiini B: n estäjä osoittivat lisääntymistä ja kasvua kaltaisia ​​valvontaa. Samanlaisia ​​palauttaminen elinkelpoisuuden MiaPaca-2-soluissa havaittiin myös, kun MUC1 ilmentyminen estyi siRNA (kuva S4). Tämä osoitti, että vaikutus GO-201 katepsiini B vapautus saattaisi olla päinvastainen käyttämällä katepsiini B: n estäjä (Fig. 4D). Tämä vahvistettiin myös biokemiallisesti, jossa MUC1 siRNA ja GO201 molemmat osoittivat lisääntynyttä sytosolin katepsiini B aktiivisuutta mutta hoidon CA-074Me osoitti käänteinen tätä toimintaa. Tämä osoitti, että MUC1 esto todellakin johti lysosomaalisiin läpäiseväksi, mikä puolestaan ​​laukaisi puhkeamista solukuolemareittejä näissä soluissa.

Inhibition MUC1 siRNA aiheutti lysosomaalisen läpäiseväksi, mikä ilmenee katepsiini B vapautumista sytosoliin ( A). Menetys rinnakkaispaikantumisen Katepsiini B ja Lamp2 in MUC1-vaiennetaan solujen havaittiin verrattuna hormonihoitoa hiljentäminen ohjaus. Biokemiallinen määritys katepsiini B aktiivisuuden sytosoliin oli kohonnut aktiivisuutta sekä MUC1 vaiennetaan soluja ja soluja käsiteltiin GO-201 (B). Solukuolemaa prosessi aiheuttama GO-201 pidätettiin käyttäen katepsiini B: n estäjä CA-O74Me (C). Data ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SEM 3 riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05 (

t

testi) verrattuna kontrolleihin.

Orthotopic hiirimallissa haimasyövän kanssa AsPC-1-solut osoittivat valtava haiman kasvain hoitamattomilla hiirillä (A), kun taas GO-201 oli hyvin vähän mitään kasvain niiden haimassa. Hidastanut kasvaimen paino (C) ja tilavuus (D) havaittiin käsittelyn jälkeen GO-201. * Edustaa p 0,05 verrattuna kontrolleihin. Edustavia kudososat hiiriä haiman kasvain (potilaalle tehdä malli AsPC1 solut) kontrolliryhmässä värjättiin Ki-67 osoitti laaja värjäystä osoittaa aktiivisesti lisääntyvissä kasvainsoluja (E), verrattuna vähemmän värjäytymistä GO-201 liukuu osoittaa tappiota leviämisen (F). Kokonaismäärä värjättyjen solujen Ki-67 laskettiin vähintään 10 kenttää sekä näytteiden ja keskimäärin lisääntyvien solujen kummassakin piirrettiin (G) *

P

0,05 (

t

testi) verrattuna kontrolleihin.

esto MUC1 Expression käytettäessä

in vivo

hiirimallissa haimasyövän Vähentää kasvaimen etenemistä

GO -201, peptidi-inhibiittorin raportoitu estävän aktiivisuuden MUC1-c, on testattu kasvaimen taantumiseen useissa syövän malleja, kuten eturauhassyövän, rintasyövän ja CML [46] – [48]. Kuitenkin sen tehoa ei ole testattu haimasyövän malleissa. Käytimme potilaalle tehdä haimasyövän hiirimallissa kanssa aggressiivinen solulinjan AsPC1 testata tehoa GO-201. Kaksikymmentä kateenkorvattomien nu /nu hiirille annettiin sisäistä haiman injektiot 2 x 10

5 solua. Käsittely intraperitoneaalisesti GO-201 (30 mg /kg) aloitettiin 10 satunnaistettiin hiirillä, alkaen päivänä 4 tuumorisoluinjektion jälkeen. Jäljellä olevat 10 hiirtä injisoitiin suolaliuosta. Koe lopetettiin päivänä 30 injektion jälkeen soluja. Hiiret lopetettiin ja tuumorimassa sekä ryhmissä arvioitiin. Päivänä 30 kaikki suolaliuoksella eläimillä oli kasvain (n = 10) (Fig. 5A), kun taas hoidetussa ryhmässä n = 10 hiirtä, vain 3 10 oli kasvaimia (kuvio. 5B). Kasvain paino hoitamattomassa ryhmässä vaihtelivat 0,6-1,6 g taas hoidetuissa ryhmissä oli kasvaimia painavat 0,1 g-0,3 g (Fig. 5C). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus hiiristä Suolaliuosryhmän oli 0,9 cm

3 taas käsitelty GO-201 oli keskimäärin kasvaimen 0,1 cm

3 (Kuva. 5D). Suolaliuosryhmän osoitti myös laaja metastaattinen leviäminen kasvaimia useisiin elimiin (taulukko 1). Kudokset päässä kasvainten värjättiin Ki-67 verrata leviämisen hinnat kahteen ryhmään. Käsittelemättömän ryhmän värjätään laajalti Ki-67, joka osoittaa aktiivisen lisääntyvien solujen (Kuva. 5E). Vertailun vuoksi GO-201 käsitellyt solut värjättiin hyvin heikosti, jossa Ki-67 (Fig. 5F). Tämä viittaa siihen, että toiminnallinen estäminen MUC1-c by GO-201 johti huomattavaan vähenemiseen kasvaintaakka hiirillä.

Keskustelu

Heat-isku (HSP) 70 proteiinit toimivat ATP -riippuvaisella chaperones jotka säätelevät laskostumista vastikään synteettisiä proteiineja, kokoonpano usean proteiinin kompleksit ja kuljetusta proteiinien poikki solukalvon [49]. HSP70 on usein yli-ilmentyy pahanlaatuisia kasvaimia, ja tämä yli-ilmentyminen liittyy huono hoitotulokseen useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien rinta- ja haimasyövän [50], [37], [40], [41]. HSP70 on merkittävä soluja suojaavat vaikutus ja estää apoptoottinen signalointi estämällä mitokondrion läpäiseväksi, vähentämällä kaspaasi aktivointia tai neutralisoimalla apoptoosin indusoivat tekijät [51]. HSP70 myös paikantuu lysosomaalisiin kalvoja [52], [53], ja se voi suojella lysosomaalisen kalvoja vastaan ​​LMP aiheuttamaa eri ärsykkeiden, kuten etoposidi, TNF-α ja oksidatiivisen stressin [54]. Olemme aiemmin osoittaneet, että HSP70 yliekspressoituu haimasyöpäsoluissa ja että sen downregulation joko siRNA

in vitro

tai käyttämällä estäjän

in vivo

indusoi kaspaasin aktivaatio ja solukuolemaa apoptoosin [ ,,,0],37], [42], [55]. Tämä viittaa siihen, että HSP70: n on tärkeää eloonjäämisen haimasyövän soluja. Monet todennäköisesti liittyvien mekanismien on ehdotettu pro-selviytymisen toiminto HSP70.

In vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että HSP70 voi häiritä suoraan apoptoosin-signalointi koneiden alavirtaan mitokondrioita estämällä apoptosome muodostumisen ja kaspaasin aktivaatio [56]. Uusimmat tutkimukset, solukuolemaa malleja ovat korostaneet, että HSP70 estoa kaspaasiriippuvaisen apoptoosia tapahtuu ylävirtaan mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi (MOMP) ja sytokromi c release [57], [58]. Aiemmat tutkimukset ryhmämme viittaavat myös siihen, että esto HSP70 ilmaisun eri estäjiä tai HSP70 siRNA johtaa kaspaasi aktivaation ja apoptoosin, mikä viittaa siihen, että HSP70 estää kaspaasiriippuvaisen apoptoosin haimasyöpäsoluissa vaikuttamalla soluliman kalsium varannot ja aiheuttaa lysosomaalisen läpäiseväksi. Kuitenkin, molekyylimekanismi tämä ilmiö on pysynyt vaikeasti [37].

MUC1-c on osoitettu olevan onkoproteiini vastaa muutosta ja tuumorigeenisyystesti useissa syöpäsolujen. MUC1-c: llä on suuri tiiviimpi rooli solusignalointi seuraavissa useita fosforylaatiotapahtumien. Useat raportit osoittavat myös kertymistä MUC1-c sytosolissa syöpäsoluja. On osoitettu aikaisemmin, että MUC1-c assosioituu lämpösokkiproteiinit ja on suunnattu mitokondrion ulkokalvon [33], [59]. Näin läheinen yhdistys HSP70 ja MUC1 esiintyy kasvainsoluissa.

Yrittäessään ymmärtää molekyylitason mekanismi solujen eloonjäämistä ja rooli HSP70 ja MUC1 haiman syöpäsoluissa, me tutkinut yhdistyksen HSP70 ja MUC1. Koska hallitseva funktio HSP70 tahansa solu on sen kaperonitoiminta, me arveltu, että HSP70 toimii kantajana MUC1-c erilaisiin solun osiin kuten lysosomeihin ja mitokondrioita, mikä johtaa suojan näissä osastoissa ja estää solukuolemaa. Nykyinen tutkimus osoitti, että HSP70 liittyi MUC1 ja että se yhteistyössä saostettiin MUC1-c (Fig. 3A). Se osoitti myös, että vaikka MUC1-C pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa, merkittävä määrä oli läsnä myös lysosomeihin ja mitokondrioiden (Fig. 3 B, C, kuvio S2). Inhibition of MUC1-c ilmentymisen siRNA tai inhibitio toimintaa käyttämällä peptidi-inhibiittori GO-201 johti vähentynyt proliferaatio ja elinkelpoisuus haimasyövän soluja (Fig. 2) ja indusoitiin kaspaasiaktiivisuus näissä soluissa, mikä viittaa aktivointi apoptoottisten reittien (Kuva S1). Tämä esto myös aiheutti lysosomaalisen permeabilisaation haimasyöpäsoluissa johtaa katepsiini B vapautumista ja korkea soluliman katepsiini B aktiivisuutta (Fig. 4B, C). Katepsiini B ilmentyminen transfektoiduissa soluissa ei-spesifisiä siRNA osoittaa selvä värjäytyminen lysosomaalisen osastoissa (kuvio 4 A). Tämä selvä värjäytymistyyppi nähdään diffusoitavan kun solut transfektoidaan MUC1 siRNA. Tämä johtuu vapautumista katepsiini B proteiinin sytosolisen osastossa analysoituna biokemiallisesti (kuvio 4B). Samanlaisia ​​lysosomaalisen läpäiseväksi havaittiin myös, kun HSP70 ilmentyminen estyi siRNA (kuva S3). Vaikutus inhibition MUC1 ekspression tai aktiivisuuden nähtiin päinvastaiseksi, kun soluja yhteistyössä inkuboitiin katepsiini B: n estäjä CA-074Me. Tämä osoitti, että vapautuminen katepsiini B lysosomeihin haimasyövän soluja johti käynnistämiseen solukuoleman polkuja. Aiemmat raportit ryhmämme osoittavat, että inhibitio HSP70 jota estäjä, joko triptolide tai quercetin, johti myös samanlainen lysosomaalisen läpäiseväksi ja apoptoottisen solukuoleman [37]. Samassa tutkimuksessa se oli myös havaita, että katepsiini B: n estäjä on pystyä kääntämään vaikutukset HSP70 inhibitio haimasyövän soluja, mikä osoittaa, että lysosomien läpäiseväksi on yksi aikaisempi vaiheet apoptoottista kuolemaa näissä soluissa.

Klassisen, lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi (LMP) on ajateltu olevan mukana solukuoleman mekanismeja, vaikka täsmällinen peräkkäinen tapahtumia LMP solukuolemaan ei ole kartoitettu. Riippuen tappava ärsyke, laajuus LMP määrä ja tyyppi katepsiinit vapautuu sytoplasmaan, sekä runsaasti katepsiini estäjien, LMP voi käynnistää erilaisia ​​syöttämällä liittyvän morfologioita vaihtelevat klassisesta apoptoosin kuolion. Siten LMP liittyy katepsiini translokaatio voi suoraan aktivoida kalpaiinien ja caspases, mutta LMP voi myös laukaista klassisen MOMP-kaspaasi-reitin sekä MOMP- ja kaspaasi-riippumaton apoptoosin. Jotka tappavat reittejä stimuloidaan LMP riippuu solutyypistä, kuolemattomiksi tila ja geneettisen taustan solujen.

Nykyisessä tutkimuksessa, ehdotamme mallia solun eloonjäämisen jossa HSP70 toimii kantajana MUC1-c liittämällä siihen fyysisesti ja kuljettaa sen lysosomeihin (ja mitokondrioita) haiman syöpäsoluja. Läsnäolo MUC1-c lysosomeihin estää LMP ja pitää lysosomeihin ehjä. Kuitenkin kun HSP70 tai MUC1 estetään joko siRNA tai peptidi estäjä MUC1 (joka estää aktiivisuus MUC1 ja siten sen yhdessä muun molekyylin), suojelu lysosomeihin katoaa, ja siellä on laaja LMP, joka johtaa vapautuminen Katepsiini B ja liipaisu solukuoleman. Olipa induktio LMP ja vapautumisen katepsiini B aktivoi ylimääräisiä apoptoottisia reittejä, joihin mitokondriot on tutkittava tarkemmin.

From kliininen näkökulma, tarkempi lähestymistapa hyödyntämisessä MUC1-c välittämiä solun eloonjääminen on kehittää terapeuttinen aineet, jotka ovat vuorovaikutuksessa suoraan MUC1-c ja estää sen toimintaa. MUC1-c muodostaa oligomeerit kautta CQC aminohappo motiivin sen sytoplasminen ja toiminta on välttämätöntä MUC1-C ydinvoiman liikenteen [60], [61]. Peptidi-inhibiittori GO-201, joka sisältää CQC aihe, on suunniteltu ja testattu joukko syöpäsolujen estää oligomerisaation MUC1 ja näin ollen estävät sen signaloinnin aktiivisuutta ja toimintaa [18], [46] – [48]. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme GO-201 koskevasta potilaalle tehdä haimasyövän hiirimallissa testata sen tehoa sillä haiman kasvain. Aggressiivinen haimasyövän solulinjaa AsPC1 käytettiin tuottamaan potilaalle tehdä haiman kasvaimia. GO-201 (30 mg /kg) injektoitiin intraperitoneaalisesti jokapäiväistä 26 päivää, ja kokeilivat päätettiin päivänä 30. inhibitio MUC1 toiminnon GO-201 nähtiin estää kasvaimen kasvua ja etenemistä hoitoryhmässä merkittävästi verrattuna käsittelemättömän ryhmän. Aikaisemmissa tutkimuksissa GO-201: n on osoitettu olevan erityisen MUC1 estäjä, joka ei vaikuta mihinkään muuta proteiinia kuin MUC1 [47]. Meidän aikaisemmissa tutkimuksissa olivat osoittaneet, että käyttämällä inhibiittorit HSP70, haiman kasvaimia voitaisiin taantunut

in vivo

[60]. Jatkona Näiden tutkimusten tämä tutkimus osoitti myös, että esto MUC1

in vivo

voisi vähentää tuumorikuorma hiirillä, mikä vahvistaa, että MUC1-HSP70 yhdistys on olennainen tekijä eloonjäämisen haiman syöpäsoluja. Edelleen esto tämä yhdistys estämällä joko HSP70 ilmaisun tai MUC1 toiminta voisi olla merkittävää terapeuttista arvoa haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki menettelyt