Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kvantifiointi kiertävien tuumorisolujen (CTC) on arvokas arvioitaviksi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Herkkyys nykyisten menetelmien rajoittaa niiden käyttöä havaita harvinaisia ​​CTC varhaisessa vaiheessa. Tässä arvioimme uutta menetelmää, ligandi-kohdistettua polymeraasiketjureaktio (LT-PCR), joka voi havaita harvinaisia ​​CTC NSCLC potilailla.

Methods

CTC rikastettiin immunomagneettisella ehtyminen leukosyyttien ja sitten leimattu konjugaatti kasvain-ligandi ja oligonukleotidi. Pesun jälkeen pois vapaa konjugaatit, sitoutuneet konjugaatit stripattu CTC ja sitten analysoitiin qPCR. Arvioida kliinisen hyödyn, verinäytteet saatiin 72 pienisoluista keuhkosyöpää (33 aluksi diagnosoidaan ja 39 kemoterapiaa), 20 hyvänlaatuinen potilaille, ja 24 terveen luovuttajan.

Tulokset

Kokeet terveitä blood spiked kasvaimen soluihin osoitti LT-PCR mahdollistaa havaitsemiseen CTC. Kliiniset Tutkimus osoitti, että alun perin diagnosoitu potilailla on keskimäärin 20,8 CTC yksiköiden metastaattinen sairauksia, 11.8 CTC yksiköihin paikallisia sairauksia, ja 6,0 CTC yksiköitä hyvänlaatuinen sairauksia. Kun kynnys 8,5 CTC yksiköitä, määritys voi havaita 80% vaiheen I /II, 67% vaiheen III, ja 93% vaiheessa IV syöpä. Kun hyvänlaatuinen potilaiden ja terveiden luovuttajien kuin kontrolliryhmässä, menetelmä voi havaita syövän herkkyydellä 81,8% ja spesifisyys 93,2%.

Johtopäätös

LT-PCR sallisi kvantifiointiin CTC NSCLC potilaiden herkempi tasolla, joka tarjoaa potentiaalia työkalu osituksesta pahanlaatuisia keuhkosairaudet, erityisesti varhaisessa vaiheessa.

Citation: Lou J, Ben S, Yang G, Liang X, Wang X, Ni S , et ai. (2013) kvantifiointi Harvinainen Kiertävä kasvainsolujen in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä by Ligandivälitteinen Kohdennettu PCR. PLoS ONE 8 (12): e80458. doi: 10,1371 /journal.pone.0080458

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 2. lokakuuta 2013. Julkaistu: 06 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Lou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Key Project Shanghai Science and Technology komission (Grand nro: 10411950600). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ilmoittavat, että Dr.Guohua Yang on työsuhteessa Genosaber Biotech. Samalla, hänellä vähäisiä optio ( 5%). Aikana tutkimuksen, tohtori Yang vain tarjoaa teknistä tukea meille valmiiksi kliinisen tutkimuksen. Tämä tekninen tuki sisältää tietojen analysointi ja tekninen kuvaus menetelmän käsikirjoituksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Kiertävä kasvainsolujen (CTC), joka tunnetaan nimellä ”nestemäinen koepala”, on helposti pääsy markkeri seurantaa syövän etenemiseen, hoitovaste ja pahanlaatuisen sairauksia. Varsinkin, CTC entistä tärkeämpää, kun kudosbiopsia- ei sovi tiettyjä potilasryhmässä. Kliinistä merkitystä CTC NSCLC on laajalti raportoitu viimeaikaisissa tutkimuksissa. Suuri määrä havaittujen CTC raportoitu liittää huonon ennusteen metastaattisessa keuhkosyövän [1] – [5]. Detection tiettyjen mRNA tai usean geenin CTC voidaan käyttää ennusteen tuloksista rajaamisvai- kirurgian ja sädehoidon pienisoluista keuhkosyöpää [6] – [10]. Viime aikoina molekulaarinen CTC NCSLC on osoitettu mahdollisesti ohjata hoitoa [1], [11].

edetä CTC havaitsemista seuraavalle tasolle, on syntynyt lupaavia teknologioita CTC rikastamiseen: 1) CTC positiivisesti, immunomagneettisesti vangiksi anti-EpCAM (epiteelisolujen adheesiomolekyyli) vasta päällystetyt magneettiset helmet [7], [12], 2) CTC rikastettiin immunomagneettinen ehtyminen leukosyyttien anti-CD45-vasta-aineen päällystetyt magneettiset helmet [5], [13]. 3) CTC rikastettiin kokoon perustuva suodatus laitteita [14], 4) CTC rikastettiin siru-pohjainen laite, jossa on signature mikrorakenne [15], ja 5) CTC rikastettiin samanaikainen ehtyminen punasolujen ja leukosyyttien avulla heysgradienttisentrifugoinnilla [16], [17]. Myöhempää, määrällinen analyysi CTC, rikastetun fraktion avulla edellä mainitut menetelmät oli immunofluorescently merkitty ja sitten tutkittiin mikroskoopilla tai virtaussytometrialla [12], [18] – [21]. Vaikka immunofluoresenssilla perustuvat menetelmät esillä korkea spesifisyys, herkkyys ei ehkä ole riittävä havaitsemaan harvinaisten solujen varhaisessa vaiheessa syöpä [4], [12], [22]. RT-PCR (RT-PCR) käytettiin myös CTC laskentaa suurella herkkyydellä [8], [23], [24]. Kuitenkin, post-transkription säätelyyn, että deregulates geenin ekspressio havaittiin lukuisista syöpäsoluja [25] – [27]. Tämä asetus muuttaa geeniekspression muutoksia mRNA vakauden ja /tai transkription tehokkuutta, ja tekee proteiinipitoisuus ei korreloi mRNA tasolla. LT-PCR kehittämä GenoSaber Biotech, osoitti lupauksen havaitsemaan CTC kautta pinnan proteiineja. Täällä aiomme arvioida valmiutta LT-PCR tutkimaan CTC NSCLC potilailla. Tässä menetelmässä, CTC oli leimattu konjugaatti kasvain-ligandi foolihappoa, selektiivisesti sitoutuneen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut yli-ilmentävät folaatin reseptoria [28] – [31], ja syntetisoidun oligonukleotidin (kuvio 1) . Konjugaatti toimii Jatkemolekyylin muuntaa CTC osaksi detektorimolekyylien ”oligonukleotidit”, joka voidaan monistaa kvantitatiivista analyysiä. Tämä tutkimus on ehdotettu arvioida kliinistä arvoa havaitsemiseksi folaatin reseptorin positiivinen CTC pienisoluista keuhkosyöpää.

Kun negatiivinen rikastamiseen immunomagneettisella ehtyminen leukosyyttien, CTC leimattiin konjugaatin kasvain-ligandi ja oligonukleotidi. Leimatut CTC pestiin perusteellisesti poistamiseksi ilmaiseksi konjugaatteja. Sitten sidottu konjugaatit stripattu CTC ja analysoitiin qPCR.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

CytoploRare® kiertävä keuhkosyöpäsolua kit tarjosi GenoSaber Biotech Co Ltd (Shanghai, Kiina). Kitti käsittää kaksi osaa: toinen on CTC rikastamiseen ja toinen on CTC havaitsemiseen ja kvantifiointiin. Rikastamista komponentti sisältää punasolujen lyysipuskuria, inkubointipuskuri, anti-CD45 valkosolujen ehtyminen magneettiset helmet, pesupuskuria merkintöjä puskuri, strippaus puskuri ja neutralointi puskuri. Toteamiseen ja määrän komponentti sisältää PCR-reaktiopuskuria, alukkeet, deionisoitua vettä, positiiviset ja negatiiviset solujen valvontaa, PCR valvontaa ja vaatimuksia. Alukesekvenssejä listattiin seuraava. RT-aluke, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTCTAA-3 ’; Forward-aluke, 5’-TATGATTATGAGGCATGA-3 ’; Reverse-aluke, 5’-GGTGTCGTGGAGTCG-3 ’; Taqman Probe, 5’-FAM-CAGTTGAGGGTTC-MGB-3 ’.

jälkeen valmistajan ohjekirjan, CTC rikastettiin lyysin punasolujen ja immunomagneettinen ehtyminen valkosolujen 3 ml verinäytteestä. Rikastetusta CTC oli leimattu konjugaatti kasvain-ligandi foolihappoa ja syntetisoitu oligonukleotidi. Sen jälkeen merkintöjä, rikastetusta CTC pestiin perusteellisesti poistamiseksi sitoutumattoman konjugaatteja. Sitten sidottu konjugaatteja spesifisesti erotetaan CTC pinta ja kerätään kvantitatiivinen PCR-analyysi (kuvio 1). Ennen vahvistusta, konjugaatin ensimmäinen hehkutettu ja jatkettiin RT pohjamaali. Sen jälkeen laajennettu konjugaatti monistettiin ja analysoitiin käyttäen Taqman koetinpohjaisista kvantitatiivinen PCR-menetelmällä. Edellä menetelmässä verenkierrossa olevia kasvainsoluja havaittiin folaatin reseptori-positiivisten solujen, kuten leimataan folaatti-sidottu oligonukleotideja.

solulinja

Käytimme ihmisen nenänielun syöpäsolulinjan KB, joka ilmentää folaatti reseptori 1 (FR) solun pinnalla, arvioida elpymisen suhteen piikki solumäärityksessä. KB-soluja viljeltiin folaatti-puutteellisia RPMI-1640-väliaineessa (Life Technologies), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Life Technologies) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Potilaat

Seitsemänkymmentä kaksi potilasta NSCLC, 20 on hyvänlaatuinen keuhkosairauksia, ja 24 sukupuoli- ja ikä-haun terveistä luovuttajista otettiin tutkimukseen. Vuonna pienisoluista keuhkosyöpää, 33 potilasta aluksi diagnosoitiin, ja 39 potilasta olivat kemoterapiaa. Syöpäpotilaan ominaisuudet ovat läsnä taulukossa 1. ominaisuudet Potilaan kohortin hyvänlaatuisia sairauksia ovat taulukossa S1 File S1. Kolme millilitraa ääreisverenkierron otettiin osaksi antikoagulantti putkiin, jotka sisälsivät EDTA-aineisiin osallistuvat tähän tutkimukseen. Kaikki potilaan ja terveillä vapaaehtoisilla mukana tässä tutkimuksessa allekirjoittama kirjallinen lupa ennen luovuttaa verta. Tutkimus hyväksyttiin sairaalan eettisen komitean Shanghai Rinta sairaala ja eettiselle toimikunnalle Affiliated sairaalan Nantong yliopistosta.

Näytteen valmistus

Valmistele verinäytteitä PCR-analyysiä, CTC oli rikastettu hajottamalla punasoluja, ja sen jälkeen ehtyminen leukosyyttien viitaten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, antikoagulantti koko verinäytteet ensin hajotettiin punasolujen lyysipuskuria (v:v, 01:04) 15 minuutin ajan jäissä. Solut käsiteltiin sitten 200 ul: anti-CD45 päällystettyjä magneettisia helmiä 30 min leukosyyttien. Sen jälkeen, CTC inkuboitiin 10 ui merkintöjä puskuria (folaatti-sidottu oligonukleotidi) 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestiin 3 kertaa 1 ml: lla pesupuskuria 500 g. Lopuksi soluja käsiteltiin 120 ui strippaus puskuri poistaa ligandi-oligonukleotidikonjugaattien. Supernatantti otettiin talteen sentrifugoimalla ja neutraloitiin 24 ul: neutralointi puskuria edelleen PCR-analyysiin.

PCR-analyysi

Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio suoritettiin käyttäen CytoploRare® kiertävän keuhkosyöpäsolua kit on ABI StepOne ™ -järjestelmä (Life Technologies). Kaksi ja puoli mikrolitraa valmis näytteet lisättiin 25 ui PCR-reaktio järjestelmä valmistajan ohjeiden ohjekirjan. PCR-reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: denaturointi 95 ° C: ssa 2 min, pariutuminen 40 ° C: ssa 30 s, pidennys 72 ° C: ssa 30 s, sitten jäähdyttämällä 8 ° C: ssa 5 min; 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 10 s, pariutuminen 35 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 10 s. Serial standardien sisältävien oligonukleotidien (10

-14-10

-9 M, mikä vastaa 2-2 x 10

5 CTC yksikköä /3 ml verta) käytetään CTC kvantifiointiin. Kaikki potilaan näytteet testattiin kaksoiskappaleet 6 standardien ja 3 laadunvalvontaa. Per valmistajan protokollan keskimääräinen määrityksen sisäinen varianssi (suurin ero kaksoiskappaleet) pitäisi olla 0,5 Kynnyssykli standardeja ja laadunvalvontaa, ja 1 Kynnyssykli tutkituista näytteistä.

Recovery, lineaarisuus ja määritysraja tutkimusten

Luodaan laillinen järjestelmä arvioi tarkkuutta ja lineaarisuus tämän määrityksen, verinäytteet terveiltä luovuttajilta yhdistettiin ja näyte otetaan 3 ml näytettä, joka terästettiin 5, 10, 20 , 40, ja 200 viljellyt KB-soluja. Unspiked, yhdistettiin veren toimi negatiivisena kontrollina (NC). Kaksisataatuhatta viljellyistä KB-solut toimivat positiivisena viite (PR). Edellä mainitut kokeet toistettiin 3 kertaa. Havaitut solujen määrä laskettiin seuraavan yhtälön mukaisesti: talteenotto-suhde määritettiin jakamalla määrän havaitun solun määrä, spiked soluja.

määrittämiseksi lineaarisuus määrityksen, olemme analysoineet havaittujen ja piikki CTC laskee kaikissa datapisteet lineaariregressiolla. Poistimme sekoittavat muuttuja prosentin elpyminen käyttämällä havaittu arvo alkuperäisen näytteen jaettuna laimennuskertoimet määrittää odotusarvot laimennussarja kunkin testattu näyte.

immunoväriäys rikastettua CTC

Kolme millilitraa verinäytettä kahden metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaat rikastettiin käyttäen edellä mainittuja protokollaa. Rikastettu CTC näytteet ja viljellyt KB solut kiinnitettiin metanolilla 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Sitten solut leimattiin pan-sytokeratiini monoklonaalinen vasta-aine on konjugoitu fykoerytriiniin (sc-8018PE, Santa Cruz, laimennettiin 1:100) ja fluoresoiva konjugaatteja foolihappoa [19] (Wuxi AppTec, Kiina, 10 nM) ja 1 tunnin. Tämän jälkeen näyte pestiin kolme kertaa PBS: llä, jota seurasi kiinnitys 4′-6-diamino-2-fenyyli (DAPI), jossa asennusainetta (Life technologies), ja tämän jälkeen alistettiin kuva-analyysin avulla konfokaalimikroskopialla (Leica, Saksa).

kliiniset arvioinnit

arvioimiseksi kliinisen hyödyn, olemme suorittaneet kaksoissokeassa, kaksi tutkimuskeskusta sairastavilla potilailla hyvän- ja pahanlaatuiset keuhkosairauksiin. Jotta voitaisiin arvioida niiden erot testi ryhmien käytimme opiskelijan t-testissä Welch n korjaus epätasainen varianssit 95%: n luottamusväli. Määrittää kynnys, spesifisyys ja herkkyys Menetelmän tietoja potilaista, joilla aluksi diagnosoitu NSCLC alistettiin vastaanotin toimii (ROC) analyysi Prism (GraphPad software). Kriteeri määrittää optimaalisen Kynnysarvoksi ROC analyysi on maksimoida kokonaisarvo spesifisyys ja herkkyys.

Tulokset

PCR kalibrointia ja CTC yksikkö

Koska ulkoisen Kalibrointikäyrä, kuusi standardit, jotka sisältävät järjestysnumero konsentraatioita konjugoituja oligonukleotideja käytettiin laskettaessa määrä folaatin reseptoreita CTC (kuvio S1). Ekstrapoloida määrä CTC siitä määrästä folaatin reseptoreita, käytämme mielivaltaisesti määritellyn yksikön nimi CTC yksikkö. Määritettynä kalibrointikäyrän määrä folaatin reseptorin numero 1 x 10

5 KB soluja on 7,5 × 10

-14 mol, joka on määritelty 1 x 10

5 CTC yksikköä. Havaittavissa valikoima kokeessa on 2-2 x 10

5 CTC yksikkö. Laadun valvonta, määrityksen sisäinen kerroin vaihtelevuus (CV) on välillä 2,6%: sta 3,8%, ja määritysten välinen CV on 3,3%: sta 5,3% (taulukko S2 File S1).

validointi ligandin kohdistetun PCR menetelmä CTC kvantifiointiin

KB solun lisäystasot tutkimus osoitti, että 80% piikki soluja voitiin ottaa talteen jokaisesta pitoisuudesta (5, 10, 20, 40 ja 200) (kuvio 2A ). Keskimääräinen CTC palautumisen suhde oli 81% 5 piikki solua 3 ml verta, ja jopa suurempia näytteissä piikkeinä suurempaa soluja. Kun tulokset lisäystasot tutkimuksessa olemme suorittaneet pienimmän neliösumman sovi vertailun havaittujen ja sekoitettu määrä kaikissa laimennussarja (kuvio 2B). Regressioyhtälö oli Y = 0,9455 × -0,831 R

2 = 0,9946. Tutkimus osoitti, että yli testattu CTC pitoisuus keskimäärin saanto kuten johdettu regressioanalyysi, on 94,6%.

A) talteenotto suhde piikki solun määrityksen. B) Lineaarinen regressio käyrä piikki solun määrityksen. C) Spesifisyys testi määrityksen. Spiked KB-soluja käsiteltiin (

kilpaili

) tai ilman (

ohjaus

) 10pM foolihappoa ennen merkintää. D) Terve luovuttajien verinäytteistä johon on lisätty 20 KB-solujen

(20 solua) B tai ilman KB kasvainsolujen

(kontrolli) B leimattiin 10 nM folaatti-oligonukleotidi konjugaatti

(konjugaatti ) B tai konjugoimattoman-oligonukleotidi

(oligonukleotidi) -iin kohottamisen jälkeen. Tiedot näytetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä määrityksissä.

arvioimiseksi määrityksen sisäinen varianssi (vajaan-run toistettavuus), analysoimme näytteen 100 KB-solujen 3 ml verta samassa run kolmena kappaleena jälkeen edellä protokollaa. Sitten arvioitiin määritysten välinen varianssi (välillä-run toistettavuus) analysoimalla samasta näytteestä kolmena kappaleena 6 erillisessä määrityksissä 6 eri päivinä. Sisäiset määrityksen CV on 11,2%, ja määritysten välinen CV on 14,2% (taulukko S3 File S1).

spesifisyyden määrittämiseksi tämän menetelmän teimme kilpailu tutkimus käyttäen 10 uM foolihappoa kilpailevan ligandin folaatti sidottu oligonukleotidi. Kokeen tulokset osoittivat, että 10 uM foolihappo voi estää konjugaatin sitoutuminen KB-soluja (kuvio 2C). Esto tarjoaa todisteen spesifisyyden folaatti sidottu oligonukleotidin kiinnittyneenä folaatin reseptoriin piikki KB-soluissa.

On huomattava, että on olemassa ”tausta” signaalit terveiden luovuttajien verinäytteistä. Tutkia alkuperä ”tausta” signaali, me merkitty terveen luovuttajan verinäytteistä johon on lisätty 20 KB solujen tai ilman KB kasvainsolut käyttämällä 10 nM folaatti-oligonukleotidi konjugaatin tai konjugoitumattoman -oligonucleotide (kuvio 2D). Verinäytteitä terästetty ilman kasvainsolujen sitoutua folaatti sidottu oligonukleotidi tai konjugoimattoman oligonukleotidien indiscriminatively, määritettynä qPCR. Sen sijaan näytteet, joihin on lisätty kasvainsoluja voidaan tietenkin leimata folaatti-konjugoidun oligonukleotidin sijasta konjugoimattoman oligonukleotidi. Tuloksena ehdotti, että ”tausta” signaaleja aiheuttama sitoutumisen oligonukleotidien jäljellä verisolujen rikastettu näytteissä. Vielä tärkeämpää on, ”tausta” signaali aiheuttama ”oligo-sitovaa vaikutusta” ei vaaranna havaitsemiseen harvinaisia ​​CTC kuten jäljempänä osoitetaan.

edelleen arvioimista spesifisyyden FR ilmentymisen CTC NSCLC, kolme millilitran verinäytteet kahdelta metastaattisen potilaista kuljettavat FR positiivinen CTC rikastettiin käyttäen edellä mainittuja protokollaa. Sitten rikastetun CTC näytteet ja viljellyt KB solut kiinnitettiin metanolilla, ja leimattu fluoresoivalla konjugaatteja foolihappoa, monoklonaalinen vasta-aine sytokeratiineja ja tumavärjäystä reagenssi, DAPI. Kuten kuviossa 3 on esitetty, KB-solujen ja verenkierrossa olevia kasvainsoluja oli erityisesti leimattu fluoresoivalla folaatti konjugaatteja (vihreä) ja sytokeratiineja vasta-ainetta (punainen). Sen sijaan pieni leukosyyttien ei voida leimata fluoresoivalla folaatin konjugaatteja ja sytokeratiini-vasta-ainetta (kuvio 3H ja 3L). Lisäksi mikroskoopilla havainto, CTC ja viljeltiin KB solut osoittivat samanlaisen ekspressiotason folaatti-reseptorin (kuvio 3).

KB-soluja (A-D), ja rikastettu CTC kahdesta metastaattinen pienisoluista keuhkosyöpää (CTC sample1 : E-H; CTC näyte 2: I-L) kiinteään metanolilla, ja värjättiin sytokeratiinia (A, E ja I) ja folaatti reseptori (FR) (B, F ja J). Solun tumassa leimattiin DAPI (C, G ja K). Sulautuneella kuvat osoittivat sytokeratiinia ja folaatin reseptoria ilmennetään ainoastaan ​​CTC (H ja L) ja KB-solut (D), eikä hematologinen soluissa.

CTC esiintyvyys kliinisissä näytteissä

kuten taulukosta 1, yhteensä 72 potilasta NSCLC otettiin tutkimukseen. Kuten kontrolliryhmää, saimme ääreisverenkierron 20, joilla on hyvänlaatuinen keuhkosairauksia ja 24 terveen luovuttajan.

Ensimmäinen vertasimme CTC tasot syöpäpotilailla alkudiagnoosin, hyvänlaatuinen tautia sairastavilla potilailla, ja terveillä koehenkilöillä. Kuten kuviossa 4A, CTC veren potilailta, joilla oli paikallinen (vaihe I, II ja III; keskiarvo 11,9 CTC yksikköä; alue 3,8-25,7 CTC yksikkö;

p

= 0,0011) tai metastaattinen (vaihe IV ; keskimääräinen 20,9 CTC yksikköä; alue 6,8-75,0 CTC yksikkö;

p

= 0,0055) sairauksia on huomattavasti suurempi kuin terveillä vapaaehtoisilla (keskiarvo 6,7; alue 3,0-11,4 CTC yksikkö) ja hyvänlaatuinen keuhkosairaus (potilaiden keski 6,0; vaihtelevat 1,6-8,7 CTC yksikkö). Metastaattista potilailla voi olla CTC kuin lokalisoitu potilaista (

p

= 0,045). Edellä esitetyt tulokset osoittivat, että paikallinen ja metastaattisen potilailla on eri tasoa CTC. Vuonna kehittyneempi analyysi, haluamme tutkia menetelmän herkkyyttä kohti eri histologisia alatyyppejä NSCLC. Sillä 16 adenokarsinooma potilaita, CTC tasot (keskiarvo 18,1, vaihteluväli 3,8-75,0) eivät osoita merkittävää eroa 11 levyepiteelisyöpä (SCC) (potilaiden keski 12,4, vaihteluväli 4,3-20,8) ja muut histologinen alatyyppi (keskiarvo 15,1, alue 10,1-25,7) (kuvio 4B). Tämä tulos viittaa siihen, ilmaus folaatin torilla saattaa olla samanlainen kaikissa histologisia alatyyppejä pienisoluista keuhkosyöpää.

A) CTC tasoilla lokalisoitu ja metastasoituneen pahanlaatuisen keuhkosairaus, hyvänlaatuinen keuhkosairaus ja terveillä luovuttajilla. B) jakauma CTC tasoilla eri histologisia alatyyppejä. ADC, adenokarsinooma; SCC, okasolusyöpä. C) Vastaanotin toimii (ROC) analyysi välillä pahanlaatuinen keuhkosairaus ryhmä ja hyvänlaatuinen sairaus ja terve ryhmä.

analysoimiseksi edelleen herkkyys ja spesifisyys eri patologisten vaiheisiin ja histologisia alatyyppejä NSCLC, meidän on ensin luotava raja-kynnyksen ROC analyysi. Kuva 4C osoitti, että raja-arvon mukaan välillä kontrolliryhmän (hyvänlaatuinen potilasta ja tervettä vapaaehtoista) ja alun perin diagnosoitu syöpä ryhmä oli 8,5 CTC yksikkö, herkkyys on 81,8%, ja spesifisyys on 93,2%. On selvää, CTC havaittiin verinäytteitä 82% (27 32) aluksi diagnosoitu NSCLC potilaiden, kun taas vääriä positiivisia 20 hyvänlaatuista tautia sairastavilla potilailla (5%, 1 20) ja 24 tervettä vapaaehtoista olivat vähäisiä (8%, 2 24 ). Kuten taulukosta 2, 80% (8 10) vaiheen I-II, 67% (6 9) vaiheen III, ja 93% (13 14) vaiheen IV potilaista todettiin yli 8,5 CTC yksikkö. Vuonna histologinen alatyyppi, 69% (11 16) adenokarsinooma potilasta oli CTC positiivisia, ja 91% (10 11) SCC potilasta oli CTC positiivisia.

Julkaistut tutkimukset osoittivat kemoterapia voi vaarantaa läsnäolo CTC kierrossa [1], [4], [5]. Suoritimme esiselvityksen verrata CTC numero pienisoluista keuhkosyöpää alkudiagnoosin ja kemoterapiaa. Kuten kuviossa 5, 16 lokalisoitu potilailla kemoterapiaa (keskiarvo 5,8, alue +0,7-11,5) ovat merkittävästi pienemmät CTC tasolle kuin alun perin diagnosoitu potilailla (

p

= 0,0006); kun taas ero CTC tasoilla Metastasoitunutta potilaalla ei hoitoa ei ollut niin merkittävä kuin lokalisoitu potilaita. Vaikka keskimääräinen CTC tasolla Metastasoitunutta potilailla alkudiagnoosin oli 20,9 CTC yksikköä verrattuna 13,5 CTC yksikkö potilailla kemoterapiaa, t-testi ei varmista, että ero oli merkitsevä

p

arvo 0,05 . Tilastollinen analyysi ehdotti, että paikallinen NSCLC potilaat voivat olla parempi ennuste verrattuna metastaattisen potilaille, kun laittaa kemoterapiaa.

w /o kemoterapia

aluksi diagnosoitu NSCLC potilaat;

kanssa kemoterapia

, pienisoluista keuhkosyöpää kemoterapiaa.

Keskustelu

Olemme arvioineet LT-PCR-tekniikkaa kvantifioivien CTC perifeerisissä verinäytteissä NSCLC potilaiden. Tekniikka perustuu negatiivinen ehtyminen valkosoluja seuraa merkintöjä CTC folaatin sidottu oligonukleotidi ja myöhemmät kvantifiointi kanssa qPCR. Tutkimukset terveillä verinäytteiden piikkeinä kasvainsolujen osoittavat, että määritys on spesifinen, kvantitatiivinen ja lineaarinen useista 5-200 solua kohden 3 ml verta analysoitiin. Arvioida potilaan veren näytteiden osoittaa, että menetelmä on riittävän herkkä osittaa potilaille, joilla on eri taudin tilasta (hyvänlaatuinen, paikallista ja metastaattisen).

Mahdolliset edut LT-PCR onkologit voivat sisältää 1) ei-invasiivisia arviointi kasvaimen taakan ääreisverenkierrossa, 2) ultraherkät analyysi, joka mahdollistaa kehittyneiden kerrostuneisuus keuhkosairaudet, 3) niinkin alhainen kuin 3 ml näytteenotto tilavuus, joka ei pahentaa potilaan aiheuttamaa anemiaa sytotoksisten sivuvaikutusten, 4) reaaliaikainen pitkittäinen seuranta tautitilanne ja hoitovaste, ja 5) standardoitu ympäristö, joka poistaa keinotekoisen analyysi bias.

Useimmat

in vitro

diagnostisten verikokeiden NSCLC syövän kärsivät mahdollisia vääriä negatiivisia ja /tai positiivisia tuloksia. Käyttää anti-EpCAM päällystetyt magneettiset helmet yritettiin rikastamiseksi CTC NSCLC verinäytteistä. Kuitenkin kliiniset tutkimukset osoittivat, että alhainen herkkyys EpCAM perustuu rikastus CTC tunnistus pienisoluista keuhkosyöpää [12], [22]. Julkaistut tutkimukset osoittivat myös, että ei-EpCAM ilmentävää solua voi käsittää enemmistön CTC in NSCLC ääreisverenkierrossa, ja siten EpCAM perustuu rikastamiseen voi epäonnistua havaita harvinaisia ​​CTC [22]. Havaitsimme folaatin reseptorin ilmentymistä EpCAM positiiviset ja negatiiviset CTC NSCLC potilailla. Anti-EpCAM päällystetyt magneettiset helmet käytettiin erottamaan EpCAM-positiivisia ja EpCAM-negatiivinen osa CTC. Löysimme FR positiivinen CTC määrä oli huomattavasti suurempi EpCAM-negatiivinen osa kuin EpCAM positiivisten fraktio kaikissa kolmessa pienisoluista keuhkosyöpää (kuva S2). Tulokset osoittivat, että EpCAM perustuu syömällä voi jäädä suuri osa CTC keuhkosyövässä. Karsinoembryonisen antigeeni (CEA), glykoproteiini mukana keuhkosyöpä kehitys, löytyy myös normaali tai hyvänlaatuinen sairaisiin soluihin luovutettu liikkeeseen [32]. Sovellettavuus CYFRA21-1, joka on sytokeratiinia 19 fragmentteja vapautuu vereen, on tutkittu tutkimuksissa diagnoosin NSCLC [33] – [35]. Vaikka CYFRA21-1 voi olla herkin tuumorimarkkeri kehittyneissä NSCLC, herkkyys CYFRA21-1 on edelleen alhainen alkuvaiheen tauti [33], [35].

Julkaistu tietoja kudosbiopsia ovat osoittaneet 72% -83% keuhkosyöpä yli-ilmentävät FR solun pinnalla [28] – [31]. Viimeaikaiset raportit osoittivat FR positiivinen CTC löytyivät munasarjasyöpiä [19]. Tähän mennessä ei ole raportoitu, että esiintyvyys FR positiivinen CTC NSCLC. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet kliinistä arvoa folaatin reseptorin positiivinen CTC NSCLC. Tulokset osoittivat FR on potentiaalinen pintamerkkiaine tunnistamisessa CTC NSCLC potilaiden, vaikka varhaisessa vaiheessa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että ensisijainen syöpäkasvain, FR ilme on paljon pienempi SCC kuin adenokarsinooma metastaattinen [29]. Kuitenkin löysimme FR ilmaisua CTC on samanlainen kaikissa histologisia alatyyppejä. Tämä ristiriitainen havainto voidaan selittää eri jakelu patologisten vaiheita yksittäisten histologinen alatyyppi. Iwakiri

et al.

Raportoitu, että pienempi ilmaus folaatin reseptorin todettiin pitkälle edennyt verrattuna alkuvaiheessa NSCLC [36]. Vuonna osallistuneista potilaista tutkimuksessamme, 48% on adenokarsinoomat (vaihe IV, 44%), 33%: lla on okasolusyöpää (vaihe IV, 27%) ja 18% on määrittelemätön keuhkosyöpä. Alempi FR positiivisuuden adenokarsinooman tutkimuksessamme voidaan selittää korkean prosenttiosuuden myöhäisessä vaiheessa olevaan potilaaseen verrattuna SCC ryhmään. Kuten hyvin, on olemassa toinen mahdollisuus, että CTC voi ilmaista FR eroaa primaarikasvaimen massoja. Edellinen kirjallisuus osoitti ero geenien ilmentymisen välillä primaarikasvaimen ja CTC näytteen [37]. Laajamittainen, hyvin suunniteltu kliininen tutkimus olisi tarpeen käsitellä edellä huolenaihe.

Vaikka folaatin reseptori on tunnistettu normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien munuainen, perna ja keuhkojen jne [28]. On kuitenkin olemassa mitään soluja, jotka ilmentävät folaatin reseptoreita verenkierron paitsi CTC tai aktivoidut monosyytit [19], [38]. Alustavat tutkimukset osoittivat, että tämän alaryhmän aktivoitujen monosyyttien on tuskin havaittavissa verinäytteissä terveiltä luovuttajilta tai hyvänlaatuinen potilaille [19], [39]. 9%: ssa tapauksista, joissa ”CTC” voidaan havaita terveillä näytteissä, saattaa olla mahdollista laittoman ilmentymisen monosyyteissä. Mutta hypoteesi on tarkistettava joka jatkotutkimuksia. Folaatti reseptorin ilmentymisen löytyy myös kasvaimen aktivoitu makrofageissa [40]. Jotta tutkia makrofagien vaikutus tässä havaitsemisjärjestelmä pienisoluista keuhkosyöpää, anti-CD14 päällystetyt magneettiset helmet käytettiin heikentävistä aktivoitu makrofagit verinäytteestä NSCLC potilaiden [41], kun ehtyminen CD45-positiivisten valkosoluja. Löysimme CTC lukemat olivat tuskin muuttaa ”extra-CD14” hoito NSCLC potilailla (kuva S3). Tämä tulos viittaa siihen, ehtyminen mekanismi käyttäen anti-CD45 magneettiset helmet on riittävä poistamaan vaikutusta kasvaimeen liittyvien makrofagien CTC laskee.

Tässä tutkimuksessa, löysimme alhainen tausta ”CTC” tason terveillä henkilöillä ja hyvänlaatuinen tautia sairastavilla potilailla. Kuten on osoitettu spesifisyydestä tutkimuksen taustalla signaali voi aiheuttaa sitoutumisen oligonukleotidin jäljellä verisoluja. Vaikka edellinen kirjallisuus kuvattu useita mekanismeja sitovan oligonukleotidin nisäkässoluille [42], ei ole yksimielisyyttä tälle biologisen prosessin. Nämä tutkimukset kaikki osoittivat, että sitova määrä oligonukleotidi on huomattavasti alhaisempi kuin meidän konjugaatteja. Olemme vakuuttuneita siitä, että ”tausta CTC” ei häiritse havaitsemista todellinen ”CTC” keuhkosyöpäpotilaiden.

Lisäksi koska korkeampi CTC määrä ilmoitettiin yhdistää huonon ennusteen metastasoituneen syövissä [ ,,,0],2], [4], [43], LT-PCR olisi mahdollisesti tunnistaa potilaiden alaryhmässä huonon ennusteen varhaisessa vaiheessa taudin ja siksi tuen onkologit määrätä tehokkaampia hoitomuotoja. Vuonna kehittyneempi analyysi, fenotyyppi CTC tarjoaisi suoraa näyttöä varten onkologit määrittää optimaalisen hoito-ohjelman. Sopivilla affiniteettiligandina (esim vasta-aine, peptidi, pieni kemiallisia molekyylejä, jne.), LT-PCR voidaan tutkia edelleen fenotyypitykseen harvinainen CTC on multiplex, suuren läpimenon muoti.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kalibrointikäyrä on qPCR ja lineality parametrit.

doi: 10,1371 /journal.pone.0080458.s001

(TIF) B Kuva S2.

Folaatti reseptorin ilmentymistä EpCAM positiiviset ja negatiiviset CTC NSCLC potilailla. CTC näytteet rikastettiin 3 ml verta kolmesta FR positiivisia pienisoluista keuhkosyöpää hajottamalla punasolujen ja immunomagneettinen ehtyminen valkosoluja. Sitten rikastettu CTC näytteitä inkuboitiin anti-EpCAM magneettiset helmet (Life Technologies, Cat No. 16203) 30 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun immu- eristäminen 10 minuutin ajan, EpCAM positiiviset solut vangiksi magneettisia helmiä. EpCAM-negatiiviset solut kerättiin supernatantista sentrifugoimalla 600 g: ssä 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen kaksi fraktiota CTC näytettä leimattiin ja havaitaan edellä mainitun protokollan. Tiedot näytetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä qPCR määrityksissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0080458.s002

(TIF) B Kuva S3.

vaikutus kasvaimeen liittyvien makrofagien FR positiivinen pienisoluista keuhkosyöpää. CTC näytteet rikastettiin 3 ml verta kolmesta FR positiivisten pienisoluista keuhkosyöpää hajottamalla punasolujen ja immunomagneettinen ehtyminen CD45-positiivisten valkosoluja.