Krooninen sairaus

tiivistelmä

Context

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooman (ACC) on harvinainen kasvain tyyppi on huono viiden vuoden pysyvyys ja rajallinen hoito vaihtoehtoja.

tavoite

ymmärtäminen molekyylitason patogeneesin tämä tauti on auttanut genomista analyysit korostamalla muutoksia TP53, WNT, ja IGF signalointireitteihin. Edelleen selvittäminen on tarpeen paljastaa terapeuttisesti käytännöllisiä tavoitteita ACC.

Suunnittelu

Tässä tutkimuksessa maailmanlaajuinen DNA metylaatiotasoilla arvioitiin jonka Infinium HumanMethylation450 BeadChip Array 18. ACC kasvaimia ja 6 normaalia lisämunuaisen kudoksista . Uusi, epälineaarinen korrelaatio lähestymistapaa,

diskretoin menetelmä

, arvioi suhde DNA metylaatio /geenien ilmentymisen poikki ACC kasvaimia.

Tulokset

Tämä korrelaatio analyysi paljasti epigeneettiset sääntelyn geenien tiedetään moduloida TP53, WNT, ja IGF signalointi sekä hiljentäminen tuumorisuppressorin MARCKS, aiemmin ilmoittamatta ACC.

Johtopäätökset

DNA: n metylaatio voi säädellä geenien tiedetään pelata rooli ACC synnyssä sekä tunnettuja tuumorisuppressoreilla.

Citation: Legendren CR, Demeure MJ, Whitsett TG, Gooden GC, Bussey KJ, Jung S, et al. (2016) Pathway seuraukset Aberrant Global metylaatio Lisämunuaisen kuorikerroksen Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0150629. doi: 10,1371 /journal.pone.0150629

Editor: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, FRANCE

vastaanotettu: toukokuu 28, 2015; Hyväksytty: 17 helmikuu 2016; Julkaistu: 10 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Legendre et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Ilmaus tiedot käsitellään tässä julkaisussa on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO sarjan hakunumerolla GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776). Metylointi tiedot käsitellään tässä julkaisussa on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 ).

Rahoitus: Tekijät haluavat tunnustaa antaman tuen ATAC Research Fund ja Kirsten Legacy Fund. Tutkimus raportoitu tässä julkaisussa tukivat antelias hyväntekeväisyys panos Mr. Ray Thurston. Rahoitustukea saatiin myös Virginia G. Piper Charitable Trust (TGW ja BS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooman (ACC) ovat harvinaisia ​​kasvaimet, jotka muodostavat jopa 0,2% syöpäkuolemista. Arvioitu taudin esiintyvyyden on 0,7-2,0 tapausta miljoonaa henkeä vuodessa [1, 2]. Tämä tauti yleensä iskee aikuisten niiden 40-50s, mutta voi myös nähdä lapsilla, tyypillisesti kanssa tuumoriproteiinia p53 (

TP53

) ituradan mutaatio [3]. Ainoa parantava hoito on kirurginen poisto lokalisoitu kasvain; monet potilaat ovat etäpesäkkeitä aikaan diagnoosin, mikä edelleen rajoittaa niiden terapeuttisia vaihtoehtoja [4, 5]. Eräässä tutkimuksessa tarkastellaan lähes 4000 tapausta ACC vuosien 1985 ja 2005 Bilimoria

et al

. raportoitu 26,5% esittelyyn solmukohtien etäpesäkkeitä ja 11,3% esittelyyn kaukainen etäpesäke, joka johtaa viiden vuoden pysyvyys 11,5% verrattuna 55,1% ilman kaukainen etäpesäke [4]. Vastausprosentti on yleisesti hyväksytty ensilinjan kemoterapiaa, johon kuului etoposidin, doxibucin, sisplatiinin ja mitotaani on vain 23% [6], tehdään selväksi, että on olemassa kiireellinen tarve uusille hoidoille.

Perimän analyysit ovat selvittämiseen molekyylitason patogeneesi ACC ja altistaa potentiaalisia terapeuttisten kohteiden. Useimmat hyvin tutkittu ja johdonmukaisesti havaittu genomista poikkeavuuksia liity

TP53

tuumorisuppressorigeeniä, insuliinin kaltainen kasvutekijä tyypin 2 (

IGF2

) signalointia ja Wingless-Type MMTV Integration Site Family (

WNT

) kautta. Useat tutkimukset ovat selvästi vahvistettu rooli poikkeavalle TP53 toimintoa, vaikka raportoitu mutaatio korko

TP53

satunnaista aikuisten ACC on vain noin 16-27% [7-9]. Yliekspressio

IGF2

nähdään vähintään 95% ACC kasvainnäytteestä tutkittu [10], jossa kehotetaan kliiniset kokeet, jotka käyttävät insuliini-kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1 R) estäjät [11]. WNT polku signalointi on myös poikkeava, on aktivoivia somaattisten mutaatioiden β-kateniinin geeni nähdään yhtä usein noin 30% sekä hyvän- että pahanlaatuisia lisämunuaiskuoren kasvaimet [12]. Vaikka genomista analyysit ovat paljastaneet reitin häiriöiden ACC, kliinisen toiminnan tavoitteet ovat pysyneet vaikeasti, mikä johtaa yksi päätellä, että on olemassa tarve syvempää ymmärrystä ACC kasvaimen kehittymisen.

tutkinta epigeneettiset muutokset ACC keräämään kiinnostusta. Global metylaatio analyysit ovat osoittaneet, että erilaiset metylaation olemassa erottaa ACC päässä hyvänlaatuiset kasvaimet ja /tai normaalin lisämunuaisen kudoksessa [13, 14]. Rechache

et al

. ovat osoittaneet, että metastaattinen ACC kasvaimia ilmeni selvä metylaatiokuvion verrattuna normaaliin lisämunuaisen ja ensisijainen ACC kasvaimia, pahanlaatuista näytteet osoittivat, maailmanlaajuinen hypometylaatio [14]. Barreau

et al

. tunnistettu CpG saari methylator fenotyyppi (CIMP) ACC liittyy huono elossaololuku [15]. Nämä globaali metylaatio analyysissä todettiin hypermetylaatiota tuumorisuppressoreilla kuten sykliiniriippuvaisen kinaasiestäjän 2A (

CDKN2A

), Poistetut Lung ja ruokatorven syöpä 1 (

DLEC1

), tai

N- myc

Loppupään säätelemät Gene perheenjäsen 2 (

NDRG2

) mekanismina lyhennetyllä mRNA: n ilmentymisen havaittiin ACC kasvaimissa verrattuna adenoomia tai normaaliin lisämunuaisen kudosta. Äskettäin integroitu genomin kartoitus tunnistettu kaksi erillistä molekyylien alaryhmiä ACC: C1A ja C1B [7]. C1A alaryhmä korreloivat huono potilaan ennustetta, tihentynyt kuljettaja geneettisiä mutaatioita, erillinen mRNA ja miRNA klustereita, ja oli selvää yhteyttä CIMP. Siten metylointi analyysit ovat tunnistaneet alaryhmiä ACC kasvainten ero ennusteen ja ehdotti molekyylitason muutoksia, jotka saattavat edistää ACC synnyssä; vaikka, koko laajuutta geenien ja reitit moduloidaan metylaation ACC on tuntematon.

Tässä työssä olemme pyrkineet yhdistämään DNA metylaatiomuutokset ilme profiileja joukko ACC (n = 18 [17 kasvaimet , 1 maksa etäpesäke ACC_150]) ja normaalin lisämunuaisen (n = 6) näytteet, jotta voidaan paremmin ymmärtää, miten metylaatio voi johtaa poikkeavaan geenin ja polku ilmentyminen havaittiin ACC. Tutkimuksemme käyttää epälineaarinen korrelaatio lähestymistapaa kutsutaan

diskretoin menetelmä

[16] arvioida DNA metylaatio /geenien ilmentymisen suhteita polkuja, ja paljastaa mahdollisia epigeneettiset sääntelyn liittyvien geenien TP53, WNT, IGF2, ja tuumorisuppressorigeeniä signalointia ja /tai vakautta. Vaikka muut tutkimukset ovat raportoitu DNA: n metylaation muutoksia ACC aiemmin, meidän tutkimus on selvä tavalla, jolla kuvaamme DNA: n metylaatio /geenien ilmentymisen yhdistysten tunnistaa epigeneettiseltä säänneltyä reittejä tunnetun tärkeää ACC.

Materiaalit ja menetelmät

kliiniset näytteet

kliinistä näytettä käytetään tässä analyysissä edustavat osajoukkoa näytteitä aiemmin kuvattu [8]. Lyhyesti, joukko ACC flash jäädytetty kasvaimia ja normaali lisämunuaisten kerättiin Mayo Clinic (Rochester, Minnesota), University Hospital Essen (Essen, Saksa), University of Calgary (Alberta, Kanada), ja Scottsdale Healthcare (Scottsdale , Arizona), sekä lahjoitti suoraan potilaiden kautta avohoitoon asetukset; kaikki näytteet saatiin sopivissa eettiset menettelyjä ja Kirjallinen potilaan suostumus kulloisellakin toimielimissä. Normaali lisämunuaisten kerättiin leikkauksen aikana toisen merkinnän, tyypillisesti kasvaimen kirurgisen poiston munuaisen. Lisämunuaisen otettiin yhtenä kokonaisuutena, ja aivokuori oli macrodissected päässä ydin kuin paras mahdollinen. Tutkimus materiaaleja tätä tutkimusta varten saatiin pöytäkirjojen mukaisesti hyväksymien Länsi Institutional Review Board (WIRB # 20051769). Diagnoosi ACC vahvistettiin tarkastelu patologian raportin, ja useimmissa tapauksissa, jonka uusiutuminen histopatologisen dioja kokeneen hormonitoimintaa patologi.

geeniekspressioprofilointi

mRNA ilmaisun ja tilastolliset analyysi ACC ja normaaleissa kudoksissa on aiemmin kuvattu [8]. Lyhyesti, RNA uutettiin 100 mg: n näytteet ACC kasvaimia ja normaalissa lisämunuaisen kudos, vahvistetaan ja käänteiskopioitua käyttämällä MessageAmp II Biotiini Enhanced Kit (Ambion Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Biotiinileimatuilla cRNA syntetisoitiin niiden vakioprotokolla, jota seurasi puhdistus kautta edellyttäen cRNA -suodatinpatruunoita. Merkityt cRNA oli hajanaista ja hybridisoitiin Affymetrix U133 Plus 2 ihmisen genomin paneelit seuraavan standardin Affymetrix protokolla (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Skannaus ja pesu valmistui Fluidic asemat FS450 ja GeneChip-

® Scanner 3000 Workstation.

Array laadun ACC ja normaaleissa näytteissä arvioitiin käyttäen Affy QCReport paketin Bioconductor ja R tilastokieltä ; kaikki taulukot läpäissyt laadunvalvontaa mittareita. Kaikki seuraavat tiedot normalisointi ja tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä GenePattern (Broad Institute, www.broadinstitute.org) [17]. Expression array data normalisoitiin gcRMA kanssa kvantiiliesti- normalisoituminen sekä tausta vähennyslasku jälkeen käyttämällä Expression File Luoja [18]. Sitten aineisto pyöristetään alaspäin arvoon 5,5 käyttäen Preprocess Dataset, ja suodatetaan 1) koettimien, joissa on enemmän kuin 35 floored arvot ja /tai 2) koettimia, joissa kaikki arvot erästä oli pyöristetään alaspäin, kun taas arvoja muista erää ei. Edelleen erän vaikutukset minimoitiin käyttämällä torjumiseksi muuttujien vaihtoehto [19]. Ilmaisu tiedot käsitellään tässä julkaisussa on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776 ).

DNA metylointianalyysi

Global DNA: n metylaatio arvioitiin käyttämällä Infinium

® HumanMethylation450

® BeadChip Array. (Illumina, San Diego, CA). Lyhyesti, 1 ug kutakin DNA-näytettä tehtiin bisulfiittikonversion käyttämällä EZ DNA Metylointi Kit (Zymo Research, Irvine, CA) valmistajan suosituksesta Illumina Infinium Assay. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta hybridisoidaan sitten paneelit mukaan valmistajan protokollaa. Käytimme GenomeStudio V2011.1 (Illumina) metylaation tietojen kokoaminen ja hankinta. Metylaatiotasoilla kunkin CpG jäännös esitetään ß-arvot, arvioimalla suhde metyloitua signaalin intensiteetin yli summa metyloitu ja metyloitumaton intensiteetit kussakin lokuksessa. Keskimääräinen ß arvo raportoi metylaation signaalin välillä 0 1 edustaa täysin metyloitumattomat täysin metyloitu arvot, vastaavasti. Metylointi Aineisto esikäsitellään R käyttäen Illumina metylaatio Analyzer (IMA) paketti [20]. Tietojen esikäsittely mukana taustakorjausta, koetin skaalaus tasapainottamiseksi Infinium I ja II antureista, kvantiili normalisoituminen sekä logit muutosta. Logit muutos muuntaa muuten heteroscedastic beeta-arvot (joita rajoittaa 0 ja 1) M arvot seuraaviin Gaussin. Lisäksi havaitseminen p-arvot 0,05 25% näytteistä, koettimista X ja Y-kromosomia, ja anturit sijaitsevat 10 emäsparia oletettujen SNP poistettiin. Differential metyloituvuutta on logit-muunnosarvolohko suoritettiin vertaamaan 18 ACC kasvaimia 6 normaalin lisämunuaisen näytettä IMA. Wilcox rank -testi tehtiin ACC ja normaalin näytteitä ja p-arvot korjataan laskemalla vääriä löytö korko, jonka Benjamini-Hochberg menetelmällä. Koettimien säätää

p-arvot

0,05, ja delta β arvot ≥0.2 tai ≤-0.2 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja differentiaalisesti metyloitu. Metylointi tiedot käsitellään tässä julkaisussa on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 ).

korrelointi DNA metylointi Gene Expression jonka diskretointi Method

käytimme äskettäin raportoitu epälineaarinen

diskretisointitaso menetelmä

luokittelemalla näytteitä eri ryhmiin perustuu anturi metylaatio tasot tunnistaa DNA: n metylaatio /ilmentymisen korrelaatio [16]. Geenien ilmentyminen tietoja oli käytettävissä 14 18 näytteistä analysoidaan metylaatiomuutokset. Kunkin metylaatio koetin, 14 ACC näytteet jaettiin

hypermetyloitunut

(M) tai

hypometyloidut

(U) ryhmät asteen perusteella metylaation poikkeavat keskimääräisestä metylaatiotasoilla 6 normaalia lisämunuaisen näytteet. Näytteet, joissa metylaatiotasoilla

μ

(keskimääräinen metylaatio taso normaali näytettä) luokiteltiin

M

ryhmä ja näytteiden kanssa metylaatiotasoilla

μ

luokiteltiin U annetulle CpG lokuksen kuulustelee koetin. Jokainen anturi Metylointilaitteistoon array geeniekspressiovektoria luotain Affymetrix U133 Plus 2 ihmisen perimän array analysoitiin. Differential geenien ilmentymisen analyysi, jossa verrataan näytteitä, jotka luokiteltiin M ja U, suoritettiin

t

-testi olematta yhtä suuri varianssi (Matlab-ohjelmisto, www.mathworks.com). Jos geeni oli ilmennetty eri (FDR-korjattu

p-arvo

0,05) välillä näytteet M ja U ryhmiä, CpG metylaatio katsottiin korreloi ilmaus tästä geenistä. Negatiivinen korrelaatio määriteltiin suuntaavuus muutoksen ilmaisun ja metylaation vastakkaisiin suuntiin (esim hypermetylaation ja menetys ilmaisun, tai päinvastoin). Positiivinen korrelaatio tapahtui, kun suuntaavuus muutos oli sama välistä metylaatio ja ilmaisun (esim hypermetylaation ja positiivinen ilme, tai hypometylaatio ja vähentää ilme).

Validoida havaintomme raportoidaan S2 taulukossa käytimme RNAseq ja metylointi data 78 ACC näytteistä syntyvät TCGA. Taso 3 RNAseq data (TPM-arvot) ja metylaation beeta-arvot ladataan TCGA Data Portal (https://tcga-data.nci.nih.gov). RNAseq tietoja log2 transformoitiin: log2 (TPM + 1), ennen tarkempaa analyysiä. Tason 3 TCGA metylaatio, jotkin arvot mitattiin kuten ”NA” ja ne arvot poistettiin aikana ero analyysi. Myös ei sisälly näitä metylaatio antureilla 2 näytettä joko hypo- tai hyper- ryhmä analyysissä. Validointi analyysi suoritettiin testaamalla jos sama metylaation koettimet raportoitu S2 taulukossa oli myös korrelaatio geenin ilmentymisen TCGA ACC aineisto, käytettäessä diskretointi menetelmällä. Nykyisessä käsikirjoitus, olemme muuttaneet diskretointi kuvattiin ensimmäisenä Jung

et al

. [16] vastaamaan pieni määrä näytteitä. Tässä muokatulla menetelmällä, me diskretoidaan näytteitä perusteella, onko näyte oli hypo- tai hypermetyloitunut verrattuna ei-neoplastisia lisämunuaisen kudosta. Tämän, delta-beeta-arvon kunkin koettimen laskettiin kullekin kasvaimen metylaatio tiedot, kun verrataan keskiarvo metylaation tietoja ei-neoplastisen lisämunuaisen kudosta. Tässä binary diskretisointitaso, kasvain näyte katsottiin hypometyloidut tai hypermetyloitunut kun sen delta-beeta-arvo oli negatiivinen tai positiivinen, vastaavasti, verrattuna normaaliin kudokseen. Koska oli riittävät näytteet TCGA aineisto, myös suoritetaan diskreetillä alkuperäisin menetelmällä (kutsutaan tässä kolmen komponentin diskreetillä) Jung

et al

. [16]. Kun näytteet jaettiin U ja M ryhmiä joko binaarinen tai kolmen komponentin diskreetillä ilmaisu arvot geenien kanssa vastaavan metylaation koettimet testattiin erilainen ekspressio käyttäen Welchin t-testillä.

Pathway Analyysi

geeni lista etua ladataan IPA (Ingenuity

® Systems, Redwood City, CA) ja Core analyysi työnkulun ajettiin oletusparametrit. Core Analysis siinä arvioidaan merkittävästi muuttunut kulkuväylillä molekyyli verkkoja, ja biologisia prosesseja edustettuina näytteissä ”geeni lista.

Tulokset

Global metylaatiovyöhykkeiden ACC versus Normaali lisämunuaisen

arvioimiseksi maailmanlaajuinen DNA metylaatiovyöhykkeiden ACC kasvaimissa, käytimme 450K-metylaatio alustan vertailla 18 ACC kasvaimista 6 normaalin lisämunuaisen näytteitä. Kaiken kaikkiaan analyysi paljasti 1291 erilaisesti metyloitua CpG loci (DML) kattaa 629 ainutlaatuinen geenejä (S1 taulukko). Beta arvoja käytetään tuottaa rasiakuvaajien edustamaan yleistä metylaatiotasoilla poikki enimmäiskuolleisuusrajaa ACC ja normaali. Mediaani metylaatio oli hieman pienempi ACC (β = 0,51) kuin normaalissa lisämunuaisen (β = 0,67) (kuvio 1A), mikä osoittaa hypometylaatio ACC (p-arvo 0,0001). Yksittäiset näyte rasiakuvaajien DML osoitti tasaisempi jakautuminen metylaation arvojen normaalissa lisämunuaisen näytteissä verrattuna ACC joka näkyy eriasteista metylaation näytteiden välillä (kuvio 1 B). Kaikista DML, 475 oli hypermetyloitunut ja 816 olivat hypometyloidut. Seuraavaksi tutkittiin jakelu DML koko kromosomeja, piirtämällä jakelu hypo- ja hyper-DML normalisoinnin jälkeen kromosomiin pituus (taulukko 1). Analyysin mukaan kromosomeja 5, 7, 12, ja 19 oli eniten hypometyloidut loci ja kromosomien 11, 17, ja 19 oli eniten hypermetyloitunut loci, jossa kromosomien 7, 12, ja 19, joilla on eniten yleistä DML.

) rasiakuvaaja osoittavat alhaisemmat mediaani β arvo metylaatiotasoilla for 1291 erilaisesti metyloituja antureista. B) Rasiakuvaajat osoittaa β arvot 1291 erilaisesti metyloitua loci kunkin näytteen (6 normaali ja 18 ACC näytettä).

Seuraavaksi tarkastelimme alue- ja toiminnallinen CpG jakelu DML ACC . Funktionaalinen jakelu liittyy CpG asennosta: transkription aloituspaikkoja (TSS -200–1500 bp), 5 tulkitsemattoman alue (UTR), eksonin 1 koodaukseen geenejä, ja geeni elimissä. Kaiken kaikkiaan suurin osa antureista ( 50%) sijaitsivat geenien elimissä, minkä jälkeen ~ 15% antureista sijaitsee 1500 emäsparia ylävirtaan TSS, hyvin samankaltainen jaottelu liiallisen ja liian DML (kuvio 2A).

A) Piirakkakuviot osoittaa taajuuden, jolla hyper- tai hypometyloidut lokuksen jaetaan niiden toiminnallisten asentoon, mukaan lukien etäisyys transkription aloituskohdasta (TSS). B) Taajuus DML voidaan sijaitsee CpG-saarekkeiden, rantojen, hyllyt, tai avomerelle. Seudun yhteydessä on osoitus läheisyys CpG-saarekkeen.

aluejakauma DML arvioitiin perustuen niiden läheisyydestä lähinnä CpG-saarekkeen. Lisäksi saaret, rannat ovat 0-2 kb CpG-saarekkeiden, hyllyt ovat 2-4 kb pois, ja avomerellä alueet eristetään loci ilman nimitys. Verrattaessa ACC näytteet normaaliin näytteet tunnistimme valtaosa DML (55,7%) oli avomerellä, jota seurasi saaret (21%), rantojen (15,8%), ja hyllyt (7,5%). Lisäksi toteamme, että suurin osa hypermetyloitunut loci (50,3%) sijaitsi CpG-saarekkeiden verrattuna useimpien hypometyloidut loci on sijaitsee avomerellä (77%) (kuvio 2B). Sen sijaan kaikkien hypometyloidut loci, pienin prosentuaalinen (3,92%) todettiin saarilla ja pienin prosenttiosuus hypermetyloitunut antureista (4,42%) löytyi hyllyiltä.

Seuraava suoritetaan ilman valvontaa klustereiden analyysi (euklidinen etäisyys , Complete hierarkkinen klusterointi menetelmät) DML ja osoittivat selvä erottaminen normaalien ja ACC näytteitä todisteet geeniryppäät jotka ovat suosivasti hyper tai hypometyloidut ACC (kuva 3). Niistä geenit eniten hypermetyloitunut ACC olivat

EPHX3

ja

MEIS

geenejä, 20% ja 9,2% mahdollisista Geenikoettimia vaikuttanut (kuvio 4). Edustavia geenien hypometyloidut klusterit ovat

ADCY2

ja

TMEM132D

geenejä, joka vaikutti 16,2% ja 18,5% koettimia (Kuva 4).

Clustering analyysi paljasti erottaminen ACC ja normaali näytteitä. Näytteet ovat vaaka-akselilla: normaali näytteet esitetään keltaisella baari ja ACC näytteet näytetään sininen palkki.

EPHX3

ja

MEIS

geenit merkittävästi hypermetyloitunut ACC verrattuna

TMEM132D

ja

ADCY2

jotka ovat merkittävästi hypometyloidut.

tunnistaminen Metylaatiospesifinen Expression korrelaatiot käyttäminen Diskretointi Method

erillisessä analyysissä tutkimme metylointi-ilmentymisen korrelaatioita käyttäen epälineaarista lähestymistapaa: nimitystä

diskretointi menetelmä

. Tämä menetelmä perustuu siihen, että syövän näytteet voidaan luokitella kahteen ryhmään sen mukaan, mikä on niiden suhteellinen metylaatiotasoilla kunkin koettimen metylaatio array, jolloin suurempi määrä korrelaatioiden voidaan havaita kuin vertailut käyttäen lineaarista menetelmiä. Näytteet joko pidettiin

hypermetyloitunut

(M) tai

hypometyloidut

(U) verrattuna viittaus (keskiarvo metylaatiotasoilla normaaleista näytteistä tässä tutkimuksessa) ja tilastollisesti merkitsevä geeniekspression eroja näytteiden

M

ja

U

ryhmät Ehdottaisin metylointi-ilme korrelaatio tietyssä lokuksessa. Soveltamalla tätä binary diskretisointitaso menetelmää, tunnistimme 763 ainutlaatuinen CpG loci (550 ainutlaatuinen geenejä) metylaatiospesifisiin-ilme korrelaatioita. Keskimäärin oli 9 näytettä

M

ryhmä ja 5 näytteet

U

ryhmä. Oli 319 lokusten positiivinen korrelaatioita ja 444 lokusten negatiivisia korrelaatioita. Kaikki CpG metylaatio /ilmentymisen korrelaatiot tältä löytö kohortin esitetään S2 taulukossa.

Jotta vahvistaa havainnot nykyisen tutkimuksen riippumattoman kohortin näytteitä, me ladattu RNA-seq ekspressiotietojen ja vastaavat DNA: n metylaatio tietoja TCGA portaali 78 ACC näytteitä. Tämä otoskoko paitsi antanut meille mahdollisuuden testata korrelaatioita käyttämällä modifioitua binary diskretisointitaso menetelmä, mutta myös mahdollisuuden hyödyntää kolmen komponentin menetelmällä samoin. Johtuen poissa /puuttuvia tietoja TCGA asetettu, 468 koettimet olivat käytettävissä binary testaukseen koordinoitu ilme. Lisäksi jotkut antureista ollut riittävästi kokoluokkien (M ja U), mikä jättää 433 koettimia kolmen komponentin ryhmittelyä pois 763 ainutlaatuista antureista raportoitu S2 taulukossa. Binary ryhmittely, 164/468 (35%) antureista (S3 taulukko) osoitti merkittävää korrelaatiota (p-arvo 0,05) kanssa vastaavan geenin ilmentymisen arvoja ja kolmen komponentin ryhmittely 154/433 (35,6%) antureista (S4 taulukko) osoitti merkittävää korrelaatiota (p-arvo 0,05).

Muutokset TP53 ja WNT signalointireitteihin

jotta voitaisiin tunnistaa biologisia käsitteitä rikastunut S2 taulukossa, me molemmat silmämääräisesti luettelon tunnistaa ilmeinen kuvioita ja esitimme geeni luettelon Core Analysis työnkulun IPA (Ingenuity

® Systems). Merkittäviä havaintoja lajiteltiin perustuu p-arvot tunnistamaan kaikkein erottava luokat edustavat epigeneettiseltä geenien ACC. Lyhyesti Yhteenvetona merkittävimmät sairaudet ja häiriöt liittyvät geenit S2 taulukossa oli Cancer kanssa 471 geenien välillä listalta (S5 taulukko). 5 Top Molecular and Cellular toiminnot olivat Cellular ja kasvua Solumorfologia, Cellular Assembly ja organisaatio, Cellular Function ja ylläpito ja solukuoleman ja Survival (S6 taulukko).

Käyttämällä diskretointi menetelmää, tunnistimme määrä geenejä metylaatiospesifisiin-ilme korrelaatioita tiedetään osallistuvan syövän, tai erityisesti ACC synnyssä. Kaikki geenit osoitamme alla rikastuneet nerokkuus Pathway Analyysi johonkin edellä mainittuun luokkaan. Heidän polku yhdistys ja ovatko ne validoitu huomautetaan kullekin taulukoissa. Joukossa tämä lista vastaaviin geenit sääntelevät TP53 reitin, esimerkiksi:

SETD7

,

DYRK2

,

CCDC8

,

UBE2D1

,

RBM5

,

NDRG1

ja

DUSP7

(taulukko 2, kuviot 5 ja 6, S2-S4 taulukot). Kussakin esimerkissä, näytteet, joilla on alhainen metylaatio oli tilastollisesti merkitsevästi korkeammat tasot geenin ilmentymisen ja näytteitä, joilla on korkea metylaatio oli pienempi geeni-ilmentymisen.

DUSP7

,

NDRG1

,

SETD7

, ja

UBE2D1

havaittiin olevan alle ilmaistu itsenäinen datajoukon verrataan ACC mRNA ilmaisun normaaliksi lisämunuaisen, jossa alle ilmaisu samaa mieltä havaittujen hypermetylaation /ali-ilmentyminen korrelaatio [21].

kunkin geenin, ylempi heatmap edustaa log2 metylaation arvot 14 ACC näytteiden kukin normalisoitu keskiarvo 6 normaali lisämunuaisen näytteitä. Log2 metylaatio suhteet 0 edustaa hypermetylaation ja 0 edustaa hypometylaatio. Alempi lämpö kartta osoittaa ilmentymisen z transformoitujen ekspressiotasot, jossa arvo 0 tarkoittaa, ei ilmentymistä muutosta verrattuna keskimäärin ilmentymistason 14 ACC näytteitä. Kolme geeniä negatiiviset korrelaatiot valittiin visualisointi:

CCDC8

(TP53 reitti),

TBX3

(WNT reitti), ja

PAX8

(muiden tunnettujen syövän geeni, mukana invaasio ja muuttoliike). Näytteitä korkeamman metylointi (persikka-viininpunainen) oli pienempi lauseke (vihreä). Näytteitä pienemmillä metylaatio (sininen) oli korkeampi lauseke (punainen). Vain korreloi metylaatio loci ja ilmaisun koettimet on esitetty, ja näytteet järjestävät niiden diskretointi luokittelu M tai U kutakin geeniä.

Kunkin geenin, ylempi lämpökartassa edustaa log2 metylointi arvot ( beeta) 78 TCGA ACC näytteitä kunkin normalisoitu keskiarvo 6 TGen normaalin lisämunuaisen näytteitä. Log2 metylaatio suhteet 0 (punainen) edustaa hypermetylaation ja 0 (sininen) edustavat hypometylaatio. Alempi heatmap osoittaa geenin ilmentymistä vastaava TCGA ACC näytteitä, log2 (TPM + 1). Sama kolme geeniä käytetään TGen ACC tutkimuksessa (discovery) käytettiin visualisointi:

CCDC8

(TP53-reitti),

TBX3

(WNT reitti), ja

PAX8

( muita tunnettuja syöpää geeni, mukana invaasio ja muuttoliike). Näytteitä korkeamman metylaatio (punainen) oli pienempi lauseke (vihreä). Näytteitä pienemmillä metylaatio (sininen) oli korkeampi lauseke (punainen). Vain korreloi metylaatio loci ja ilmaisun koettimet on esitetty, ja näytteet järjestävät samankaltaisuus metylaatiovyöhykkeiden näytteiden välillä kullekin geenille. Kuten on esitetty, kaikki kolme geeniä osoittavat samaa negatiivista korrelaatiota metylaatiostatuksen ja geeniekspressiota TGen ACC näytteitä.

Havaitsimme myös metylaatio /ilmentymisen korrelaatiot 4 WNT signalointi liittyviä geenejä; tämä on toinen polku tiedetään liittyvän kanssa ACC tumorigeneesin (taulukko 3, S2-S4 taulukot). Näytteitä näyttämällä suurempi metyloinnin

PRDM5

ja

DKK3

, jotka molemmat ovat antagonisteja WNT signalointi, mukana oli menetys mRNA ilmaisun ja päinvastoin. Kääntäen,

TBX3

(a WNT kohdegeenin) oli hypometyloidut ja yli-ilmentyy; nämä korrelaatiot havaittiin sekä alkuperäisessä TCGA aineistot (kuviot 5 ja 6).

WNT3

(WNT ligandi) oli metyloitu ja ali-ilmentynyt 11 näytteiden ja metyloitumaton ja yli-ilmentynyt 3 näytettä. Menetys

DKK3

-mRNA validoitu riippumaton, julkisesti saatavilla joukko vertaamalla ACC normaaliin lisämunuaisen kudokseen [21].

Muut syöpään liittyvien Gene muutostyöt

transkriptiotekijä

PAX8

, joiden voidaan osoittaa olevan hypermetyloitunut muita kasvaimia, pitkälti osoitettu negatiivinen korrelaatio geenien ilmentymisen, jossa hypermetylaation korreloi alentunut ilmentyminen (taulukko 4, kuvioissa 5 ja 6, S2-S4 taulukot ). Negatiivinen metylaatio /ilmaisun korrelaatioita löydettiin myös

HDAC4

(a chromatin modifioija),

ErbB3

(tunnettu onkogeeni) sekä

MARCKS

ja

CXCR4

; geenien tiedetään aiheuttavan kasvainsolun invaasiota ja terapeuttinen vastustusta muissa elimissä (taulukko 4, S2-S4 taulukot). Rooli IGF2 ja IGF merkinannossa onkogeenisessä kuljettaja ACC on myös hyvin kuvattu. Tuloksemme osoittavat merkittävää metylaation /ilmentymisen korrelaatio

IGF2

geeni. Yksi koetin (cg04057455) sijaitsee geenin kehon korreloi positiivisesti kahden geenin ilmentymisen antureista (S2 taulukko). Toinen anturi (cg08986368) sijaitsevat CpG-saarekkeen korreloivat negatiivisesti yhden geenin ilmentymisen anturi. Lopputuloksena nostettiin ilmaus näytteissä on CpG-saarekkeen hypometylaatio tai geenien elin hypermetylaation, joka on sopusoinnussa odotetut vaikutukset metylaation geenien ilmentymisen.

Keskustelu

tarkoitus nykyinen tutkimus oli analysoida globaalin DNA metylaatiovyöhykkeiden ACC kasvaimissa verrattuna normaaleihin lisämunuaisen kudosten ja korreloida DNA metylaatiomuutokset kanssa mRNA ilme. Tutkimuksemme osoitti maailmanlaajuista hypometylaatio ACC verrattuna normaaliin lisämunuaisen kudokseen. Global genomista hypometylaatio on havaittu useiden eri syöpäsolutyyppien [22, 23], mukaan lukien pahanlaatuiset lisämunuaiskasvain verrattuna hyvänlaatuinen tai normaali lisämunuaisen kudoksessa [14]. Yhdenmukaisia ​​aiempien globaali metyloinnin analyysejä, kuten ACC, hypometylaatio oli yleisintä ”avomerellä”, pois CpG-saarekkeiden ja hypermetylaation tapahtumia esiintyi yleisimmin CpG-saarekkeiden [15].

Tunnistaa merkittäviä korrelaatioita metylaatio ja geenien ilmentymisen ACC, joka on diskreetti menetelmää käytettiin. Tämä epälineaarinen tapa tunnistaa korrelaatioita on herkempi kuin lineaarinen menetelmiä, koska se perustuu osajoukkoja näytteitä, joilla vastapäätä metylaatio suuntauksia [16]. Tällä menetelmällä tunnistimme 550 geenejä, joilla on merkittäviä kielteisiä tai positiivinen korrelaatio metylaation ja geeniekspression. Geenit tunnistetaan käyttämällä tätä menetelmää sotkea väyliä tiedetään levoton ACC kuten TP53, WNT, ja IGF2 signalointi. Lisäksi klassista tuumorisuppressorin, muut syöpään liittyviä, ja uusia geenejä ei ole aiemmin liitetty ACC tunnistettiin myös.

TP53

tuumorisuppressorigeeni on mutatoitu yli 50% kaikista kasvaimista. Geneettisten muutosten

TP53

, mukaan lukien mutaatiot (16%) [7] ja epigeneettiset hiljentäminen (harvoin) [24], esiintyy alhaisempi ACC kasvaimia. Viimeaikaiset työ ACC osoitti merkittävää ero ilmentymistä liittyvien geenien TP53 kanoninen signalointi [8].