Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ohjelmoitu kuolema ligandia 1 (PD-L1) on todettu liittyvän tekijän huonon ennusteen erilaisia ​​syöpiä, ja ilmoitettiin olevan lähinnä aiheuttama by PTEN menetys glioomis-. Kuitenkin kliininen vaikutus PD-L1 ja sen sääntelyä PTEN ei ole vielä määritetty peräsuolen syöpä (CRC). Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tarkistanut sääntely PTEN PD-L1 ja edelleen määritti PTEN on korrelaatio PD-L1-proteiinin ekspression ja kliinisten parametrien CRC.

Menetelmät /Tulokset

RNA-interferenssi lähestymistapaa käytettiin alas-säädellä PTEN ilmaisun SW480, SW620 ja HCT116-soluissa. Se osoitti, että PD-L1-proteiinia, mutta ei mRNA: n, on merkittävästi lisääntynyt transfektoiduissa soluissa siRNA PTEN verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Lisäksi kapasiteetti PTEN säädellä PD-L1-ekspressiota ei ilmeisesti vaikuttanut IFN-γ, tärkein indusoija PD-L1. Tissue mikrosirujen immunohistokemia käytettiin tunnistamaan PD-L1 ja PTEN vuonna 404 CRC potilaan näytteitä. Yliekspressio PD-L1 korreloi merkitsevästi etäpesäkkeiden (P 0,001), TNM (P 0,01), metastasointiin (P 0,01) ja PTEN-ilmentyminen (P 0,001). Univariate analyysi paljasti, että potilaalla on korkea PD-L1-proteiinin ekspression oli huono kokonaiselinaikaa (P 0,001). Kuitenkin monimuuttujamenetelmin ei tue PD-L1 itsenäisenä ennustetekijä (P = 0,548). Univariate (P 0,001) ja monimuuttuja eloonjäämisen (P 0,001) analyysi 310 sijaitsee CRC potilailla ilmeni, että korkean tason PD-L1-ilmentyminen oli yhteydessä lisääntyneeseen riskejä metastasointiin. Lisäksi kliininen vaikutus PD-L1 on CRC ei ollut tilastollisesti merkitsevä alaryhmässä 39 potilaalla, joilla ei ole PTEN ilme (etäinen etäpesäke: P = 0,102; TNM: P = 0,634, eloonjäämiseen: P = 0,482).

Johtopäätökset

PD-L1 voidaan käyttää tunnistamaan CRC potilaille, joilla on suuri riski etäpesäke ja huonon ennusteen. Tämä kliiniset oireet voidaan osittain liittyvän PTEN ilme.

Citation: Song M, Chen D, Lu B, Wang C, Zhang J, Huang L, et al. (2013) PTEN menetys Lisäykset PD-L1 Protein Expression and Vaikuttaa Korrelaatio PD-L1 Expression ja kliiniset parametrit peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (6): e65821. doi: 10,1371 /journal.pone.0065821

Editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 joulukuu 2012; Hyväksytty: 28 huhtikuu 2013; Julkaistu: 13 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Sun Yat-sen yliopiston ”100 Talents ohjelma”; Guangdong Innovative Research Team Program (2009010058); Science and Information Technology Bureau of Guangzhou, Guangdong (2011J5200009); Guangdongin maakunnan Department of Science and Technology (2012B050500004); ja ”985 Project” Sun Yat-sen yliopiston ja Guangdongin Translational Medicine Public Platform (4202037). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpäkuolemista länsimaissa. Maailmanlaajuisesti se on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi eniten diagnosoitu syöpä naisilla [1]. Mikä pahempaa on, että kuolleisuus CRC kasvaa monissa maissa metastasoitunut kolorektaalisyöpä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) on ensisijainen kuolinsyy useimmilla potilailla. Alkuvaiheen CRC potilaalla oli viiden vuoden eloonjääminen on enintään 90%, mutta määrä voi laskea 60% määrästä potilaita, joilla imusolmuke osallistumista, ja jopa 10%: iin, kun etäpesäkkeet ovat läsnä [2]. Kuitenkin on vaikea havaita metastasoitunutta kolorektaalisyöpää varhaisessa vaiheessa vain perustuu oireisiin, mikä johtaa monimutkaiseen hoitoon päätöksentekoon, usein myös aggressiivinen hoito tai hoidon vapaapäiviä. Biomarkkereiden jotka voivat tunnistaa potilaat, joilla on korkea riski etäpesäke ja huonon ennusteen voisi olla laaja kliinisiin sovelluksiin. Tutkimukset, jotka etsivät tällaisia ​​biomarkkereiden ovat runsaat. PD-L1 on yksi tärkeimmistä aiheista biomarkkereiden tutkimuksen.

PD-L1 (joka tunnetaan myös nimellä CD274, B7-H1), joka on yksi ligandien ohjelmoidun solukuoleman 1 (PD-1), on immuuni-inhiboiva reseptori kuuluvat CD28 /sytotoksisten T lymfosyyttiantigeenitoiminnon 4 (CTLA-4) perhe. Se voi tuottaa estävä signaalin PD-1 /B7-1 ilmentävät T-solut, mikä johtaa immuunijärjestelmän vajaatoiminta [3], [4]. PD-L1-proteiini on usein ilmentyy aktivoitujen T-solujen, B-solujen, NK-solujen, DC, makrofagit ja luuytimestä peräisin syöttösoluista [5]. PD-L1-ilmentyminen löytyy myös monenlaisia ​​ihmisen kasvaimista. Lisäksi tutkimukset, jotka liittyvät PD-L1-proteiinin ekspression sairauden lopputulos on tehty useimmissa kasvaimia, ja tulokset osoittavat, että PD-L1-proteiinin ekspression vahvasti korreloi epäedullinen ennusteeseen munuaisten [6], munasarjasyöpä [7], virtsarakon [8], rintojen [9], maksan [10], mahan [11], ja haimasyövän [12], mutta ei ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [13]. Tärkeintä on, nämä tutkimukset osoittavat, että korkeampi ilmentyminen PD-L1 voi helpottaa etenemistä kasvaimen vaiheen ja lisäävät hyökkäys potentiaalia. Kuitenkin CRC, kliininen vaikutus PD-L1 ja sen sääntely mekanismi ei ole vielä määritelty.

PD-L1 ilmentyminen voidaan indusoida monien tulehduksellisten välittäjäaineiden ja sytokiinien, josta interferoni-γ (IFN- γ) on voimakkain. On osoitettu, että sekä tyypin I ja tyypin II IFN upregulate PD-L1-proteiinin ekspression useimmissa syöpäsolulinjoissa. Harvat tutkimukset keskittyvät säätelevän roolin PD-L1 kasvaimissa. Lisäksi nämä tutkimukset tuotti erilaisia ​​tuloksia. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että menetys tuumorisuppressorin PTEN (fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa kymmenen) voi olla tärkeä mekanismi, joka lisää PD-L1-proteiinin ekspression glioomasolulinjoja ja potilaan kasvaimen yksilöt [14]. PTEN on tärkeä kasvainta estävä geeni, joka ensisijaisesti säätelee negatiivisesti solun eloonjäämisen signalointi PI3K-proteiinikinaasi B (Akt) reitin [15], [16]. Lisäksi kertynyt tutkimukset osoittivat, että PTEN voi olla tärkeä geeni, joka liittyy kasvaimen etäpesäke [15], [17], [18]. Sekä

vitro

ja

vivo

kokeilut CRC osoittivat, että PTEN ohjaa kasvaimia ja metastaattisen potentiaalia. On todettu, että injektio PTEN-vajaiden solujen hiirillä johti paljon keuhkojen ja ”multi-location” etäpesäkkeet kuin injektio valvonnan solujen [19]. Lisäksi jotkin kliiniset tiedot osoittavat, että menetys havaitsemisen PTEN immunovärjäyksellä liittyi edenneen taudin, maksan etäpesäke ja huono potilaan eloonjääminen [20] – [22]. Kuitenkin jotkut tuoreet tutkimukset eivät tue roolia PTEN sääntelyssä PD-L1-proteiinin ekspression. Todettiin, että ”PD-L1-proteiinin ekspressio on moduloitu läpi erilaisia ​​reittejä eri kasvainsolutyypit” [23].

On hyvin tunnettua, että PD-L1 on voimakas negatiivinen säätelijä antitumor immuniteetin, mutta se on tiedetä, onko tämä immuuni-pakenevat vaikutus on riittävä, jotta PD-L1 selvä tekijä liittyy huono prognoosi kaikenlaisille ihmisen syövissä. Kääntäen, PTEN on todettu olevan ratkaiseva tekijä erilaisissa keskeisiä prosesseja syövän kehityksen, ja tärkeänä geeni syöpädiagnoosin ja ennustetta. Viimeaikaisten havainto, että PD-L1-proteiinin ilmentyminen korreloi PTEN menetys [14], tulimme hypoteesin, että syövän etenemiseen ja PD-L1-ilmaisu ovat itsenäisesti liittyvät PTEN menetys, ja että kliinistä vaikutusta PD-L1 voi milloin ainakin osittain johtua korrelaatio PTEN menetys ja PD-L1-proteiinin ekspression.

Tässä tutkimuksessa, ensin tutkittiin, mikä vaikutus PTEN tappio PD-L1-proteiinin ekspression CRC solulinjoissa, ja määrätietoinen onko havaittu vaikutus säilyy, kun läsnä on IFN-γ. Toiseksi arvioimme yhdistys PD-L1 ilmaisutapoja tauti tulokseen ja PTEN ilmaisun 404 CRC potilailla, joiden seuranta-ajan mediaani 5 vuotta. Lopuksi tutkimme kliininen merkitys PD-L1 alaryhmässä 39 potilaalla, joilla PTEN täydellinen menetys tutkia, onko vaikutus PD-L1 CRC riippuu PTEN ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämän tutkimuksen hyväksyi laitoksen tarkastuslautakunta Sun Yat-Senin yliopistossa (Guangzhou, Kiina), ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

näytekokoelma ja Cell Culture

tässä tutkimuksessa 404 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet CRC saatiin kasvain pankin patologian osaston ensimmäisen Affiliated sairaala, Sun Yat-Senin yliopistossa (Guangzhou, Kiina ). Nämä 404 potilasta, jotka oli diagnosoitu CRC ja tehtiin alustava kirurginen resektio CRC tammi 2000 ja marraskuussa 2006 oli seuranta puhelimitse tai kirjeitä leikkauksesta asti huhtikuussa 2010 kerätä yleistietoa, patologiaraporteista, sekä tietoa potilaiden ehto leikkauksen jälkeen.

kolme CRC solulinjoissa, SW480, SW620 ja HCT116 ostettiin Culture Collection of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kiina), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 10% FBS ja 1% penisilliini -streptomycin 37 ° C: ssa 5% CO

2.

RNA Interference (RNAi) B

alas-säädellä PTEN ilme, erityiset siRNA-dupleksit kohdistaminen ihmisen PTEN (sense: 5 ’-GAGCGUGCAGAUAAUGACAdTdA-3′; antisense: 3’-dAdTCUCGCACGUCUAUUACUGU-5 ’) syntetisoitiin ja hankittiin RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, Kiina), ja siRNA-dupleksit epäspesifistä sekvenssit käytettiin negatiivisena kontrollina (NC). SiRNA-transfektio suoritettiin lipofektamiinin 2000 (Invitrogen, CA, USA), jonka pitoisuus oli 100 nM. Transfektiotehokkuutta testattiin qRT-PCR ja western blot. Nämä kokeet suoritettiin läsnä ollessa ja ilman ihmisen rekombinantti-IFN-γ (500 IU /ml, Peprotech, NJ, USA) ja toistettiin kolmena rinnakkaisena.

Kvantitatiivinen Käänteinen transkriptio-PCR (qRT-PCR)

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, solun kokonais-RNA uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, CA, USA) valmistajan protokollan. cDNA oli peräisin 500 ng kokonais-RNA: sta käyttämällä cDNA käänteistranskriptio kit (Toyobo, Osaka, Japani). Jälkeenpäin, reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen määrällistä SYBR Green PCR (Takara Bio, Dalian, Kiina) ABI 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) valmistajan protokollan. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa 1, PTEN ja PD-L1-proteiinin suhteellinen geeni-ilmentymisen taso analysoitiin käyttämällä vertailevan C

T-menetelmä (jota kutsutaan myös 2

-ΔΔCT menetelmä). Tiedot vertailevan C

T-menetelmä on kuvattu aiemmin [24], [25]. Lyhyesti, kolme rinnakkaista PCRmonistukset suoritettiin kullekin näytteelle. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Keskimääräinen C

T laskettiin sekä kohdegeeneissä ja β-aktiini. ACk

T määritettiin (keskiarvo kolmena C

T arvot kohdegeenin) miinus (keskiarvo kolmena C

T arvot β-aktiini). ΔΔC

T edustaa eroa pariksi solulinjojen, jossa PTEN ΔΔC

T = ACk

T-solujen, jotka on transfektoitu siRNA miinus ACk

T negatiivisen kontrollin ja PD-L1 ΔΔC

T = ACk

T käsiteltyjen solujen IFN-γ miinus ACk

T käsittelemättömään kontrolliin soluja. Suhteellinen ilmentymistaso ilmaistiin 2

-ΔΔCT.

Western Blot

Seitsemänkymmentäkaksi tuntia transfektion jälkeen solut pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS ) ja hajotettiin RIPA-puskurilla (Dingguo, Peking, Kiina) täydennettynä proteaasi ja fosfataasiestäjät (Merck Bioscience, Darmstadt, Saksa). Sen jälkeen, PTEN-proteiinin tasot määritettiin käyttäen kahta väriä fluoresoivia western blotting on Odyssey infrapuna Imaging System (LI-COR, Nebraska, USA) kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Lyhyesti, yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) kalvo (Pall, New York, USA). Sitten kalvot estettiin 5% BSA: ssa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa [Primary vasta-aine: Kanin anti-PTEN (laimennettu 1:10000, Epitomics, CA, USA); Kanin anti-Akt (laimennettu 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA); Kanin anti-fosfo-Akt

Ser473 (laimennettu 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA); Hiiren β-aktiini vasta-ainetta (laimennettu 1:10000, Proteintech, Chicago, USA)]. Seuraavana päivänä, kun inkubointi lajien sopivia fluoresoivasti konjugoidun sekundaarisen vasta-aineiden kanssa 1 h huoneen lämpötilassa, kalvot analysoitiin käyttäen Odyssey infrapuna Imaging System.

virtaussytometria

PD-L1-proteiinin ekspression solun pinnalla määritettiin käyttäen virtaussytometreja. Solut kerättiin ja niitä inkuboitiin anti-ihmis-PD-L1 PE-Cy7 (eBioscience, CA, USA), tai isotyyppi-sovitettua kontrolli-vasta-aineen (eBioscience, CA, USA) 30 minuutin ajan pimeässä jäällä (0,5 ug vasta-aineita 10

5 solua lopullisessa tilavuudessa 100 ui). Sen jälkeen näytteet pestiin kolme kertaa, värjättiin solut suspendoitiin uudelleen ja analysoitiin BD FACSCanto II (BD Biosciences, CA, USA) käyttäen FlowJo ohjelmistoa (TriStar, CA, USA). Standardoitu fluoresenssivoimakkuudet laskettiin jakamalla mediaani fluoresenssin spesifisiä vasta-aineita, jotka mediaani fluoresenssin isotyypin kontrolli. Kaikki tiedot kerättiin kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen merkittävyys määritettiin pariksi-näytteitä

t

testiä.

Tissue Microarray (TMA) ja immunohistokemia (IHC) B

TMA rakennettiin automatisoidulla kudosta mikrosirulla väline (ALPHELYS, Plaisir, Ranska). Kun on tunnistettu H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Associations of PD-L1 /PTEN ilmaisutapoja kliinisiä parametrejä arvioitiin käyttämällä Wilcoxonin summa testi (kahden populaation, jotka liittyvät) tai Kruskal- Wallisin testi (yli kaksi populaatiot, jotka liittyvät) koska data PD-L1 /PTEN ilmaisua indeksi ei ole sopusoinnussa normaalijakaumaa (Shapiro-Wilk test: P 0,001). Kokonaiselinaika (OS) ja etäpesäkkeiden-elinaika (MFS) arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Diagnoosin kuten etäpesäkkeiden seuranta-aikana vuonna sijaitsee CRC (pM0) potilaat määriteltiin terminaali tapahtuma MFS analyysiä. Liitot PD-L1 /PTEN ilmaisutapoja tauti tuloksen arvioitiin käyttämällä Coxin suhteellisten riskien regressiomalleja. Optimaalinen single cut-piste PD-L1 /PTEN ilmaisu erilliset potilaiden ryhmään PD-L1 /PTEN korkeampi ilmaisun ja ryhmä PD-L1 /PTEN alempi ilmaisun rakennettiin X-laatta ohjelmistoa kuten aiemmin on kuvattu [23 ], [24]. Samanlaisia ​​yhdistysten ja eloonjääminen analyysi tehtiin alaryhmässä 39 potilasta ilman PTEN ilmaisua, joka edustaa ryhmää, jossa sekoittava rooli PTEN ohjataan.

Tulokset

Ei PTEN Loss mutta IFN -γ aiheuttama PD-L1-mRNA Expression CRC Cell Lines

sekä mRNA-tasolla ja proteiinin taso PTEN laski transfektoiduissa soluissa siRNA PTEN verrattuna negatiiviseen kontrolliin. MRNA taso PTEN oli pudotettu noin 12,4% vuonna SW480, 14,6% vuonna SW620, 22,6% vuonna HCT116 48 h transfektion jälkeen transfektoiduissa soluissa siRNA PTEN verrattuna negatiiviseen kontrolliin (Fig. 1.). Ei ollut merkittävää eroa PD-L1-mRNA-tason välillä, jotka on transfektoitu siRNA PTEN ja negatiivisen kontrollin. Sen sijaan PD-L1-mRNA taso nousi merkittävästi soluissa, jotka altistettiin IFN-γ verrattuna sovitetun kontrolli soluja ilman altistumista IFN-γ (noin 8-taittuu) (Fig. 1 B).

(A) suhteellinen ilmentymistaso PTEN mRNA: ta (havaittu qRT-PCR: llä, lasketaan 2

-ΔΔCT menetelmä) neljään ryhmään: solut, jotka on transfektoitu siRNA PTEN tai ei-spesifisiä sekvenssejä läsnä ollessa tai poissa ollessa IFN -γ. (B) suhteellisen ilmentymisen taso PD-L1-mRNA: n neljään ryhmään soluja. Tiedot kerättiin kolmen erillisen kokeen. Virhe palkit kuvaavat SD.

Sekä IFN-γ ja PTEN Loss aiheuttama PD-L1-proteiinin ilmentäminen CRC

arvioitiin seuraukset PTEN Knockdown on Akt aktivoinnin läsnä ollessa /poissa ollessa IFN-γ. Fosfo-Akt

Ser473 kasvoi transfektoiduissa soluissa siRNA PTEN verrattuna negatiiviseen kontrolliin, riippumatta läsnä IFN-γ (Fig. 2). PD-L1-proteiinin ekspressio on merkittävästi lisääntynyt transfektoiduissa soluissa siRNA PTEN verrattuna negatiiviseen kontrolliin (P 0,05). Lisäksi, kun läsnä on IFN-γ ei muuttanut tätä lähtötilanteeseen (Fig. 3).

ekspressiotaso PTEN, Akt ja fosfo-Akt

Ser473 määritettiin Western-blottauksella. β-aktiini käytettiin tarkistaa yhtä suuri kuormitus. Edustavat kuvat valitaan suoritetaan kokeet toistettiin kolmena rinnakkaisena.

PD-L1-proteiinin ekspression tason pinnalla SW480, SW620 ja HCT116 määritettiin virtaussytometrillä: transfektoitujen solujen siRNA PTEN (punaiset viivat) ja solut, jotka oli transfektoitu ei-spesifisiä sekvenssejä (siniset viivat) ilman IFN-γ; solut, jotka on transfektoitu siRNA PTEN (mustat viivat) ja transfektoitujen solujen ei-spesifisiä sekvenssejä (oranssi riviä): n läsnä ollessa IFN-γ; solut värjättiin isotyypin kontrollivasta-ainetta (varjostettu alue). Standard fluoresenssin voimakkuuden PD-L1-proteiinin kuvannut histogrammin oikeassa paneelissa: käsitellyt solut (valkoiset sarake) tai käsittelemätön (harmaa pylväs) IFN-γ. Tiedot kerättiin kolmen erillisen kokeen. Virhe palkit kuvaavat SD. (* P 0,05 pariksi-näytteitä

t

testi).

IFN-γ aiheuttama PD-L1 Protein kanssa kahdella eri rakenteella on SW480 Cell Line

Euroopan virtaussytometrillä histogrammit osoittivat kaksi piikkiä SW480 soluissa, joita käsiteltiin IFN-γ (500 IU, 72 tuntia), vaikka oli vain yksi yksittäinen selvä huippu hoitamattomien ryhmässä. Lisäksi, vain yksi selvä huippu havaittiin SW620-soluissa ja HCT116-solut sekä läsnä ja poissa ollessa IFN-γ (Fig. 3). Sen määrittämiseksi, ovatko nämä kaksi piikkiä olivat ajasta riippuvia tai annostus riippuvaa, käsittelimme SW480-solujen eri annostuksella IFN-γ 48 tuntia. PD-L1-proteiinin maksimaalisesti lisääntynyt 500 IU /ml IFN-γ. Aika-tietenkin vaikutusta IFN-γ PD-L1-proteiinin, määritettiin sen jälkeen. SW480 käsiteltiin 500 IU /ml IFN-γ 0, 24, 48 ja 72 tuntia. Tulokset osoittivat, että kun läsnä on IFN-γ riippumatta annoksen IFN-γ ja hoidon aikana, PD-L1-proteiinin, jossa on kaksi eri rakenteiden todettiin pinnalla SW480-soluja (Fig. 4).

(A) SW480 käsiteltiin IFN-γ ilmoitetuilla pitoisuus (0 IU /ml, 50 IU /ml, 100 IU /ml, 500 IU /ml, 1000 IU /ml). (B) SW480 käsiteltiin 500 IU /ml IFN-γ syytteeseen asetettujen kertaa (0 h, 24 h, 48 h ja 72 h). Varjostettu alue edustaa SW480 ilman käsittelyä IFN-γ, ja numerot vieressä huiput edustamaan standardia fluoresenssin voimakkuus PD-L1. Kuvat ovat valitaan suoritetaan kokeita toistettiin kolmena rinnakkaisena.

Potilaan seuranta

Niistä 404 potilaalle, 5 potilaalla ( 3%) oli kadonnut lopussa seuranta, 110 potilasta (27,2%) oli kuollut, mediaani seuranta-aika 2,7 vuotta (vaihteluväli: +0,1-9,1vuotta), ja loput 288 potilasta oli keskimääräinen seuranta-aika oli 5,8 vuotta (vaihteluväli: 0,1 -10,2vuosi). Kun IHC suoritettiin, kudoksen 57 potilasta pestiin pois lasilevyille ja loput 347 potilaalla oli immunohistokemiallista dataa. Ei ollut eroa kokonaiselossaoloaikaa potilaiden välillä ja ilman immunohistokemiallista dataa (P = 0,716, log-rank-testi). Myös mitään merkittävää eroa metastasointiin (diagnosoitu etäpesäkkeiden leikkauksen jälkeen) hinnat potilaiden välillä ja ilman immunohistokemiallista dataa (12,4% ja 14,0%, P = 0,682).

Korrelaatio PD-L1 /PTEN Expression and Clinical parametrit

immunohistokemiallisella värjäyksellä PD-L1 sijaitsee solukalvon ja endomembrane järjestelmässä oli ilmaus indeksi vaihteli 0-15,9 (mediaani: 2,33) (Fig. 5.

1-D

1, A

2-D

2). PTEN sijaitsi sytoplasmassa kanssa ilmaus indeksi vaihteli 0-54,7 (mediaani: 5,57) (Fig. 5. E

1-G

1, E

2-G

2) .On oli 39 potilasta, jolla ei ollut PTEN lauseke (Fig. 5. H

1, H

2).

(A

1, A

2, E

1 , E

2) Negatiivinen kontrolli; (B

1, B

2, F

1, F

2) yksilöt samasta potilaasta, metastasoivaa etenemisen; (C

1, C

2, G

1, G

2) Näytteet toiselta potilaaseen metastasointiin; (D

1, D

2) tyypillinen edustaja, joka osoitti, että PD-L1-proteiinin ekspressio on koholla kasvaimen alueella (T) verrattuna vierekkäisten normaalin limakalvon (N); (H

1, H

2) Näytteet potilaasta ilman PTEN ilmaisua; (J, K) Tilastollinen analyysi osoitti, että PD-L1-ilmentyminen lisääntyy potilailla, joilla oli metastaattinen etenemistä verrattuna ilman metastasointiin, vaikka tällainen tilastollinen analyysi PTEN ei ollut merkittävä. (Kaksi paneeleja, värjättiin PD-L1-vasta-aineen, kaksi alas paneelit, värjättiin PTEN vasta-aine), (A

1-H

1, × 100: A

2-H

2, × 400).

Kuten taulukosta 2, potilaalla on suurempi PD-L1-ilmentyminen olivat todennäköisemmin näytteille etäispesäkkeitä (pM) (P 0,01), haitalliset patologinen ominaisuudet (2007 TNM-luokitus) (P 0,01), ja metastasointiin (P 0,001) (Fig. 5. J), ja PD-L1-proteiinin ekspressio korreloi PTEN ilmaisua jossakin määrin (P 0,001). Ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa sukupuolten välillä, iän, kasvaimen sijainti, primaarikasvaimen luokittelu (pT), alueellinen imusolmuke osallistuminen (PN), tai toistuminen leikkauksen jälkeen. Kääntäen, PTEN ilme ei ollut merkittävää yhteyttä päämuuttujia (pT: P = 0,221; pN: P = 0,131; pM: P = 0,525; TNM: P = 0,337; toistuminen: P = 0,397; metastasointiin: P = 0,710 ). Yleinen eloonjääminen ja etäpesäkkeiden elinaika oli myös ei liittynyt PTEN ilme (P = 0,366, P = 0,141 vastaavasti) (Fig. 6. C, D).

(A, B) Käyttöjärjestelmä ja MFS olivat merkittävästi alhaisemmat PD-L1-suurempi-ilmentymisen potilailla verrattuna PD-L1-alempi-ilmentymisen potilailla (sekä P 0,001). (C, D) Käyttöjärjestelmä ja MFS eivät eronneet merkittävästi välillä PTEN-suurempi-ilmaisun potilaiden ja PTEN-alempi-ilmentymisen potilailla (OS, P = 0,366; MFS, P = 0,141). (E) alaryhmässä 39 potilaalla täysin PTEN menetys, PD-L1-ekspressiota ei enää liittyy OS (P = 0,482).

Survival Analysis

analyysi X-laatta ohjelmisto paljastaa, että 1,49 oli optimaalinen leikkaus pisteen joka erottaa potilaiden ryhmään PD-L1 suurempi ilmaisun ja ryhmä PD-L1-alempi ilme. Kaplan-Meier käyrä ja log-rank testi osoitti, että yleinen eloonjäämisaste potilaiden alemman PD-L1-ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi kuin potilaille, joilla on korkeampi PD-L1-ilmentymisen (Fig. 6A, χ2 = 13,964, P 0,001). 5 vuoden OS oli 62,9% potilailla, joilla on korkeampi PD-L1-proteiinin ekspression ja 81,1% potilailla, joilla on alhaisempi PD-L1-ilmaisua. In Monimuuttuja-analyysissä Coxin suhteellisten riskien mallia, PD-L1 ei ollut itsenäinen ennustetekijä CRC oikaisun jälkeen muuttujat, jotka täyttävät PH oletus (ikä, kasvaimen sijainti, erilaistuminen luokalla pT, PN, pM, metastasointiin) (P = 0,548). Jos kuitenkin muuttujia, jotka liittyivät merkittävästi PD-L1-ekspression (pM, metastasointiin) ei mukautettu vuonna Monimuuttuja-analyysissä, PD-L1-proteiinin ekspression tuli merkittävä ennustaja CRC (P 0,01) (taulukko 3).

Kuten meidän tuloksiin, PD-L1 taipuvainen assosioivansa etäpesäkkeitä muuttujia. Joten edelleen määrittää yhdistys PD-L1 syöpä metastasointiin, tutkimme osajoukko 310 potilasta, joilla oli paikallinen CRC (pM0), joista 28 (9,03%) eteni kaukaisia ​​etäpesäkkeitä, mediaani seurannan 5,14 vuotta ( alue, +0,06-+10,14vuosi). Tässä alaryhmässä, PD-L1-ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä etäpesäkkeitä-elinaika (MFS) (Fig. 6B, χ2 = 21,444, P 0,001). 5 vuoden MFS oli 99,5% PD-L1-alempi-ilmaisun potilaista ja 72,1% PD-L1-suurempi-ilmentymisen potilailla. Lisäksi, Cox-analyysi paljasti, että PD-L1-proteiinin ekspressio oli merkittävä ennustaja metastasointiin (RR: 1,165; 95% CI: 1,072-1,268; P 0,001).

Mielenkiintoista on, että osajoukko 39 PTEN -ei-ilmentyminen potilaita, jossa häiriövaikutukset PTEN PD-L1 ohjataan, PD-L1-ekspressiota ei enää liittynyt etäpesäkkeiden (P = 0,102), TNM (P = 0,634), ja selviytyminen analyysi osoitti, että ei ollut merkittävää eroa yleisen eloonjäämisen välillä PD-L1-suurempi-ilmaisun ryhmä ja PD-L1-alempi-ilmentymisen ryhmässä (kuvio. 6E, χ2 = 0,494, P = 0,482).

keskustelu

PD-L1 on yksi tärkeimmistä aiheista kasvaimen biomarkkereiden tutkimusta viimeisen vuosikymmenen aikana. Useat tutkimukset ovat osoittaneet korrelaation kasvaimen aggressiivisuus ja PD-L1-proteiinin ilmentymisen. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme myös vahvaa näyttöä siitä, että korkeampi PD-L1-proteiinin ekspression CRC helpottaa etenemistä kasvaimen vaiheen ja metastasointiin. Yleinen eloonjäämisaste potilailla, joilla on pienempi ilmentyminen PD-L1 oli merkittävästi suurempi kuin potilailla, joilla on suurempi ekspressio PD-L1. Lisäksi PD-L1 ilmentyminen oli myös merkitsevästi yhteydessä etäpesäkkeitä elinaika on 310 sijaitsee CRC potilaille. Kuitenkin PD-L1-ekspressiota ei merkittävästi liittynyt epäsuotuisa ennusteeseen säätämisen jälkeen etäpesäke ja metastasoituneen etenemisen monimuuttuja eloonjääminen analyysi. Tämä on ristiriidassa edellisen havainnon, että PD-L1-ilmentyminen pysyy liittyy epäedullinen ennusteen mukaan monimuuttujamenetelmin munuaissolukarsinoomassa potilailla [6]. Yksi selitys tälle ero voi olla eri muuttujia, jotka on oikaistu monimuuttujakalibrointiin mallissa. Edellisessä tutkimuksessa metastasointiin muuttuja (diagnosoitu etäpesäkkeiden kirurgian jälkeen) ei ollut oikaistu monimuuttujakalibrointiin selviytyminen analyysi. On tunnettua, että etäpesäke on ensisijainen kuolinsyy CRC potilaille; joten kun me oikaistuna tämän kuolemaan liittyvien muuttuja, PD-L1 ei enää itsenäinen ennustetekijä CRC.

Todisteita siitä kirjallisuutta ja tutkimuksemme osoitti, että PD-L1 yliekspressio liittyy läheisesti syövän etenemisessä ( erityisesti etäpesäkkeitä eteneminen), mikä PD-L1 lupaava biomarkkereiden ja terapeuttisia kohteita kasvaimia. Kuitenkin mekanismi, jonka PD-L1 parantaa syövän etenemisessä on huonosti ymmärretty. Kuten kirjallisuudessa, nämä yhdistykset voivat johtua hyvin tunnustettu ”molekyyli kilpi”, jonka PD-L1. Kerrottiin, että PD-L1 tarjoaa ”suojaus” vaikutus suojella syöpäsolujen hajoamiselle sytotoksisia T-soluja. Lisäksi, PD-L1 havaittiin anti-apoptoottinen vaikutus tuumorisoluissa [3], [30]. Kuitenkin in

vivo

tutkimus osoitti, että siirtogeeninen ilmentymä PD-L1 on PD-L1-puutosta naiivi hiiri ei muuttanut tumourigenicity [31]. Monikeskustutkimuksessa vaiheen I tutkimuksessa, Brahmer ym ilmoittanut, että vasta-aine-välitteinen saarto PD-L1 indusoi kestävä kasvaimen regressio ja pidentää vakauttaminen tautia sairastavilla potilailla valitse kehittyneitä syöpiä. Valitettavasti, peräsuolen syöpä ei ole yksi näistä valitse syöpien [32]. Mietimme, onko kyky tuhota ”molekyyli kilpi” voi tarjota riittävän perustan tämän kliinisen yhdistys CRC. Andrew T Parsa ehdotti myös, että siltä osin kuin PD-L1-proteiinin ekspression suoraan vaikuttaa syövän etenemistä on vielä määrittämättä [14].

Tässä tutkimuksessa tunnistamaan muita välillisiä vaikutuksia PD-L1 ilme syövän etenemisessä tutkimme signalointireittien säätelyyn osallistuvan PD-L1-proteiinin ekspression CRC.