Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että kromosomi alueista MikroRNA ovat toiminnallisesti tärkeitä syövissä. Tässä osoitamme, että genomista loci koodaus miR-204 usein menetetään useita syöpiä, kuten munasarjan syövät, lapsipotilailla munuaisten kasvaimia, ja rintasyöpiä. MiR-204 näyttää rajusti ilmentymistä useissa syövissä ja toimii voimakkaana tuumorisuppressori, tuumorin etäpesäkkeiden in vivo systeemisesti toimitettu. Olemme osoittaneet, että miR-204 saa aikaan toiminnon kohdistamalla geenien kasvaimien syntyyn liittyvien lukien

aivoperäinen neurotrofinen tekijä

(

BDNF

), neurotrofiini perheenjäsen, joka tiedetään edistävän kasvaimen angiogeneesiä ja invasiivisuus . Analyysi primaarikasvainten osoittaa, että lisääntynyt ilmentyminen BDNF tai sen reseptori tropomyosin liittyvä kinaasi B (TrkB) yhdensuuntainen huomattavan alennettu ilmaus miR-204. Tuloksemme osoittavat, että menetys miR-204 johtaa BDNF yli-ilmentymisen ja myöhemmän aktivoinnin pienten GTPaasina Rac1 ja aktiini uudelleenjärjestelyn kautta AKT /mTOR-signalointireitin johtaa syöpäsolun muuttoliikettä ja invaasiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mikrodeleetio genomista loci sisältävien miR-204 liittyy suoraan vapauttamisen keskeinen onkogeenisten polkuja, jotka tarjoavat ratkaisevan kannustin kasvaimen kasvu ja etäpesäke. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy vahva perusta manipuloimalla miR-204 tasot terapeuttisesti tukahduttaa kasvainmetastaasit.

Citation: Imam JS, Plyler JR, Bansal H, Prajapati S, Bansal S, Rebeles J, et al. (2012) Perimän menetys Kasvain vaimennin miRNA-204 Edistää Cancer Cell Migration ja Invasion aktivoimalla AKT /mTOR /Rac1 Merkinanto ja Actin uudelleenjärjestely. PLoS ONE 7 (12): e52397. doi: 10,1371 /journal.pone.0052397

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 8. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 14 marraskuu 2012; Julkaistu: 21 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Imaami et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat William ja Ella Medical Research Foundation avustus (MKR), GCCRI käynnistä rahasto (MKR), CPRIT fellowship (BZ), National Institutes of Health (NIH) T32 koulutus avustus (YFC), ja NIH /National Cancer Institute syöpä keskusta avustus (P30 CA054174-17). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tunnistaminen kromosomialueita kätkeminen onkogeenien ja tuumorisuppressoriproteiinia on ratkaiseva käsitys kasvaimen synnyssä ja parantaa hoitotuloksia [1]. Vaikka useat syöpään liittyvien geenien on tunnistettu alueilla, joilla kromosomipoikkeavuuksien [2], lisäalueita satunnaisella tai toistuvia kromosomipoikkeavuuksien kätkeminen tekijät tärkeitä syövän kasvua ja etenemistä vielä tunnistamatta. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että MikroRNA (miRNA) ovat yksi tällainen ryhmä tekijöistä [3]. MiRNA ovat pieniä, endogeeninen, ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät transkription jälkeisestä geenin ilmentymisen sitoutumalla 3 ’transloimattomia alueita (UTR) ja kohde-mRNA: iden. MiRNA tiedetään pelata tärkeisiin toimintoihin useissa biologisissa prosesseissa kuten kehitys- ja erilaistuminen [4], ja vapautuneilla ilmaus miRNA on liitetty useisiin ihmisen sairauksia kuten syöpää [5]. Kasvava todistusaineisto viittaa siihen, että miRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [6].

Tässä tutkimuksessa keskityimme kromosomi loci sisältävien miR-204. MiR-204 on raportoitu tärkeitä rooleja sileälihassolujen kalkkeutumista sekä Endoplasmakalvosto stressivasteen trabekkelikudoksessa soluissa [7], [8]. Lisäksi tuoreet raportit ovat osoittaneet yhtä tärkeitä rooleja miR-204 kasvainten synnyssä, kuten sääntely syövän syntymistä ääreishermoston tuppi kasvaimia, ja muuttoliike ja invaasio kohdun limakalvon syövän solulinjoista [9], [10]. Kuitenkin hyvin vähän tiedetään mekanismi, jonka miR-204 säätelee oncogenesis yleensä, ja kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden rinta- ja munasarjasyövän syöpiä erityisesti. Lisäksi juuri mitään ei tiedetä, onko miR-204 voidaan kohdistaa terapeuttisesti ja miten miR-204 ilmentymistä säädellään syövissä. Tuloksemme osoittavat, että kromosomi loci sisältävä miR-204 on usein menetetään, jolloin sen pienempi ilmaisu useita syöpiä. Osoitamme, että miR-204 toimii voimakas kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden vaimennin. Tärkeää on, tuloksemme osoittavat, että miR-204 voidaan kohdistaa terapeuttisesti systeemisessä annostelussa miR-204 inhiboi rintasyöpä keuhkometastaasitestissä aiheuttamatta maksatoksisuutta. Olemme havainneet, että miR-204 toimii tuumorisuppressorina kohdistamalla geenien tuumorigeneesiin liittyvistä, mukaan lukien

aivoperäinen neurotrofinen tekijä

(

BDNF

). BDNF on fysiologisesti tärkeä hermokasvutekijän että on keskeisessä asemassa kehitettäessä hermoston sitomalla ja myöhemmin aktivoimalla tyrosiinikinaasireseptorin tropomyosin liittyvä kinaasi B (TrkB) [11], [12]. Lisäksi BDNF /TrkB reitin raportoidaan olevan kriittinen rooli kasvainten synnyssä, koska se edistää proliferaatiota, erilaistumista, angiogeneesi ja kasvaimen invasiivisuus [13]. Yli-ilmentyminen BDNF /TrkB: n on myös liitetty huonoon ennusteeseen useita kiinteitä kasvaimia, kuten neuroblastooma, munasarja-, rinta-, eturauhas- ja keuhkosyöpä [14], [15], [16]. Meidän havainnot osoittavat, että menetys miR-204 johtaa BDNF /TrkB yli-ilmentymisen ja samanaikainen aktivoituminen AKT /mTOR /Rac1 signalointireittiä, mikä aktiini uudelleenjärjestelyn aikana syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota. Nämä tulokset korostavat toiminnallista merkitystä kromosomialueita, jotka sisältävät tiettyjä miRNA kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

Tulokset

Somaattiset Menetys miR-204 Syövät

Tunnistaa miRNA jotka ovat joihin liittyy poikkeava kromosomialueita ihmisen syövissä, käytimme korkearesoluutioinen mukautetun miRNA vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) ja tiheäksi CGH julkisuuteen aineistoja munasarjojen syöpien, rintasyöpiä ja lapsipotilaiden munuaisten kasvaimia. Tämä analyysi paljasti useita miRNA on minimaalinen kromosomaalinen deleetio ja vahvistusta alueet näistä kasvaimista. Alkaa ymmärtää toiminnallista merkitystä kromosomi loci liittyy miRNA kasvainten synnyssä, me aluksi keskittyi miRNA näytteille genomista tappio (Kuva S1A). 9q21.12 geenivirhe sisältävä miR-204 oli usein menetetty 44.63% (158/354) munasarjojen syöpiä, 28% (10/35) rintasyövistä ja 40% (15/38) ja lapsipotilaiden munuaisten kasvaimia (kuvio 1A , 1B, ja kuvio S1B), joka on edelleen todentaa kvantitatiivinen genomista reaaliaikainen PCR-analyysi (kuvio 1C ja 1D). Lisäksi vähennys tasot kypsän miR-204 voimakkaasti myös sen genomisen DNA pitoisuus kaikissa kolmessa kasvaintyypeissä (kuvio 1 E-1G).

, korkearesoluutioisia miRNA-CGH valittuihin lapsipotilaiden munuaisten kasvaimia (vasen) tai ilman (oikealla) miR-204 poistot. Poistaminen genomista loci sisältävä miRNA on merkitty katko- kohtisuorassa linjat. Punainen ja vihreä pisteet osoittavat asema ja arvo kunkin koetin heijastavan kopioluvun muutos, edustettuina kolmena kappaleena sen CGH array. Harmaa trendilinja edustaa keskimääräistä arvoa kolmena koetin jokaisen kasvain. B, kaaviot saatu meta-analyysi korkean resoluution CGH munasarjasyövistä (

n

= 354; saatu TCGA) edustavat osajoukko kasvaimia tai ilman poisto. Poisto genomista loci sisältävien miR-204 on osoitettu katko- kohtisuorassa linjat. C ja D, alleeliset PCR miR-204 genomisen lokuksen lapsipotilaiden munuaisten kasvaimet (C) ja munasarjojen syöpien (D). Y-akseli esittää log

2 muuttaneet suhteellisen kvantifioinnin arvoja. Katkoviivat esittävät menetys kopio kynnys. E-G, graafisesti qRT-PCR-analyysi osoittaa tasoja miR-204 lapsipotilaiden munuaiskasvaimia (

n

= 38; E), on edennyt jo pitkälle munasarjojen syöpiä (

n

= 11 , F), ja rintasyöpiä (

n

= 10; G), verrattuna normaaliin sovitettu kontrollimunuaista (

n

= 38), normaali munasarjojen kudoksiin (

n

= 5) ja normaaleille sovitetun rintakudosten (

n

= 10).

MiR-204 toimii voimakkaana Tumor Growth and Metastasis vaimennin

rajusti ilmentyminen miR-204 useissa syövän kudoksissa sai meidät puuttumaan rooli miR-204 kasvainten synnyssä. Tämän selvittämiseksi ensin arvioitu vaikutus miR-204 ankkurointi riippumattomaan kasvuun. Alkion munuaisen HEK-293-soluissa (HEK-293-soluja siirrostettiin yli 52 kertaa on raportoitu olevan erittäin tuumorigeenisiä [17]), jotka yliekspressoivat miR-204 oli vähemmän pesäkkeitä muodostavien kapasiteettia, joka on pelastettu yliekspressio estäjän miR-204 ( kuvio 2A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös miR-204 yli-ilmentävät rintasyöpä MDA-MB-231 ja munasarjasyövän SKOV3-soluja (tietoja ei esitetty). Edelleen vahvistaa miR-204: n potentiaalin tuumorisuppressorigeenin-kaltainen aktiivisuus, korkea-passage HEK-293-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät joko miR-204 tai sekoitetun sekvenssin injisoitiin munuaisen kapselit nude-hiirten ja kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden arvioitiin 24 päivää injektion jälkeen . Jyrkästi hallita kasvaimia, miR-204 yli-ilmentävät kasvaimet dramaattisesti pienentynyt (kuvio 2B). Seuraavaksi tutkittiin, miR-204 estää myös kasvainsolun invaasiota. Histologinen analyysi ksenograftin tuumorisektioiden ilmoitettu radikaalisti vähentynyt tai ei invasiivisuus kasvainten osaksi munuaisten kudoksiin että yli-ilmentynyt miR-204 kontrolliin verrattuna (kuvio 2C). Tämän mukaisesti miR-204 yliekspressio rajusti muuttolintujen ja invasiivisen valmiuksia rintasyövän (MDA-MB-231) ja munasarjasyöpä (SKOV3-) soluja (kuvio 2D ja tietoja ei ole esitetty) in vitro.

, miR-204 estää kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Ravinteiden kulutus (vasemmalla) ja kuvaaja (oikealla) kuvaavat muodostuneiden pesäkkeiden määrästä pehmeässä agarissa kaivojen HEK-293-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät joko ryntäily tai miR-204, lisäksi transfektoitu miR-204 estäjä. (*)

P

0,05; (**)

P

0,01. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta. B, miR-204 yliekspressio inhiboi kasvaimen kasvua. Valokuva esittää edustavaa piirrettä kasvaimen kasvua

rag2

– /-, yc

– /- SCID hiiriin ruiskutettiin (munuaisissa kapseli), jossa HEK-293-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät joko scramble ohjaus tai miR -204. Pylväsdiagrammi osoittaa kasvaimen keskimääräisen tilavuuden Mir-204 (

n

= 9) ja ryntäily (

n

= 9) transfektanteissa. (*)

P

0,001. C, histologinen analyysi jaostojen tuumoriksenograftien yliekspressoivat joko scramble (kontrolli) tai miR-204. Kuvat oikealla esitetty paneelissa edustavat suurennettuna boxed ilmoitetulla alueella vasemmassa paneelissa. Kasvain miehityksen vuonna verrokkitransfektantteja heijastuu hyökkäys kasvain osaksi munuaisten kudokseen. D, tyvikalvon matriisin invaasiomääritys MDA-MB-231-soluja, jotka on transfektoitu 75 nM sekoitetun sekvenssin (kontrolli) tai miR-204 matkivat (miR-204) tai miR-204 matkivat transfektoidut solut edelleen transfektoitu miR-204-estäjän (asennuspalveli- 204 + estäjä). Pylväsgrafiikka esittää keskimääräistä lukumäärää tunkeutuneet solujen laskettiin mikroskooppisesti viidellä eri aloilla kohti suodatin. (***)

P

0,001.

terapeuttinen kohdentaminen miR-204

konkretisoimiseksi edelleen etäpesäke suppressoriaktiivisuutta miR-204 suoritimme terapeuttinen kokeiluja rintasyövän keuhkometastaasitestissä malli. Me ensin keuhkometastaaseja häntälaskimoinjektiona MDA-MB-231 rintasyövän soluja, jotka ilmentävät lusiferaasia-GFP, ja sen jälkeen ruiskutetaan miR-204 tai miR-204-mutantin oligo (negatiivinen kontrolli) häntälaskimoon nude-hiirten välein 5 päivää varten 30 päivää käyttäen LANCErII, lipidipohjaista in vivo kuljetusvehikkeliin. Mielenkiintoista, systeeminen toimitus miR-204 aiheutti merkittäviä vähentäminen tai poistaminen keuhkoetäpesäkkeet, kun taas miR-204 mutantti oligo injektoidaan hiiriin oli vaikea keuhkometastaasitestissä mitattuna yli 60 päivän ajan (kuvio 3A-3D ja kuvio S2). Tärkeää on, hiiret injektoitiin miR-204 ei osoittanut ilmeisiä sivuvaikutuksia joka käy ilmi puuttuminen maksatoksisuuden tai painon muutoksia (kuvio 3E ja tuloksia ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että miR-204 voi olla turvallinen ja elinkelpoinen hoito-ohjelma hoitaa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

, injektio miR-204 oligonukleotidi häntälaskimoon tukahdutetaan keuhkometastaasitestissä. Live-bioluminenssi kuvia hiiriä injektoitiin miR-204 (

n

= 6) tai miR-204 mutantti (neg. Kontrolli;

n

= 6) oligonukleotidien avulla Xenogen In Vivo Imaging System ( IVIS) (Xenogen). Kuvat on otettu sen jälkeen, kun ihon alle ruiskuttamalla 150 mg /kg D-lusiferiini substraatin PBS nukutetuille hiirille. B, kasvainmetastaasit tilavuus arvioitiin alkaen päivänä 10 saakka eläimet lopetettiin päivänä 60. Käyttäen ROI-analyysi, kasvain valon voimakkuus laskettiin fotonin /s, joka vastaa määrää elävien solujen in vivo. C, edustaja keuhko kuvat osoittavat GFP

+ ve pesäkkeitä (punainen ympyrä) in neg. kontrolliryhmiin. D, edustaja keuhkoleikkeissä osoittaa etäispesäkkeitä neg. kontrolliryhmiin. E, ei maksamyrkyllisyyttä miR-204 pistetään hiirillä. Jaksot maksa miR-204 pistetään hiirillä ei ole todettu oireita maksatoksisuuden. Läsnäolo multifokaalisia periportaalista lymfosyyttien ei ole epätavallista, ja on yleinen löydös nuorilla eläimillä.

MiR-204 tavoitteet Genes tuumorigeneesiin liittyvistä

Ymmärtää mekanismia, jolla miR-204 voi olla merkitystä kasvainten synnyssä, tunnistimme geenejä säätelee miR-204. Koska useimmat miRNA toimivat laskevan kohde-mRNA-tasoja [18], suoritimme geeniekspressio analysoidaan solujen yli-ilmentävät miR-204 ja määritetään mahdolliset kohteet miR-204. Geenien muuttunut miR-204 yliekspressoivia soluja, vaimentua geenit ovat todennäköisimmin suoraan kohteena miR-204. Mielenkiintoista, useat vaimentua geenit liittyvät syöpään liittyvien prosessien ja fyysisesti tai toiminnallisesti vuorovaikutuksessa toistensa kanssa, joka käy ilmi reittiin analyysin perusteella (kuva S3). Suoritimme yksityiskohtaisia ​​analyysejä kaksi tällaista geeniä:

BDNF

ja

Erzin

että osoitti korkeampi muutoksen meidän mikrosiruanalyysi ja esillä kaikissa ennustettu biologinen reittejä korkeimmalla toiminnallinen rikastamiseen merkitys. BDNF sen reseptorin TrkB tiedetään ratkaiseva rooli kasvaimen angiogeneesiä ja etäpesäke; ja Erzin, joka on solun tukirangan järjestäjä proteiinia, on ollut mukana kasvaimen kasvua etäpesäke useita aikuisten ja lasten kasvaimet kuten osteosarkooma, maitorauhasen ja haiman adenokarsinooman, munasarjakarsinooma sekä rabdomyosarkooma ja lapsipotilaiden munuaisten kasvaimia [19], [20], [21 ]. Lisäksi useita kohde ennustus algoritmit, kuten SvMicrO [22], Bayesian päätös fuusio lähestymistapa [23], ja miRmate [24], että olemme hiljattain saanut sekä TargetScan [25] ja Pictar [26], myös ennustettu

BDNF

ja

Erzin

, joihin kohdistetaan miR-204. Lisäksi miR-204 sitoutumiskohtia havaittiin evoluutiossa säilyneitä kaikkialla selkärankaisten, mikä viittaa siihen, että sillä on tärkeä sääntelytehtävä pitää eri lajeja. Tärkeää on, miR-204 ja

BDNF Twitter /

TrkB

sekä

Erzin

ilme oli voimakas negatiivinen korrelaatio useissa kasvaimissa (kuvio 4A-4C ja kuviossa S4A-S4C) .

A-C, lisääntynyt BDNF ilme korreloi voimakkaasti alemman miR-204 ilmentymistä useissa syövissä. Graafisesti qRT-PCR-analyysi osoittaa käänteinen korrelaatio miR-204 ja

BDNF

lapsipotilaiden munuaiskasvaimia (

n

= 38, A), pitkälle munasarjojen syöpiä (

n

= 11, B) ja rintasyöpiä (

n

= 10; C), verrattuna normaaliin sovitettu kontrollimunuaista (

n

= 38), normaali munasarjojen kudoksiin (

n

= 5) ja normaaleille sovitetun rintakudosten (

n

= 10). D-H,

BDNF

on bonafide kohteena miR-204. D, kaavamaisen oletetun miR-204 sitovan sekvenssin

BDNF

3 ’UTR. E, HEK-293-solut kotransfektoitiin Renilla lusiferaasiekspressio rakentaa PRL-TK ja tulikärpäsen lusiferaasi konstrukteja, jotka sisältävät joko pMIR-

BDNF

3 ’UTR puuttuessa ja läsnä miR-204 matkivat tai pMIR-

BDNF

3 ’UTR-mutantti. Tulikärpäsen lusiferaasi kunkin näytteen aktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (suoritettu kahtena kullekin kokeelle). (**)

P

0,01; (***)

P

0,001. F, qRT-PCR-analyysi miR-204 yliekspressoivia soluja ja soluja, jotka oli transfektoitu miR-204 estäjiä käyttäen

BDNF

erityisiä alukkeita. G, western blot-analyysi HEK-293-solut transfektoitiin miR-204 matkivat anti-BDNF-vasta-aineen (1:1000). β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Geelikuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. H, graafinen esitys kaistaintensiteettien mittaamaan Yhteensä Labs TL100 1D geeli analyysin ohjelmisto (

n

= 3, Nonlinear). BDNF proteiinin taso torjunta- asetettiin 100.

vahvistaa meidän microarray ja kohdistaa tulosennusteita, ensin tutki miR-204 tavoitteet

BDNF Twitter /

Erzin

sitoutumalla ennustettu sivuston sen 3 ’UTR (kuvio 4D ja kuviossa S4d). Itse asiassa, lusiferaasiaktiivisuus on pMIR-reportteri-konstrukti, joka sisältää

BDNF

tai

Erzin

3 ’UTR merkittävästi tukahdutettu, mikä edelleen pienentää yliekspressoiviin soluihin miR-204 verrattuna rakentaa ilman 3 ’UTR (kuvio 4E ja kuvio S4d). Sen sijaan, mutaatio siementen sekvenssin

BDNF

3 ’UTR sisältävä rakenne ei ainoastaan ​​palauttaa lusiferaasin aktiivisuus, joka on lähellä villityypin konstrukti, mutta myös suoritettu selostukset Näiden rakenteiden herkkä miR-204 yliekspressio ( kuvio 4E), joka vahvistaa tietyn vuorovaikutuksen miR-204 ja ennustettu sitoutumiskohta 3 ’UTR: t näistä geeneistä. Edelleen tueksi Näiden tulosten määritimme tasot BDNF /Erzin soluissa yli-ilmentävät miR-204. MiR-204 yliekspressio johti huomattavaan vähenemiseen BDNF /Erzin molempia RNA ja proteiini tasoilla (kuvio 4F-4H ja kuvio S4E ja S4F). Seuraavaksi tutkimme onko BDNF ja Erzin ovat toiminnallisesti tärkeitä tavoitteita miR-204. Käsitellä tätä suoritimme pelastuskokeiden. Uudelleen

BDNF

tai

Erzin

pelastettiin miR-204 aiheuttama fenotyyppejä kuten ankkurista riippumaton kasvu, solujen vaeltamiseen ja invaasiota (kuva S5 ja tuloksia ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-204-säätelyyn on

BDNF

ja

Erzin

on tärkeä tapahtuma syöpäsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio.

Menetys miR-204 aktivoi AKT /mTOR merkinanto ja Rac1 translokaatio syöpäsoluissa

Voit selvittää mekanismi, jonka miR-204 voi ilmetä sen kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden suppressoriaktiivisuutta, tutkimme vaikutus miR-204 AKT /mTOR signalointi kuin sekä BDNF ja Erzin on osoitettu aktivoivan AKT-reitin aktivaation [27], ja selektiivinen aktivointi AKT by mTOR on osoitettu säätelevän syöpäsolujen muuttoliike ja invaasiota [28]. Mielenkiintoista, miR-204 yliekspressio johti alhaisempaa AKT ja mTOR loppupään tavoitteet 4E-BP1 ja S6 (kuvio 5A). 4E-BP1 on käännös estäjä, joka dissosioituu EIF4E kun fosforylaation sallimaan proteiinin translaation, ja S6 on ribosomaalinen proteiini, jonka fosforylaatio helpottaa kokoonpanoa ribosomin ja siitä kääntäminen mRNA. Vahvista meidän in vitro löydöksiin, analysoimme ilmentyminen fosfo-AKT (Pakt) ja fosfo-S6 (PS6) in -tuumoriksenografti yliekspressoivia miR-204. Kuten kuviossa S6, tasot Pakt ja PS6 vähensi merkittävästi, kun koko AKT ja yhteensä S6 tasot pysyvät muuttumattomina kasvaimet yli-ilmentävät miR-204 verrattuna valvoa transfektantti kasvaimia, kuten kävi ilmi immunohistokemiallisella analyysillä. Konkretisoimiseksi edelleen käsitystä, että AKT /mTOR-reitti on todella tärkeä tavoite miR-204, me kotransfektoidaan miR-204 konstitutiivisesti aktiivinen AKT T308D /S473D mutantti ja osoittivat, että konstitutiivisesti aktiivinen AKT pelastettu kielteisiä vaikutuksia asennuspalveli- 204 loppupään PS6 ja fosfo-4E-BP1 (p4E-BP1) tasot (kuvio 5, vertaa 5A ja 5B). Emme kuitenkaan voi havaita pelastamista kielteiset vaikutukset välittyvät miR-204 Pakt tasoilla soluissa kotransfektoitiin konstitutiivisesti aktiivinen AKT (kuvio 5B). Tämä johtuu siitä, että mutaatio Ser

473 Asp

473 konstitutiivisesti aktiivinen AKT, ja siksi anti-fosfo-Ser

473-AKT-vasta käytettiin western blot-analyysi vain havaittu endogeeninen Pakt, joka pelkistetään tasolla, kun läsnä on miR-204 (kuvio 5A ja 5B).

A, miR-204 estää aktivointi AKT ja mTOR signalointia. HEK-293-solut transfektoitiin miR-204, kasvatettiin seerumittomissa olosuhteissa ja altistettiin Western blot -analyysillä käyttäen anti-fosfo-Ser

473-AKT (1:1000), anti-kokonais-AKT (1:1000) , anti-fosfo-Ser

235/236-S6 (1:1000), anti-kokonais-S6 (1:1000), anti-fosfo-Thr

37 /46-4E-BP1 (1:1000 ) ja anti-kokonais-4E-BP1 (1:1000). β-aktiini (1:10,000) käytettiin latauskontrollina. Geelikuvat edustavat kolmen erillisen kokeen. B, HEK-293-solut transfektoitu konstitutiivisesti aktiivinen AKT T308D /S473D mutantti (CA-AKT) puuttuessa ja läsnä miR-204 kasvatettiin seerumittomassa kunnossa ja alistettiin western blot-analyysi mitä kuvataan A. C, yliekspressio miR-204 poistetaan BDNF-induced kalvo ruffling ja Rac1 translokaatio. HEK-293-solut transfektoitiin miR-204 tai miR-185, kasvatettiin seerumittomissa olosuhteissa ja käsiteltiin kanssa tai ilman BDNF (100 ng /ml) 10 minuuttia ja värjättiin Rac1 vasta-aineella (punainen) ja FITC-phalloidin (vihreä) . Nuolet osoittavat kalvo poimutuskokoonpanosta alueilla. D, miR-204 lisää herkkyyttä HEK-293 soluja apoptoosin määritettynä anneksiini V /PI-värjäys käyttäen FITC-anneksiini V Apoptosis Detection Kit. Prosenttiosuus solupopulaatio esitetty on keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. E, western blot-analyysi HEK-293-solut transfektoitiin miR-204 käyttäen anti-kaspaasi-3 (1:500) vasta-aine ja anti-PARP (1:1000) osoittavat lisääntynyt pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP. β-aktiini (1:10,000) käytettiin latauskontrollina. Geeli valokuva edustaa kolmen erillisen kokeen.

AKT ohjaa solun invasiivisuus säätelemällä useita prosesseja, jotka ovat mukana aktiini organisaatiossa, solu-solu-adheesion ja solun liikkuvuus [28], [29] , [30]. Sen tutkimiseksi, onko miR-204 voi olla suora rooli tässä prosessissa, arvioimme vaikutusta miR-204 ilmentymisen vaikutus aktivointi pienen GTPaasi proteiinia Rac1, joka toiminnallisesti vuorovaikutuksessa AKT /mTOR ja raportoidaan olevan keskeinen rooli solujen vaeltamiseen ja aktiini uudelleenjärjestely induktion BDNF [31] tai epidermaalisen kasvutekijän (EGF) [28]. Stimulaatio MDA-MB-231-soluja (ja SKOV3 tai HEK-293-solut), jossa BDNF tai EGF indusoima kalvon ruffling ja aiheutti Rac1 olla kuljetettu, että ruffling alueelle (kuvio 5C, kuvio S7, ja dataa ei näytetty). Sen sijaan kalvo ruffling ja Rac1 translokaatio ei havaittu soluissa, jotka yli-ilmentävät miR-204, kun indusoitu BDNF tai EGF: n (kuvio 5C, kuvio S7, ja dataa ei näytetty). Evasion apoptoosin, mikä on kriittistä kasvaimen kasvu ja eteneminen [32] voisi olla toinen mekanismi keskeinen onkogeneesille syövät näytteille menetykseen miR-204. Lisäksi lisääntynyt AKT /mTOR aktiivisuus on myös liitetty laski apoptoosin syövissä [33]. Todellakin, miR-204 yliekspressio aiheutti merkittävän tasojen nousu sekä aktivoitu kaspaasi-3 ja poly ADP riboosi-polymeraasi (PARP), indikaattorit peruuttamatonta vahinkoa eheyden solun ja genomin, jossa on lisääntymiseen myötä apoptoottista aktiivisuutta (kuvio 5D ja 5E). Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että menetys miR-204 edistää kasvainsolujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasio aktivoimalla sen kohdegeenien, joiden tiedetään sääntelyviranomaiset onkogeenisten signalointiryöpyn.

Keskustelu

Monet miRNA liittyy syöpiin tiedetään lokalisoitu genomista hauras sivustoja [34]. Kuitenkin yllättävän vähän tiedetään toiminnallinen merkitys alueiden kanssa kromosomipoikkeavuuksien sisältävien miRNA. On todennäköistä, että alustava geneettinen näytöt (alemman vertaileva genominen hybridisaatio resoluutio), jonka tarkoituksena on löytää kromosomipoikkeavuuksien huomaamatta muutoksia genomialuetta sisältävien miRNA. Koska miRNA vaikuttaa useita geenejä yhdessä tai useammassa polkuja, jotka säätelevät solujen kasvua ja apoptoosin ja edistää kasvainten muodostumista, kun purettu, on tutkittava tarkemmin pienempiä genomialueiden koodaavat miRNA todennäköisesti sisältyy tärkeitä havaintoja mekanismin kasvaimen. Koska useimmat miRNA ehdotetaan vaimentua syövissä, uskomme, että mikrodeleetio geneettisten sisältävien alueiden erityinen miRNA on useammin tapahtuma, joka on tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen ihmisen syövissä ja ansioista enemmän huomiota.

tässä tutkimuksessa osoitettava, että miR-204, joka toimii voimakas kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden vaimentimella on somaattisesti menetetty ihmisen syövissä. Osoitamme, että miR-204 säätelee ilmentymistä ja toimintaa angiogeneesiä proteiinin BDNF ja sen reseptorin TrkB kasvaimissa. Tuloksemme osoittavat, että menetys miR-204 edistää BDNF (tai EGF) aiheuttaman syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota aktivoimalla AKT /mTOR johtava väylä Rac1 translokaatio ja aktiini uudelleenjärjestely. Koska AKT ja Rac1 edellyttävät toisiaan niiden aktivointi [28], [35], meidän havainnot viittaavat siihen, että menetys miR-204 ilmentymistä ihmisen kasvaimet voivat aiheuttaa positiivista palautetta silmukka välillä BDNF /AKT1 /mTOR ja Rac1 aikana syöpäsolun muuttoliike ja invaasio. Tukee tätä, sekä mTOR kompleksit mTORC1 ja mTORC2 on raportoitu säännellä liikkuvuutta ja etäpesäkkeiden kolorektaalisyövän kautta Rac1 signalointireitin [36], ja Rac1 on osoitettu samanaikaisesti säätelemään mTORC1 ja mTORC2 [37]. Lisäksi BDNF, joka aktivoi GTP: hen sitoutuneen Rac1 tasot [38], on osoitettu olevan estää mTOR-estäjä rapamysiini [39]. Nämä tutkimukset yhdessä tuloksemme osoittavat alhaisempia Pakt /pS6K solulinjoissa ja tuumoreissa yliekspressoivat miR-204, viittaavat vahvasti siihen, että BDNF /AKT /mTOR /Rac1 signalointiryöpyn on yksi tärkeimmistä tavoitteista miR-204. Jatkotutkimuksissa pyritään käsittelemään vaikutus miR-204 mTORC1 ja mTORC2 komponentteja kuten Raptor /sin1 todennäköisesti antamaan lisätietoja. Samanlainen kuin BDNF, tuloksemme osoittavat, että miR-204 inhiboi EGF-indusoidun aktivaation Rac1. Tämä on merkittävä, sillä ylikuulumisen välillä EGFR ja BDNF reseptori TrkB on osoitettu aiheuttavan syöpää solujen vaeltamiseen [40] ja vastaus EGF on tärkeä askel aikana syöpäsoluinvaasiota ja on suoraan sidoksissa etäpesäkkeitä [41]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-204 voi olla laajempi merkitys muuttamalla kasvutekijän aiheuttamaa syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota yleensä. Syövän lisäksi solujen vaeltamiseen ja invaasiota, aktivointi BDNF /TrkB signalointi voi myös edistää kiertämisen apoptoosin miR-204 köyhdytettyä solujen BDNF /TrkB yliekspressio on yhdistetty vakauttaminen ja aktivointi AKT mikä laski apoptoosin [42]. Tämän mukaisesti, tuloksemme osoittavat, että miR-204 yliekspressio aiheuttaa alentuneen fosforylaatioon ja aktivointi mTOR loppupään tavoitteiden 4E-BP1 ja S6-kinaasi.

Koska miR-204 oleskelee Euroopan

ohimenevä reseptorin potentiaalia kationin kanava osa 3

(

TRPM3

) geeni, joka on jäsen, ohimenevä reseptorin mahdollisia kanavia perheen proteiineja, joiden tiedetään olevan tärkeitä solun kalsiumin merkinanto- ja homeostaasin, on houkuttelevaa spekuloida, että liittyvien fenotyyppien genomisen menetys kromosomi loci sisältävien miR-204 voidaan myös myötävaikuttanut vastaanottavan geeni

TRPM3

. Tuloksemme osoittavat kasvaimen kasvun estoa ja etäpesäkkeiden seuraava käyttöönotto miR-204 yksinään, eikä muutosta tasot

TRPM3

geenin miR-204 matkivat tai inhibiittori yli-ilmentäviä syöpäsoluja (kuva S8), osoittavat selvästi, että miR-204 liittyvän tuumorisuppressoriproteiinia fenotyyppiä ei välittyvät

TRPM3

. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että miR-204 ja sen isäntä-geenin

TRPM3

toimia synergistisesti säädellä kasvaimen kasvun estoa sekä kasvainten solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Koska selvä rooli

TRPM3

kasvainten synnyssä ei ole raportoitu, yksityiskohtainen tutkimus, jossa tarkastellaan

TRPM3

n potentiaali tuumorisuppressoriproteiinia rooli ja sen synergistinen vaikutus miR-204 (jos sellainen on) on aiheena tuleviin tutkimuksiin.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että geenipaikkojen sisältävät tiettyjä miRNA voi olla syy rooli syövän kasvua ja etäpesäkkeiden säätelemällä avain onkogeeninen kautta. Kyky miR-204 kohdistaa

BDNF Twitter /

TrkB

ja

Erzin

, joilla on merkittävä rooli normaalissa solun prosesseja ja ovat yli-ilmentyy aggressiivisia syöpiä, osoittaa, että miR -204 voi avainsalpalupa sääntelymekanismit, häiriöstä, joka voi altistaa normaalia kehityshäiriöitä /differentiaatiotapahtumiin käymään muutosta. Siksi strategioita, joilla pyritään käyttämällä miR-204 terapeuttisissa hoito on se etu, että peruutettaessa epäasiallisesti aktivoitu vaiheet syöpäsoluissa entistä normaalitilaan. Tunnistaminen miR-204 tehokkaana tuumorisuppressoriproteiinia yhdessä osoitus sen terapeuttista potentiaalia ja vähäinen maksatoksisuuden luoda vahva perusta kehittämiseen miR-204 elinkelpoinen hoito-syöpien hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Normaali ja Tuumorikudoksen Näytteet ja Solulinjat

Solulinjat edustavat lapsipotilailla munuaisten kasvaimet (HEK-293; alkion munuais- solulinja), munasarjojen (SKOV3), ja rinta (MDA-MB-231) syöpiä kokeissa käytettiin, saatiin ATCC: ltä ja viljeltiin protokollien mukaisesti tarjotaan. Seitsemänkymmentä kuusi lapsipotilailla munuaisten kasvaimia ja normaali sovitettu munuaisten hankittiin Lasten Oncology Group (Arcadia, CA). Yksitoista pitkälle munasarjojen kasvaimia ja viisi normaalia munasarjan kudokset saatiin UT MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Viisitoista rintasyöpä kudoksiin ja normaali täsmäsi kudokset saatiin UT Health Science Center (San Antonio, TX).

RNA ja proteiini analyysit

Kokonais-RNA uutettiin kasvaimia ja normaaleista kudoksista, sekä kaikki solulinjat, ja tehtiin qRT-PCR-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [43]. Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [43]. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.