Krooninen sairaus

tiivistelmä

D, L-Sulforaphane (SFN), synteettinen raseeminen analogi parsakaali osatekijän L- sulforaphane, on erittäin lupaava syövän chemopreventive aine

in vivo

teho vastaan ​​kemikaalien aiheuttamien sekä onkogeenin perustuva syövän prekliinisissä jyrsijöiden. Syöpä chemopreventive vaikutus SFN on ominaista G

2 /M vaiheessa solusyklin pysähtymisen, apoptoosin induktio ja inhibitio solumigraation ja invaasiota. Lisäksi SFN estää useita kasvaimia synnyttävän signalointireittien usein hyperaktiivinen ihmisen syövissä, mukaan lukien Nukleaaritekijä-KB, Akt, signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription 3, ja androgeenireseptorin. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli määrittää roolin Notch signalointi, joka on konstitutiivisesti aktiivinen monissa ihmisen syövissä, vuonna syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SFN käyttäen eturauhasen syöpäsolujen mallina. Altistuminen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (PC-3, LNCaP ja /tai LNCaP-C4-2B) ja SFN sekä sen luonnollisesti esiintyvät tio-, sulfinyl-, ja sulfonyyli-analogeja johti pilkkominen (aktivointi) ja Notch1, Notch2, ja Notch4, joka oli mukana alenemiset täyspitkän Notch muotoja varsinkin 16- ja 24-tunnin ajankohtina. SFN -välitteisen pilkkomisen Notch isoformien liittyi sen transkriptionaalista aktivaatiota osoituksena RBP-Jk-, HES-1A /B- ja HEI-1 lusiferaasireportterilla määrityksissä. Migraatio PC-3 ja LNCaP väheni merkittävästi RNA-interferenssi on Notch1 ja Notch2, mutta ei Notch4. Lisäksi SFN estoa PC-3 ja LNCaP solumigraatio oli vain vähän vaikuttanut knockdovvn Notch1 ja Notch2. Silmiinpistävän, SFN antamisen siirtogeeniset Adenokarsinooma Mouse Eturauhasen siirtogeenisiä hiiriä ei lisätä tasoa pilkkoa Notch1, halkaistut Notch2, ja HES-1 proteiinien

in vivo

eturauhasen intraepiteelisen neoplasian, hyvin erilaistunut karsinooma tai huonosti erilaistunut eturauhasen syöpä vaurioita. Nämä tulokset osoittavat, että Notch aktivaatio on pitkälti tarpeeton SFN estoa solujen vaeltamiseen, jotka olisi pidettävä terapeuttinen etu, koska Notch aktivointi on usein ihmisen eturauhasen syöpiä.

Citation: Hahm ER, Chandra-Kuntal K, Desai D, Amin S, Singh SV (2012) Notch aktivointi on tarpeeton D, L-Sulforaphane estoa Human Eturauhassyöpä Cell Migration. PLoS ONE 7 (9): e44957. doi: 10,1371 /journal.pone.0044957

Editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 10 elokuu 2012; Julkaistu: 07 syyskuu 2012

Copyright: © Hahm et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Cancer Institute apurahan CA115498-07. Tämä tutkimus käytti kudosten ja tutkimus patologian laitos tukee avustusta National Cancer Institute (P30 CA047904). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

D, L-Sulforaphane (SFN), synteettinen raseeminen analogi parsakaali johdettujen L-isomeeri (L-SFN), on erittäin lupaava syövän chemopreventive agentti huomattavaa aktiivisuutta prekliinisissä eläinmalleissa [1], [2]. Talalay ja työtoverit oli ensimmäinen tarkkailla ehkäisyyn 9,10-dimetyyli-1,2-bentsantraseeni aiheuttama rintasyöpä rotilla tämä yhdiste [3]. Syöpä chemopreventive tehoa SFN tai L-SFN myöhemmin laajentaa muihin kemiallisiin karsinogeneesiin malleja. Esimerkiksi SFN anto osoitettiin tukahduttaa azoxymethane aiheuttamaa paksusuolen poikkeavaa krypta pesäkkeitä rotilla [4]. Samoin, SFN-hoito johti ehkäisyyn bentso [a] pyreeni-indusoitu forestomach syövän ja estäminen maligni kehittyminen keuhkoissa adenoomien aiheuttama tupakan syöpää aiheuttavaksi 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanoni hiirissä [5 ], [6]. Uudemmat tutkimukset ovat käyttäneet siirtogeenisen hiiren mallia perustaa chemopreventive teho SFN vastaan ​​onkogeenin perustuva syöpiä. Esimerkiksi, ravinnon anto 300 ja 600 ppm SFN 3 viikkoa ApcMin /+ hiirillä johti tukahduttaminen polyyppien ohutsuolen annoksesta riippuvalla tavalla [7]. Aiemmat tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet, että suun kautta letkulla 6 umol SFN (kolmesti viikossa), joka alkaa 6-7 viikon iässä esti merkittävästi ilmaantuvuus ja taakkaa eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) ja /tai hyvin eriytetty eturauhassyöpä (WD ) sekä keuhkojen etäpesäkkeiden moninaisuus siirtogeenisissä Adenokarsinooma Mouse Eturauhasen (TRAMP) hiiret aiheuttamatta sivuvaikutuksia [8]. Yhdenmukainen näiden tietojen [8], 8 viikon ikäisille TRAMP hiirillä ruokittu 240 mg parsakaali ituja /hiiri /päivä näytteillä merkittävä lasku eturauhasen kasvaimen kasvua toisessa tutkimuksessa [9]. Lisäksi kasvu PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ksenosiirrettyjä urospuolisilla atyymisissä hiirillä oli jälkeenjäänyt merkittävästi Suun kautta SFN [10].

Koska lupaavia tuloksia prekliinisissä jyrsijämalleilla [3] – [8], [10] selvittämiseen mekanismin taustalla syöpä chemopreventive vastauksena SFN on ollut aihe intensiivisen tutkimuksen viime vuosikymmenen aikana. Mekanismeja, jotka auttavat syövän kemopreventiossa by SFN ovat: esto CYP2E1 [11], solusyklin pysähtymisen [12], [13], apoptoosin induktio [12], [14], tukahduttaminen angiogeneesin [15], esto histonideasetylaasin [16 ], proteiineihin sitoutuminen [17], induktio vaihe 2 entsyymejä [18], epigeneettiset tukahduttaminen

hTERT

[19], ja esto itseuudistumisen rintasyövän kantasolujen [20]. Mekaaniset tutkimukset käyttäen viljeltyjä syöpäsoluja ovat myös osoittaneet, SFN-välitteisen suppression eri onkogeenisten reittien usein hyperaktiivinen ihmisen syövissä, mukaan lukien ydin- tekijä-KB: n, androgeenireseptorin, Bcl-2, Bcl-x L, ja signaalin anturi- ja aktivaattori transkription 3 [14 ], [21] – [23]. Vaikka aktivointi signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 antaa vaatimaton suojan SFN: n indusoiman apoptoosin, mitokondriot johdettu reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) perehdyttävää signaalin apoptoosin sitoutumisesta syöpäsoluissa altistuu tälle aineelle [14], [24].

Notch signalointi on osallisena eturauhassyövän kehitykseen ja etäpesäkkeiden [25] – [28]. Esimerkiksi tutkimuksessa, johon osallistui kasvain näytteet 154 miestä näkynyt yli-ilmentymisen Jagged-1, Notch ligandi, metastaattisessa eturauhassyöpä verrattuna paikallinen syöpä ja hyvänlaatuinen eturauhasen sairaus [26]. Samoin, Bin Hafeez et ai. [27] löydetty voimistunutta ilmentymistä Notch1 eturauhassyövissä. Lisäksi pudotus on

Notch1

esti hyökkäyksen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen yhdessä matriksin metalloproteinaasi-9: n (MMP-9) ja urokinaasi plasminogeenin aktivaattorin [27]. Down-regulation of Notch1 ja sen ligandi Jagged-1: n on osoitettu estävän proliferaation eturauhassyöpäsolujen [28]. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin viljellyissä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (PC-3, LNCaP ja LNCaP-C4-2B), ja dorsolateral eturauhasen kudoksia ohjaus ja SFN-käsiteltyjen TRAMP-hiirissä [8] selvittää rooli Notch1, Notch2, ja Notch4 in syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SFN.

tulokset

SFN hoito kohonneeseen Pilkottua Notch1, katkaistiin Notch2, ja halkaistut Notch4 in viljellyissä ihmisen eturauhassyövän solut

Notch aktivointi liittyy sitoutumiseen reseptorin viereisen ligandeja seurasi konformationaalisen muutoksen reseptorin ja Notch välittämän pilkkoutumisen γ-sekretaasin kompleksia dasta, joka sijaitsee Notch transmembraanidomeeni [29]. Net tulokset näistä reaktioista on vapauttaa Notch solunsisäisen domeenin sytoplasmaan, joka sitten siirtyy tumaan, säätelemään kohdegeenin ilmentymistä [25], [29]. Käytimme PC-3 (androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhassyöpä-solulinjaa, josta puuttuu toiminnallinen p53), LNCaP (androgeenistä reagoiva ihmisen eturauhassyövän solulinja villityypin p53), ja LNCaP-C4-2B (androgeeni-riippumaton variantti että LNCaP solulinja) tutkia roolia Notch signaloinnin syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on SFN. Tasot pilkkoa Notch1, halkaistut Notch2, ja pilkotaan Notch4 proteiinit kasvanut selvästi käsittelemällä SFN PC-3 (Fig. 1A), LNCaP (Fig. 1 B), ja LNCaP-C4-2B soluja (Fig. 1 C), vaikkakin eri kinetiikkaa. Esimerkiksi, toisin kuin LNCaP-solut (Fig. 1 B), lohkaisu Notch1 käsittelemällä SFN oli ohimenevää (lisääntynyt lohkaisu havaittiin vain 8 hour- ajankohtana) PC-3-solut (Fig. 1A). Molecular perustan solulinjan liittyviä eroja Notch aktivoitumisen SFN ei ole selvä, mutta Notch aktivaatio SFN seurasi lasku tasot täyspitkän Notch1, Notch2, ja Notch4 kussakin solulinjassa varsinkin 16- ja 24 tunnin ajankohtina (Fig. 1A-C). Erityisesti Notch2 oli yleisesti herkempi katkaisun SFN verrattuna Notch1 tai Notch4 (Fig. 1A-C). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että SFN-hoito johti pilkkoutumisen Notch1, Notch2, ja Notch4 sekä androgeenistä riippumaton ja androgeenien reagoiva ihmisen eturauhasen syöpäsolujen.

immunoblottaus pilkottu ja täyspitkän Notch1, Notch2, ja Notch4 käyttämällä lysaatit (A) PC-3, (B) LNCaP, ja (C) LNCaP-C4-2B solujen jälkeen 8-, 16- tai 24-tunnin hoidon DMSO tai SFN (10 tai 20 uM). Blotit stripattiin ja uudelleen koetettiin anti-aktiini-vasta-aine latauskontrollina. Immunoblottaus kullekin proteiinia tehtiin ainakin kahdesti käyttäen itsenäisesti valmis lysaatit. Numerot edellä band edustavat muutoksia proteiinin tasot suhteessa vastaaviin DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin.

Effects of luonnossa esiintyviä analogeja SFN on Notch aktivointi PC-3 ja LNCaP Solut

käytetyt luonnossa esiintyviä tio-, sulfinyl-, ja sulfonyyli-analogeja SFN eri alkyyliketjun pituus (Fig. 2A), voiko aktivointi Notch oli ainutlaatuinen SFN. Kahdeksan tunnin altistuminen PC-3 (Fig. 2B) ja LNCaP (Fig. 2C) ja tio- (Iberverin, Erucin, ja Berteroin) ja sulfinyyli-analogeja (Iberin ja Alyssin) johti lohkaisu Notch1 ja Notch2 (kuvio . 2B, C). Lisäksi tio- ja sulfinyyli-analogit olivat suhteellisen voimakkaampi aiheuttaa pilkkoutumisen Notch1 ja Notch2 verrattuna sulfonyyli-analogeja (Cheirolin, Erysolin, ja Alyssin sulfonin) sekä PC-3 (Fig. 2B) ja LNCaP (kuvio . 2C). Yllättäen tasot pilkottu Notch4 laskivat vaihtelevassa määrin käsittelemällä tio- ja sulfinyyli-analogit mutta ei sulfonyyli-analogeja molemmissa solulinjoissa. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että luonnossa esiintyvät tio- ja sulfinyyli-analogit SFN olivat tehokkaita aiheuttaa pilkkoutumisen Notch1 ja Notch2. Toisaalta, Notch4 aktivointi näyttää ainutlaatuinen SFN.

(A) Kemialliset nimet yleisnimiä, ja kemiallisia kaavoja analogeja käytetään esillä olevassa tutkimuksessa. Immunoblottauksella ja pilkotaan Notch1, Notch2, ja Notch4 käyttämällä lysaatit (B) PC-3, ja (C) LNCaP-soluja sen jälkeen, kun 8 tunnin hoidon DMSO: ssa tai erilaisia ​​analogeja (10 tai 20 uM). Blotit stripattiin ja uudelleen koetettiin anti-aktiini-vasta-aine latauskontrollina. Immunoblottaus kullekin proteiinia tehtiin ainakin kahdesti käyttäen itsenäisesti valmis lysaatit. Numerot edellä band edustavat muutoksia proteiinin tasot suhteessa DMSO-käsiteltyihin kontrollieläimiin.

vaikutus SFN Hoito on transkriptionaalista aktiivisuutta Notch

eteni testata, onko SFN -välitteisen pilkkomisen Notch1 , Notch2, ja Notch4 oli mukana transkription aktivoituminen Notch käyttäen lusiferaasireportterilla määrityksiä. RBP-Jk [C proteiiniin sitoutumisen kerroin 1 /vaimennin on karvaton /Lag1 (CBF1 /Su (H) /Lag 1)] on suora alavirtaan modulaattori Notch signalointi [25], [29]. Altistuminen PC-3 ja LNCaP 20 uM SFN 8 ja /tai 24 tuntia tilastollisesti merkittävän kasvun RBP-Jk lusiferaasireportteri aktiivisuutta (Fig. 3A). Yhdenmukainen Näiden tulosten tasot ydinvoiman HES-1, alavirran kohde Notch, lisättiin upon 24 tunnin hoito PC-3 ja LNCaP SFN verrattuna dimetyylisulfoksidin (DMSO) hoidetun kontrollisoluja (Fig. 3B ). Lusiferaasiaktiivisuus liittyy Notch kohdegeenien

HES-1A /B

ja

HEI-1

(Fig. 3C, D) on myös lisääntynyt merkittävästi käsittelemällä 20 uM SFN eturauhassyöpäsoluissa . Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että SFN-hoito aiheutti transkription aktivaation Notch viljellyissä eturauhasen syöpäsoluja.

(A) vaikutus SFN hoidon RBP-Jk lusiferaasireportteri aktiivisuus (mitta transkriptionaalista aktiivisuutta Notch) PC -3 ja LNCaP jälkeen 8- tai 24-tunnin hoidon DMSO tai 20 uM SFN. (B) Immunofluoresenssi mikroskooppiset kuvaavan ydin- tasoja HES-1-proteiinin PC-3 ja LNCaP-solujen 24 tunnin hoidon DMSO tai 10pM SFN (x 100 tavoite suurennus). (C) HES-1A /B lusiferaasireportterista toimintaa PC-3 ja LNCaP jälkeen 8- tai 24-tunnin hoidon DMSO tai 20 uM SFN. (D) HEY-1 (PC-3-solut) tai HES-1A /B (LNCaP-C4-2B solut) lusiferaasireportterista toimintaa sen jälkeen, 8- tai 24-tunnin hoidon DMSO tai 20 uM SFN. Paneeleissa A, C, ja D, tulokset ovat keskiarvo ± SD (n = 6; yhdistetyt tiedot kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena). * Merkittävästi erilainen (

P

0,05) verrattuna vastaaviin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään Studentin

t

-testi (paneelit A, C, ja D). Kukin koe suoritettiin kahdesti.

vaikutus RNA häiriöt Notch1 on SFN estoa PC-3 ja LNCaP Cell Migration

Down-regulation of Notch1 osoitettiin estävän eturauhasen syöpäsolun muuttoliike ja invaasiota [28]. Siksi suunniteltu kokeet, joissa käytetään PC-3 ja LNCaP määrittää seuraukset Notch1 aktivoinnin SFN estoa solumigraation. PC-3 ja LNCaP-soluja transfektoitiin ohimenevästi Notch1 kohdistettu siRNA osoitti 80%: n tai suurempi väheneminen tasot täyspitkän Notch1 verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu kontrollina siRNA (Fig. 4A). RNA-interferenssi Notch1 yksin johti merkittävään väheneminen PC-3 ja LNCaP migraatiota (Fig. 4B, C). Kuitenkin SFN-estoa PC-3 ja LNCaP solumigraatio oli vain vähän vaikutusta knockdovvn Notch1 (Fig. 4C). Näiden tulosten perusteella päättelemme, että Notch1 aktivaatio on pitkälti tarpeeton SFN estoa eturauhassyövän solumigraation.

(A) immunoblottaus täyspitkän Notch1 proteiinia käyttämällä lysaatit PC-3 ja LNCaP-soluihin väliaikaisesti transfektoitu kontrollina (epäspesifinen) siRNA tai Notch1 kohdistetun siRNA. (B) Kuvat ovat (Boyden kammion määritys) kuvaa migraatio PC-3 ja LNCaP ohjaus (epäspesifinen) siRNA tai Notch1 kohdistettuja siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia DMSO tai 10pM SFN (x 100 suurennus). (C) kvantitointi PC-3 ja LNCaP solujen siirtyminen tiedot esitetään paneelissa B. Kahdesta kolmeen kenttiin kukin suodatin pisteytettiin solujen vaeltamiseen alle käännettyä mikroskooppia. Data edustaa prosenttia solumigraation normalisoidaan ohjata siRNA-transfektoiduissa soluissa, joita käsiteltiin DMSO: ssa (keskiarvo ± SD, n = 6; yhdistetyt tiedot kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena). Merkittävästi erilaiset (

P

0,05)

SESAR-hankkeen vastaavien DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin (jotka on transfektoitu ohjaus siRNA tai Notch1 kohdistettuja siRNA), ja

bbetween ohjaus siRNA transfektoituja soluja ja Notch1 kohdistetun siRNA transfektoitujen solujen yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Kukin koe suoritettiin kahdesti.

vaikutus Notch2 Protein Knockdown on SFN estoa PC-3 ja LNCaP Cell Migration

Olemme osoittaneet aiemmin, että hiljentäminen täyspitkän Notch2 proteiini merkittävästi vähentää muuttoliikettä kyky sekä PC-3 ja LNCaP [30]. Jatkoimme testata Notch2 aktivoitumisen SFN vaikuttaa sen kyky estää PC-3 ja LNCaP solujen vaeltamiseen. Taso täyspitkän Notch2 proteiinin väheni 90% ja 60%, vastaavasti, kun lyhytaikaista transfektiota PC-3 ja LNCaP-solut, joissa on Notch2 kohdistettujen siRNA verrattuna vastaavien solujen, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA (kuvio . 5A). Vastaa meidän aikaisempien havaintojen [30], knockdovvn Notch2 proteiinin yksinään vähensi PC-3 ja LNCaP migraatiota (kuvio. 5B, C). SFN estoa PC-3 ja LNCaP solumigraatio vähäisessä täydennetty RNA-interferenssi on Notch2 (Fig. 5C). Esimerkiksi PC-3 solumigraation estyi 43% ja 18% (yhteensä 59%: n esto), vastaavasti, sen jälkeen, kun 24-tunnin hoidon valvonnan siRNA transfektoitujen solujen 10 uM SFN: n ja RNA: interferenssin Notch2 yksin. Migraatio PC-3 solujen estyi 67% käsittelemällä SFN in Notch2 vaiennetaan soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Notch2 aktivaatio SFN luovuttaa marginaalinen vastustuskykyä sen inhiboiva vaikutus solujen vaeltamiseen.

(A) immunoblottaus täyspitkän Notch2 proteiinia käyttämällä lysaatit PC-3 ja LNCaP-soluja transfektoitiin ohimenevästi ohjaus ( epäspesifinen) siRNA tai Notch2 kohdistetun siRNA. (B) Kuvat ovat (Boyden kammion määritys) kuvaa migraatio PC-3 ja LNCaP ohjaus (epäspesifinen) siRNA tai Notch2 kohdistettuja siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia DMSO tai 10pM SFN (x 100 suurennus). (C) kvantitointi PC-3 ja LNCaP solujen siirtyminen tiedot esitetään paneelissa B. Kahdesta kolmeen kenttiin kukin suodatin pisteytettiin solujen vaeltamiseen alle käännettyä mikroskooppia. Data edustaa prosenttia solumigraation normalisoidaan ohjata siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin DMSO: ssa (keskiarvo ± SD, n = 6; yhdistetyt tiedot kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena). (D) analyysi histoni liittyvien DNA-fragmentti levittämisestä sytosoliin PC-3 ja LNCaP ohjaus (epäspesifinen) siRNA tai Notch2 kohdistettuja siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia DMSO tai SFN. Tulokset edustavat rikastuminen histoni liittyvien DNA-fragmentti vapautumisen sytosoliin suhteessa kontrolliin siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin DMSO: ssa (keskiarvo ± SD, n = 6; yhdistetyt tiedot kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena). Paneeleissa C ja D, merkitsevästi erilainen (

P

0,05)

SESAR-hankkeen vastaavien DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin (jotka on transfektoitu ohjaus siRNA tai Notch2 kohdistettuja siRNA), ja

bbetween ohjaus siRNA transfektoituja soluja ja Notch2 kohdistettu siRNA transfektoitujen solujen yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Kukin koe suoritettiin kahdesti.

O’Neill et al [31] ovat osoittaneet, aiemmin, että Notch2 säätelee apoptoosia ainakin MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpäsoluilla. Siksi oli loogista onko Notch2 aktivointi vaikuttaa SFN: n indusoiman apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 5D, knockdovvn Notch2 proteiinin yksinään ei ollut mitään merkittävää vaikutusta histoni-liittyvä DNA-fragmentti vapautumisen sytosoliin, joka on hyvin hyväksyttyä menetelmää kvantitoimiseksi apoptoosin. SFN-välitteinen histoni-liittyvä DNA-fragmentti levittämisestä sytosoliin oli hieman kumottu kun RNA-interferenssiä Notch2 LNCaP-soluissa, mutta tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä PC-3-solulinjassa (kuvio. 5D). Koska vähäisiä vaikutuksia ja solulinjaa-eroja, voimme päätellä, että Notch2 aktivointi on minimaalinen vaikutus kykyyn SFN apoptoosin ainakin eturauhassyövän soluissa.

Notch4 aktivointi Kulutus SFN estoa PC -3 Cell Migration

Seuraavaksi eteni roolin määrittämiseksi Notch4 aktivaation SFN-inhibitiota solumigraation PC-3-soluja. Taso täyspitkän Notch4 proteiinin väheni 70%, kun lyhytaikaista transfektiota PC-3-solujen kanssa Notch4 kohdistettu siRNA verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA (Fig. 6A). Toisin Notch1 (Fig. 4C) tai Notch2 (Fig. 5C), RNA-interferenssi on Notch4 yksin oli vain vähäinen vaikutus PC-3 solujen vaeltamiseen (Fig. 6B, C). Lisäksi inhibitio PC-3 solumigraation johtuvat SFN altistus ei vaikuttanut RNA-interferenssi on Notch4 (Fig. 6C). Näin ollen aktivaatio Notch4 oli tarpeeton SFN-estoa PC-3 solumigraatio ainakin PC-3-soluja. Vastaavia tutkimuksia käyttäen Notch4 siRNA ei ole tehty LNCaP.

(SFN) -välitteisen esto PC-3 solujen vaeltamiseen. (A) immunoblottaus täyspitkän Notch4 proteiinia käyttämällä lysaatit PC-3-soluja transfektoitiin ohimenevästi ohjaus (epäspesifinen) siRNA tai Notch4 kohdistettu siRNA. (B) Kuvat ovat (Boyden kammion määritys) kuvaa migraatio PC-3-solut transfektoitu kontrollina (epäspesifinen) siRNA tai Notch4 kohdistettuja siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia DMSO tai 10pM SFN (x 100 tavoite suurennus). (C) kvantitointi PC-3 solujen siirtymistä data esitetty paneelissa B. Kahdesta kolmeen kenttiin kukin suodatin pisteytettiin solujen vaeltamiseen alle käännettyä mikroskooppia. Data edustaa prosenttia solumigraation normalisoidaan ohjata siRNA-transfektoiduissa soluissa, joita käsiteltiin DMSO: ssa (keskiarvo ± SD, n = 6; yhdistetyt tiedot kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena).

aSignificantly eri (

P

0,05) verrattuna vastaavaan DMSO-käsiteltyihin kontrolleihin (jotka on transfektoitu ohjaus siRNA tai Notch4 kohdistettuja siRNA) yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Kukin koe suoritettiin kahdesti.

Imzmunohistochemical Analyysi Pilkottua Notch1, katkaistiin Notch2, ja HES-1 Proteiinit Dorsolateral eturauhasen kudososat Ohjaus ja SFN-käsitellyille TRAMP Hiiret

Käytimme arkistoidut parafinoidut eturauhaskudoksiin meidän aiemmin suorittanut TRAMP tutkimus [8] selvittää

in vivo

vaikutus SFN hallinnon tasoilla pilkkoa Notch1, halkaistut Notch2, ja HES-1-proteiineja. Edustaja kuvia lohkaista Notch1, pilkottiin Notch2, ja HES-1-proteiinin ekspression PIN, WD, ja huonosti erilaistunut eturauhassyöpä (PD) valvonta- ja SFN-käsiteltyjen TRAMP-hiirissä on esitetty kuviossa. 7A. Yllättäen SFN hallinto ei lisätä määriä näitä proteiineja PIN, WD, ja PD. Kuitenkin vaatimaton, mutta selvän laskun kokonaistaso pilkkoa Notch2 (yhdistetty ilmentyminen PIN, WD, ja PD) oli havaittavissa dorsolateral eturauhasen SFN-käsiteltyjen TRAMP hiirissä verrattiin kontrolli TRAMP-hiirissä.

(A) edustaja immunohistokemiallisella kuvaavan ilmentymä pilkotun Notch1, halkaistut Notch2, ja HES-1 proteiineja eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN), hyvin erilaistunut eturauhassyöpä (WD), ja huonosti erilaistunut eturauhassyöpä (PD) on dorsolateral eturauhanen alkaen TRAMP hiiristä osoitti ryhmien (× 200 tavoite suurennus). (B) kvantitointi ilmaisun (yhdistetty analyysi PIN, WD, ja PD) on esitetty H-pisteet (keskiarvo ± SD, n = 5). Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin

t

-testissä.

Keskustelu

Notch signalointi on varsin monimutkainen, joihin liittyy vuorovaikutus neljän reseptorin (Notch1, Notch2, Notch3, ja Notch4) ja viisi ligandit [Jagged1, Jagged2, Delta kaltainen ja ligandit (Dll1, Dll3, ja Dll4)] [25], [29]. Notch signalointi on osallisena solukohtalon määrätietoisesti alkion ja aikuisen kudoksissa [32], [33], ja normaalia eturauhasen kehittämiseen sekä synnyssä prostatasyövistä [25]. Yli-ilmentymisen Jagged-1 osoitettiin metastaattisessa eturauhassyöpä verrattuna paikallinen syöpä ja hyvänlaatuinen eturauhasen sairaus [26]. Lisäksi Notch1 pudotus on osoitettu estävän MMP-9 ja hyökkäys PC-3-soluja [27]. Down-regulation of Jagged1 on osoitettu estävän proliferaation eturauhassyöpäsolujen [28]. RNA-interferenssi Notch1 estää eturauhassyövän solumigraatioon ja invaasiota [28]. Esillä oleva tutkimus osoittaa, että SFN-hoito aktivoi Notch-signaloinnin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa riippumatta androgeenin reagointikykyä. SFN-aktivaatio Notch1, Notch2, ja Notch4 on ominaista niiden lohkominen ja lisääntynyt transkriptionaalisen aktiivisuuden. Aktivointi Notch1 ja Notch2, mutta ei Notch4, ei ole ainutlaatuinen SFN kuin jotkut sen luonnossa esiintyvän analogit ovat tehokkaita aiheuttaa pilkkominen sekä Notch1 ja Notch2 PC-3 ja LNCaP. Yhdenmukainen kirjallisuustiedoista [28,] Huomasimme myös, että knockdovvn Notch1 ja Notch2 vähentää siirtymää eturauhassyöpäsolujen riippumatta androgeenin reagointikykyä. Yllättäen Notch aktivaatio SFN on minimaalinen vaikutus sen kykyyn estää eturauhassyövän solujen vaeltamiseen. Erityisesti knockdovvn Notch1, Notch2 tai Notch4 ei ole vaikutusta lainkaan tai vain vähäinen vaikutus SFN estoa eturauhassyövän solumigraation. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Notch aktivaatio on tarpeeton SFN estoa eturauhassyövän solumigraation.

Evidence kertyminen jatkuu osoittamaan, että rakenteellisista eroista luonnossa esiintyvän isotiosyanaatit (ITC) voi syvällisesti vaikuttaa niiden toimintaan. Esimerkiksi, autophagy induktion SFN on suojata apoptoosia vastaan ​​[34]. Päinvastoin, autophagy edistää solun kuoleman induktion fenetyyli-isotiosyanaatti (PEITC) [35], joka on luonnossa esiintyvä ainesosa vesikrassia kanssa rakenteellista samankaltaisuutta SFN (ts läsnäolo ITC funktionaalisen ryhmän). Tämä tutkimus antaa vielä toinen esimerkki havainnollistaa mekanistinen eroja rakenteellisesti samankaltaisten ITC yhdisteiden (esim SFN ja PEITC). Olemme osoittaneet aikaisemmin, että toisin kuin SFN (tässä tutkimuksessa) Notch aktivaatio PEITC estää sen inhiboiva vaikutus eturauhassyövän solumigraation [30]. Nämä havainnot korostavat varovaisuus ekstrapoloitaessa mekanistisiin tulosten välillä rakenteellisesti eri ITC yhdisteitä.

aktivointi Notch2 yliekspressiolla sen solunsisäisen verkkotunnus on osoitettu edistävän apoptoosin MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän solujen [31] . Koska apoptoosin induktio pidetään tärkeä mekanismi syövän kemopreventiossa by SFN [12], [14], se oli kiinnostavaa määrittää seuraukset Notch2 aktivoinnin proapoptoottiset vastaus SFN. Toisin kuin MDA-MB-231-soluja, knockdovvn Notch2 ei ole vaikutusta apoptoosin joko PC-3 tai LNCaP-soluja. Lisäksi SFN: n indusoiman apoptoosin vähän vaikuttaa knockdovvn Notch2 PC-3 ja LNCaP-soluissa. Näin proapoptoottiset rooli Notch2 voi olla ilmiö ainutlaatuinen MDA-MB-231-soluja.

Olemme osoittaneet aiemmin, että SFN hallinto estää esiintymistä ja taakka (ihoalue) PIN ja WD, mutta ei PD, kuten sekä keuhkojen etäpesäkkeiden kirjoa TRAMP hiirillä [8]. Mielenkiintoista, SFN hallinto ei pysty lisäämään tasoja pilkkoa Notch1, halkaistut Notch2 tai HES-1

in vivo

vuonna dorsolateral eturauhasen TRAMP hiirten (tässä tutkimuksessa). Toisaalta, nämä tulokset viittaavat siihen, että ennaltaehkäisy eturauhassyövän SFN TRAMP hiirillä ei liity Notch signalointi. Samalla, mahdollisuutta, että voimakkaampi annostuksella SFN (esim korkeammat pitoisuudet ja päivittäinen hallinto) voidaan vaatia esiin Notch aktivointi

in vivo

ei voida hävittää. Havaittu ristiriita

in vitro

ja

in vivo

järjestelmissä koskee vaikutusta SFN on lovi aktivaatio voi liittyä myös kasvaimen mikroympäristössä. Kuitenkin työtä on jatkettava tutkia näitä mahdollisuuksia.

Yhteenvetona tulokset esillä paitsi paljastaa

in vitro

ja

in vivo

eroja vaikutus SFN on Notch aktivointi, mutta myös osoittavat, että aktivointi Notch1, Notch2, ja Notch4 on pitkälti tarpeeton soluvasteita SFN (esim inhibitio solumigraatio tai apoptoosia) ainakin ihmisen eturauhasen syöpäsoluja.

Methods

Ethics lausunto

Käytimme arkistoituja kudosleikkeiden meidän aiemmin julkaistu

in vivo

tutkimuksessa [8] ja määrittää vaikutus SFN hallinnon ilmaus pilkkoa Notch1, halkaistut Notch2, ja HES-1-proteiinit. Käyttö hiiriä ja niiden hoitoon hyväksyi ja noudattaen University of Pittsburgh Institutional Animal Care ja käytön komitea ohjeita.

Reagenssit ja Solulinjat

SFN syntetisoitiin kuten on kuvannut Conaway et al. [6], kun taas sen luonnossa esiintyvät analogit ostettiin LKT Laboratories (St. Paul, MN). Kantaliuokset SFN ja sen analogit valmistettiin DMSO: ssa, säilytetään -20 ° C: ssa, ja laimennettiin tuoreeseen väliaineeseen välittömästi ennen käyttöä. Sama tilavuus DMSO: ta (lopullinen konsentraatio 0,1%), lisättiin kontrollinäytteestä. Soluviljelmäreagenssit, kuten naudan sikiön seerumia, antibiootteja seokset, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), ja trypsiini ostettiin Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA). Vasta-aineet pilkottu Notch1, ja täyspitkä Notch2 olivat Cell Signaling Technology (Danvers, MA); spesifistä vasta-ainetta havaitsemista varten katkaistun Notch2 oli EMD-Millipore (Billerica, MA); vasta-aineita täyspitkä Notch1, Notch4 (tämä vasta-aine havaitsee molemmat täyspitkät ja pilkotun muodot), ja HES-1 oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); ja anti-aktiini-vasta-aine oli yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Pieni häiritsevät RNA: t kohdistettu Notch1, Notch2, ja Notch4 ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Epäspesifiseen ohjaus siRNA ostettiin yhtiöltä Qiagen (Germantown, MD). PC-3 ja LNCaP ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [14], [24]. LNCaP-C4-2B solulinja hankittiin UroCor ja ylläpidetään ehdotti toimittaja.

immunoblottauksella

kokosolulysaateille valmistettiin, kuten on kuvattu [36], ja sille suoritettiin natriumdodekyylisulfaatti-ti-polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla [36], [37]. Märkä-siirtää kalvoa inkuboitiin sopivan primaarisen ja sekundaarisen vasta-aineita, ja immunoreaktiiviset vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia menetelmällä. Multiplexing tai strippaus /uudelleen hyvää suoritettiin joillekin proteiineille joissakin kokeissa.

Luciferase Reporter Assay

transkriptionaalista aktiivisuutta Notch määritettiin käyttämällä Cignal RBP-Jk lusiferaasireportteri kit (SABiosciences- Qiagen) seuraavasti toimittajan suosituksia. Määrittämistä varten HES-1A /B ja HEY-1 lusiferaasivaikutusta, käytimme pGL2-HES-1A /B ja pGL2-HEY-1 plasmideja avokätisesti antanut meille Dr. Kimberly E. Foreman (Department of Pathology, Loyola University Medical Center, Maywood, IL). Lyhytaikaisesti co-transfektoitujen solujen tulikärpäsen lusiferaasi plasmidi ja renilla lusiferaasi käyttämällä FuGENE6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), käsiteltiin DMSO (kontrolli) tai SFN 8 tai 24 tuntia.