Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MicroRNA ilmentyminen haittasi karsinogeneesissä kuitenkin vähän näyttöä validoida tulokset solusta-line malleja ihmisen syövän kliininen yksilöitä. MicroRNA-21 (mir-21) ja microRNA-143 (mir-143) on aikaisemmin tunnistettu merkittävästi vapautettiin erilaisia ​​syöpiä, kuten kohdunkaulan syöpää. Tavoitteena oli tutkia ilmentymiskuviot useiden hyvin tutkittu microRNA lajien kohdunkaulan näytteistä ja verrata tuloksia solulinjan näytteitä.

Menetelmät /Principal Havainnot

mitattu ilmaus asennuspalveli- 21 ja mir-143 142 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin (FFPE) kohdunkaulan biopsiakudoksesta lohkot, kerätään Dantec Oncology Clinic, Dakar, Senegal. MicroRNA ilmentymisen analyysi suoritettiin käyttäen Taqman-pohjainen reaaliaikainen PCR-määrityksissä. Proteiini immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin myös tutkimaan kohdeproteiinin ekspressiota 72 näytettä. Huomasimme, että mir-21 ilmentyminen lisääntyi pahenemista kliininen diagnoosi mutta mir-143 ei korreloi histologisesti. Nämä havainnot olivat jyrkässä ristiriidassa aikaisempien raporttien liittyy kohdunkaulan syövän solulinjoja, joissa mir-143 oli johdonmukaisesti alassäädetty mutta mir-21 pitkälti ennallaan. Havaitsimme myös, ensimmäistä kertaa, että sytoplasminen ilmentyminen ohjelmoidun solukuoleman Protein 4 PDCD4; tunnettu kohde mir-21) oli merkitsevästi pienempi naisilla invasiivista kohdunkaulan syöpä (ICC) verrattuna niihin, joilla CIN-muutos (2-3) tai karsinooma

in situ

(CIN2-3 /CIS) , vaikka ei ollut merkittävää korrelaatiota mir-21 ja PDCD4 ilme, vaikka aikaisemmat tutkimukset tunnistaa PDCD4 transkriptio tunnettuna mir-21 tavoite.

Johtopäätökset

vaikka microRNA biomarkkerit on useita lupaavia piirteet, lisää tutkimuksia ekspressiotasot histologisesti määritelty kliinisissä vaadita näytteitä tutkimaan kliinistä merkitystä löytö perustuvat tutkimukset. Mir-21 voi olla noin hyödyllisyys ennakoivaa seulonta, koska havaitsimme merkittävä korrelaatio mir-21 ekspressiotason ja pahenemista histologista diagnoosia kohdunkaulan syövän.

Citation: Deftereos G, Corrie SR, Feng Q, Morihara J, Stern J, Hawes SE, et al. (2011) Expression of Mir-21 ja Mir-143 kohdunkaulan näytteistä Vaihtelevat histologisesti Normal läpi invasiivisen kohdunkaulan syövän. PLoS ONE 6 (12): e28423. doi: 10,1371 /journal.pone.0028423

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 22 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 08 marraskuu 2011; Julkaistu: 14 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Deftereos et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa rahoitusosuuksia National Institutes of Health /National Cancer Institutes (NIH /NCI) (R01 CA75920 ja R01 CA115713, Dr. Kiviat) ja Yhdysvaltain Australian Association (Merck Company Foundation Postdoctoral Fellowship; Dr. Corrie). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

varhainen syövän havaitseminen strategiat perustuvat tunnistamista ja tunnustamista biomarkkereita, jotka ovat erittäin osoitus taudin etenemisen normaalista tai precancerous kudoksen varhaisen invasiivisia syöpiä. MikroRNA ovat ryhmä äskettäin löydetty lyhyen RNA-lajeja (~21 nt), jotka osallistuvat geenin ilmentymisen säätelyyn in kudosspesifisellä tavalla, joka vaikuttaa lukuisia solureiteillä kuten proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [1]. On osoitettu, että MikroRNA ovat poikkeavasti säännellään kohdunkaulan syöpä, ja voi toimia tuumorisuppressoreilla tai parantajia eri kudoksissa ja ympäristöissä [2]. Heidän viime löytö on johtanut useita tutkimuksia, joiden tavoitteena on löytää uusia syöpä biomarkkereita (tarkistetaan [3] – [5]), mutta harvat on validoitu kliinisistä näytteistä, erityisesti edustaja syöpää edeltävän sairauden.

MikroRNA ovat kasvavan kiinnostuksen syöpädiagnostiikassa johtuen havainnosta, että yllättävän pienen perheen molekyylit voivat tarjota hienoja spesifisyyttä luokittelussa kudostyypeissä, mikä kehitys- linjaa ja erilaistumista tila. Lu

et al.

Hyödyntämällä tätä käyttämällä microRNA paneelin 217 lajien luokitella huonosti eriytetty kasvaimet suurella konkordanssin taas vertailukelpoinen mRNA sisältävä paneeli ~16,000 lajeja epäonnistui [6]. Jatkotutkimukset ovat osoittaneet mahdollisuuksia MikroRNA erottaa syövän alatyyppejä jossa histologiseen diagnoosi on monimutkainen tai mahdoton, diagnosoida kasvaimet tuntematonta alkuperää ja syövän diagnosoinnissa taipumus [4].

Tutkimukset käyttöä MikroRNA biomarkkereina varhaisen syövän havaitseminen on tunnistettu yllättävä veren ja kudosten vakaus toisin mRNA [7], [8], ja kehittää erittäin herkkä ja spesifinen qPCR menettelyjä on rohkaiseva. Kuitenkin kaikissa tapauksissa tähän mennessä näytteet uutetaan potilasta, jotka olivat jo kehittynyt syöpä [4], joten hyödyllisyys mikroRNA markkerina syövän etenemistä precancerous kautta varhaiseen invasiivisen pahanlaatuisten vaurioiden edelleen tuntematon. Tutkiminen mikroRNA ilmaisun näytteissä ulottuu koko joukko histologisesti määritelty näytteille, normaalista kohdunkaulan syöpä, on selvästi tarvitaan asianmukaisesti määrittää, hyödyllisyyttä mikroRNA ekspressiotasoja kuin syöpä biomarkkereita.

Kohdunkaulan syöpä on sairaus varten joka kerrostuminen histologisia tyyppejä normaalista läpi invasiivisen syövän hyvin ominaista ja tuettu molekyylitekniikkaa perustuen HPV genotyypitys. Kun kuitenkin otetaan huomioon valtava menestys kohdunkaulan seulontoihin vain 35-65% CIN-3 /CIS, 12-20% CIN-2 ja 5% CIN-1 tapausta odotetaan edetä vakavampia muotoja dysplasian tai invasiivisia syöpä – viittaa siihen, että markkereita, joilla on korkeampi ennustearvo progression olisi erittäin toivottavaa [9], [10]. Siksi tunnistettu kohdunkaulan syövän ihanteellisena testinä, joka seuraa muutoksia tiettyihin microRNA ilmaisuja tasoja normaalista kautta precancerous ja syöpäkudokset. Aikaisemmat tutkimukset ovat tunnistaneet useita poikkeuksellisesti säänneltyjen MikroRNA kohdunkaulan syövän solulinjoissa, joissa Mirs-127, 9, 203, 199 a, 218, 21, 143, 205, 214126, 15b, 16, 146A ja 155 yleisimpiä [3 ], [11] – [17]. Kuitenkin vain yksi näistä tutkimuksista sisältyi precancerous kohdunkaulanäytettä (CIN1-3), jossa korkea biologinen vaihtelua todettiin vuonna microRNA ekspressiotasot, varsinkin normaaleissa näytteissä (vaikkakin pieni näyte koot) [16].

tässä tutkimuksessa selvitettiin ekspressioprofiilit kahden MikroRNA (mir-21 ja mir-143) ja niiden aiemmin validoitu kohdeproteiineissa kliinisissä näytteissä naisten HPV-infektio ilman vaurioita, joilla on histologisesti diagnosoitu syövän esiasteista, tai kohdunkaulan syöpä ( ICC), sekä normaali valvonta ilman HPV-infektio. Sekvenssit valittiin perustuu aikaisempien havaintojen muista ryhmistä merkityksellisten vapauttaminen useilla kohdunkaulan syövän solulinjoista ja joitakin rajoitettuja Tuorenäytteissä [12]. Ensisijaisena tavoitteena oli määrittää, jos oli merkittäviä korrelaatioita microRNA ilmaisun ja histologinen tyyppi, joka voi viitata mahdollinen rooli microRNA varhaisena markkerina onkogeeninen potentiaali ennalta leesiottoman HPV-infektion ja /tai etenemisen precancer syöpään. Toiseksi, verrattuna microRNA ilmentymisen kliinisissä näytteissä ja syöpäsolulinjat sen määrittämiseksi, onko solulinjojen tulisi edelleen käyttää perustana kliinisiin tutkimuksiin. Olemme tunnistaneet Merkitsevä yhteys mir-21 ilmentyminen ja histologiset diagnoosi, mutta ei yhdessä mir-143. Tutkimme myös ilmaisua tunnettujen mir-21 kohdeproteiinit (PDCD4, PTEN (fosfataasi ja tensin homologi), TPM1 (tropomyosin 1)) immunohistokemiallisesti analyysi ja tunnistaa Merkitsevä yhteys sytoplasmista PDCD4 ilmaisun ja histologisia diagnoosi. Havaitsimme eroja kliiniset näytteet ja kohdunkaulan syövän solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että kliiniset näytteet on tutkittava validointitarkoituksissa paljastumisen seurauksena ehdokas biologisten merkkiaineiden solulinjassa löytö keskittynyt tutkimuksia.

Tulokset

MicroRNA ilmentyminen kohdunkaulan syövän solulinjoissa

Tutkimme ilmaisua mir-21 ja mir-143 kohdunkaulan syövän solulinjoissa suhteen (Normaali (HRHPV-) vahvistaakseen Aiempien huomautusten. Kuvio 1 osoittaa, että kaikki kolme syövän testatuissa solulinjoissa (SiHa-, CaSki, HeLa), ei ollut johdonmukaista eroa mir-21 ilmentyminen ja että normaalien näytteiden. kuitenkin mir-143 ilmentyminen kaikissa kolmessa syöpäsolulinjojen, väheni huomattavasti suhteessa kliinisistä näytteistä emme kuitenkaan ole liitetty tilastollinen analyysi näiden vertailujen koska eri virheiden jakaumat välillä kliinisissä näytteissä ja solulinjoissa, ja koska meillä olisi vain

n

= 3, kun kyseessä on solulinjojen vertailussa.

Mir-143 oli merkittävästi alassäädetty kaikissa kolmessa kohdunkaulan syövän solulinjoissa yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten. Kuitenkin mir-21 ei ollut merkittävästi erilainen kuin normaali yksilöitä, vaikka aiemmissa tutkimuksissa mir-21 on havaittu olevan merkitsevästi ajan säädellä samalla solulinjoissa.

MicroRNA ilmaisun kliinisissä näytteiden

toisin solulinjaan tietoja, havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä mir-21 ilmentyminen ja histologinen tyyppi kliinisissä näytteissä, mutta ei yhdistys mir-143 (kuvio 2 ja taulukko 1). Naiset, joilla ICC osoitti merkittävästi lisääntynyt mir-21 ekspressiotasot verrattuna naisiin, joilla CIS /CIN2-3, CIN1, normaali (HRHPV +) ja normaali (HRHPV-) (ANOVA,

p

0,0001). Lisäksi naisten CIS /CIN2-3 oli marginaalisesti mir-21 ekspressiotasot verrattuna naisiin, joilla CIN1 (

p

u

= 0,14 ja

p

= 0,24 ) ja normaali (HRHPV +) (

p

u

= 0,07 ja

p

= 0,14). Emme löytäneet yhdistyksen välillä iän tai HRHPV tila ja histologinen tyyppi (tuloksia ei ole esitetty). Sulku 5,06 parhaiten erottaa ICC /Normaali (HPV) populaatiot (määritetty ROC käyrä) ja oli 91% herkkä ja 87% erityisiä. Kuvio 2 esittää, kuinka, että sulku profiloitu kahden muun histologia ryhmää. Vain 5% näytteistä naisilta, jotka ovat Normal (HPV +), 7% CIN 1, ja 24% CIN 2-3 /CIS näytteissä MIR-21 arvo on suurempi kuin 5,06. Mielenkiintoista, 13% näytteistä naisten Normal (HPV) histologia osoitti mir-21 ekspressiotaso on suurempi kuin 5,06.

Toisin kuin solusta-line data esitetään kuviossa 1, havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä lisääntynyt mir-21 ilmentyminen paheneminen histologista diagnoosia, mutta ei merkittävää yhdistysten mir-143. Oli merkitsevä ero kaikkien histologinen ryhmien (ANOVA,

p

-arvo 0,0001) ja lisäksi naisten CIS /CIN2-3 oli hieman korkeampi mir-21 ekspressiotasot verrattuna luokiteltu Normal /HRHPV + (

p

u

= 0,0375

p

= 0,0563).

PDCD4, PTEN ja TPM1 ilmaisun

jotta vaikutuksen tutkimiseksi mir-21 sääntelyn purkamista kudosspesifisiä kohdeproteiinin ilmentymistä kliinisissä näytteissä, mittasimme proteiinin ekspressiotasot PDCD4 ja PTEN immunohistokemiallisesti (IHC) 72 näytteistä testattiin mir-21 ilmentyminen . TPM1 ilmentyminen arvioitiin osajoukko näytteitä, mutta taso TPM1 ilmentymistä kohdunkaulan epiteelin havaittiin olevan alle raja-arvon havaitsemiseen immunohistokemiallisesti. Havaitsimme Merkitsevä yhteys sytoplasman PDCD4 (cPDCD4) ilmaisun ja näyte histologia (taulukko 2, kuva 3 ja kuva 4). Näytteitä naisten ICC oli huomattavasti pienempi cPDCD4 ilmaisu verrattuna niihin, joilla CIN2-3 /CIS (pu = 0,0005 tai pa = 0,003) ja hieman pienempi ilmentyminen verrattuna (HRHPV +) (

p

u

= 0,03 tai

p

= 0,11). Naiset normaalissa (HRHPV-) ryhmässä oli merkitsevästi alempi cPDCD4 ilmaisu verrattuna CIS /CIN2-3 (

p

u

= 0,005 tai

p

= 0,02) . Siellä näytti myös olevan marginaalinen lasku ydin- PDCD4 (nPDCD4) naisilla ICC verrattuna niihin, joilla CIN2-3 /CIS. Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota PDCD4 ilmentymistä (ydin- tai soluliman) ja mir-21 ilmentyminen näissä näytteissä, mutta havaitsimme yleistä ryhmittymä ICC korkean mir-21, mutta ei PDCD4, ja CIN-2,3 /CIS korkeamman PDCD4 mutta ei-koholla mir-21 (kuvio 4). Ei myöskään ollut yhdistyksen välillä PTEN-proteiinin ekspression ja näytteen histologia tai microRNA ilme. Mietimme analysoimalla IHC sekä taajuuden enimmäisvoimakkuudesta pisteet ja taajuus hallitseva voimakkuuden pisteet. Olemme kuitenkin havaittu samanlaisia ​​tuloksia verrattuna komposiitti pisteet analyysejä ja ei ole mitään hyötyä käyttää taajuuden intensiteetti tulokset yli komposiitti tulokset.

Tässä havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä sytoplasmista PDCD4 ilmaisun ja näyte histologia.

keskustelu

Vaikka microRNA ilmaisun profilointi on osoitettu olevan erittäin spesifinen syövän kirjoittamista, kasvain diagnoosin ja tunnistaa kasvainten alkuperä on tuntematon, se ei ole vielä selkeää jos MikroRNA voi suorittaa merkkiaineina taudin etenemistä – kriittinen vaatimus eritellään ne olosuhteet, jotka vaativat hoitoa. Ihannetapauksessa tällaiset markkereita etenemisen osoittaisi systemaattista muutoksia ilmaisun precancerous kudoksissa, mikä korreloi sairauden etenemistä kohdunkaulan syöpä. On selvää, mikä vaatii suuria määriä kliinistä näytettä, jotka kattavat erilaisia ​​histologisesti määritelty kudostyypeissä mukana taudin etenemistä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ekspressiotasot kaksi keskeistä MikroRNA tunnistettu kirjallisuudessa (ja niiden validoitu proteeinikohteet) kohdunkaulan kudokseen ositettu histologista diagnoosia, jotta voidaan määrittää niiden hyödyllisyys biomarkkereina varhaisen syövän diagnosointiin. Huomasimme, että mir-21 ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt vain ICC suhteessa muihin kliinisissä näytteissä ja että mir-143 ilmaisua ei korreloinut histologia lainkaan. Kohdunkaulan syöpä solulinja tuloksia, kun taas yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten samoilla solulinjoilla, näytti antaa ristiriitaisia ​​microRNA ilmaisun tuloksia verrattuna kliinisissä näytteissä. Mielenkiintoista, PDCD4 proteiinin ilmentyminen lisääntyi syövän esiasteita laski sitten merkittävästi ICC, mahdollisesti vaikutuksena mir-21 aiheuttama hiljentäminen. Nämä tulokset korostavat tarvetta lisätutkimuksia keskitytään kudosten profilointia mieluummin solulinjoissa, jossa ekspressiotasot ehdokas MicroRNA biomarkkereiden voidaan arvioida syöpää edeltävän sairauden, jossa niiden hyödyllisyys syöpädiagnostiikassa osoittautuisi eniten hyötyä. Havaitsimme avain epäjohdonmukaisuutta microRNA ekspressioprofiileja meidän kliinisissä näytteissä verrattuna kohdunkaulan syövän solulinjoja. Kuitenkin viime aikoina tutkimukset osoittavat merkittäviä eroja microRNA ilme perustuu Soluviljelyolosuhteiden viittaa siihen, että solulinjakokeissa ehkä ole erityisen informatiivinen etsittäessä kliinisesti merkittäviä MikroRNA [12]. Cheng

et al.

2005 [18] osoitti merkittävää kasvua HeLa solujen kasvua ja jakautumista vasteena eston mir-21, kun taas Yao

et al

2009 [14] osoittivat merkittävää vähenemistä solujen kasvun ja lisääntymisen samasta hoidosta. Wang

et al

2008 [12] osoitti lisäksi, että muuttuvat viljelyolosuhteet peräisin monokulttuuria suspensioon lautta kulttuuri johtanut täysin eri joukko merkittävästi vapautettu MikroRNA. Samanlaisia ​​ristiriitainen tuloksia on nähty muissa tutkimuksissa tutkitaan merkitystä soluviljelymalleissa verrattuna

in vivo

kudoksessa pallomaisia ​​viljelmiä [19], [20]. Myös muut geenin /proteiinin ilmentymisen eroja on äskettäin tunnistettu, mukaan lukien läsnäolo WNT5A ilmentymisen syöpien (ei ilmaistu solulinjoissa) [21], ja erot DNA: n metylaatio [22] ja geenin ilmentymistä [23] allekirjoituksia peräsuolen karsinoomat ja paksusuolen syövän solulinjat. On selvää, että keskeinen ongelma solulinjan lähestymistapa on, että mahdolliset biomarkkereiden havaitaan soluissa kuolemattomiksi invasiivisen syövät – se on usein täysin tuntematon, jos nämä biomarkkerit voidaan havaita syöpää edeltävän sairauden, joka vaatii analyysiä kliinisistä näytteistä. Tilannetta vaikeuttaa vielä nykyisessä tutkimuksessa voi olla rotutaustansa (Länsi-Afrikkalainen) verrattuna syöpäsolun linjat, jotka ovat valkoihoinen – kuitenkin vain vähän tietoa saatavilla tällaista vaihtelua.

Lisääntynyt mir-21 ilmentyminen on tunnistettu suuri määrä kasvaintyypeissä [24] – [29], ja tämä tutkimus on osoittanut merkittävää yhteyttä kehittämistä histologisesti määritelty ICC. Lisäksi tuloksemme osoittavat, että mir-21 voi olla noin hyödyllisyys ennustaa etenemistä syövän esiasteista osaksi ICC, kuten naisten korkea mir-21 arvot voidaan olettaa edetä. Kuitenkin lisätutkimuksia, joissa suurempi otoskoko ja potilaiden seurantaan tarvitaan tutkimaan tätä näkökohtaa, koska on selvästi riittävästi tietoa asianmukaisen testauksen Tämän hypoteesin jakamalla koulutukseen ja testaus sarjaa. Lisäksi vaikka mir-21 ekspressiotasot naisten normaali patologian ja ilman HRHPV infektiota eivät ole tilastollisesti erilaisia, HRHPV- ryhmä osoitti noin kaksinkertainen määrä näytteitä yläpuolella optimaalisen cut-off verrattuna HRHPV + ryhmä. Tämän merkitys tulos on jälleen vaikea arvioida määrällisesti johtuen suhteellisen alhainen otoskoot mukana, mutta se voi osoittaa, että paneeli biomarkkereiden voi olla tarpeen vähentää vääriä positiivisia.

Useat tutkimukset ovat todenneet mir -143 kuten merkittävästi ali-ilmentynyt syövän, mukaan lukien rinta- ja kohdunkaulan syöpiä [12], [17], [30]. Vaikka olemme myös havaittu merkittäviä ali kohdunkaulan syövän solulinjoissa nähden normaali (HRHPV-) näytteet, emme löytäneet mitään tilastollisesti merkitseviä suhteessa kliiniset näytteet naisilta useilla eri neoplastisten sairauksien. Aiemmat tutkimukset tutkivat microRNA ilmaisun kohdunkaulan näytteistä osoitti jälleen kerran ristiriitaisia ​​tuloksia. Lee

et al

2008 [11] ei sisältynyt myöskään mir-21 tai mir-143 alkuperäisen seulonta kokeet ja sellaisenaan eivät nimenneet näistä lajeista olevan osallisena syövän kehittymisen; Tämä korostaa selvä haaste löytämään potentiaalisia biomarkkereiden tapauksissa, joissa johtava ehdokkaita ohitetaan. Kuitenkin Wang

et al

2008 [12] viittasi siihen, että vähentäminen mir-143 vaadittiin kasvainten kehittymiseen samalla Lui

et al

2007 [17] osoitti sekoitettu tulokset mir-143, pääasiassa alhaisen ilmentymisen taso havaittu joko normaalissa tai syöpä näytteitä. Epäjohdonmukaisuudet saattaa johtua suhteellisen alhainen mir-143 ilmentymisen kohdunkaulan kudoksissa, mikä voi edellyttää tarkempaa uuttomenetelmällä (

esim

laser mikrodissektion) kasvaimen louhinta – mikään tutkimuksista ei lueteltu tässä käytetään tällaisia ​​menetelmiä.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että PDCD4, PTEN ja TPM1 ovat kaikki selostukset kohdistetaan mir-21 eri kudoksissa [14], [17], [24], [26], [31], [32] ja että PTEN vähitellen ali-ilmentynyt normaalista kudoksesta läpi kohdunkaulan syöpä [33] – [35]. Eräs viimeaikainen tutkimus on myös raportoitu vähentänyt PDCD4 ilmentymistä kohdunkaulan syövän solulinjoissa [14], joka on yhtä mieltä havaintomme kliinisessä tutkitut näytteet tässä tutkimuksessa. Itse asiassa viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet paitsi suora suhde PDCD4 ilmaisun ja kasvaimen etenemiseen (Wei

et al

, 2009 [36]), mutta myös keskeinen rooli PDCD4 ja mir-21 apoptoottista tulehdusvastetta (Sheedy

et al

, 2009 [37]). Lisäksi viimeaikaiset solumallin tutkimukset tukevat viittaavat rooli menetys PDCD4 ilmentymisen lisääntynyt herkkyys solujen aineet, jotka vaurioittavat DNA: ta (Singh

et ai

, 2009 [38]), jotka kaikki voidaan odottaa tarjottava suotuisat olosuhteet kasvaimen kasvua. Hiiriä, jotka ekspressoivat korkeita tasoja PDCD4 ovat myös vastustuskykyisiä kasvaimen kasvua verrattuna normaaleihin kontrolleihin. Me hypoteesin että cPDCD4 ilmaisun (ja vähemmässä määrin, nPDCD4 lauseke) lisääntyy syöpää edeltävän yksilöitä lisääntyneen apoptoosin, jota seurasi jyrkkä lasku lausekkeen ICC yksilöitä, jossa apoptoottiset mekanismit kyseenalaistettu. Samanlaisia ​​suuntauksia on havaittu muita tuumorisuppressorigeeneille suhteessa onkogeneesiin ja apoptoosin [39], [40]. Mielenkiintoista, emme tunnistamaan korrelaatio PTEN ilmaisun ja histologista diagnoosia; menetys ilmentyminen on aiemmin on huomattu, ja on havaittu, alempi ilmentyminen rintasyövän tutkimuksessa, jossa käytettiin samoja menetelmiä (tuloksia ei ole esitetty).

Tässä tutkimuksessa olemme havainneet, että ilmentymistaso mir-21 on korreloi merkitsevästi histologisia diagnoosi ICC. Tunnettu tavoite mir-21, PDCD4 myös vaimentua mutta ei merkittävästi korreloi mir-21 ilme. Expression of mir-143 ei korreloi histologista diagnoosia kliiniset näytteet, mutta se oli merkitsevästi alassäädetty kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Nämä havainnot ovat tärkeitä pyrkimyksissä mitata hyödyllisyyttä MicroRNA biomarkkereita diagnostisia sovelluksia varten, joka on keskeinen osa, joka on mitata ilmentymistasoihin precancerous kudoksissa sekä normaali ja invasiivisia syöpiä. On selvää, tulevan työn on keskityttävä kliinisesti merkittäviä näytteitä, joissa ennakoivaa markkereita ilmaistu ennalta syöpäkudoksen voidaan tunnistaa edelleen vahvistettavaksi.

Materiaalit ja menetelmät

Valinta MikroRNA

Mirs tutkittu tässä tutkimuksessa valittiin perustuu aikaisempien havaintojen kirjallisuudessa (taulukko 3). Me määritelty, että kunkin microRNA pitäisi myös olla kokeellisesti todistettu mRNA kohde tai asettaa kohdegeenien ja ainakin yksi ennustettu tavoitteet oli raportoidaan mukana kasvaimen synnyssä ja etenemistä kohdunkaulan tai muiden kasvaimien (perustuen sekvensseihin miRBase tietokantaan [ ,,,0],41] – [43]). MiR-21 on raportoitu yli-ilmentynyt useissa syövistä [29], [44] ja tavoitteet selostukset

PTEN

[24],

TPM1

[26] ja

PDCD4

[14], [31], [32] geenejä, kun taas miR-143 on ali-ilmentynyt monissa syövissä ja tavoitteet

ERK5

selostukset [17], [29], [30]. Sekä mir-21 yli-ilmentymisen ja mir-143 ali on havaittu kohdunkaulan syövän solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä [12], [17].

Näytteet

Kliiniset näytteet kerättiin Dantec Oncology Clinic, Dakar, Senegal tutkimuksista kohdunkaulasyövän [45]; kaikki tutkimus menettelyjä hyväksyi laitoksen tarkastuslautakunta yliopiston Washington (Seattle, WA) ja University of Dakar (Dakar, Senegal) ja tietoisen kirjallisen suostumuksen saatiin TET. Histologinen diagnoosit tuotettiin University of Washington, Patologian osasto, Harborview Medical Center, Seattle, WA, jonka patologi (NBK). Näytteitä kerättiin mukana 142 kohdunkaulan biopsiat säilynyt FFPE kudosblokeista. HPV tehtiin genotyypin kuten aiemmin on kuvattu [46], jossa on korkean riskin HPV (HRHPV) alatyyppien HPV16 /18/26/31/33/35/39/45/51/52/53/56/58/59/66 /67/68/73/82 määrittelemien Munoz

et. al.

2006 [47]. Kliiniset näytteet ryhmiteltiin histologisen diagnoosin, jossa ryhmät määritellään hoito-ohjelmat kohti nykyisiä suuntaviivoja [48]. Normaali (HRHPV-) yksilöi ne naiset, joilla on normaali histologia ja negatiivinen testitulos varten HRHPV (

n

= 23). Normaali (HRHPV +) osoitti niille naisille, joilla on normaali histologia ja positiivinen testi HRHPV (

n

= 21). Lievästi dysplastic CIN1 vaurioita (

n

= 15) tyypillisesti spontaanisti taantuvat ja naisten nämä vauriot ovat yleensä seuranneet toista Papakokeen. Naiset, joilla precancerous CIN2-3 /CIS leesioita (

n

= 51) olisivat kaikki ohjattiin hoitoon estää kehitystä invasiivisen sairauden ICC (

n

= 23). Nämä ryhmittymät pystyimme onko microRNA biomarkkerit tutkittavana voisi tunnistaa eri vaiheissa kasvainsairaus jotka edellyttävät erilaisia ​​kliinisen hoidon. Keskimääräinen ikä 133 aiheita, jotka kliinisistä näytteistä käytettiin oli 44 vaihtelee 29-72 vuotta. Kaikki neljä histologinen ryhmät olivat taajuus Hyväksytty iän saavuttamiseksi samanlainen ikäjakauma ja välineet, jotka vaihtelivat 43 ja 45 vuotta. Solulinjoja ja elatusaineet hankittiin ATCC Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA).

MicroRNA qPCR ilmentymisen analyysi

uuttaminen mikroRNA lohkoista suoritettiin käyttäen RECOVERALL- Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ainoa muutos oli se, että solulinjan Uuton parafiinit vaiheet pois neuvojen Applied Biosystems henkilöstöä. Käänteistranskriptio (RT) reaktio ja määrällinen polymeraasiketjureaktioissa (qPCR) suoritettiin käyttäen MicroRNA TaqMan Reverse Transcription Kit ja TaqMan MicroRNA määritykset (Applied BioSystems) ja mir-21, mir-143 ja RNU6B ohjaus shRNA. RT ja qPCR varten RNU6B ohjaus shRNA analyysi tehtiin side-by-side kanssa mir-21 ja mir-143 reaktioita jokaisesta näytteestä. Standardikäyrä tuotettu uuttamalla kokonais-RNA VK2 soluista ja suorittamalla RT reaktiot 10-kertaisia, myöhemmin myös kukin sarjalaimennoksesta kussakin qPCR aikavälillä koko tutkimuksen.

immunohistokemia

PDCD4 kanin polyklonaalinen vasta-aine ja TPM1 hiiren monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Abcam (Abcam Inc., Cambridge MA, ab51495, ab17784 vastaavasti), PTEN hiiren monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Dako (Dako Corporation, Carpinteria, CA, klooni 6H2.1) Four- mikronin leikkeitä, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudosta leikattiin ja asetettiin Superfrost Plus mikroskoopin. Kudosleikkeissä poistettiin parafiini ja rehydratoitiin läpi sarjan porrastettu alkoholeja. Antigeeni haku toteutettiin Tris /EDTA pH 9,0 puskuri pöydälle autoklaavissa. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% H

2O

2. Primaaristen vasta-aineiden vaihdeltiin määrittää optimaalisen vasta-aineen konsentraatio tuloksena voimakkain värjäytyminen ilman taustaa. Vasta-aineet PDCD4 laimennettiin 1:2000 ja PTEN-vasta laimennettiin 1:500 ja kumpaankin dia. TPM1 vasta-aine laimennettiin 1:100.The objektilasit pestiin ImmPRESS (Vector Laboratories, Burlingame, CA), sitten anti-hiiri (ja PTEN ja TPM1) ja anti-kani (for PDCD4) IgG polymeroitujen toimittaja entsyymi on sovellettu kuhunkin kudokseen. Värin kehitys suoritettiin inkuboimalla diaminobentsidiinillä (Dako). Levyjä vastavär- vuonna hematoksyliinillä (Dako), kuivatut kautta porrastettu alkoholeja, kirkastettiin ksyleenissä ja peitettiin Kiinnitysliiman media. Negatiivinen kudos kontrolli ajettiin kussakin kudoksessa, jossa vasta-aine laimennusaineen puskuri korvattiin primaarisen vasta-aineen. Lisäksi, positiivinen kontrolli kudosten tiedetään ilmentävän kysymyksessä oleva antigeeni ajettiin yhdessä kunkin erän dioja. PDCD4 ja PTEN värjäytyminen arvioitiin puolittain määrällisesti käyttäen H-pisteet pisteytys menetelmällä [49]. Kvantitointimenetelmä otetaan huomioon värjäytymisen intensiteettiä ja solujen prosenttiosuus värjäämällä tietyllä voimakkuudella. Värjäys intensiteetti pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (kohtalainen värjäytyminen), 3 (voimakas värjäytyminen). Kukin intensiteetti pisteet kerrottiin solujen prosenttiosuus värjäys tällä tasolla. Tuloksena arvot laskettiin yhteen, jolloin saatiin komposiitti pisteet välillä 0 300. PDCD4 ja PTEN ilmentyminen arvioitiin sekä ydin- ja sytoplasman osastoja.

tilastolliset menetelmät

Taqman qPCR reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena redundanssi ja Ct-arvoja muutetaan suhde nähden RNU6B valvontaa. Non-syöpä ohjaus ei taajuus samanikäisiin tapauksia, joissa on kohdunkaulan syöpä. Arvot Molempien MikroRNA olivat log

10-transformoidut normalisoimiseksi jakeluun nämä mittaukset kaikille tilastolliset analyysit. ANOVA käytettiin vertailla histologinen ryhmien suhteen jatkuvan tekijöihin kiinnostava. P-arvot ilmoitetaan oikaisematon (

p

u

) ja säädettiin monimuuttujille väärien löytö hinnat (

p

). Vastaanotin Operating (ROC) käyriä arviointiin käytettiin ennustettavuutta kohdunkaulan taudin etenemistä. Optimaalinen cutoffs määritettiin parhaiten erottamaan Normal (HPV) naiset naisten ICC. Kaksipuolinen 0,05 testi taso määritetään tilastollisesti merkitsevä kaikkien analyysit. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SAS versiossa 9,2 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Kiitokset

Tekijät haluavat tunnustaa Pap Toure, Papa Salif Sow, ja Amadou Dembélé niiden kliininen työ, rekrytointi ja tutkimuspotilaiden ja kokoelma yksilöiden Senegalissa. Lisäksi olemme kiittää Donna Kenney ja Limin Hu niiden teknistä apua tallentamiseen, valmistelussa ja leikkuun näytteen lohkoja.