Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli vuosikymmenen, sytokiini interleukiini-12 (IL-12) on hyödynnetty, joko yksin tai yhdessä muiden lääkkeiden, kuten syövän hoitoon. Lukuisat anti-kasvain ominaisuuksia IL-12 vielä herättää kiinnostusta kliiniseen käyttöön tämän sytokiinin, vaikka se on osoittanut myrkyllinen ylläpitäjä systeemisesti. Koska lähestymistapa voittaa tämän myrkyllisyys, useat laboratoriot ovat yrittäneet saada aikaan IL-12 ilmentyminen on kasvaimen. Kuitenkin kasvaimia, jotka ovat vaikeita poistaa kirurgisesti tai hoitoon levittää etäpesäkkeitä, systeeminen ilmentyminen tämän sytokiinin edelleen on tehokkain antotapa. Kuitenkin löytää vaihtoehtoisia lähestymistapoja käytön IL-12: n syövän ja purkautumassa perusteella IL-12-sivuvaikutuksia edelleen haaste. Esillä olevassa työssä me osoittavat, että systeeminen IL-12: sta hydrodynaamisen injektion IL-12-cDNA pystyy aiheuttamaan erilaisia ​​maksaleesioiden liittyy myrkyllisiä patologian. Kuitenkin me raportoimme tässä, että maksatoksisuus on vähentynyt ja selviytymistä hiirten tehostetun puuttuessa tuumorinekroositekijä alfa (TNFa). Tämä havainto on vastoin useita hiiren malleja ja kliinisissä kokeissa, että olettaa, interferoni-gamma (IFNy) on tärkein sytokiinin vastaavat IL-12 toksisuutta. Lisäksi työmme osoittaa, että kun IL-12-cDNA on co-ruiskutettiin IL-18-cDNA: n tai silloin, kun hiiriä esikäsitellään pienellä annoksella IL-12-cDNA ennen saavat suuren annoksen IL-12-cDNA, systeemisiä TNFa: n on lähes täysin kumottu, mikä parantaa selviytymistä ja vähemmän maksavaurioita. Tärkeää on, kumota TNFa signalointi ei vaikuta voimakas antituumorivaikutus IL-12. Siten neutraloivat TNFa antagonisteilla on jo hyväksytty ihmisten käyttöön tarjoaa lupaavan lähestymistavan kumota IL-12 sivuvaikutuksia käytön aikana tämän sytokiinin varten syövän hoitoon.

Citation: Barrios B, Baez NS, Reynolds D , Iribarren P, Cejas H, Young HA, et ai. (2014) kumoaminen TNFa aikana Syöpä immunoterapia on ratkaiseva vaimentamiseksi Side Effects Koska systeeminen IL-12. PLoS ONE 9 (2): e90116. doi: 10,1371 /journal.pone.0090116

Editor: Irving Coy Allen, Virginia Tech University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 syyskuu 2013; Hyväksytty: 27 tammikuu 2014; Julkaistu: 28 helmikuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä projekti on rahoitettu osittain liittovaltion varoja Intramural tutkimusohjelma Center for Cancer Research, National Cancer Institute (NCI) , National Institutes of Health, ja myös Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (Argentiina) ja Secretaria de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de Córdoba (SeCyT-UNC, Argentiina). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

immuunivastetta ja anti-angiogeenisten toimintoja IL-12 ovat antaneet perustelut hyödyntää tämän sytokiinin syöpälääkkeenä. Yli kymmenen vuotta sitten, kliinisiä kokeita annettaessa IL-12 kasvainten hoidossa, mukaan lukien T-solujen lymfooma [1], non-Hodgkin-lymfooma [2], melanooma [3], munasarjasyöpä [4], Kaposin sarkooma [5] , ja munuaiskarsinooma [6] aloitettiin. Systeeminen IL-12: n osoitettiin kykenevän estämään tuumorin kasvua, metastaasia, ja angiogeneesi

in vivo

[7] – [11], mutta sen käyttö on liittynyt merkittäviä annoksesta ja aikataulun riippuvainen toksisuus, muodostaa huomattavan esteen sen kliinisen käytön [1], [3], [4], [6], [7]. Luokka 1-4 toksisuus, on estänyt käyttöä IL-12, kuten syövän hoidossa. Kuitenkin vaihtoehtoisia lähestymistapoja käyttöön IL-12 ovat tehostetussa tutkimuksen syövän eläinmalleissa ja viime kliinisissä tutkimuksissa [12] – [16].

Useat kliiniset kokeet käyttäen IL-12 ovat osoittaneet, että lisääntynyt tasoilla tulehdusta aiheuttavien sytokiinien IFNy olivat yhteydessä eri laatuja maksatoksisuuden ja muiden myrkyllisten sivuvaikutuksia [2], [4], [6], [17]. Lisäksi useissa hiiren malleissa IFNy ilmaisu indusoi jälkeen IL-12 annon todettiin olevan vastuussa suurimmasta osasta havaittujen haittavaikutusten [18] – [21].

hyödyntäminen eri kasvainten hiirimallissa, olemme aiemmin on raportoitu, että systeemisiä IL-12 yksinään tai yhdessä IL-18 indusoi jälkeen hydrodynaaminen injektion vastaavien cDNA: iden, kumosi kokonaan ihonalainen kasvaimen kasvua ja keuhkojen ja maksan etäpesäkkeiden [10]. Lisäksi, co-IL-12 + IL-18 pystyi parantamaan selviytymistä vähentämällä IL-12-sivuvaikutuksia [10]. Aikaisemmat työ osoitti myös, että IFNy oli osittain vastuussa IL-12-sivuvaikutuksia. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että lisääntynyt eloonjääminen IL-12 + IL-18: lla hoidetuissa hiirissä liittyy varhaisen IL-10: n tuotantoa ja vähentää IFNy ja TNFa seerumissa [10]. Tässä yhteydessä esillä oleva työ osoittaa, että käyttämällä hydrodynaamista injektio aiheuttaa systeemisen co-IL-12 + IL-18-cDNA: iden tai pre-ruiskuttamalla matalan annoksen IL-12-cDNA ennen suuren annoksen IL-12 cDNA, havaitsimme merkittävästi elonjäämisetua ja vähentynyt hepatotoxicity. Mielenkiintoista, molemmat menetelmät osoittavat, että tämä vaikutus on erittäin liittyy kumoamisen TNFa ilmaisun, tulehduksellinen sytokiini joka soittaa myös patologinen rooli sepsiksen sokki ja

in vivo

LPS hoito [22] – [25]. Yhdessä tiedot esitetään tässä työssä edistää ymmärrystämme perusta IL-12-systeemisiä sivuvaikutuksia. Lisäksi ehdotamme, että riippuen järjestelmää käytetään aiheuttaa systeemisiä IL-12 ilmentyminen; Eri myrkyllinen välittäjien voisi olla päähenkilöt haitallisia sivuvaikutuksia. Lisäksi tiedot esitetään tässä käsikirjoitus voi toimia pohjana uusien lähestymistapojen vähentää IL-12 myrkyllisyys suunniteltaessa tulevia hoitoja syövän hoitoon, joihin liittyy tämän sytokiinin.

Materiaalit ja menetelmät

hiiret ja solulinjat

C57BL /6 (B6) hiirillä, 6-10 viikkoa ikäisiä, käytettiin ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Indusoituva typpioksidin (iNOS) knock out (KO), TNFa KO ja TNFa-reseptorin yksi (TNFαR1) KO hiiriä C57BL /6 geneettinen tausta ostettiin Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, Yhdysvallat. Eläinten hoito annettiin mukaisesti esitettyjen menettelyjen oppaassa Care ja käyttö Laboratory Animals (NIH-julkaisu nro 86-23, 1985). Kokeelliset protokollat ​​hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Eläinpalvelussa on saanut NIH eläinten hyvinvoinnin varmuuden (varmuus no. A5802-01, toimisto Laboratory Animal Welfare, NIH, Bethesda, MD, USA). Jotta vältetään eläinten kärsimykset, hiiret nopeasti tapettiin katkaisemalla kaula. Aikana pernansisäistä (i.s.) tuumorisoluinjektion lyhyemmän ajan leikkauksen levitettiin ja viillot tehtiin mahdollisimman pieneksi menettelyn aikana. Aikana leikkauksesta toipumisen, hiiret laitettiin lämmintä huopia ja heidän silmänsä hydratoitiin suolaliuosta. Eläimet laitettiin takaisin häkkeihin jälkeen yhteensä toipuminen leikkauksesta.

B16-F10-melanoomasoluja hankittiin American Type Culture Collection. Solulinja oli vapaa Mycoplasma-infektio ja testattiin PCR: n välein 6 kuukautta. B16-F10-melanoomasoluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja ei-välttämättömiä aminohappoja 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Hydrodynaaminen cDNA injektiot

hydrodynaaminen geeninsiirto menettely on kuvattu aiemmin [10], [26]. Lyhyesti, eläimet injektoitiin häntälaskimoon alle 8 sekunnissa vastaavien cDNA liuotetaan 1,6 ml: aan steriiliä 0,9% natriumkloridiliuosta ja jaettu 3 ryhmään, kontrolli: 5-15 ug ORF tyhjän vektorin ohjaus cDNA, IL 12: 5 ug IL-12-cDNA (pscIL-12, p40-p35-fuusiogeenin) ja IL-12 + IL-18: 5 ug IL-12-cDNA (pscIL-12, p40-p35-fuusiogeenin) plus 10 ug: IL-18-cDNA: n (PDEF pro-IL-18). Kaikki plasmidit hyödyntää ihmisen venymä 1-α promoottori transkription ohjaamiseksi.

in vivo

vaikutuksia huomioitava sytokiinien induktio ovat puhtaasti ilmentymisen vuoksi sytokiinin cDNA eikä LPS saastuminen. WT ja TLR4 KO hiiret kehittävät vastaavia tasoja ja kinetiikka TNFa ilmaisun jälkeen IL-12-cDNA: n hoitoon, mikä osoittaa LPS: n puuttuessa, että sytokiini-cDNA käytetty valmiste injektiota varten (tietoja ei esitetty).

Perna näytteitä

sytokiinien analyysi

in vitro

stimuloituja soluja, pernat rikottiin, köyhdytettyä punasolujen inkuboimalla ACK hajotuspuskuria (Biowhittaker, Walkersville, MD), pestiin ja suspendoitiin uudelleen täydennettyä elatusainetta (RPMI 1640, 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 5 x 10

-5 M 2-merkaptoetanolia, 1 mM natriumpyruvaattia ja ei-välttämättömiä aminohappoja). Solususpensiot laskettiin ja stimuloitiin

in vitro

kanssa täydennettyä elatusainetta, anti-CD3-päällystetyt vasta-ainetta (Ab) (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) 2 ug /ml tai LPS: ää (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1 ug /ml 72 h inkubaattorissa asetettu 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

sytokiini ja ALT määritykset

Seerumit analysoitiin sytokiinin tuotanto ELISA mukaan valmistajan ohjeiden. Sarjat käytettiin, olivat: mIL-10, mIFNγ, mTNFa (BD-Pharmingen, La Jolla, CA). Alaniiniaminotransferaasin (ALAT) seerumit tasot määritettiin käyttämällä spesifistä kolorimetristä Kit (Wiener Laboratories) ja noudattamalla valmistajan ohjeita.

Hystopathological analyysi maksan kudoksen

maksa saatu hiiristä eri kohtelu ryhmiä kerättiin päivänä 15 post cDNA hoitoa, kiinnitettiin 4% formaldehydiä ja sitten upotettiin parafiiniin. 6 um: n leikkeet valmistettiin ja hematoxilin /eosiini (H /E) tai perjodihappo-Schiff (PAS) tahroja levitettiin osiin. §, ilman tunnistaminen, analysoitiin kudosvaurioita optisella mikroskoopilla, jonka patologi.

Virtaussytometrianalyysi

monivärinen värjäystä, fluorocrome konjugoidun Abs (BD-Pharmingen, La Jolla, CA ) vastaan ​​sukuperää markkereita käytettiin erilaisia ​​yhdistelmiä. Lyhyesti, Fc-reseptorit solut estettiin anti-CD16 /32 Ab: n 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja pestiin. Sitten solut värjättiin Pintamerkkiaineilla 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, pestiin kahdesti ja analysoitiin virtaussytometrialla BD FACS Canto ™ II-sytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Virtaussytometriako- solulajittelussa splenosyytit IL-12 + IL-18-cDNA käsitellyistä hiiristä värjättiin fluorocrome-leimatun CD4 (klooni RM4-5), CD8 (klooni 53-6.7), CD11 (klooni M1 /​​70) ja CD11 c (klooni HL3) vasta-aineita (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) ja lajitellaan puhtaus on 97-99% käyttäen MoFlo lajittelija (Dako Cytomation).

mRNA louhinta ja analysointi

kokonais-RNA eristettiin käyttäen yksivaiheista uutetaan fenoli /kloroformilla menettelyä (Trizol; Invitrogen Life Technologies). RT-PCR suoritettiin 100 ng kokonais-RNA: ta jokaisesta näytteestä (Super Script III yhden askeleen RT-PCR, jossa platina Taq, Invitrogen), joka koostuu 15 minuutin käänteistranskriptioreaktio 45 ° C: ssa, 40 sykliä denaturointi 94 ° C (15 s), hehkutus 55 ° C: ssa (30 s) ja pidennys 68 ° C: ssa (60 s), ja lopullinen laajennus 5 minuuttia 68 ° C: ssa. Käytetyt alukkeet olivat: iNOS, aistimaan 5′-GCA TTT GGG AAT GGA GAC TG-3 ’, antisense 5′-GTT GCA TTG GAA GTG AAG CGT TTC-3’.

Western immunoblottaus

Pernasoluja lyysattiin 150 ui jääkylmää lyysipuskuria ja sentrifugoitiin 14000 rpm, 4 ° C: ssa 5 min. Proteiinit-uutokset ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin päälle Immun-Blot PVDF-kalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraanit blokattiin 5% maitoa, 0,1% Tween-20 TBS: ssä yön yli 4 ° C: ssa ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 3 h huoneen lämpötilassa. Inkuboinnin jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA), proteiinin vyöhykkeet havaittiin kanssa Super Signal kemiluminesenssisubstraatilla (Pierce) ja Biomax-MR kalvon (Eastman Kodak, Rochester, NY).

Arginase Activity Assay

Triton X-100 (0,1%, 100 ui) lisättiin pernasolujen pellettejä, jotka käsiteltiin sitten, kuten on ilmoitettu. Inkuboitiin 30 min, Tris-HCI: a ja MnCl

2-seosta (100 ui) lisättiin soluihin 10 min ajan 56 ° C: ssa. Levyjä inkuboitiin L-arginiini (100 ui) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sitten H

2SO

4 /H

3PO

4 /H

2O seosta ( 800 ui) lisättiin ja kuumennettiin α-isopropylideeni nitrobentseeniä asetonia (50 ui) 95 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Monimutkainen kussakin kuopassa laimennettiin 20 kertaa PBS: llä havaitsemiseksi optisen tiheyden (OD) arvo on 540 nm: ssä UV-spektrofotometrillä.

Maksan etäpesäkkeiden määrityksessä ja ihonalainen kasvaimen kasvua

C57BL /6 ja TNFαRI KO hiiret olivat ei pistetään B16-F10-melanoomasoluja (0,5 x 10

6 solua /0,5 ml 0,9% natriumkloridi) ja maksan etäpesäkkeiden analyysiä. Kolme päivää myöhemmin, cDNA: t toimitetaan hydrodynaamisen injektion. Yksitoista päivää myöhemmin, maksa kerättiin ja määrä etäpesäkkeiden määritettiin alla preparointimikroskooppia.

arvioimiseksi ihonalaisen kasvaimen kasvua, C57BL /6 ja TNFαRI KO-hiiret ajeltiin ja injektoitiin s.c. in vasempaan kylkeen 1 x 10

6 B16-F10-melanoomasoluja 0,2 ml: aan steriiliä 0,9% natriumkloridiliuosta. 10-14 päivän jolloin kiinteät kasvaimet olivat näkyvissä (4-5 mm), hiiret Hydrodynaamisesti injektoitiin nimetyn cDNA. Kasvaimen kasvua seurattiin tämä paksuudeltaan. Päivä 0 vastaa päivää, jolloin cDNA ylläpitäjä.

Tilastollinen

tilastollista merkittävyyttä, analysoitiin avulla Studentin paritonta

t

testi (vertailu 2 koeryhmään) tai ANOVA testi (koostumus yli 2 koeryhmään) kanssa p 0,05 pidetään merkittävänä. Ei-parametriset testit (Kruskal-Wallisin testi) hyödynnettiin kun

n

oli alle 10. Hiiren eloonjäämiskäyrien piirrettiin Kaplan – Meier tontteja käyttäen GraphPad Prism Version 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) ja p 0,05 pidettiin merkittävänä.

tulokset

muutoksia leukosyyttien määrän jälkeen systeeminen IL-12 tai IL-12 + IL18

Olemme aiemmin osoittaneet, että ehtyminen T-solujen ja NK /NKT-solujen lisää eloonjäämistä IL-12: lla hoidetuissa hiirissä [10]. Kuitenkin jäännöstoksisuus poistu T /NK /NKT soluvajeeseen, mikä viittaa siihen, että muut solutyypit voivat myös olla osa IL-12-haittavaikutuksia [10]. Ensimmäisenä askeleena Tutkimme ongelmaa olemme analysoineet suhteellisen lukumäärän muutosten leukosyyttien läsnä pernassa (ja maksa, ei esitetty) verrattuna kontrollihiiriin. Kuten kuviosta 1 nähdään, numerot NK ja NKT osajoukot vähenevät suuresti jopa 50 päivää hoidon jälkeen annon jälkeen joko IL-12 tai IL-12 + IL-18-cDNA: t. Tämä data tuntui melko yllättävää, koska ehtyminen NK /NKT-solujen korreloi parannusta selviytyminen käsiteltyjen hiirien IL-12-cDNA. Kuitenkin, kun arvioitiin fenotyyppi NK-solujen on saatu IL-12-käsitellyillä hiirillä, havaitsimme, että ne ilmentävät korkeita IFNy ja varhaisen aktivaation markkerin CD69: n (tietoja ei esitetä). Nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka niitä löytyy hyvin vähän, NK /NKT-solut osoittavat aktivoitu fenotyyppi ja voi siten olla osittain vastuussa myrkyllisyyttä jälkeen havaittu systeemisen IL-12.

C57BL /6-hiirten oli hydrodynaamisesti injektoitiin kontrolli, IL-12 ja /tai IL-18-cDNA: t. Jopa 50 päivää injektion jälkeen eläimet lopetettiin ja yhden solujen suspensioita pernan solut saatiin. Prosenttiosuus eri osa saatiin pinta linjaa värjäämällä yhdistelmä seuraavista Abs: NK1.1, CD3, CD11, CD19, CD4 ja CD8 ja analysoitiin virtaussytometrialla. Suhteellinen solujen määrä eri solupopulaatioiden laskettiin jakamalla absoluuttinen solujen määrä on saatu sytokiini-käsiteltyjen hiirten absoluuttinen solujen määrä on saatu ohjaus hiirillä. Data on ilmaistu keskiarvo altaan 4 Eri kokeiden (yhteensä n = 12 hiirtä ryhmää kohti). * 12 + 18 ja 12 kontrolliryhmään verrattuna p 0,05,

# 12 vs 12 + 18 p 0,05.

Havaitsimme myös muutoksen määrän T-lymfosyyttien seuraavista sytokiinien cDNA annon. Vaikka CD4

+ T-solut osoittavat alempaa cellularity suurimman ajanjaksojen analysoitu, CD8

+ T-solut käyvät läpi laajennus numerot ensimmäisen viikon aikana hoidon jälkeen, mutta sitten myöhemmin normalisoituvat (kuva 1).

Seuraavaksi arvioimme makrofagi (MO) väestöstä käsitellyissä hiirissä. IL-12 yksinään indusoi aikaista kasvua MO: ssä numeroita, kun taas määrä sitä vastoin näiden solujen IL-12 + IL-18-käsitellyissä hiirissä ei ole laajennettu (päivinä 2 ja 3 jälkikäsittely). Lisäksi vaikka MO numerot saavuttaa korkeampi huippunsa IL-12 + IL-18-hoidetut hiiret päivällä 10, ne normalisoituvat päivällä 50 jälkikäsittelyn kun taas määrä MO: ssä IL-12 hoidetussa ryhmässä on edelleen koholla . Se, että patogeeninen rooli näissä soluissa toisessa hiirimallissa IL-12 + IL-18-systeemistä ilmentyminen on aiemmin raportoitu [19], oletamme, että sovittelijoita tuottaman MO voisi olla vastuussa, ainakin osittain, että myrkyllisten haittavaikutuksia jälkeen havaittu systeemisen IL-12 hoito.

tasapaino typpioksidin (NO) ilmentyminen ja arginase aktiivisuus viittaa enemmän tulehduksellinen profiili makrofageihin IL-12-käsitelty verrattuna IL-12 + IL-18 hoidetuilla hiirillä

Seuraavaksi tutkittiin miten NO perustana IL-12-sivuvaikutuksia, kuten NO: n tiedetään indusoida MO: n läsnä ollessa IL-12 + IL-18 [27] . Sukupolven NO neutrofiilien ja monosyyttien on lisääntynyt sepsispotilaista ja niiden kesto liittyy huono kliininen tulos [28]. Lisäksi liiallinen NO muodostuminen on tärkeä rooli patogeneesissä shokki ja monielinvaurio aikana sepsiksen ja akuutin keuhkovaurion [29]. Tässä yhteydessä ensin analysoidaan jos NO /iNOS ilmaistaan ​​meidän kokeellisessa mallissa. Kuten voidaan nähdä kuviossa 2A, iNOS RNA ekspressio on merkittävästi säädelty sekä IL-12 ja IL-12 + 18-käsiteltyjen hiirten varhainen jälkeen cDNA annon ja jatkuu vähintään 15 päivää hoidon jälkeen (tietoja ei esitetty). Mielenkiintoista on, että proteiini-analyysi paljasti, että kun 15 päivää hoidon jälkeen, iNOS ilmentyminen on vielä säädellään ylöspäin IL-12-käsitellyillä hiirillä, mutta pienempi tai ei ilmentymistä havaitaan IL-12 + IL-18-käsitellyissä hiirissä (Fig. 2B) . Lisäksi

in vitro

NO tasot arvioitiin päivänä 15 hoidon jälkeen pernasoluista stimuloitiin LPS: llä oli pienempi ilmentyminen soluissa on saatu IL-12 + IL-18-käsitellyissä hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot johtivat meitä määrittämään jos alempi iNOS- /NO IL-12 + IL-18: lla hoidetuissa hiirissä voisi selittää parantuneen selviytymisen tuloksista havaittiin tässä ryhmässä, verrattuna IL-12: lla hoidetuissa hiirissä [10]. Yllättäen kun seurataan eloonjäämisen WT ja iNOS KO hiirissä IL-12 tai IL-12 + IL-18-cDNA hallinto, havaitsimme, että puute iNOS ilmaisun ei paranna vastustuskyky hoitoja (Fig. 2C). Nämä tulokset saivat meidät olettamukseen, että NO ehkä ole suoraan osallisena myrkyllinen välittäjänä näistä hoidoista, mutta suhde MO NO /arginase ilmaisua voitaisiin antaa tietoa tulehduksellinen johtuviin eri hoitoja. Näin ollen, kuviossa 2D osoittaa, että splenosyytit IL-12-käsitellyistä hiiristä on merkittävästi alempi arginase aktiivisuus verrattuna splenosyytit IL-12 + IL-18: lla hoidetuissa hiirissä. Yhdessä iNOS tiedot, voimme päätellä, että NO /arginase suhde on suurempi hiirissä, joita hoidettiin IL-12 yksin kuin hiirillä, joita hoidettiin IL-12 + IL-18. Tämä tulos viittaa siihen, että hoito IL-12 + IL-18 indusoi makrofagi fenotyypin vähemmän tulehduksellinen verrattuna IL-12: llä käsitellyissä hiirissä.

(A) RT-PCR-analyysi iNOS-geenin ilmentymisen saatuja pernasoluja hiiriä, joihin injektoitiin nimetyn cDNA, 12 + 18 ja 12 vs. verrokki p 0,05. (B) Western blot-analyysi pernasolujen proteiiniuutteita saadaan hiiriä, joihin injektoitiin nimetyn cDNA, 12 vs 12 + 18, p 0,05. (C) Survival tarkkaillaan B6 (WT) tai iNOS KO hiiret päivän ajan IL-12 tai IL-12 + IL-18-cDNA injektio. (D) Arginase aktiivisuus mitattiin määritys urean tasoa 1 x 10

6 pernasolua. Tiedot A, B ja D ilmaistaan ​​keskiarvona 2 eri kokeiden 4-5 hiirtä ryhmää kohti. Survival käyrä rakennettiin allas 2 eri kokeiden 5 hiirtä ryhmää kohti. * 12 + 18 vs 12 p 0,05.

Expression IFNy, TNFa ja IL-10, kun IL-12 + IL-18 hoito

Olemme raportoineet, että IL- 12 + IL-18-käsitellyissä hiirissä, varhainen IL-10 ohjaa tasot tulehduksellisten sytokiinien IFNy ja TNFa [10]. Vaikka suoritimme nämä kokeet kuluttamalla eri leukosyyttien väestön ja arvioida eloonjäämisen kussakin tapauksessa, emme voi tunnistaa lähteitä sytokiinien [10]. Tutkimaan asian, arvioimme tuotannon IL-10, IFNy ja TNFa lajitellusta splenosyyteistä saatu IL-12 + IL-18-hoidetut hiiret päivänä 3 jälkikäsittelyä, joka on ajankohta, jolloin olimme aikaisemmin havaittu näiden sytokiinien tuotantoa (kuvio 3). Havaitsimme, että TNFa on erittäin tuotetaan CD8

+ T-solujen ja CD11

+ plus CD11 c

+ soluja (MO: ssä, dendriittisolut (DC) ja luonnollisten tappajasolujen (NK-solut) järjestetty yhteen). Koska NK-solujen ja DC: muodostavat vain erittäin pienen populaation pernasolujen näissä hiirissä (Fig. 1 ja dataa ei esitetty), me lajitellaan kaikki nämä solut yhdessä määrän lisäämiseksi talteen soluista. Voit selvittää panos MO: ssä yksin, arvioimme sytokiinien ilmentymistä kulttuureissa rikastetun kiinnittynyt pernasolua ( 85% MO) ja totesi, että nämä solut myös ilmaissut korkeita TNFa. Tämä havainto viittasi siihen, että ilmaus TNFa voi tulla lähinnä MO sijaan muut 2 solutyyppien läsnä CD11b /c

+ lajitellun ryhmän (Fig. 3A). Sen sijaan, IFNy ilmaistaan ​​CD4

+ ja CD8

+ T-soluja, mutta ei MO: ssä, joka osoittaa, että CD11 b /c ilmentyminen johtuu luultavasti läsnäolon NK-solujen tässä ryhmässä (Fig. 3B). Mielenkiintoista, IL-10 valmistetaan CD4

+ T-solut ja myös DC tai NK-solujen mutta ei MO (Fig. 3C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ehtyminen T, NK ja NKT-solujen, voisi poistaa lähteet IFNy (kuten olemme aiemmin raportoitu [10]), mutta MO edelleen erittäin tärkeä lähde TNFa. Tämä havainto on luultavasti miksi ehtyminen lymfosyyttien vain osittain parantunut eloonjääminen IL-12: lla hoidetuissa hiirissä [10]. Lisäksi se, että MO profiili näyttää olevan enemmän tulehduksellinen perustuu NO /arginase tiedot, voisi selittää, miksi IL-12-käsitellyillä hiirillä esiintyy paljon alhaisempi eloonjääminen kuin IL-12 + IL-18-käsitellyillä hiirillä.

pernasoluja IL-12 + IL-18-hiiret saatiin ja värjättiin anti-CD4, anti-CD8 ja anti-CD11b /c fluorocrome merkitty Abs ja sitten lajitellaan puhtaus on 97-99% käyttäen MoFlo lajittelija (Dako Cytomation). Lajitellut solut viljeltiin sitten, kun läsnä on anti-CD3-päällystetyt Ab (2 ug /ml) ja LPS: ää (1 ug /ml) 72 tuntia. Supernatantit kerättiin sitten ja (A) TNFa, (B) IFNy ja (C) IL-10 ilmentyminen arvioitiin ELISA: lla. Data ilmaistaan ​​keskiarvona 2 eri kokeiden 4-5 hiirtä ryhmää kohti. * Stimuloidut vs Stimuloimattomissa, p 0,001.

TNFa on tärkeä sytokiini, joka välittää IL-12 systeemisen myrkyllisyyden

roolin tutkimiseksi TNFa myrkyllistä välittäjänä jälkeen IL -12 systeeminen ilme, analysoimme selviytymistä TNFa KO tai TNFαR1 KO hiirissä IL-12 hoito. Kuten nähdään kuviossa 4A, kumota TNFa tai sen tyypin 1 reseptorin geenien merkittävästi lisääntynyt eloonjääminen IL-12-käsitellyissä hiirissä verrattuna WT-hiirissä. Mielenkiintoista on, että kun olemme analysoineet kinetiikka TNFa seerumin, me havaitsimme, että proteiinin ilmentyminen huiput noin päivänä 4 sekä IL-12 + IL-18- ja IL-12-käsitellyissä hiirissä; kuitenkin, tasot ovat paljon alhaisemmat IL-12 + IL-18-käsitellyissä hiirissä (Fig. 6C). Lisäksi päivällä 8 ja jopa päivä 12 jälkikäsittelyä, TNFa sera pitoisuus alkaa jälleen pienentyä molemmissa ryhmissä; jää kuitenkin pysyviä ja aina suurempi IL-12 hoitoryhmässä (Fig. 4B).

(A) Survival seurattiin WT, TNFa KO ja TNFRI KO hiiret päivinä jälkeisessä IL-12 cDNA hoito. * WT vs TNFa KO ja TNFRI KO, p 0,01. (B) Hiiret kontrollista, IL-12 tai IL-12 + IL-18-cDNA käsitellyissä ryhmissä otettiin verta ja TNFa-seerumit tasot määritettiin päivinä hoidon jälkeen. (C) Pernasoluja ohjaus, IL-12 tai IL-12 + IL-18-cDNA: n käsiteltyjen hiiret saatiin ja niitä viljeltiin väliaineen läsnäollessa (NS), anti-CD3-päällystetyt Ab tai LPS: llä 72 tuntia. Supernatantit kerättiin sitten, ja TNFa: n ilmentyminen arvioitiin ELISA: lla. * IL-12 vs IL-12 + IL-18, p 0,05. (D) Seerumit B6 käsiteltyjen hiirien ohjaus- tai IL-12-cDNA ja TNFRI KO hiirillä, joita hoidettiin IL-12-cDNA saatiin päivän ajan käsittelyn jälkeen. ALT-tasot määritettiin käyttämällä erityistä kolorimetristä kit. Tiedot A, B ja C on ilmaistu keskiarvona 2 eri kokeiden 4 hiirtä ryhmää kohti. Tiedot D on ilmaistu keskiarvo altaan 3 eri kokeissa (WT n = 12, TNFR1 KO n = 9). * WT IL-12-cDNA: vs TNFRI KO IL-12-cDNA, p 0,05.

Seuraavaksi verrattiin TNFa

in vitro

ilmentymisen pernasoluja hiiristä käsiteltiin

in vivo

IL-12 yksinään tai IL-12 + IL-18. Vaikka TNFa on valmistettu sen jälkeen, kun

in vitro

stimulaatio anti-CD3-Ab: n (T-solujen stimulaation) on aivan samanlainen kuin solujen välillä on saatu molempien ryhmien, se on huomattavasti pienempi IL-12 + IL-18: lla hoidetuissa hiirissä kun stimuloidaan

in vitro

LPS (eli MO ja DC stimulaatio) (Fig. 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että alempien tasojen systeemisiä TNFa havaitaan IL-12 + IL-18-hoidetut hiiret johtunee pienemmän panoksen MO ja DC ilmaisussa tämän sytokiinin tässä hoitoryhmässä.

systeeminen IL-12 tai IL-12 + IL-18-hoidon herättää patologisia vaikutuksia immuunijärjestelmän kudoksia ja maksassa

systeeminen IL-12 on raportoitu aiheuttavan useita erilaisia ​​patologisia muutoksia hiirimalleissa ja syövän potilaat [2], [4], [6], [17]. Arvioidaan yleisiä myrkyllisyyden IL-12 hoito, uhrasimme ohjaus ja sairas IL-12 ja IL-12 + IL-18-käsitellyillä hiirillä ja suorittaa täydellinen analyysi elimen patologian. Kuten voidaan nähdä taulukosta S1 merkittäviä muutoksia havaittiin ovat atrofiaa kateenkorvassa ja lymfaattisen ehtyminen, ja nämä muutokset ilmestyi samanlaisia ​​IL-12 ja IL-12 + IL-18: llä käsitellyissä hiirissä.

Kuitenkin analyysi paljasti myös voimakkaampi histiocytosis imusolmukkeissa (LNS) saatu IL-12-käsitellyissä hiirissä verrattuna IL-12 + IL-18: lla hoidetuissa hiirissä. Histiocytosis liittyy läsnäolo makrofagien kudoksessa, joten pahentaa patologian IL-12 käsiteltyjen hiirten liittyy merkittävän laajentamisen /läsnäolo makrofagin LNS.

Muutokset maksan kudoksen systeemisen IL -12: n tai IL-12 + IL-18

vaikka emme tarkkailla eroja histiocytosis verrattaessa maksa IL-12 ja IL-12 + IL-18-hiirissä, aiemmat tulokset vahvistivat, että seerumit tasot maksaentsyymien ALAT ja aspartaattiaminotransferaasin (ASAT) olivat merkittävästi korkeammat IL-12-hoidetut hiiret [10]. Seuraavaksi päätimme arvioida patologian tämän elimen sijasta toteamisesta yksi haittavaikutuksia systeemisen IL-12 hoito on hepatotoxicity havaittu antamisen jälkeen tämän sytokiinin [2], [4], [6], [17]. Mielenkiintoista, kuten kuvassa 4D, IL-12 hoito TNFa tyypin 1 reseptorin KO hiiret kumoaa ALT huippu havaittu päivällä 15 WT hiirillä.

histopatologisia piirteitä läsnä maksa hoidettujen hiirien IL- 12 tai IL-12 + IL-18-cDNA paljasti suuria muutoksia kudoksen, mukaan lukien ulkonäkö: solut, joissa on pyöreä muoto (solu ballooning) (Fig. 5B) verrattuna klassiseen kuusikulmainen muoto hepatosyyttien verrokkihiiristä (Fig. 5A). Lisäksi maksa hoidettujen hiiristä menetys maksan sinikäyriä, jotka voidaan selvästi havaita verrokkihiiriin (kuviot. 5A vs 5B). Lisäksi havaitsimme pesäkkeitä ektooppisen hematopoieesia (Fig. 5c) kanssa, kun läsnä megakaryosyyttien (Fig. 5D) koko maksan IL-12- tai IL-12 + IL-18: lla hoidetuissa hiirissä, mutta ei kontrollihiiristä. Molemmat Mallory elimet (Fig. 5E) ja Kunnanvaltuusto elimet (Fig. 5F) ja pesäkkeitä nekroottista kudosta (Fig. 5G) voidaan nähdä ainoastaan ​​hiirillä, joille sytokiinin cDNA. Lopuksi havaittiin, että glykogeenin talletukset vähenevät suuresti hiirissä, joita käsiteltiin IL-12 tai IL-12 + IL-18 (Fig. 5I) verrattuna kontrollihiiriin (kuvio. 5H). Vaikka kaikki nämä leesiot ovat läsnä kaikkialla maksakudosta hiirillä hoidettiin joko IL-12-cDNA yksin tai IL-12 + IL-18 cDNA (korkeimmillaan päivän välillä 14-16), samanaikainen IL-12 ja IL-18 pystyy vähentämään näitä IL-12-liittyvän maksan poikkeavuuksia (taulukko S2). Nämä havainnot korreloivat aiempien tietojen osoittivat alhaisempi ALAT ja ASAT sera tasoilla 12 + IL-18-hoidetut hiiret [10]. Lisäksi TNFαR1 KO hiiriä (Kuva. 5K) osoitti harvemmin nämä patologiset jälkeen IL-12-cDNA kohtelun kuin mitä havaittiin käsiteltiin WT hiirillä (Kuva. 5J), erityisesti määrän ja koon infiltraatiota pesäkkeitä (taulukko S2 ).

maksa saatu hiiristä eri ryhmien saatiin päivä 14-16 jälkeisen cDNA hoitoa. Osat 6 um saatiin ja (A-G) hematoxilin /eosiini (H /E) tai (H-I) perjodihappo-Schiff (PAS) tahroja levitettiin osiin. (A) maksasoluihin sinusoids vertailuliuoksesta hiiri, 100 x. (B) Kuumailmapalloilu hepatosyyttien ja puuttuminen maksan siniaaltojen IL-12-cDNA: n käsitelty hiiri, 100 x. (C) Focus kohdunulkoisen hematopoieesia in IL-12-cDNA käsitelty hiiri, 100 x. (D) megakaryosyyttien, joka on IL-12-cDNA: n käsitelty hiiri, 100 x. (E) Mallory ja (F) Kunnanvaltuusto elimet IL-12-cDNA käsitelty hiiri, 100 x. (G) Focus of kuolion; 10 ×. Glykogeeni talletukset saatu hiiren (H) kontrolliryhmässä tai (I) IL-12-cDNA ryhmä, 20 ×. Maksa osastoja (J) WT tai (K) TNFR1 KO hiiret 15 päivän kuluttua IL-12-cDNA hoitoa. Kuvia edustavat 2 eri kokeiden 4-5 hiirtä ryhmää kohti.

B6 hiiriä hoidettiin IL-12-cDNA yksin (musta ympyrä), IL-12 + IL-18-cDNA (avoin ympyrä