Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer kantasolut (CSCS) pidetään osajoukko suurin kasvaimen vastaava aloittaa ja ylläpitää sairauden. Useat pinta solumarkkerit on hiljattain käytetty tunnistamaan CSCS. Niistä on CD133, jota ilmaistaan ​​hematopoieettiset esisolut sekä alkion kantasoluja ja erilaiset syövät. Olemme äskettäin eristettiin ja niitä viljeltiin CD133 positiivisia [CD133 (+)] soluja eri syöpäsolulinjasta käyttämällä NASA kehitetty Hydrodynamic Tarkennus BIOREAKTORITEKNIIKKA (HFB) (Celdyne, Houston, TX). Vertailun vuoksi toinen bioreaktori, pyörivä soluviljelmässä (RCC), valmistaja Synthecon (Houston, TX) käytettiin. Sekä HFB ja RCC bioreaktorit simuloida näkökohtia hypogravity. Tutkimuksessamme HFB lisääntynyt CD133 (+) solujen kasvuun eri solulinjojen verrattuna RCC aluksen ja tavanomaisen painovoiman valvontaa. Havaitsimme (+) 15-kertainen proliferaation CD133 (+) solujen fraktio, syöpäsolut, jotka viljeltiin 7 päivän optimoiduilla olosuhteissa. RCC alus sen sijaan tuotti (-) 4,8-kertainen lasku CD133 (+) solujen fraktion suhteessa HFB jälkeen 7-päivän viljelyn. Kiinnostavaa kyllä, Huomasimme myös, että hypogravity ympäristö HFB suuresti herkisti CD133 (+) syöpäsolut, jotka ovat yleensä resistenttejä sytostaattihoitoon, tulla alttiita erilaisille kemoterapeuttiset aineet, pohjustaa vähemmän myrkyllisiä ja tehokkaampia kemoterapeuttisen hoidon potilailla. Voidakseen tehokkuuden testaamiseksi sytostaattien in vitro ennen niiden käyttöä kliinisessä ympäristössä syöpäsoluihin sekä syövän kantasoluja voidaan tasoittaa tietä tehokkaampia kemoterapeuttisen strategioita potilailla. Tämä voisi olla tärkeä edistysaskel terapeuttinen vaihtoehtoja onkologisesta potilaita, mikä mahdollistaa paremmin kohdennettuja ja yksilöllisiä kemoterapiahoitojen sekä korkeammat vasteeseen.

Citation: Kelly SE, Di Benedetto A, Greco A, Howard CM , Sollars VE, Primerano DA, et ai. (2010) Rapid valinta ja leviämisen CD133 (+) Solut Cancer Cell Lines: Kemoterapia vaikutukset. PLoS ONE 5 (4): e10035. doi: 10,1371 /journal.pone.0010035

Editor: Annarosa Leri, Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 helmikuu 2010; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2010; Julkaistu: 08 huhtikuu 2010

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Tämä tutkimus suoritettiin saadut varat osittain solujen erilaistumisen ja Development Center (CDDC-maiden) at Marshall University, NIH- CA138510, NIH-CA140024, NIH-COBRE 5P20RR020180 (PPC); West Virginia NASA Space Grant Consortium (ja S. K. ja J.V.V.); WV-INBRE 5P20RR016477 (ja D.P.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimet voidaan nähdä kudoksen koostuvat heterogeenisen populaation soluja, jotka eroavat biologiset ominaisuudet ja mahdollisuudet itseuudistumisen [1]. Klonaalisen huomioon tiettyjen pahanlaatuisten kasvainten on vakiintunut [2]. Mallin mukaan klonaalisen kehittyminen kasvainsolujen, syöpä on muodostettu kertymistä geneettisiä muutoksia soluissa ja asteittain kloonien valinta [3], [4]. Näin ollen kasvaimen pidetään epänormaalia kudosta, joka polveutuu yhden solun jatkuvan kertymisen geneettisten virheiden ja eri epigeneettisiä muutoksia. Kuitenkin useat kokeista suoritettiin viimeisten vuosikymmenien aikana ovat osoittaneet, että ei jokainen kasvain solu on kasvain aloittamista solun (T-IC) ja että jopa 10

6 hiiren tai ihmisen kasvainsoluja vaaditaan elinsiirron uuden kasvain olemassa oleva [4], [5], [6], [7]. Tämä näyttö viittasi siihen mahdollisuuteen, että kasvainsolut voivat olla hierarkkinen tilassa, jossa on vain pieni määrä soluja, joilla on kasvaimen aloittamista mahdollisia. Viimeaikaiset tiedot sekä hematologisia syöpiä ja kiinteitä kasvaimia, ovat ehdottaneet, että on olemassa vain pieni solujen populaatiot kussakin maligniteetti, jotka kykenevät kasvaimen aloittamisesta, jotka ovat syövän kantasoluja (CSC) [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Nämä solut näyttävät olevan kykenee epäsymmetrinen jako ja itseuudistumiseen, ja ne ovat vain pieni murto-osa joukossa suurin osa enemmän erilaistuneita soluja kasvaimen [16], [17], [18].

Äskettäin CSCS on tutkittu eri primäärikasvain tyyppejä kehittämiseksi CSC-erityisiä hoitoja [6], [11], [19], [20], [21]. Mielenkiintoista on, että tietyt kasvaimet ovat hyvin resistenttejä kemoterapialle ja muista hoitomuodoista ja vaikka aggressiiviset hoidot tuhota enemmistö syöpäsoluja, joka on pieni murto-osa soluista hengissä ja usein regeneroitumaan vielä suurempia massoja kasvainsoluja [22], [23] , [24]. Tehokas hoitoja syöpäpotilaille vaativat perusteellista ymmärtämistä johtavien mekanismien kasvainten kehittymiseen ja lääkeresistenssin.

Viime löytö CSCS on ollut keskeinen rooli muuttuvassa mielestämme syövän synnyn ja kemoterapiaa. CSCS uskotaan olevan vastuussa muodostumista ja kasvua kasvainkudoksessa. CSCS ovat luonnostaan ​​resistenttejä uusin kemoterapiaa johtuu niiden lepotilassa luonne. Tämä saattaa selittää, miksi perinteisiä chemotherapies voi aluksi pienentää suurimman kasvaimen irtotavarana mutta eivät sen kitkemiseksi kokonaan, jolloin mahdollisen toistumisen [1], [11], [17], [18], [22]. CSCS ovat resistenttejä ei vain toissijainen liikkumattomuus, mutta myös lisääntyneen ekspression anti-apoptoottisten proteiinien ja lääkevuoto- kuljettajat. Syöpä hoitoja saatavilla tänään enimmäkseen hyödyntää proliferatiivisia ja metastaattisen potentiaalit syöpäsolujen; Näin ollen, suurin osa hoidoista on suunnattu nopeasti jakautuvia soluja, ja molekyyli tavoitteet, jotka muodostavat suurimman osan kasvain. Tämä saattaa selittää epäonnistumisen käsittelyjen taudin hävittämiseksi, tai estää syövän uusiutumisen. Lisäksi, jos lääkkeen kasvu vaikuttaa vain pieni solujen populaatio, siellä on vain vähäinen lasku kasvaimen kasvua lyhyellä aikavälillä.

Teoriassa, tunnistaminen ja karakterisointi CSCS voi sallia kehittäminen hoitomuotojen että tavoite syövän kantasoluja pikemmin kuin nopeasti jakautuvien solujen syöpään.

Pitkäaikainen ihmisten ja koe-eläinten muuttuneen painovoiman olosuhteet avaruuslento on haitallisia vaikutuksia eri solukkojärjestelmissä. Vaikutukset hypogravity ympäristön kasvaimen kasvuun ja syövän syntymistä ei vielä tunneta ja tällä tutkimusalalla puuttuu edelleen järjestelmällinen tutkimuksen hypogravity aiheuttama geenien ilmentymisen, joka on avain tarvittavat tiedot lopulta kehittyä mekanismi takana hypogravity aiheuttamia sairauksia. Tätä varten olemme tutkineet vaikutuksia simuloidun hypogravity ihmisen luusarkoomasolujen viljeltiin NASA kehitetty hydrofocusing bioreaktori (HFB) ja pyörivässä soluviljelmäjärjestelmässä (RCC). Eri mallit pyörivät seinän aluksia on käytetty luomaan kolmiulotteinen kulttuuri ympäristö vaihteleva leikkausjännitys ja hypogravity simuloida että avaruudessa [25]. HFB (Celdyne, Houston, TX) kehittämä NASA klo Johnson Space Center, on nesteen täyttämä kupoli, joka pyörii tietyllä nopeudella ja on kartiomainen kiekkoa tarjoamaan ainutlaatuisen hydrofocusing ominaisuus, joka mahdollistaa erittäin alhaisen leikkausvoiman kulttuuri ympäristö ja nylon kaasun siirto kalvo [25]. RCC koostuu vaakasuoraan pyöritetään viljelyastias- happipitoista tasaisella silikonikumi kaasun siirto kalvo [26]. NASA suunniteltu HFB bioreaktorissa ja RCC on käytetty onnistuneesti maapallolla ja avaruudessa, jotta tutkijat voivat käyttää mallinnetun tai todelliset hypogravity vastaavasti tutkia roolia painovoiman muodostumista kolmiulotteinen nisäkässolussa kudosmalleissa ja tuotanto bio-tuotteet [25], [27], [28], [29], [30], [31].

tässä tutkimuksessa osoitetaan, että syövän kantasolut stimuloidaan lisääntymään, kun ne ovat viljellään että hypogravity olosuhteissa tuottamat HFB että vähennys painovoiman simuloitiin HFB herkistää CSCS kemoterapeuttisten aineiden kanssa.

tulokset

Osteosarkooman kantasolujen kaltaisia ​​soluja lisääntyä Hydro-Tarkennus bioreaktorissa ( HFB), mutta ei pyörivässä soluviljelmäjärjestelmässä (RCC) B

mallinnettu hypogravity on sairaus, jossa solut ovat jatkuvassa vapaassa pudotuksessa ja jossa ne pystyvät kasvamaan kiinnityskohdassa riippumattomalla tavalla. Koska vaikutukset hypogravity kasvaimia ei tunneta, ajattelimme tutkia vaikutuksia mallinnettu hypogravity puuttuessa leikkausjännitys on kasvua kapasiteetin kasvainsolujen eri alkion alkuperää. Olemme käyttäneet HFB kehittämä NASA klo Johnson Space Center, joka koostuu 50 ml nestettä täynnä kupoli, joka pyörii tietyn nopeudella ja että on sisäinen kartiomainen kiekkoa että vesivoiman keskittyy soluviljelmän mahdollistaa alhaisen leikkausvoiman ympäristöön.

yllätykseksemme olemme havainneet, että kun tunnetaan useita SAOS-2-soluja siirrostettiin HFB, vain pieni osa näistä soluista selviytyi hoidossa, riippumatta solujen tiheys kylvetään bioreaktorissa . Kuvio 1A esittää, että elinvoimaisten SAOS-2-soluja viljeltiin 5-päivää HFB väheni dramaattisesti.

A) trypaanisiniekskluusiolla solumäärän SAOS-2-soluja (osteosarkooma-soluja) ja SAOS-2 soluja viljeltiin HFB, CD133 (+) SAOS-2-soluissa ja CD133 (+) SAOS-2-soluja viljeltiin HFB, ja CD133 (+) SAOS-2-soluissa ja CD133 (+) SAOS-2-soluja viljeltiin normaaleissa painovoima kunnossa. Harmaat pylväät osoittavat solujen lukumäärä sijoitettu valvonta päivä-1. Mustat palkit osoittavat elävien solujen lukumäärä talteen kuluttua 5 päivän viljelyn että viljelemällä kunnossa. B) Helotaustanäkymä kontrasti vaihe kuva (20 x) 3-D kulttuuri (pallojen) muodostettu SAOS-2 soluja, jotka kasvatettiin HFB 5 päivää. Inset (ylhäällä oikealla) esittää kuvaa CD133 immunofluoresenssivärjäyksen Saos-2-soluissa kasvatettu bioreaktorissa 5 päivää. C) Virtaussytometria kaavio CD133 immunofenotyyppi SAOS-2-soluissa. Isotyyppiä vasta-ainetta käytettiin kontrollina. D) trypaanisiniekskluusiolla solumäärät optimoidun kokeilu HFB kulttuurin Saos-2-solujen HFB seitsemän päivän kuluttua. CD133 (+) SAOS-2-soluja viljeltiin bioreaktorissa valittiin ja lisääntynyt 15-kertaisesti seitsemän päivän kuluttua. Valkoinen palkki osoittaa määrän Saos-2-solut kylvetään HFB. Musta palkki osoittaa elinvoimaisten CD133 (+) Saos-2-solujen talteen 7 vuorokauden optimoitu kulttuurin bioreaktorissa. Harmaa palkki osoittavat määrän CD133 (+) solujen läsnä vanhempien SAOS-2 väestöstä. Aineisto edustaa kolmen erillisen kokeen jolloin saatiin vertailukelpoisia tuloksia.

Mielenkiintoista, SAOS-2-soluja viljeltiin bioreaktorissa muodostunut solun aloilla ja vaikutti olevan huomattavasti pienempi kuin SAOS-2-soluja viljeltiin ruokia ja korjatun trypsiinikäsittelyllä (tuloksia ei ole esitetty). Kuviossa 1B on esitetty 20 x Kirkas kuva pallojen muodostettu SAOS-2-soluja, jotka oli kasvatettu HFB varten 5 päivää. Solut poistettiin HFB reaktorista ja kuvat on otettu välittömästi käyttämällä käännettyä mikroskooppia käyttäen sijaan vaiheessa.

Koska niiden havaittavaa muutosta morfologia ja kyky muodostaa pallojen HFB ympäristöön ja koska muut ovat osoittaneet, että läsnä oli CD133 (+) solujen ensisijainen luun sarkoomat, sekä luusarkoomasolulinjoissa MG-63, OS-521, 0S-01-187, OS-99-01, ja SAOS-2 ja kondrosarkoomasolulinjassa CS-828 [ ,,,0],32], [33], me arveltu, että HFB valitut solut olivat CD133 (+). Tämän hypoteesin testaamiseksi me immunophenotyped näitä soluja vastaan ​​kohdistettu vasta CD 133 (Miltenyi, Saksa), ja totesi, että HFB valitut solut olivat 100% positiivisia CD133, tyypillinen kantasolujen markkeri mesenkymaaliset (kuvio 1 B, pieni kuva ja kuvio 1C ). Koska SAOS-2-soluja talteen bioreaktorissa olivat CD133 (+) (98,8%) (kuvio 1C), halusimme onko CD133 (+) solujen selviytymisen lisäksi myös lisääntynyt, että hypogravity ympäristössä. Tämän vuoksi valitsimme CD133 (+) soluja SAOS-2 tai HOS solulinjoista käyttämällä MACSorting järjestelmää ja haastoi nämä CD133 (+) soluja 5 päivää juoksussa HFB. Mielenkiintoista on, että Saos-2 tai HOS-soluissa MACSorted vastaisella vasta-aineella CD133 ja viljeltiin bioreaktorissa 5 päivää lisääntyneet kaksinkertaisella (kuvio 1A). Kuvio 1A esittää trypaanisinieksluusiolla valkosolujen määrän CD133 (+) Saos-2-elävät solut talteen 5 päivän viljelyn bioreaktorissa.

Muutaman tutkimuksissa soluviljelmässä optimoinnin, pystyimme saavuttamaan 15-kertainen nousu leviämisen CD133 (+) syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja vanhempien Saos-2 yli seitsemän päivän aikana pysäyttämällä reaktori välein 24 tunnin ja varovasti sekoittamalla kulttuuri 10 kertaa kohtisuorassa tavalla yli kestää yhdestä minuutista, mikä mahdollisti uudelleenjaon median kupoli ja sekoittaminen ravinteiden kanssa lisääntyvien solujen (kuvio 1 D). Kuvio 1D esittää, että seuraten optimoitua protokollaa solujen kulttuurin HFB, on mahdollista valita ja lisääntyä tietyn populaation sisältämät SAOS-2 emosolulinjassa. Samanlaisia ​​tuloksia saavutetaan käyttämällä erilaisia ​​muita syöpäsolulinjat eri kudosten alkuperää ja jotka ilmentävät vaihteleva määrä CD133 markkerin (HOS, U2OS, T98G, U87MG, DU145, LNCap, WI38-, H23, Hep3B, Hela, Mewo, HO-1 solut, HN12 ja HN30), katso taulukko 1, ja dataa ei näytetty.

Toinen bioreaktoriin, joka simuloi hypogravity, 50 ml pyörivän soluviljelmässä (RCC) [26] valmistetaan Synthecon (Houston, TX), käytettiin vertaamaan tuloksia syntyy käyttämällä HFB. Rinnakkaisessa kokeessa, jossa me ympättiin yhtä suuri määrä SAOS-2-soluja samalla kudosviljelyinkubaattorissa, jossa samanlaisissa oloissa roottorin nopeuden, CO2, lämpötila, ja astian tilavuus (50 ml), HFB lisääntynyt CD133 (+) solujen kasvuun mistä SAOS-2-soluja verrattuna RCC astiaan ja maan painovoiman valvontaa. 5 x 10∧6 SAOS-2-soluja siirrostettiin HFB tai RCC bioreaktoreita, joiden 350000 (7%) oli CD133 (+) ja 4650000 CD133 (-) (taulukko 2). Kasvatusaine, hapetus, nopeus, lämpötila ja CO

2 pidettiin johdonmukaisesti vakiona kaksi viljelysysteemejä ja samassa inkubaattoriin 7 päivää ajaa. Sen jälkeen 7 päivän aikavälillä alukset otettiin talteen ja solut reagoida vasta-aineen fluoreseiinikäsitellyn vastaan ​​CD 133 (Miltenyi, Saksa) ja laskettiin käyttämällä BD FACS Aria virtaussytometria. Isotyyppiä vasta-ainetta käytettiin kontrollina. Vertailusta kahden bioreaktorin kulttuureissa, osoitimme, että (+) 15-kertainen CD133 (+) solujen lukumäärä (5370960 CD133 + solut) saatiin aikaan käyttämällä HFB on 7 päivän aikavälillä. O leviämisen CD133 (+) solujen havaittiin viljelmän peräisin RCC viljelyastias-. RCC kulttuuri alus osoitti sen sijaan huomattava vähentäminen CD133 (+) solupopulaation [(-) 4,8-kertainen pieneneminen] lukumäärästä CD133 (+) soluja kylvetään Bioreaktoreissa päivänä-0 (taulukko 2). Itse asiassa määrä SAOS-2 CD133 (+) solujen laski 350.000 72800 in 7 päivän juoksussa RCC, kun HFB kasvanut SAOS-2 CD133 (+) soluja nousi 350.000 5.370.960 vastaavien jaksojen aikana aikaa.

tämän vuoksi dramaattisen eron kasvu SAOS-2 CD133 (+) solujen kaksi bioreaktoreissa tuottavan hypogravity (HFB RCC), halusimme tarkistaa, jos pH voisi olla muuttuja aiheuttaa vaikutukset solujen kasvuun havaittu. Siksi mittasimme pH tiedotusvälineissä HFB RCC bioreaktorit pidetään samassa inkubaattorissa, CO

2 taso asetettu 5% ja tasaisessa lämpötilassa 37 ° C ennen ja jälkeen run 7-päivää. Vertasimme pH median HFB RCC alusten kanssa elatusaine valvonnan soluja kasvatettiin petrimaljassa maapallon painovoiman kunnossa versus käyttämättömiä D-MEM. Ei tilastollisesti merkittävä ero havaittiin kesken eri soluviljelmässä olosuhteissa toistamalla kokeet kolme kertaa. Itse asiassa, käyttämättömät väliaine osoitti pH 7,82 ± 0,04. Medium kontrollista Saos-2 kasvatettiin petrimaljassa normaaleissa painovoima olosuhteissa osoitti pH on 7,96 ± 0,23; väliaine SAOS-2-soluja kasvatettiin HFB pH oli 7,71 ± 0,23; ja väliaine Saos-2 kasvatettu RCC bioreaktorissa osoitti pH 7,9 ± 0,11, mikä osoittaa, että eri kasvua CD133 (+) Saos-2-solujen välillä havaittiin RCC ja HFB aluksia ei aiheutunut muutoksia pH- viljelemällä media.

luusarkoomasoluissa kuolee apoptoosin Hydro-Tarkennus BIOREAKTORITEKNIIKKA (HFB) B

koska vain pieni osa osteosarkooman SAOS-2 sekä HOS-solut sijoitetaan HFB solussa kulttuuri järjestelmä otettiin talteen jälkeen 3 tai 5 päivän viljelyn testasimme ovatko nämä solut olivat eliminoitu alkupopulaatiosta aiheuttamalla ne apoptoosiin. Siksi vertasimme määrien apoptoosin SAOS-2-soluja viljeltiin HFB 3 ja 5 päivää sen MACSorted CD133 (+) viljeltyjen solujen HFB 3 ja 5 päivää.

Tämän vuoksi olemme analysoidaan SAOS-2-soluja viljeltiin 3 päivän tai 5 päivän bioreaktorissa ja totesi, että Saos-2-soluja viljeltiin HFB 3 tai 5 päivän kuolevat apoptoosin kuten on esitetty virtaussytometrinen määritys anneksiini-V: n ja propi- jodidi värjäys näytteistä (kuviot 2 B ja D). 24% soluista löytyivät apoptoosin jälkeen 3-päivän viljelyn HFB. Mielenkiintoista, osa soluista kuolee apoptoosin kasvoi 62%, kun 5-päivän viljelyn HFB, vahvistaen havainnon (kuvio 1). Tärkeintä on, että näytteet CD133 (+) MACSorted soluja kasvatettiin HFB 5-päivän ajan, ei näytä tällainen korotus apoptoosin anneksiini V-värjäyksellä verrattuna kontrollinäytteeseen (kuvio 2E ja F). Samassa viljely olosuhteet HFB, The CD133 (+) solut lisääntyvät, kun CD133 (-) solut sen sijaan kuolevat apoptoosin kautta.

A) anneksiini-V-värjäys SAOS-2-soluja viljeltiin 1-G ja 3 päivää. Analyysin avulla erottaa kaaviossa välisen elävien solujen (alhaalla vasemmalla neljänneksessä), varhainen apoptoottiset solut (oikeanpuoleiseen alanurkkaan), apoptoottiset solut (oikeasta yläneljänneksestä), ja nekroottinen soluja (ylhäällä vasemmalla neljänneksessä). B) anneksiini-V-värjäys SAOS-2-soluja viljeltiin HFB varten 3 päivää. C) anneksiini-V-värjäys SAOS-2-soluja viljeltiin 1-G 5 päivää. D) anneksiini-V-värjäys SAOS-2-soluja viljeltiin HFB varten 5 päivää. E) anneksiini-V-värjäys CD133 (+) MACSorted SAOS-2-soluja, jotka viljeltiin 1-G 5 päivää. F) anneksiini-V-värjäys CD133 (+) MACSorted SAOS-2-soluja, jotka viljeltiin HFB varten 5 päivää. G) Suhteellinen kaspaasi-3 aktiivisuutta Saos-2 (koko väestöstä) viljeltiin 5 päivää HFB verrattuna Saos-2-solut (koko väestö) kasvatettiin staattisessa 1G kunnossa.

Olemme myös tutkinut tätä ilmiötä mittaamalla aktiivisuus caspases käyttämällä kolorimetristä caspases pakki joka mittaa aktiivisuutta caspases-3 näytteissä. Mukaan esitettyjen tietojen huomasimme, että Saos-2-solut (yhteensä väestöstä) viljeltiin HFB varten 5 päivää kasvoi 1,6-kertaiseksi kaspaasit-3-aktiivisuus havaittiin (kuvio 2 G), joka on mitta apoptoottisten indeksi näissä soluissa.

Kantasolujen merkki ilmaisun kasvaa seuraavien kulttuurin Hydro-kohdentaminen BIOREAKTORITEKNIIKKA

Ehkä kiehtovimpia kyky myönnettyjä pyörivän, alhaisen leikkausvoiman bioreaktori järjestelmä on mahdollisuus opiskella valvotuissa olosuhteissa, vuorovaikutusta solujen tietyn tyypin tai vuorovaikutus yhden solutyypin toiseen kun solut suspensiossa voivat vapaasti muodostaa omia yhdistyksiä. Halusimme analysoida ekspressiotasoja eri merkkiaineiden kehittämiseen liittyvien kantasolujen mesenkymaalista alkuperää. Ilmentymisen CD133, CD34, CD38, osteokalsiini, Sparc, Sox-9, RunX-2, Stro-1, CD117 /c-Kit, Oct3 /4, Endoglin, ja integriini-SS1 tutkittiin virtaussytometrialla. Kuvio 3A esittää prosenttia fluoresoivien solujen eri merkkiaineiden tarkastellaan SAOS-2-soluja viljeltiin staattista tilaa ja sen jälkeen kulttuurin HFB 5 päivää. Ekspressiotasoja ja solujen määrä, jotka ekspressoivat tutkittiin markkereita kasvoi sen jälkeen, kun 5 päivää kulttuurin HFB aluksen verrattuna viljeltyjen solujen normaalin painovoiman olosuhteissa. Mielenkiintoista on, että Saos-2-soluja kasvatettiin HFB astiassa oli suurinta suhteellista lisäystä solujen määrän positiivisia Sox-9, CD133, osteokalsiini, integriini-SS1, Sparc, RunX-2, ja Endoglin (94,7%, 89,3% , 82%, 81,8%, 81,3%, 79% ja 76%, vastaavasti), verrattuna SAOS-2-soluja viljeltiin normaalin painovoiman olosuhteissa. Oct3 /4, CD117, Stro-1 ja CD34 myös kasvoi määrä solujen lukumäärä positiivisuus (75,9%, 67,5%, 47,6%, 22,36%, vastaavasti) verrattiin 1G-kasvu vs. SAOS-2-soluja kasvatettiin simuloidussa hypogravity 5 päivää. Löysimme mitään muutosta määrän CD38-positiivisten solujen samoissa olosuhteissa. Koe toistettiin 5 kertaa vertailukelpoiset tulokset ja keskihajonnat laskettiin ja raportoidaan kaaviossa virhejanoina. Kuvio 3B esittää esimerkkiä immunofluoresenssivärjäyksen ja positiivisuus SAOS-2-soluissa ja CD133, Sox-9, Sparc, ja CD117 /c-Kit seuraavat kasvua HFB astiassa 5 päivää.

A) Kaavio ekspressiotasot eri bio-markkereita. Laventeli palkit ilmaisevat ekspressoivien solujen prosenttiosuus-tasojen eri merkkiaineiden vanhempien SAOS-2-soluja viljeltiin normaalin 1-G painovoima olosuhteissa (kontrolli). Violetti palkit ilmaisevat ekspressoivien solujen prosenttiosuus eri merkkiaineiden CD133 (+) MACSorted SAOS-2-soluja, jotka eristettiin vanhempien SAOS-2-soluja viljeltiin normaalin 1-G painovoima kunnossa. Keltainen palkit ilmaisevat ekspressoivien solujen prosenttiosuus eri merkkiaineiden CD133 (+) MACSorted SAOS-2-soluja, jotka viljeltiin hypogravity kunnossa. Vaaleansininen palkit ilmaisevat ekspressoivien solujen prosenttiosuus eri merkkiaineiden vanhempien SAOS-2-soluja, jotka viljeltiin hypogravity edellytys 5 päivää, jolloin populaatio valitaan ja lisääntynyt CD133 (+) SAOS-2-soluissa. B) immunofluoresenssi (40 x) ja positiivisuus SAOS-2-soluissa ja CD133, Sox-9, SPARC, ja CD117 /c-Kit kasvun jälkeen bioreaktorissa 5 päivää.

CD133 (+) solut kasvavat kolmiulotteisesti Hydro-kohdentaminen BIOREAKTORITEKNIIKKA ja muoto pallojen

SAOS-2 CD133 (+) rikastunut luusarkoomasoluissa lisääntyvät ja koota kolmiulotteisesti kuin sarcospheres jälkeen 3-päivän kulttuuri bioreaktorissa , joka on vielä toinen ominaisuus kantasolujen kasvua. Kuviot 4 A ja B esittävät 10 ja 40 × suurennos valtaa, vastaavasti sarcospheres viljellään bioreaktorissa kuluttua 3 päivän viljelyn simuloidussa hypogravity. Mielenkiintoista, CD133 (+) Saos-2-solut, jotka oli kasvatettu simuloidussa hypogravity pystyivät palauttamaan emosolulinjassa (muodostuu noin 10% ± 6,8 CD133 (+) soluja ja 90% ± 6,8 CD133 (-) solut ) jälkeen yhden viikon ajan, kun ympättiin käsitellään kulttuuriin ruokia, jotka mahdollistavat tarttuvien solujen kiinnittyä muovi ympäristöön. Kuva 4 C ja D (10 × ja 40 ×, vastaavasti) esittävät SAOS-2 CD133 (+) solut lisääntyivät ja valitaan HFB jotka myöhemmin kasvatettiin kiinnittämistä kudosviljelymaljoille. Vuonna saatetun soluviljelmissä jotkut ei-kiinni soluja havaittavissa; nämä voisivat olla kantasolujen kaltaisia ​​soluja kutsutaan myös syövän kantasoluja.

A) HFB kasvatettiin SAOS-2 luusarkoomasoluissa (CD133 +) pystyvät lisääntymään ja koota kolmiulotteisesti kuin sarcosheres jälkeen 3-päivän viljelyn bioreaktori (10-kertainen suurennus). B) HFB kasvatettiin SAOS-2 luusarkoomasoluissa (CD133 +) pystyvät lisääntymään ja koota kolmiulotteisesti kuin sarcosheres jälkeen 3-päivän viljelyn bioreaktorissa (40-kertainen suurennus). C) HFB kasvatettiin SAOS-2 luusarkoomasoluissa (CD133 +) ympättiin säteilytetty muovi viljelymalja, liuota normaali liitteenä fenotyypin vanhempien Saos-2 viikon kuluttua viljelyn (10-kertainen suurennus). Nuolet on CD133 (+) SAOS-2-soluissa, joka esittää pyöristetyn ja heikosti liittämällä fenotyypin. D) HFB kasvatettiin SAOS-2 luusarkoomasoluissa (CD133 +) ympättiin säteilytetty muovi viljelymalja, liuota normaali liitteenä fenotyypin vanhempien Saos-2 viikon kuluttua viljelyn (40-kertainen suurennus). Nuoli osoittaa CD133 (+) Saos-2-soluissa osoittaa pyöristetty ja heikosti liittämällä fenotyypin.

Tiedetään, että kantasolujen kaltaisia ​​soluja muodostavat solun palloja kun viljellään ultra low-liittämällä ruokia. Siksi testattiin kykyä CD133 (+) SAOS-2 MAC-lajitellut solut muodostavat soluklustereita jos se sijoitetaan ultra low-liittämällä ruokia. Niiden kyky muodostaa klustereita oli vähemmän tehokas verrattuna niihin soluihin, jotka on viljelty hydrofocusing bioreaktorissa, mutta ne olivat silti muodostaa palloja. Kuvio 5 A ja B esittävät palloja muodostuu SAOS-2 CD133 (+) solujen ultra low-liittämällä ruokia. Testasimme myös kykyä SAOS-2 CD133 (+) MACSorted ja rikastunut soluja kiinnittymään kudosviljelylautasiin ja todentaa emo Saos-2-solulinja. Kuten odotettua, MACSorted CD133 (+) rikastunut solut laitettiin kiinnittämistä kudosviljelymaljoilla oltuaan viljeltiin ultra low-kiinnittämällä annoksia kaksi viikkoa, käyttövalmiiksi emo SAOS-2 solulinjan viikon kuluttua kulttuurin kiinnittämällä lautasen, ilmentää litteä ja eriytetty fenotyypin ajan. Kuvio 5C ja D esittää kiinnittynyt SAOS-2-soluissa, jotka ovat peräisin CD133 (+) MACSorted soluja kasvatettiin kiinnittynyt kudosviljelymaljoille. Kuvio 5 E esittää Saos-2-solulinja saatettu jälkeen 10 päivän ymppäyksen CD133 (+) rikastettu solujen kiinni kudosviljelymaljoille.

A) MACSorted CD133 (+) SAOS-2-soluissa koota kolmen mitoiltaan kuin sarcosheres 2 viikon kuluttua kulttuurin ultra low-kiinnittämällä astiat (20-kertainen suurennus). B) Toinen esimerkki MACSorted CD133 (+) Saos-2-solut muodostavat Sarco-palloja 2 viikon kuluttua kulttuurin ultra low-kiinnittämällä astiat (10-kertainen suurennus). C) SAOS-2 luusarkoomasoluissa peräisin kolmiulotteisen viljelmiä kasvatettiin ultra low-kiinnittämistä ruokia ympättiin liittämällä astioissa kiinnittyvä eriytetyn fenotyyppi jälkeen 3 päivää. D) SAOS-2 luusarkoomasoluissa peräisin kolmiulotteisen viljelmiä kasvatettiin ultra low-kiinnittämistä ruokia ympättiin liittämällä astioissa kiinnittyvä eriytetyn fenotyyppi kuluttua 5-päivän. E) SAOS-2 luusarkoomasoluissa peräisin kolmiulotteisen viljelmiä kasvatettiin ultra low-kiinnittämistä ruokia ympättiin liittämällä astioissa on pysyvä ja eriytetty fenotyypin 10 päivän kuluttua.

Toinen osoitus siitä, että kaksi erillistä populaatiot ovat tunnistettavissa SAOS-2 solulinja on todisteita siitä, että CD133 (+) MACSorted Saos-2 ovat lisääntynyt kyky kasvaa pehmeässä agarissa verrattuna vanhempien soluihin. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille suorittaa 6 rinnakkaisnäytettä kustakin kokeellisen pisteen. Sama määrä SAOS-2-soluissa ja CD133 (+) SAOS-2-soluja (5 x 10

3 solua /kuoppa) ympättiin 6 jäljennöksiä osaksi kuuden hyvin lautasen. Tehokkuutta CD133 (+) Saos-2-solut voivat kasvaa pehmeässä agarissa ja kokoontua kolmiulotteisia rakenteita on paljon suurempi kuin vanhempien SAOS-2-soluissa. Kuusisataa ja ± 240 pesäkkeet laskettiin pehmeästä-agar 6-kuopan astioihin ympättiin CD133 (+) Saos-2-rikastettu solujen verrattuna vain 20 ± 12 pesäkkeiden pehmeästä-agar ruokia ympättiin CD133 (- ) SAOS-2-soluissa. Kiinnostavaa kyllä, 120 ± 80 pesäkkeet lasketaan siitä pehmeässä agarissa ruokia ympättiin vanhempien SAOS-2-soluissa, mikä viittaa siihen, että kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa voi johtua, että läsnä on osa (jatkuvasti, noin 10% ± 6.8) kantasolujen kaltaisia ​​soluja sisällä SAOS-2 solulinja meillä laboratoriossamme (taulukko 3). Kuvio 6 esittää esimerkin pehmeän agar-määritys suoritettiin vanhempien kasvaimen solulinja (kuvio 6A) kanssa tai CD133 (+) rikastettu osa SAOS-2-soluissa (kuvio 6B). Emo SAOS-2 solut muodostivat aloilla, mutta hyvin alhainen hyötysuhde verrattuna rikastettu CD133 (+) soluista.

A) Contrast vaiheen mikroskopia pehmeä agar määritys vanhempien SAOS-2-soluissa. B) Contrast vaiheen mikroskopia pehmeä agar määritys HFB CD133 (+) lisääntynyt SAOS-2-soluissa. C) Propidiumjodidia virtaussytometria-analyysi SAOS-2-soluja kasvatettiin 1-G kulttuuri järjestetty niiden CD133 tila näytetään kaksi erilaista ryhmää: CD133 (+) ja CD133 (-) solut, joissa on eri solusyklin profiili. D) immunofenotyyppi SAOS-2-soluja kasvatettiin 1-G verrattuna HFB kulttuurin osoittaa, että Saos-2-soluja kasvatettiin 5 päivää simuloidussa hypogravity on valtaosa soluista värjättiin Ki-67 ja sen vuoksi S-vaihe solusyklin.

lisäksi näyttöä siitä, että on olemassa kaksi erillistä populaatioita SAOS-2 solulinjasta, joka näyttää koostuu CD133 (+) ja (-) solut, että nämä kaksi eri populaatioissa on selvä solusyklin profiilin. Suoritimme virtaussytometria-analyysin SAOS-2-soluja kasvatettiin 1G kulttuurin ja havaitsi, että Saos-2-CD133 (+) soluja, jotka oli lajiteltu niiden CD133 asema ja värjätään propidiumjodidilla, oli eri solusyklin profiilin suhteen CD133 (+) väestöstä. Kuvio 6C esittää edustavan virtaussytometristä määritystä SAOS-2-soluissa, jotka osoittavat, että CD133 (-) SAOS-2 väestöstä oli 13,8% solujen G2 /M-vaiheen solusyklin, kun CD133 (+) soluista osoitti lisääntynyttä osa (49%) soluja G2 /M-vaiheen solusyklin. Vertailukelpoisia tuloksia saatiin rinnakkain ja kokeiden toisto.

Mielenkiintoista, SAOS-2-soluja kasvatettiin bioreaktorissa ja 5 päivää ja värjättiin anti-CD133 (Miltenyi, Saksa) ja leviämisen markkerin anti-Ki-67 havaittu olevan solujen lisääntymiseen verrattuna SAOS-2-soluja kasvatettiin 1G kulttuureissa. Kuvio 6D esittää edustavan virtaussytometria määrityksessä SAOS-2-soluissa, jotka osoittavat, että solut viljeltiin HFB lisääntyvät eri nopeudella kuin koko SAOS-2-solupopulaation. Itse asiassa, osa SAOS-2 CD133 (+) solut, jotka ovat myös positiivisia Ki-67, kasvoi 14,27%: sta 53,98%: vertaamalla soluja viljeltiin 1G kasvun verrattuna nämä solut viljeltiin 5 päivää HFB simuloitu hypogravity kunnossa vastaavasti. Vastaavia tuloksia saatiin rinnakkain ja kokeiden toisto.

simuloitu hypogravity parantaa apoptoosin ja herkistää syövän kantasoluja kemoterapiaa

CSCS uskotaan olevan vastuussa aloittaa ja ylläpitää sairauden. Jotkin kasvaimet kestävät hyvin kemoterapiaa ja muista hoitomuodoista.