Krooninen sairaus

tiivistelmä

mikrosatelliitti epävakaus (MSI) on tunnettu siitä, että laajeneminen tai supistuminen DNA toista kirjoitusten seurauksena DNA mismatch korjaus puutos (MMRD). Tarkka havaitseminen MSI syöpäsoluissa on tärkeää, koska MSI liittyy useita syövän alatyyppejä ja voi auttaa ilmoittaa terapeuttista päätöksiä. Vaikka kokeelliset määrityksiä on kehitetty havaitsemaan MSI, ne yleensä ovat riippuvaisia ​​pieni määrä tunnettujen mikrosatelliittimerkkien loci tai yhteensopimattomuus korjaavien geenien ja on rajoitettu luotettavuus. Täällä me raportoimme uusi genominlaajuisten lähestymistapa MSI tunnistus perustuu maailmanlaajuiseen havaitsemiseen lisäyksiä ja poistoja (indeleitä) in mikrosatelliitteihin löytyy ilmaistuna geenejä. Meidän laajamittainen analyysit 20 syöpäsolun linjat ja 123 terveillä henkilöillä paljasti silmiinpistävää Indel piirteitä liittyy MSI: on merkittävä kasvu lyhyitä mikrosatelliittimerkkien deleetioiden MSI näytteissä verrattuna microsatellite vakaa (MSS) ne, mikä viittaa mekanistinen bias korjaus tehokkuuden välillä lisäykset ja poistot normaaleissa ihmisen soluissa. Sisällyttämällä tämä havainto meidän MSI pisteytys metrinen, osoitamme, että lähestymistapamme voi oikein erottaa MSI ja MSS syöpäsolun linjat. Lisäksi kun sovelsimme lähestymistapa Primal kasvain näytteitä, meidän tieto on myös hyvin sopusoinnussa diagnosoitu MSI tila. Siten Tutkimuksemme tarjoaa uutta tietoa DNA yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä, ja tarjoaa myös uudenlaisen MSI diagnoosi menetelmä kliinisen onkologian paremman luotettavuuden.

Citation: Lu Y, Soong TD, Elemento O (2013) uusi lähestymistapa karakterisoimiseksi mikrosatelliittimarkkereita Epävakaus syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (5): e63056. doi: 10,1371 /journal.pone.0063056

Editor: Yousin Suh, Albert Einstein College of medicne, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 syyskuu 2012; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2013; Julkaistu: 06 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: OE olisi haluavat vastaanottaneeni National Science Foundation (NSF) Ura Grant 1054964. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

normaalit solut, mismatch korjaus (MMR) tarjoaa erittäin tehokas mekanismi korjaamiseksi aikana tapahtuneet virheet DNA-replikaation. Kun heikentynyt, esim. kautta inaktivaation ihmisen yhteensopimattomuuden korjaavien geenien kuten MLH1, MSH2 ja MSH3, epäsuhta korjaus puutos johtaa korjaamattomia insertiot /deleetiot (indeleitä), etenkin mikrosatelliitteihin jossa lyhyessä sekvenssiyksikkö (yksi-kuusi nukleotidia) toistetaan useita kertoja [1] .

mikrosatelliittien epävakaus (MSI) viittaa geneettisesti poikkeavaa tila, jossa mikrosatelliitti alleelien genomissa saada tai menettää toista yksikköä paljon korkeammalla taajuudella kuin normaaleissa soluissa. Normaalitila on usein kutsutaan microsatellite vakaana tai MSS. Laajalle levinnyt MSI ilmaisee yleensä mismatch korjaus puutos (MMRD), joka voi aiheuttaa mutaatioiden syöpään liittyvien geenien ja johtaa syövän synnyn ja kasvaimen etenemistä. Niinpä MSI havaitaan usein useita erilaisia ​​syöpiä, erityisesti paksusuolen syövän [2] ja eturauhassyövän [3]. Läsnäolo MSI voidaan käyttää markkerina tietyn kasvaimen ja alatyyppejä voidaan ennustaa herkkyyttä kemoterapiaa [1]. Lisäksi MSI tuottaa merkittävää geneettistä heterogeenisyyttä ja sitä voidaan käyttää muihin tarkoituksiin, kuten eristäminen lääkkeille vastustuskykyiset kloonit ja sen jälkeen karakterisointi lääkeresistenssimekanismien [4].

Tällä hetkellä useita määrityksiä olemassa havaitsemiseksi MSI , mukaan lukien etsivät mutaatioita MMR geenien mittaamalla niiden ilme, tai etsivät yksikön numero muutoksia joukko mikrosatelliitteihin usein vaikuttaa MSI [5], [6]. Nämä määritykset eivät aina ole luotettavia. Esimerkiksi kaksi tutkimusta käytetään eri määrityksiä edellyttäen vastapäätä tuloksia noin MSI tilan PC3 eturauhassyöpäsolulinja [3], [7]. Lisäksi yleisesti käytetty MSI markkereita ovat solutyyppispesifisiä. Esimerkiksi on raportoitu, että yleisesti käytetty merkkiaineiden paksusuolen syöpä on alhainen herkkyys akuutti myelooinen leukemia [8].

Monet muut tekijät voivat vaikuttaa negatiivisesti tarkkuuteen käytettävissä MSI havaitsemiseen tekniikoita. Menetelmät, jotka käyttävät menetys ilmaisua tai mutaation tunnettujen MMR geenien saattaa hidastaa monimutkaisuus MMR järjestelmän, joka koostuu useiden geenien ja mahdollisesti muita tuntemattomia niistä. Alhainen herkkyys yksikön numero lähestymistavat voidaan selittää satunnaisen luonteen MSI: MMRD voi vaikuttaa erilaista mikrosatelliitteihin eri yksilöillä. Tämä saattaa selittää, miksi rajoitettua sarjaa markkereita käytetään nykyisessä MSI havaitsemismäärityksissä joskus antaa vääriä negatiivisia.

voittamiseksi tällaiset rajoitukset, kehitimme uuden menetelmän, joka parantaa herkkyyttä MSI havaitsemisen sisällyttämällä kaikki havaittavissa mikrosatelliitteihin poikki genomin ominaista seuraavan sukupolven sekvensointi. Päätimme perustaa analyysimme RNA-Seq, koska se on suhteellisen kypsä seuraavan sukupolven sekvensointi tekniikka ja on jo laajalti suoritettu erilaisiin sovelluksiin. Vaikka lyhyen lukea sekvenssit haasteita kartoittamiseen ja luonteenomaiset mikrosatelliittia, olemme ratkaista nämä kysymykset ja osoitti luotettavuutta genominlaajuisten skannaus lähestymistapa MSI havaitsemiseen. Sen lisäksi perustaa tunnistus on huomattavasti lisääntynyt määrä mikrosatelliittimerkkien indeleitä MSI soluissa, lähestymistapamme hyödyntää ilmiö toistaiseksi ainoa raportoitu hiiva mutta havaitsimme ihmisen soluissa Tässä tutkimuksessa: Indel pituusjakaumista MSI ja MSS näytteet ovat merkittävästi erilaiset [9]. Genominlaajuisten havaitseminen mikrosatelliittimerkkien indeleitä vältetään puutteet rajallinen merkki asettaa ja tarjoaa herkkiä MSI havaitsemiseen. Sen lisäksi, että herkkä, meidän lähestymistapamme ei vaadi sovitetun ituradan ohjaus samasta yksilöstä, joten sitä voidaan soveltaa syöpäsolun linjat.

Materiaalit ja menetelmät

Tietoaineistot

tässä tutkimuksessa käytimme RNA-seq kerättyä 20 eri syöpäsolulinjasta selvittääkseen MSI taajuuksia eri syöpätyyppejä. Kaikki tasyöpäsolulinja aineistoja saatiin julkaistuista tutkimuksista, ja MSI asemaa monet näistä solulinjoista on jo raportoitu (vaikka joidenkin solulinjojen tuloksia eri tutkimuksista konflikti). Taulukossa 1 on esitetty MSI tilatiedot ja lähteitä RNA-seq aineistoja. Käytimme myös kaksi julkaistua RNA-seq tutkimukset HapMap lymfoblastoidisissa otetuista näytteistä 69 Nigerian [10] ja 54 Euroopan yksilöt [11] verrokkeina määritellä MSI tila normaaleissa ihmisen soluissa, koska MSI ei odoteta Näytteiden. Analysoimme myös pariksi paksusuolensyöpä kasvain ja normaali RNA-Seq näytettä 14 potilaalla diagnosoitiin MSI kasvaimia ja 14 potilaalla diagnosoitiin MSS kasvaimia [12].

havaitseminen mikrosatelliittimerkkien indeleitä

ensimmäinen uutettu mikrosatelliitit kaikissa ihmisen RefSeq transkriptit käyttäen peräkkäistoistot Finder (TRF) [13]. Tässä tutkimuksessa mikrosatelliitteihin määriteltiin peräkkäistoistot toistuvien yksiköiden 1-6 emäsparia. Kutakin RNA-seq aineisto, me sitten linjassa lyhyellä lukee RefSeq selostukset käyttämällä BWA [14], joka mahdollistaa gapped-linjaus. Käytimme korkeintaan aukon koko 20 emäsparin kaikissa analyyseissä raportoitu täällä. Testasimme myös suurempia kuilu kokoja, mutta ne eivät lisänneet havaittujen indeleitä analyyseissä, jotka seuraavat. Muilta parametrien käytimme BWA oletusparametrit. Sitten käytimme DINDEL [15] soittaa indeleitä päässä linjassa lukee. Lähdöstä dindel, me suodattaa pois yhteisestä indeleitä lueteltujen yhden emäksen monimuotoisuus tietokanta (dbSNP; Build 132) [16]. Lopuksi vertasimme koordinaatit indeleitä koordinaatteihin mikrosatelliitteihin saapuvat TRF ja tunnistettu indeleitä sisällä mikrosatelliitteihin (kuva 1a).

PI viittaa osuus insertioiden mikrosatelliitteihin kaikkia lisäyksiä, ja PD viittaa osuus deleetioiden mikrosatelliitteihin kaikkien poistot.

Quantifying MSI käyttäminen MSI-seq Index

Kartoitimme useita MSI toimenpiteitä perustuu lukumäärän indeleitä ja mikrosatelliitteihin määritettiin analyysimme putki . Näitä toimenpiteitä olivat osuus mikrosatelliittimerkkien lisäyksiä kaikkien insertiot (merkitään PI), ja osuus mikrosatelliittimerkkien poistot kaikkien deleetiot (merkitty PD, kuva 1b). Olemme myös arvioineet PI /PD, koska meidän tuloksin sopimukseen aiemman tutkimuksen hiiva [9], ehdotti, että MMRD saattavat muuttaa suhteelliset nopeudet lisäysten ja poistojen. PI /PD on myös nimitystä kuin MSI-kohdat indeksin tässä tutkimuksessa.

Expression profilointi MMR sukulaisgeenejä

Jos haluat vertailla lähestymistapamme menetelmillä käyttäen ekspressiotaso ja mutaatio tilan MMR komponenttien määritimme ilmentymistason MMR geenien (kuten MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH4, MSH5, MSH6, PMS1 ja PMS2) syöpäsolulinjoissa peräisin RNA-seq data. Käytimme Kalvosinnapit [17] laskea normalisoidut ekspressiotasot mitattiin fragmentteja kohti kiloemästä transkriptilaji miljoonasosaa lukee (FPKM). Olemme myös etsineet indeleitä MMR geenien avulla DINDEL tulokset (ei rajoitu mikrosatelliitteihin). Lopuksi etsimme yhden nukleotidin varianttien samassa MMR geenien avulla SNVseeqer [4], [18], [19]. Kuten teimme Indel soittaa, me vain säilyttänyt SNVs ole lueteltu dbSNP tarkempaa analysointia.

Tulokset

Indel Detection in RNA-seq Tiedot MSI /MSS Näytteitä

ensin pyrittiin selvittämään indeleitä sisällä RNA-seq näytteet tässä tutkimuksessa käytetyt (MSI, MSS, HapMap). Sen jälkeen lyhyen lukea linjaus käyttäen BWA, käytimme DINDEL kutsua indeleitä meidän 20 syöpäsolulinjoissa ja 123 HapMap RNA-seq aineistoja. Vuodesta DINDEL lähdöt, me suodattaa pois indeleitä lueteltujen yhden emäksen monimuotoisuus tietokanta (dbSNP; Build 132) [16]. Suodatuksen jälkeen absoluuttinen Indel laskee vaihtelevat noin 200 yli 2000 (kuvio 2).

(a) HapMap näytteistä (b) syöpäsolulinjoja.

eri jakaumat Mikrosatelliittimarkkerien Indel Muutoksia MSI /MSS näytteitä

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään taajuus, jolla mikrosatelliittimerkkien sekvenssit muuttaa indeleitä kussakin RNA-seq näyte. Kaikkiaan 505.657 mikrosatelliitteihin löytyivät 32199 Refseq transkriptio-sekvensseihin käyttäen TRF. Sitten määritetään määrä mikrosatelliitit muuttaa ainakin yhden Indel kunkin RNA-seq näyte. Tämä määrä vaihtelee 54-482 vuonna HapMap näytteissä, ja 77-1454 syöpäsolulinjoissa. Kaikkiaan seuraavat analyysit, me vain tutkia indeleitä sisällä mikrosatelliitteihin. Kussakin näytteessä, me määritetään sitten osuus mikrosatelliitit muuttaa indeleitä joka sijaitsee 5 ’UTR, koodaavan sekvenssin, 3’ UTR tai ei-koodaavat RNA: t, ja määritetään, onko nämä osuudet ovat huomattavasti toisistaan ​​MSI ja HapMap näytteiden välillä MSS ja HapMap näytteet. Havaitsimme merkittävän kasvun osuuden indeleitä in MSI näytteitä ”koodaavat sekvenssit (p = 1e-5, Studentin t-testi; kuva 3a) verrattuna HapMap näytteitä, kun osuus jäi samanlainen MSS näytteissä (p = 0,15, Studentin t-testi). Vastaava tähän kasvuun, osuus mikrosatelliittimerkkien indeleitä muilla alueilla oli alempi MSI näytteissä verrattuna HapMap (5 ’UTR: p = 0,0149; 3’ UTR: p = 0,0108), kun taas ei ole eroa MSS näytteiden ja HapMap (p Kuvio 3b-c). Ei-koodaavat RNA: t, havaitsimme merkittäviä eroja HapMap, MSI ja MSS (p 0,05, kuvio 3d). Esiintyvyys mikrosatelliittimerkkien indeleitä koodauksessa alueilla MSI (ja jossain määrin MSS) syöpäsolut mukaan nämä indeleitä voisi johtaa valikoivan edun syöpäsoluja, sopusoinnussa havaintojen muiden organismien [20].

(a) koodaavat sekvenssit (b) 3′-UTR (c) 5’UTR (d) ei-koodaavan RNA.

aiemmassa tutkimuksessa hiivassa, todettiin, että sen jälkeen, kun mutaatio DNA mismatch korjaus proteiineja, oli merkittävä kasvu useita lyhyen deleetioita mikrosatelliittia, kun taas määrä insertioiden mikrosatelliitteihin ei muuttunut merkittävästi [9]. Pohjautuu näihin tuloksiin, me tutki myös jakeluun havaittujen mikrosatelliittimerkkien Indel pituudet MSI /MSS näytteitä. Huomasimme, että lyhyet deleetiot 1 emäsparin useammin MSI solulinjat kuin ne ovat HapMap näytteissä (kuvio 4a). Tutkia tarkemmin tämän havainnon, vertasimme jakaumat paikoilleen ja poistot saadaan kustakin 7 MSI syöpäsolun linjat ja 5 MSS solulinjat yleistä jakaumat paikoilleen ja poistot kaikista 123 HapMap valvontaa. Kolmogorov-Smirnov testi osoitti, että pituus jakaumat mikrosatelliitteihin deleetioiden MSI näytteet olivat merkittävästi erilainen HapMap näytteistä (p 0,05). Sitä vastoin yhtä lukuun ottamatta kaikki MSS näytteissä ei havaittu merkittävää eroa poistetaan pituudet (p 0,05). Jakaumien lisäys pituudet, toisaalta, eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä 3 ryhmään (kuva 4b). Nämä havainnot viittaavat siihen, että puute kanssa korjausmekanismi, joka liittyy mikrosatelliittien epävakautta ensisijaisesti aiheuttaa lyhyitä poistot.

(a) mikrosatelliitti poistot (b) Mikrosatelliittimarkkerien insertioita.

Euroopan MSI-seq Index oikein ennustaa MMRD Solulinjat

alkuperäinen tavoite oli tunnistaa genominlaajuisten indeksi tai mittayksikkö, joka luotettavasti erottaa MSI näytteitä MSS näytteistä. Alussa tutki kahta mahdolliset toimenpiteet: osuus mikrosatelliittimerkkien lisäyksiä kaikkien insertiot (merkitään PI), ja osuus mikrosatelliittimerkkien poistot kaikkien deleetiot (merkitty PD, kuva 1b). Analyysi on edellisessä osassa kävi ilmi, että verrattuna normaaliin ihmisen soluja, useita lyhyitä deleetioita merkittävästi lisääntynyt MSI solulinjoissa mutta ei mikrosatelliitti vakaa (MSS) syöpäsolun linjat. Tästä johtuen erosta, PD erotellut MSI ja MSS näytteitä, vaikkakaan ei täydellisesti (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan vaikka PI ei pysty erottamaan toisistaan ​​kahden solua, se kuvastaa edelleen absoluuttinen määrä Mikrosatelliittimarkkerien indeleitä. Tämän seurauksena normalisoi PD PI voi tehdä MSI tiloja eri näytteiden enemmän vertailukelpoisia. Meillä on siis tutkinut suhdetta kaksi mittasuhteet vaihtoehtona indeksin erottamaan MSI ja MSS solulinjoissa. Kun laskettu PI /PD MSI ja MSS syöpäsolulinjat, havaitsimme merkittäviä eroja kahden ryhmän välillä (p = 2.4e-5, t-testi), jossa MSI osoittaa alemman PI /PD (kuva 5a). Kuten odotettua, PI /PD-arvot olivat myös merkittävästi toisistaan ​​MSI ja HapMap (p = 1.5e-10, t-testi). Se, että MSI ja MSS näytteet ovat tilastollisesti erilainen PI /PD ei tarkoita, että PI /PD on erittäin luotettava klo erotteleva MSI ja MSS. Olemme kuitenkin vielä todettava, että PI /PD selvästi erottaa MSI ja MSS solulinjojen kahteen eri ryhmään (kuva 5a). Itse asiassa, kaikki solulinjat, jotka on tunnistettu MSI (taulukko 1) osoittavat PI /PD-suhteet pienempi kuin 1. Sen sijaan, MSS solulinjoista suhteet ovat suurempia kuin 1, joka on samanlainen HapMap näytteet (kuvio 5a). Nämä tulokset osoittavat, että PI /PD-suhde, jota kutsumme MSI-seq indeksi voi tarkasti ennustaa MSI tila syöpäsolulinjoissa, jopa ulottuu useita syöpätyyppejä.

(a) Vertailu PI /PD suhteet HapMap näytteitä, MSI syöpäsolun linjat ja MSS syöpäsolulinjoissa (b) PI /PD suhdeluvut kaikille HapMap näytteet ja syöpäsolun linjat. HapMap näytteitä ”PI /PD suhteet edustaa empiirinen tiheyttä käyrä. Suhdeluvut tunnetut solulinjat piirretään punaisella pystyviivoja. Tunnetut MSS solulinjoja piirretty sininen, ja kaikki muut solulinjat on piirretty violetti.

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että MSI-seq indeksi voi luotettavasti ennustaa MSI tila. Siksi sovelletaan analyysimme on solulinjoja, joiden MSI tila ei ollut ominaista. Tutkimuksessamme kaikki tällaiset solulinjat laski alueella HapMap näytteistä (kuvio 5b). Siksi meidän kriteerit, ne ovat todennäköisesti MSS solulinjoja. Ennusteita jotkut solulinjat tuettu lisätodisteita. Esimerkiksi kaikki kolme MSI-karakterisoimattomat rintasyövän solulinjat luokitellaan MSS. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien tutkimusten mukaan MSI voi pelata vain vähäinen merkitys synnyssä rintasyövistä verrattuna muissa elimissä [21].

Expression tai mutaatio tiedossa MMR geenien Epäonnistua jotta ennustaa luotettavasti MSI tila

yrittänyt seuraavaksi määrittää, onko muita yksinkertaisempi perustuvia lähestymistapoja ilmentymisen tai mutaation tunnettujen MMR geenien voisi ennustaa MSI tila. Aiemmat havainnot ovat todellakin ehdottaneet, että inaktivointi MMR geenit voivat aiheuttaa MMRD [1]. Siksi periaatteessa ilmaus profiilia MMR liittyvien geenien voisi myös ennakoida MMRD ja MSI. Me katsoimme 7 MSI solulinjojen ja 5 MSS solulinjoissa MSI tilat vahvistanut aikaisempien tutkimusten.

ekspressiotasot tunnettujen MMR geenien ei korreloinut MSI tila (kuvio 6; FPKM arvot normalisoitu keskiarvo jokaisen sarakkeen). Esimerkiksi MLH1 ilmentyminen on tukahdutettu kahdessa solulinjoissa, HCT116 ja DU145. Tällainen menetys liittyy menetys MLH3 ilmaisun DU145 ja menetys MSH3 ilmaisun HCT116, kuten aiemmin raportoitu [22]. Eräässä toisessa MSI LNCaP, mutta kaikki nämä geenit ilmentyvät normaalissa tasossa, kun taas tukahdutettu ilmentyminen MSH2 voi olla vastuussa MSI [3], [23]. Analyysi pistemutaatioiden ja indeleitä osoitti myös puute korrelaatio MSI asema, jossa MSS näytteet osoittavat missense variantit MMR geenien vaikka monet MSI solut eivät variantteja (taulukko 2). Näin ollen, toisin kuin MSI-seq indeksi, ei MMR-geenin ilmentymisen tasoa eikä mutaatiot ovat todella luotettava MSI havaitsemiseen.

Arvot on normalisoitu keskiarvo kunkin sarakkeen.

Sovellus kliiniset näytteet

sitten testataan onko lähestymistapamme voi ennustaa MSI tilan ensisijainen kasvaimia. Analysoimme pariksi paksusuolensyöpä kasvain ja normaali RNA-Seq näytettä 14 potilaalla diagnosoitiin MSI kasvaimia ja 14 potilaalla diagnosoitiin MSS kasvaimia [12]. Suhdeluvut MSI kasvainnäytteestä vaihtelevat 0,630-0,814, kun taas suhteet MSS kasvainnäytteestä vaihtelevat +0,986-+1,573. Siksi kynnys noin 0,9 pystyy tuottamaan tarkkoja MSI asema ennusteita, joka on samanlainen kuin mitä olemme havainneet syöpäsolulinjoissa. Lisäksi suhde MSI kasvaimen näytteet osoittivat merkittävää eroa verrattuna pariksi normaalia näytettä (p = 5.57e-11; t-testi), kun taas ei ole eroa MSS kasvaimen ja normaalia näytettä (p = 0,6438, t-testi) (kuvio 7). Tämä tulos osoittaa, että menetelmä ei ainoastaan ​​toimii syöpäsolulinjoissa, mutta on myös tehokas havaita MSI tilaansa primäärikasvaimissa.

14 diagnosoitu MSI ja 14 diagnosoitu MSS.

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme ottaneet käyttöön uudenlainen ja luotettava indeksi (MSI-kohdat) havaitsemiseksi mikrosatelliittien epävakautta käyttämällä transcriptome sekvenointitulosten. Toisin kuin muut lähestymistavat, jotka rajoittuvat kysely pieni määrä geenejä tai mikrosatelliitti alueilla, meidän menetelmä integroi Indel dataa suuri määrä ilmaistaan ​​mikrosatelliitteja. Lähestymistapamme ei riipu ituradan DNA: n ja on siksi yhtä hyvin soveltaa syöpäsolun linjat ja perusnäytteiksi. Olemme osoittaneet, että lähestymistapamme on tarkempi kuin lähestymistavat, jotka perustuvat havaitsemiseen pistemutaatio tai ilmentymisen muutoksia yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän geeneissä. Toinen etu lähestymistapamme on, että MSI-seq-indeksi on jatkuva mitta MSI. Aiemmissa tutkimuksissa, MSI usein rinnastetaan kaikki tai ei mitään tapahtuma. Perinteiset määritykset voi vain kertoa, onko näyte on MSI tai MSS. Kuitenkin biologisesti relevantti tapauksissa MSI tila näytteiden todennäköisesti span jatkuva spektri, ja laajuus MSI voi olla terapeuttista merkitystä. Siksi MSI-seq (PI /PD-suhde) Tässä tutkimuksessa käytettiin saattaa olla lupaava ehdokas määrällisesti suhteellisen MSI asteen näyte.

aikana meidän on tutkittava mahdollista indeleitä syöpäsolulinjoissa olemme tehneet useita mielenkiintoisia havaintoja. Olemme havainneet, että lyhyet deleetioita microsatellite alueilla, erityisesti 1 kp poistot ovat johdonmukaisesti erittäin yliedustettuina MSI syöpäsolulinjoissa verrattuna MSS syöpäsolun linjat ja kuolemattomaksi mutta ei-pahanlaatuiset HapMap näytteitä. Toisaalta, emme löytäneet mitään johdonmukaista lisäystä enää deleetioita tai insertioita MSI näytteissä. Samanlainen havainto on tehty hiiva [9], mutta parhaan tietomme on ensimmäistä kertaa tätä ilmiötä raportoitu ihmisen soluissa. Tämä havainto vahvistaa, että useita DNA korjausmekanismit ovat pelissä normaaleissa soluissa ja pääsee mikrosatelliittia, tahattoman poistamisen ja insertioita eripituista korjataan kautta erillisiä mekanismeja.

Toinen havainto on, että on olemassa enemmän mikrosatelliittimerkkien indeleitä koodauksessa alueet syöpäsoluissa ja erityisesti MSI-positiivisten syöpäsolujen. Tämä havainto on yllättävä, koska huomattava osa näistä indeleitä odotetaan aiheuttavan sisäisen lukukehyksen, ei-sense-välitteinen hajoaminen ja näin ollen geenin inaktivaation. Tuloksemme toisaalta viittaavat siihen, että syöpäsolut lisääntynyt koodaus mikrosatelliittimerkkien indeleitä voidaan valita positiivisesti ja siksi, että koodaus mikrosatelliittimerkkien indeleitä voisi edistää kasvaimen fenotyypit. Vaihtoehtoisesti nämä indeleitä saattaa syntyä toiminnallisen monimuotoisuuden, joka mahdollistaa nopean mukauttamisen kasvainsolujen muuttuvassa ympäristössä, mahdollisesti samanlainen kuin mitä on havaittu hiivan [20].

Menetelmä perustuu transcriptome sekvensointi, joka on noin rajoituksia, kun käytetään MSI luonnehdinta. Esimerkiksi se jää muuttuneessa mikrosatelliitteihin sijaitsee säätelysekvenssejä, jotka voivat myös tärkeä rooli syövän synnyssä. Kuten Indel havaitseminen edellyttää riittävää luku- kattavuus, se voi olla vaikea havaita mikrosatelliittimerkkien indeleitä in selostukset alhainen runsautta. Huolimatta edellä haittoja, tarkastus ilmaisi selostukset tarjoaa edelleen merkittävää tietoa MMRD. Koska RNA-seq kokeet laajalti suoritettu ja hinta sekvensointia syöpänäytteissä määrä vähenee nopeasti, tulevaisuudessa RNA-seq perustuva diagnoosi menetelmä tulee kustannustehokasta kliinisiä sovelluksia. Lisäksi yhden RNA-Seq määritys pystyy antamaan tarkkoja MSI diagnoosin sekä rikas tietoa monet muutkin kasvain, kuten funktionaalinen mutaatiot, geeniekspressioprofiilien, aktiivinen polkuja ja geenifuusioissa jne, joten erikoistunut PCR-määrityksissä MSI tarpeeton .

Yhteenvetona menetelmämme on ensimmäinen mahdollistaa genominlaajuisten luonnehdinta MMRD tilaansa ihmisen solussa integroimalla suurikapasiteettisten sekvensointi tietoja. Yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen olemme havainneet merkittävää kasvua lyhyitä deleetioiden MSI soluissa verrattuna MSS niistä. Joka perustuu tähän havaintoon, osoitimme, että PI /PD-suhde (joka myös määritellään kuten MSI-kohdat), voidaan käyttää määrittämään MSI tilan sekä syöpäsolulinjoissa ja Primal kasvain näytteitä potilaista, ja on useita etuja perinteisiin määrityksissä. Siksi meidän menetelmä on potentiaalia palvella uutena diagnoosin välineenä perimän epävakaisuuden eri syöpänäytteissä.