Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Koska maksan syövän kantasoluja (HCSCs) uskotaan olevan peräisin muuntaminen maksan normaalit kantasolujen (HNSCs), tunnistaminen erot, jotka erottavat HCSCs maasta HNSCs on tärkeää.

Methods

HCC kautta luotiin vuonna F344 rotilla DEN induktion. Käyttäen FACS-analyysiä puolella populaation soluja HCC (SP-HCCs) eristettiin epiteelin kaltaisia ​​soluja HCC kudosten ja puoli populaation soluja normaalista maksasta (SP-NLCs) eristettiin syngeenistä normaalin maksan soluja. Ilmaisu kantasolujen merkkiaineiden havaittiin sekä vasta eristetyssä ja monistettiin -alapopulaatioiksi. Induktion jälkeen HGF, eriyttäminen kustakin alaryhmästä analysoitiin varhaisten ja myöhään maksan markkereita. In vivo, biologiset ominaisuudet SP-HCCs ja SP-NLCs analysoitiin korjaamalla loukkaantunut maksa tai muodostavat kasvaimia nude-hiirissä. Lisäksi ilmaus miRNA tutkittiin molemmissa populaatioissa mukaan miRNA array ja QRT-PCR.

Tulokset

SP-NLCs ja SP-HCCs olivat 4,30 ± 0,011% ja 2,100 ± 0,010% koko väestöstä, vastaavasti. Sekä SP-NLCs ja SP-HCCs näkyy suuremman ilmentymisen kantasolujen merkkiaineiden (CD133 ja EpCAM) kuin NSP-NLCs ja NSP-HCCs, vastaavasti (

P

0,01), sekä sen jälkeen kun tuore eristämisen ja vahvistusta. Kun HGF induktio, SP-NLCs syntyy monia ALB positiivisia soluja ja muutamat CK-7 positiivisten solujen, mutta NSP-NLCs voisi tuottaa vain ALB positiivisia soluja. Sen sijaan, SP-HCCs johti vain AFP-positiivisten solujen. Niin vähän kuin 5 x 10

5 SP-NLCs kykenivät korjaamisesta maksavaurion, mutta sama määrä NSP-NLCs voinut korjata maksassa. Lisäksi vain 1 x 10

4 SP-HCCs oli välttämätöntä aloittaa kasvain, kun taas NSP-HCCs ei muodosta kasvain. Verrattuna SP-NLCs, 68 säädelty ja 10 alassäädetty miRNA olivat läsnä SP-HCCs (

P

0,01).

Johtopäätös

Perustuen ratkaiseva roolit joitakin miRNA synnyssä HCSCs, miRNA voi edistää erilaisia ​​ominaisuuksia, jotka erottavat SP-HCCs SP-NLCs.

Citation: Liu Wh, Tao Ks, Sinä N, Liu Zc, Zhang ht, Dou Kf (2011) erot Ominaisuudet ja Mirna Expression Profiles välillä Side väestöä maksasyöpäsolut ja Normaali maksasoluissa. PLoS ONE 6 (8): e23311. doi: 10,1371 /journal.pone.0023311

Editor: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 syyskuu 2010; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2011; Julkaistu: 03 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30772102) ja Nature Science Foundation Shaanxin maakunnassa (nro 2007K09-05 (7)). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että syövät sisältävät pienessä määrässä omia kantasoluja kaltaisia ​​soluja, nimeltään ”syöpä kantasolut” (CSCS) [1], [2], [3], jotka ovat enimmäkseen vaikuttaa sekä tuumorisuppressoreilla ja syöpä induktorien [4], [5], [6]. HCC myös maksan CSCS (HCSCs), joilla on suurimmat mahdollisuudet lisääntyä ja tunkeutua ympäröivää kudosta [7]. Viimeaikaiset julkaisut ovat osoittaneet, että HCSCs voivat olla peräisin maksan normaalit kantasolut (HNSCs) [8]. Jopa alkutapahtuman joka muuntaa HNSCs on HCSCs ehdotetaan olevan eräänlaista vapauttamiseen HNSCs itseuudistumisen [9]. Täten vertaamalla ominaisuuksia HNSCs ja HCSCs on tärkeää. Normaali maksa on runsaasti HNSCs [10], ja ehdotus, että nämä HNSCs voi toimia optimaalisen koneen tutkimalla ominaisuuksia HCSCs on kohtuullinen. Kuitenkin molekyylimarkkerit jotka määrittelevät sekä HCSCs ja HNSCs pysyvät kiistelty; Näin ollen eristäminen puolella väestöstä (SP-soluja) on käytetty laajasti rikastuttaa molempia kantasolujen [11]. SP-soluissa on osoitettu olevan epäkypsiä ja erilaistumaton soluja ja ilmaisemaan korkeita tiettyjä kantasolujen merkkiaineita [12]. Näin ollen eristäminen SP-solujen on vaihtoehtoinen kantasolujen, joka on erityisen hyödyllinen tilanteissa, joissa kantasolujen merkkiaineita ei tunneta [12]. Hiirillä ja rotilla, SP fenotyyppi näyttää olevan yhteinen piirre kantasoluja, sisältää normaalit ja syövän kantasoluja [13], [14], [15]. Maksassa, nämä SP-solujen on osoitettu toimivan keskeinen rooli maksan regeneraatiota ja maksasyövän [16]. Siksi SP soluja voidaan pitää tarkoituksenmukaisina vaihtoehtoja tutkia HNSCs ja HCSCs.

miRNA ovat nousemassa tärkeitä säätelijöitä posttranskriptionaalisen geenisäätelyn. Tärkeys miRNA alleviivaa se, että ne ovat usein vapautettu aikana syövän synnyn [17], [18], [19], [20]. Jotkut miRNA voivat edistää kasvaimen kasvua yhteisiä mekanismeja, jotka edistävät miRNA-säänneltyjen solusyklikontrollin [21]. Lisäksi miRNA on osoitettu olevan olennainen osa kantasolujen sääntelyn, sisältää normaalit kantasolut (NSCs) ja CSCS [22]. Häiriön keskeisten miRNA-mRNA verkkojen NSCs on ehdotettu olevan tuntomerkki CSCS [23]. Itse asiassa, yksi onkogeenin (miRNA-145) on osoitettu uudelleen ohjelmoida alkusolut näyttämään CSCS fenotyyppi [24]. Siten kanssa yhteisten ja ainutlaatuisia ekspressiomalleja miRNA välillä HCSCs ja HNSCs on välttämätöntä.

Tässä tutkimuksessa käytimme SP analyysin kahdelle eri populaatioiden ensisijainen viljeltyjen epiteelisolujen. Yhdessä solutyypissä eristettiin rotan HCC kudoksista aiheuttama diethylinitrosamine (DEN) ja toisen solutyypin eristettiin syngeenisistä rotan maksasta kudoksiin. Side väestöä normaali maksan soluista (SP-NLCs) ja HCCs (SP-HCCs) ilmentyy voimakkaasti kantasolujen merkkiaineita.

In vitro

sekä SP-soluissa oli korkea kapasiteetin lisääntymään ja voi erilaistua kypsiksi soluihin indusoitaessa hepatosyyttikasvutekijän (HGF).

In vivo

, SP-NLCs voi suuresti tukea korjaamisesta loukkaantunut rotan maksasta. Sen sijaan, SP-HCCs voisi aloittaa kasvaimia sekä ihonalainen ja maksan kudoksissa kuin lihavien diabeettisten /sekamuotoinen immuunipuutos (NOD /SCID) hiiriä. Olettaen, että nämä erot liittyivät hyvin erilaisia ​​ekspressiomalleja miRNA näiden kahden solupopulaatioiden selvitimme miRNA profiilit SP-NLCs ja SP-HCCs. Koska HCSCs ehdotetaan HCC aloittamista soluja, tunnistaa eroja SP-HCCs ja SP-NLCs, kuten vapautettu miRNA, voi suuresti tukea ymmärtämään synnyssä HCSCs ja kasvaimen kehittymisen HCC.

Materiaalit ja menetelmät

1. Näytteen keräys

Kolmekymmentä mies Fisher 344 rottia (National jyrsijä Laboratory Animal Resource, Shanghai, Kiina) jaettiin sattumanvaraisesti ohjaus ja tutkimus ryhmiä. Rottia tutkimuksessa ryhmässä käsiteltiin 0,05% DEN (Sigma Co., USA) niiden juomavedessä 6 viikkoa ja sitten muuttui normaaliksi juomaveden [25], kun taas rotat kontrolliryhmässä annettiin normaalia ruokavaliota. Kolme rottaa kustakin ryhmästä lopetettiin anestesiassa 2, 6, 10, 14 ja 18 viikon kuluttua DEN induktion. Molemmat HCC kyhmyt kokeesta ryhmän ja normaalit maksa Kontrolliryhmän kerättiin. Annoksia näiden kudosten fiksoitiin 10% fosfaattipuskuroidussa neutraali formaliiniin ja rutiininomaisesti käsitelty ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Santa Cruz, CA) valittiin. Lyhyesti, viljelyalustan poistettu, solujen viljelmän dia huuhdottiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan ja upotettiin sitten PBS: ssa 10 min, mitä seurasi altistus 0,01% Triton X-100 huoneenlämpötilassa 10 min. Estämiseksi epäspesifisiä immuunireaktioita, soluja käsiteltiin 6% vuohen seerumia (Santa Cruz, CA) huoneenlämpötilassa 30 min. Soluja viljeltiin kukin dia alistettiin primaaristen vasta-aineiden 4 ° C: ssa yön yli ja pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä. Fluoresoiva FITC-konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (laimennus 1:100; Santa Cruz, CA) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin 2- (4-amidinofenyyli) -6-indolecarbamidine dihydrokloridi (DAPI) (laimennus 1:100, Sigma) 15 minuutin ajan. Fluoresenssi havaittiin asianmukaisen suodattimen avulla fluoresenssimikroskoopilla (FV1000MPE, Olympus Co., Tokio, Japani).

8. Detection maksan merkkiaineiden western-blottauksella

Kun induktion HGF, western-blottaus suoritettiin kvantitatiivisesti spesifisten maksan merkkiaineiden indusoituneen soluissa. ALB ja CK-7 tarkasteltiin SP-NLCs, NSP-NLCs ja SSP-NLCs; AFP ja CK-19 analysoitiin SP-HCCs, NSP-HCCs ja SSP-HCCs. Solut hajotettiin koko solun uuttopuskuria (RIPA-puskuri), joka sisältää proteaasiestäjäseostabletit tabletti (Complete-Mini, Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Homogenaatteja sentrifugoitiin 3000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit kerättiin. Proteiinit erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin Immobilon-P PVDF (polyvinylideenifluoridi) (Millipore, Bedford, MA, USA). Blotit kyllästettyä estopuskurilla (5% rasvaton maito TBS-T), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kaniinin anti-ihmisen /rotta /hiiri monoklonaalisia vasta-aineita (1:600; Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) vasta-aine (1:600; Sigma, Saint Louis, MO). Sen jälkeen, kun on pesty TBS-T, membraaneja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa HRP-vuohen anti-kani IgG: tä (1:2000; Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA). Detection of proteiinien suoritettiin käyttäen ECL-järjestelmää (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Harmaasävy- arvot kunkin vyöhykkeen blotit mitataan BandScan4.3.

9. Maksavaurion mallia ja solujensiirto

SP-NLCs ja NSP-NLCs oli itsenäisesti pestiin PBS pimeässä ja uudelleensuspendoitiin 2 ml Värjäysliuos merkitä solukalvon kanssa punaisen fluoresenssin 37 ° C: ssa, mukaan protokolla mukana toimitettu PKH26 punaisia ​​fluoresoivia solun linkkerin kit (Sigma Corp., USA). Seerumia sisältävässä väliaineessa lisättiin värjäysliuos lopettaa värjäys 5 min myöhemmin. Värjätään solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja suspendoitiin 0,5 ml: aan PBS siirtoa varten. Aiheuttavan maksavaurio, 20 normaali F344 rotille (10 SP-NLCs elinsiirrot, 10 NSP-NLCs injektio) annettiin CCI

4 intraperitoneaalisesti annoksena 1,2 ml /kg ja sai kaksi kolmasosaa osittaista hepatektomiaa (2/3 PH) kolme päivää myöhemmin. Välittömästi sen jälkeen PH, valmistetut solut (5 x 10

5 solua kohti rotta) on erikseen ruiskutetaan nämä rotat kautta porttilaskimon.

Kunkin maksa, me satunnaisesti leikkaa neljä jääleikkeiden. Arvioida asuttaminen vaikutuksia SP-NLCs ja NSP-NLCs, palautettu maksa leikkeitä tarkasteltiin käännettyä mikroskooppia. Kun punaiset alueet havaittiin kohdissa, tulos tunnistettiin positiivinen. Kuhunkin näkökenttä, positiiviset alueet laskettiin, ja prosenttiosuus positiivisen alueen suhteessa koko alueelle laskettiin. Prosentteina punaisen alueen 5% määriteltiin negatiivinen (-), 5-25% positiivisena (+), 25-50% kohtalaisen positiivinen (++) ja 50% niin vahvasti positiivinen (++ +).

10. NOD /SCID -ksenografti elinsiirtoa kokeita

Eri numerot (1 x 10

7, 1 x 10

6, 1 x 10

5 ja 1 x 10

4) ja SP- HCCs tai NSP-HCCs ruiskutettiin NOD /SCID-hiirissä ihonalaisella injektiolla. Kukin ryhmä sisälsi 4 hiirtä; Näin ollen, 32 hiiriä käytettiin ksenotransplantaatio. Jokainen mouce tehtiin 4 injektioita, symmetrisesti 2 injektiota vasen ja 2 injektiota sisään takaisin. Kasvaimen kasvua seurattiin joka 2 päivää sen jälkeen, kun toisella viikolla ymppäyksen. Kaikki hiiret uhrattiin päivänä 60 kaikki kasvaimen kudokset kerättiin, kiinnitettiin 4% formaldehydiä, ja upotettiin parafiiniin H luokka 2 (+), halkaisija kasvaimen 0,2 cm; arvosana 3 (++), 0,2-0,5 cm; 4. asteen (+++), 0,5 cm.

11. Ilmentyminen miRNA SP-soluissa

Yhteensä-RNA: t saatiin sekä SP-NLCs ja SP-HCCs jonka Totally RNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX). Laatu ja määrä koko RNA: t tarkistettiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla ja ultravioletti kvantitointiin. Ilmaisu profiilit miRNA sitten havaita miRCURY LNA ™ (lukittu nukleiinihappo) microRNA Arrays Kit (Exiqon Co, Tanska), joka kattaa kaikki ihmisen, hiiren ja rotan miRNA antisense-sekvenssit. Lisäksi pakkaus on myös sisällytetty 144 miRPlus ™ koettimia, jotka oli toimittanut Exiqon Corporation uusia miRNA havaitsemiseen. Yksi mikrogramma RNA: SP-HCCs, SP-NLCs ja viite poolit yhteistyössä hybridisoitiin päälle Exiqon miRNA Array 16 h 56 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen Cy3-leimatun -dendrimeerit (Genisphere Inc, Hatfield, PA) [29], mikrosiruissa pestiin peräkkäin pestä puskurit A, B ja C. fluoresoivat signaalit hybridisoitunut array oli vangiksi GenePix 4000B skanneri ja kvantifioidaan GenePix Pro4.0 (Axon Instruments, Burlingame, CA). Tietojen käsittely helpotettiin normalisointi Suite v1.63 (Ontario Cancer Institute, Toronto, Kanada) [30]. Testi on viittaus suhde kutakin miRNA oli keskimäärin kolmesta rinnakkaisesta täplät ja välillä toisinto kokeiluja. Suhde on suurempi tai pienempi kuin kaksinkertaisesti katsottiin säädelty tai alassäädetty, vastaavasti.

Kaksi erittäin säädelty miRNA, kolme hieman säädelty miRNA, yksi suuresti alassäädetty miRNA ja yksi kohtalaisen alassäädetty miRNA valittiin edustavia miRNA vahvistaa kansallinen kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (QRT-PCR). Yhteensä RNA: t käänteiskopioitu by MultiScribe (Applied Biosystems) reaktiossa sisältävät seokset miR-specific varsi-silmukka käänteistranskriptiotuotteiden (RT) alukkeet (taulukko 1). PCR-alukkeet on lueteltu taulukossa 1, ja sykli parametrit PCR-reaktiolle olivat 95 ° C: ssa 15 min, mitä seurasi 40 sykliä denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja pariutumis /pidennys-vaihe 60 ° C: ssa 60 sek. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Suhteellinen määrä kunkin miRNA U6-RNA kuvaa yhtälö ACk

T = (C

TmiRNA-C

Tu6) [31]. Taitteen muutos miRNA SP-HCCs verrattuna SP-NLCs esitetään kaavalla 2

-ΔΔCT, jossa ΔΔC

T = (ACk

T SP-HCCs-ACk

T SP- NLCs).

12. Tavoitteet vapautetuilla miRNA

12.1. Ennustaminen potentiaalisia vapautuneilla miRNA.

potentiaalisia kohteita vapailla miRNA todettu edellä mainituilla menetelmillä ennustettiin kahdella julkisesti saatavilla algoritmit, kuten MiRBase tavoitteet versio 5 (saatavilla osoitteessa: http: //microrna.sanger .ac.uk /) ja Targetscan versio 4.2 (https://www.targetscan.org/).

12,2 tunnistaminen tavoitteensa puolikvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (sQRT-PCR).

tiivisti todistettua tavoitteet seitsemän validoitu vapautettu miRNA. Näistä tavoitteista, MIR-200a * kohdegeenien ZEB1 ja ZEB2 [32], [33] analysoitiin sekä SP-HCCs ja SP-NLCs by sqrt-PCR. Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol-reagenssia (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), ja käänteistranskriptio cDNA: ksi, jonka SuperScript II Reverse Transcriptase mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Carlsbad, CA). Yhtä suuret määrät cDNA näistä kaksi näytettä monistettiin seuraavia spesifisiä alukkeita: ZEB1 (Sense 5’AAGAAAGTGTTACAGATGCAGCTG-3 ’, antisense-5’CCCTGGTAACACTGTCTGGTC-3′); ja ZEB2 (Sense 5’-ATACCAGCGGAAACAAGGATTTCA-3 ’, Antisense 5′-CAGGAATCGGAGTCTGTCAAGTCA-3’). Määrä PCR-syklien oli 35. Kukin sykli koostui denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 30 s, alukkeen pariutumisvaiheen 65 ° C: ssa 30 s ja pidennys 72 ° C ° C: ssa 45 s. PCR-tuotteet analysoitiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla värjätty etidiumbromidilla.

13. Tilastolliset analyysit

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe vähintään kolmesta erillisestä kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. Erot ryhmien välillä analysoitiin SAM ohjelmistoversio 3.0 käyttäen kaksipuolista Studentin

t

-testi, kun vain kaksi ryhmää olivat läsnä, ja nollahypoteesi hylättiin tasolla 0,05.

Tulokset

1. Kudosten valmistamiseksi ja soluviljelmä

NL kudosten kontrolliryhmästä olivat kirkkaan punainen ja näytetään sileät pinnat (kuvio 1A-i). Kun nämä maksat leikattiin ohuiksi osiin, täysin normaalia maksakudosta selvisi (Kuvio 1A-ii). Kun H Ensisijainen viljellyt HCC solujen (B-iv) 4 päivää, (B-v) 15 päivää ja (B-vi) 30 päivää. Alempi paneeli: eristämistä eri osapopulaatioiden. (C-i) Ilman verapamiilin: SP-soluja esitetty prosentteina NLCs; (C-ii) Verapamiililla: profiilia SP solujen väheni huomattavasti. (C-III) Ilman verapamiilin: SP solut näytetään pieni fluoresenssi in HCCs; (C-IV) verapamiilin: fluoresenssin SP-solujen fraktio siirtynyt korkeammalle tasolle. (C-v) Prosenttiosuudet SP solujen eri ryhmissä näkyvät pylväskaavion. Alkuperäinen suurennus, 200 × (A, B-iii), 100 x (A, B-iv, v, vi).

Pieniä kasvaimia ensin löydetty rotilla tapettiin 8 viikkoa kuluttua DEN induktion. Kun toinen 10 viikkoa, kaksi kolmasosaa maksa sisälsi tuumorikudoksista kanssa karkeita pintoja (kuvio 1 B-i). Olemme myös löytäneet lukuisia metastaattinen kyhmyjä keuhkoissa (kuvio 1 B-ii). Kolme eri patologit arvioinut H 0,05) (kuvio 1 C-v).

3. Self-uusimisen SP solujen

Kaksi vakio-ominaisuuksia ovat ominaisuudet kantasoluja: itseuudistumisen ja multipotenttisuus. Sillä itseuudistumisen, SP-HCCs lisääntyneet nopeimmin 7 päivän kulttuuri, jota seurasi SP-NLCs, SSP-HCCs, SSP-NLCs ja NSP-HCCs (joka lisääntynyt vastaavasti), ja lopuksi NSP-NLCs (kuvio 2A ). Yleisesti ottaen SP solut lisääntyivät huomattavasti nopeammin kuin sekä NSP-solut ja SSP solut (

P

0,01), ja HCCs lisääntyneet hieman nopeammin kuin NLCs. Koska alkuperäinen määrä kunkin solupopulaatio oli sama, täysin eri solujen määrä oli läsnä kunkin ryhmän lopussa viljelmän aikana (kuvio 2B). SP-soluissa (kuvio 2B-i, iv) havaittiin olevan homogeeninen ja paljon pienempiä kuin sekä NSP-soluja (kuvio 2B-ii, ​​v) ja SSP-soluja (kuvio 2B-III, VI) (

P

0,01). Ei kuitenkaan ole merkittäviä morfologisia eroja ei havaittu SP-NLCs (kuvio 2B-i) ja SP-HCCs (kuvio 2B-iv). Siten nämä kaksi väestön ei saa syrjiä toisistaan ​​alle käännettyä mikroskooppia.

(A) Solu kasvukäyrä 7 päivän ajan kulttuuria. (B) Kun vahvistus, erilliseen solun tiheydet havaittiin eri alapopulaatioiden. (C) ilmentymistä kantasolujen merkkiaineiden (CD133 ja EpCAM) oli erilainen jokaisessa vasta eristetyssä ja monistettiin alaryhmästä FACS. (D) täsmällinen tietoja heijastuu pylväskaavio. CD133 /EpCAM-Fresh osoittaa ilmaus CD133 /EpCAM vasta eristetyssä alapopulaatioiden, ja CD133 /EpCAM-Amplified tarkoittaa ilmaus CD133 /EpCAM amplifioidussa osapopulaatioiden. Alkuperäinen suurennus, 100 x (B).

Vuoden alusta kulttuurin, sekä SP-NLCs ja SP-HCCs ilmaisivat enemmän kantasolujen markkereita kuin NSP-NLCs ja NSP-HCCs, vastaavasti (

P

0,01) (kuvio 2C). Seuraavat prosenttiosuudet positiivisten solujen kustakin alaryhmästä havaittiin: CD133 prosenttiluvut SP-NLCs, NSP-NLCs, SSP-NLCs, SP-HCCs, NSP-HCCs ja SSP-HCCs olivat 81,2 ± 7,08, 11,4 ± 1,31, 30,3 ± 3,21 86,7 ± 8,32, 12,7 ± 1,39 ja 31,6 ± 3,42, tässä järjestyksessä; EpCAM prosenttiosuudet näissä alapopulaatioiden olivat 80,1 ± 8,10, 10,6 ± 1,21, 31,2 ± 3,18, 86,5 ± 3,28, 12,4 ± 1,31 ja 32,6 ± 3,67, tässä järjestyksessä. Lopussa kulttuurin kauden, SP-NLCs ja SP-HCCs riitti enemmän kantasolujen markkereita kuin NSP-NLCs ja NSP-HCCs, vastaavasti (

P

0,01) (kuvio 2D). Lisäksi ilmaisu kantasolujen merkkiaineita väheni huomattavasti hitaammin SP-soluissa kuin sekä SSP-soluissa ja NSP-solut (

P

0,01). Seuraavat prosenttiosuudet havaittiin: CD133 prosenttiluvut SP-NLCs, NSP-NLCs, SSP-NLCs, SP-HCCs, NSP-HCCs ja SSP-HCCs olivat 78,6 ± 6,98, 3,4 ± 0,33, 20,2 ± 2,03, 80,5 ± 7,86, 3,6 ± 0,30 ja 20,7 ± 2,38, tässä järjestyksessä; EpCAM prosenttiosuudet näissä alapopulaatioiden olivat 78,1 ± 7,53, 3,5 ± 0,28, 21,5 ± 2,17, 80,3 ± 8,12, 2,3 ± 0,27 ja 20,2 ± 2,28, tässä järjestyksessä. Aikana leviämisen aikana, sekä SP-NLCs ja SP-HCCs säilyy korkea ilmentymisen kantasolujen merkkiaineita; Sitä vastoin sekä NSP-NLCs ja NSP-HCCs vähitellen menettänyt ilmaus kantasolujen merkkiaineita. Nämä tiedot viittaavat siihen, että SP solut ovat samanlaisia ​​kantasoluja niiden kyky uusiutua.

4. Erilaistuminen SP solujen aiheuttama HGF in vitro

Under induktio olosuhteissa, kustakin alaryhmästä syntyy erillisiä outgrowths. Koska NLCs pitäisi eriyttää maksasoluiksi tai sapen epiteelisolujen valitsimme yhden kypsä maksan markkeri (ALB) ja yksi sapen merkki (CK-7) tunnistamiseksi kypsiä soluja. Useimmat SP-NLCs laajentunut arkkia tiiviisti pakattuja soluja, jotka näytetään tyypillinen maksasolujen morfologia ja tunnistettiin ALB positiivisia soluja (66,9 ± 5,34%). Osa SP-NLCs erilaistuneet CK-7 positiivisten solujen (24,6 ± 2,41%) (kuvio 3A). Vaikka sekä NSP-NLCs ja SSP-NLCs voi myös luoda ALB-positiivisten solujen, vasta useita CK-7 positiivisten solujen voisi löytyä indusoi SSP-NLCs, eikä CK-7 positiivisten solujen havaittiin indusoidun NSP-NLCs (kuvio 3A) . Nämä tiedot osoittavat, että vain SP-NLCs oli vahva voivat erilaistua eri kypsiä soluja. Western blotting osoitti, että vaikka solut tuottamat NSP-NLCs ilmaistuna korkeampi ALB kuin solut SP-NLCs ja SSP-NLCs, tyttäret SP-NLCs ilmaisi paljon korkeampi CK-7 kuin tyttäret SSP-NLCs ja muita polysakkarideja kuin tärkkelystä NLCs (kuvio 3C). Erityisesti CK-7 näkyy lähes ilmentymistä tytärten NSP-NLCs (kuvio 3C). Nämä tiedot olivat yhtäpitäviä IF havaintojen.

(A) kautta IF, ALB positiivisia soluja (vihreä, ytimet sinisellä) ja CK-7 positiivisten solujen (vihreä, ytimet sinisellä) on differentiaalisesti tuotettu SP- NLCs, NSP-NLCs ja SSP-NLCs. Prosenttiosuudet ALB tai CK-7 positiivisten solujen esitetään pylväskaavion. (B) Sen sijaan, AFP-positiivisten solujen löytyisi jälkeen SP-HCCs, NSP-HCCs ja SSP-HCCs induktio. Tiedot on esitetty yhteenvetona pylväskaavion. (C) Western-blottauksella, taita erot spesifisten suhteessa GAPDH analysoitiin aiheuttamaa SP-NLCs, NSP-NLCs ja SSP-NLCs.