Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yuanhuacine (YC), joka on daphnane diterpenoidinen päässä kukat

Daphne genkwa

, osoitti potentiaalisen kasvun estävä vaikutus ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. YC myös tukahdutti hyökkäyksen ja kulkeutumista keuhkojen syöpäsoluja. Kuitenkin tarkka molekulaarisia mekanismeja on vielä selvitetty. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme raportoivat, että YC merkittävästi aktivoitu AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) signalointireitin ja tukahdutetaan mTORC2-välitteisen alavirran signalointireitin in H1993 ihmisen NSCLC-soluja. AMPK tärkeä rooli energia-aineenvaihduntaan ja syöpäbiologian. Siksi aktivaattorit AMPK signalointipolkujen voi olla sovellettavissa syövän hoidossa. YC tehostettu ilmentyminen p-AMPKα. Yhteistyössä kohtelu YC ja yhdistettä C (an AMPK estäjä) tai metformiini (AMPK aktivaattori) vahvisti myös, että YC lisää p-AMPKα. YC tukahdutti myös aktivointi nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) ilmentymistä, joka on alavirrassa oleva kohde on AMPK. Lisäksi Tutkimus osoitti, että YC moduloi mTORC2 liittyvän alavirran signalointireittien kanssa vähentynyt ilmauksia p-Akt, p-proteiinikinaasi C-alfa (PKC-a), p-ras-liittyvät C3 botuliinitoksiinia alustan 1 (Rac1) ja rihmamaiset aktiini (F- aktiini), jotka tiedetään aktivoivan solujen kasvua ja järjestää aktiinisytoskeletonin. Lisäksi YC esti kasvaimen kasvua H1993 solun istutettu ksenografti nude-hiirimallissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, YC voisi olla potentiaalinen ehdokas syövän kemoterapia-aineiden peräisin luonnollisista tuotteista säätelemällä AMPK /mTORC2 signalointireitin ja aktiinisytoskeletonin organisaatio.

Citation: Kang JI, Hong JY, Lee HJ, Bae SY, Jung C, Park HJ et ai. (2015) antituumorivaikutuksen of Yuanhuacine säätelemällä AMPK /mTOR-signalointireitin ja Aktiinisytoskeletonin organisaation ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 10 (12): e0144368. doi: 10,1371 /journal.pone.0144368

Editor: Cong Cao, Suzhoun yliopisto, Kiina

vastaanotettu: 10 helmikuu 2015; Hyväksytty: 17 marraskuu 2015; Julkaistu 11 joulukuuta 2015

Copyright: © 2015 Kang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF), rahoittama opetus-, Science and Technology (2013R1A1A2012389 ja nro 20100024361) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä sairauksista maailmassa ja suurin syy syöpään liittyvät kuolemat [1]. On olemassa kaksi keskeistä tautimuodoille, pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jossa NSCLC on noin 85% kaikista keuhkosyöpää. Yhdessä kirurgian ja sädehoidon, kemoterapian on yksi yleisimmistä hoitomuotoja keuhkosyöpä hoidossa. Kuitenkin kemoterapia ei ole vielä riittävän tehokas potilailla, joilla on edennyt NSCLC mediaani eloonjäämisprosentti noin vuoden [2, 3]. Siksi kehittää uusia tehokkaita syöpälääkkeiden tarvitaan edelleen sairauden hoidossa.

Daphne genkwa

(näsiäkasvit) on hyvin tunnettu perinteinen lääkekasvi jaetaan lähinnä Koreassa ja Kiinassa, ja sen kukka on raportoitu olevan keskenmenon, syöpälääkkeen, anti-visena, diureetti, ja yskänlääke toimintaa [4]. Useat yhdisteet kuten daphnane-tyyppinen diterpeenit on eristetty

D

.

genkwa

[5]. Daphane-tyyppinen diterpenoidit osoitti erilaisia ​​biologisia vaikutuksia mukaan lukien anti-syöpä, ohimenevä reseptorin potentiaali kationi kanava subfamily V jäsen 1 (TRPV1) aktivoiva, anti-hedelmällisyys, torjunta, neurotrofinen, kolesterolia alentava, anti-hyperglykeeminen, ärsyttävä, kasvain edistäviä, ja anti-ihmisen immuunikatovirus (HIV) toiminta [6]. Yuanhuacine (YC) on tärkeä osa daphnane-tyyppinen diterpenoidit eristettiin kukannuput

Daphne genkwa

. YC osoitti syövän vastaista aktiivisuutta erilaisissa syöpäsolulinjoissa

in vitro

[7]. Meillä on myös raportoitu, että YC osoittaa suhteellisen selektiivinen kasvua estävä vaikutus ihmisen A549-keuhko syöpäsolujen verrattuna MRC-5 normaalin keuhkokudoksen epiteelisolujen [8]. Kuitenkin taustalla molekyylimekanismi YC ihmisen keuhkosyövän soluja ei ole vielä selvitetty.

AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) on kaikkialla läsnä oleva seriini /treoniini proteiinikinaasi muodostuu katalyyttisen α-alayksikköä ja kaksi säädin alayksiköt (β ja γ) [9], ja on tunnettua säätää solun energia-aineenvaihdunnan [10, 11]. Aktivointi AMPK aiheuttaa solujen stressiä kuten oksidatiivisen stressin, hypoksia, ja hypoglykemia, ja se johtaa lisääntyneeseen suhde solun adenosiinimonofosfaatin (AMP) ja adenosiinitrifosfaatin (ATP). AMPK valvoo myös solujen kasvua, lisääntymistä ja autophagy modulaation kautta nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) aktiivisuus, joka on johdonmukaisesti purettu syöpäsoluissa [12]. On olemassa kahdenlaisia ​​mTOR, mTORC1 ja mTORC2, jotka ovat rakenteellisesti ja toiminnallisesti erilaisia ​​multi-proteiini kompleksit [13]. Yleensä mTORC1 ohjaa solujen kasvua vastauksena ravinteiden saatavuuden ja kasvua säätävät. Sen sijaan mTORC2 on keskeinen säätelijä aktiinisytoskeletonin joka korreloi syövän etäpesäkkeitä, ja ohjaa fosforylaatiota Akt at Ser-473 vuorovaikutuksen kautta rapamysiini erottelua kumppani mTOR (rictor) ja mTOR [14, 15].

Tässä tutkimuksessa antituumorivaikutuksen YC ja sen taustalla molekyylitason toimintamekanismeja tutkittiin sekä ihmisen H1993 keuhkosyöpäsoluissa

in vitro

kulttuurin ja H1993-istutettu ksenografti nude mouse malli

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Dimetyylisulfoksidi (DMSO), bikinkoniini- happo (BCA), (TCA), sulforodamiini B (SRB) ja katalaasia ostettiin Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa, naudan sikiön seerumia (FBS), trypsiini-EDTA-liuoksella (1 x ), antibiootti-antimykoottista liuosta (100 x) ja fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) (1X) ostettiin HyClone Laboratories, Inc. (South Logan, UT, USA). Anti-p-AMPKα, anti-AMPKα, anti-p-ACC, anti-ACC, anti-p-mTOR, anti-mTOR, anti-p-4EBP1, anti-4EBP1, anti-p-EIF4E, anti-EIF4E, anti-p-P70S6K1, anti-P70S6K1, anti-p-RPS6, anti-RPS6, anti-rictor, anti-p-Akt, anti-Akt, ja anti-E-kadheriinin ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). Anti-PKC-α, anti-p-Rac1, anti-Rac1, anti-PCNA, anti-β-aktiini, ja kaikki sekundaariset vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology. (Santa Cruz, CA, USA). Anti-p-rictor hankittiin Millipore (Temecula, CA, USA). Anti-p-PKC-α, anti-F-aktiini, ja anti-Ki-67 hankittiin Abcam (Cambridge, MA, USA). Gefitinibi ostettiin Selleckchem (Houston, TX, USA) ja rapamysiini hankittiin Tocris Bioscience (Bristol, UK).

Yhdiste

Yuanhuacine (YC, kuvio 1A) eristettiin ja tunnistettiin kukat

Daphne genkwa

kuten aiemmin on kuvattu [8]. Yhdiste liuotettiin 100% dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja laimennettiin väline näytteen valmistelua.

(A) kemiallinen rakenne YC. (B) H1993-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla YC ja gefitinibin 72 tuntia. Solulisääntyminen mitattiin SRB-määritystä. (C) H1993-soluja käsiteltiin eri pitoisuus YC varten ilmoitettu ajat, ja solujen lisääntyminen määritettiin SRB-määrityksellä. (D) Morfologiset muutokset välittyvät hoidossa YC 24 tuntia havaittiin alle faasikontrastimikroskoopissa.

Cell Culture

Ihmisen NSCLC solulinjat (H358, H460, Calu-1, H1299, A549, ja H1993-solut) ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Soluja viljeltiin RPMI1640-täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja-antimykootteja (PSA; 100 yksikköä /ml G-penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, ja 250 ng /ml amfoterisiiniä B) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

proliferaatiomääritystä

vaikutus YC soluproliferaatioon arvioitiin SRB solun-värjäystä menetelmällä. Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille eri pitoisuuksina näytteitä ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. 72 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 10% TCA liuosta 30 minuuttia ja värjättiin solun proteiinien kanssa 0,4% SRB: tä 1% etikkahappoa, liuos 1 h. Värjätyt solut liuotettiin 10 mM Tris-puskurissa (pH 10,0). Vaikutus näytteiden solujen elinkelpoisuus laskettiin prosentteina suhteessa liuotinta hoidettuun kontrolliryhmään. IC

50-arvot laskettiin epälineaarisen regressioanalyysin avulla Taulukko Curve 2D v5.01 ohjelmisto (Systat Software Inc., Richmond, CA, USA).

Western Blot ja Immunosaostusanalyysi

western blot-analyysi, solut altistetaan eri pitoisuuksia näytteet lyysattiin ja proteiinin pitoisuudet määritettiin BCA-menetelmällä. Yhteensä proteiineja (40 ug) kussakin solulysaatissa tehtiin resoluutio eri pitoisuuksina (6-15%) natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja elektro-siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraanit inkuboitiin estopuskurilla (5% naudan seerumin albumiinia (BSA) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja Tween 20: tä (TBST) 1 h huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin edelleen spesifisiä vasta-aineita on laimennettu 2,5% BSA TBST: ssä yli yön 4 ° C: ssa. Kun oli pesty TBST: llä, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääriset vasta-aineet 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja visualisoitiin HRP-kemiluminesenssiosoitusta kit (Lab Frontier, Seoul, Korea) käyttäen LAS-4000 Imager ( Fuji Film Corp., Japani).

immunosaostus elatusaine, solujen supernatantti suodatettiin läpi 0,2 um: n suodattimen, ja proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) oli kuin lisättiin . Immu- viljeltyjen solujen, solut hajotettiin IP lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA: ta, ja 0,5% NP-40), joka sisältää proteaasi-ja fosfataasi-inhibiittorit. Suodatettu elatusaine tai yhtä suuri määrä solulysaateista esipuhdistettiin 30 min 4 ° C: ssa proteiini-G-Sepharose-4FastFlow (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Helmien poistamisen jälkeen (10 min, 12000 rpm, 4 ° C), supernatantti inkuboitiin osoitetun vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa. Immunokompleksin kerättiin helmiä 4 ° C: ssa 2 tuntia. Helmet pestiin neljä kertaa IP-lyysipuskuria, ja sitoutuneet proteiinit eluoitiin 2 x Laemmli-näytepuskuria 95 ° C: ssa 10 min. Kerättyjä proteiini näytteille tehtiin Western blot-analyysi.

Immunosytokemia.

H1993 soluja Saharan viljeltiin kannessa slip päällystetty poly-L-lysiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 12-kuoppaisella viljelymaljalle. Käsitellyt solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä, ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydiä 15 min ajan, minkä jälkeen läpäiseväksi 0,5% Triton X-100 PBS: ssä 5 min. Sitten solut pestiin 0,1% Triton X-100 PBS: ssä (PBS-T) ja inkuboitiin blokkausliuoksessa (3% BSA: ta ja 1% normaalia vuohen seerumia PBS-T) 1 tunnin ajan. Primaaristen vasta-aineiden lisättiin Estoliuos ja soluja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Kun oli pesty PBS-T: kolme kertaa, solut inkuboitiin sopivan sekundäärisen vasta-aineiden estäminen, liuos 45 min huoneen lämpötilassa. Leimatut solut pestiin PBS-T: kuusi kertaa ja ne asennetaan asennus liuosta [100 mg /ml: ssa 1, 4-diatsabisyklo [2.2.2] oktaani (DABCO) 90% glyserolia]. Objektilasit havaitaan vahvan LSM710 laserskannaus -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Saksa).

Cell migraatiokokeessa

vaikutuksen arvioimiseksi YC solun muuttoliikettä, haavan paranemista Määritys suoritettiin aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, H1993-soluja siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille ja inkuboitiin 48 h, kunnes ne saavuttivat 80-90% jokien yhtymäkohdista. Yksisolukerroksena H1993-solujen keinotekoisesti haavoittuneen kanssa mikropipetin kärki, ja irrottaa solut pestiin seerumittomalla RPMI1640 ja käsiteltiin testiyhdisteiden kasvualustaa 24 tuntia. Solut pestiin kahdesti PBS: llä. Kuvia haavat valokuvattiin 0 ja 24 tuntia alle käännettyä mikroskooppia (CKX41, Olympus, Tokio, Japani).

Cell invaasiomääritys

Vaikutus YC solujen invaasio suoritettiin käyttäen H1993-soluissa kuten aiemmin on kuvattu [17]. Solut ympättiin yläosaan kammioihin 24 hyvin Matrigel kuorrutettu polyetyleenitereftalaatti kalvoinserteille 8 uM huokoset (Millipore, Billerica, MA, USA). Levyt päällystettiin 10 ul: tyypin I kammion Matrigel-päällystetty transwell-insertin. Väliaine alakammioissa myös sisälsi 0,1 mg /ml naudan seerumin albumiinia kemoattraktantti. Soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut, jotka olivat tunkeutuneet ulkopinnan kalvon kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja valokuvattiin (CKX41, Olympus, Tokio, Japani).

Analyysi Drug Combination

solut (5 x 10

4 solua /kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisille levyille eri pitoisuus YC ja rapamyacin tai gefitinibi. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin solujen lisääntyminen määritettiin käyttämällä SRB-määritystä. Yhdistelmä vaikutus arvioitiin laskemalla yhdistelmä indeksi (CI) arvot seuraavasti: CI = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, jossa D

1 ja D

2 ovat pitoisuudet yhdistetyn koeyhdisteiden saavuttaa odotettua vaikutusta, ja (D

x)

1 ja (D

x )

2 ovat pitoisuuksia, jotka saavuttaa samanlaisia ​​vaikutuksia, kun testi yhdisteitä käytetään yksin. Tässä tutkimuksessa 50%: n esto otettiin tosiasiallisen. CI verrattiin viitearvojen raportoinut Chou [18].

In vivo -tuumoriksenografti Study

Female nude-hiirissä [5 viikon ikäisiä BALB /c-nu (nu /nu )] ostettiin Central Laboratory Animal, Inc (Korea) ja ylläpidetään patogeenivapaissa olosuhteissa. Kaikki eläinkokeet ja hoito tehtiin tavalla vastaa vaadittua suuntaviivat Animal Care ja käyttö komitean Ewha Womans University. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Animal kokeet Ewha Womans University. H1993-soluja injektoitiin ihonalaisesti pulloihin hiirten (1 x 10

7 solut 200 ui alustaa), ja kasvainten annettiin kasvaa. Kun kasvaimen tilavuus oli noin 90 mm

3, huumeiden hoito aloitettiin. Hiiret satunnaistettiin ajoneuvon hallinnan ja hoitoryhmien viiden eläimen kutakin. YC (0,5 tai 1,0 mg /kg) tai gefitinibin (10 mg /kg) liuotettuna 100 ul: n liuosta (etanoli-Tween 80-H

2O, 1: 1: 98) annettiin suun kautta kerran päivässä 21 päivän ajan. Kontrolliryhmä käsiteltiin yhtä suurella tilavuudella ajoneuvon DMSO: ta. Kasvaimen tilavuus seurattiin 21 päivää jokaisen 4 ~ 6 päivää mittaharpilla, ja tuumorin tilavuus arvioitiin seuraavalla kaavalla: kasvaimen tilavuus (mm

3) = 3,14 x P x L x H /6, jossa L on pituus, W on leveys, ja H on korkeus.

immunohistokemia Tuumorien

Leikatut kasvainten kudokset fiksoitiin 4% paraformaldehydillä (PFA) ja upotettiin parafiiniin. Leikesarjojen upotetun näytteet poistettiin parafiini, vedettömät, ja altistettiin antigeenille haku. Levyjä inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, jotka havaittiin käyttämällä LSAB + System-HRP kit (Dako, Glostrup, Tanska) ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Mosaiikki osat havaittiin ja valokuvattiin käänteisen faasikontrastimikroskoopissa.

Ex vivo biokemiallinen analyysi kasvaimia.

Osa jäädytettyjen tuumorit leikattiin pois nude-hiirissä sulatettiin jäillä ja homogenisoitiin käyttäen homogenisaattoria Complete Lysis Buffer (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Kasvaimen lysaatit alistettiin proteiinin pitoisuuden määrittämiseen määritykset ja alikvootteja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (S.D.). Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin

t-

testi. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

* p

0,05,

** p

0,01.

Tulokset

kasvu estovaikutus YC vuonna viljeltiin H1993-solut

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että YC on suhteellisen selektiivinen kasvua estävä vaikutus ihmisen keuhkosyövän solut verrattuna normaaleihin keuhkojen epiteelisolujen [8]. Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa olemme laajennettu arvioimiseksi anti-proliferatiivista aktiivisuutta YC eri NSCLC solulinjoissa. YC osoitti potentiaalisen kasvun estävä aktiivisuus viljellyissä ihmisen NSCLC-solut (taulukko 1). Erityisesti H1993 solulinjan osoitettiin olevan kaikkein herkimpiä IC

50-arvo 9 nM, 72 tunnin kuluttua inkubaation ja YC näytti olevan tehokkaampi kuin gefitinibi, syöpälääkkeen hoitoon NSCLC potilaiden klinikalla, samoissa koeolosuhteissa (kuvio 1B). Kun käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla YC useita ajankohtana (24, 48 ja 72 h), YC inhiboivat H1993 solujen pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1C). Koska H1993-solulinja oli herkin solun YC, mekanismi toiminta tutkimuksessa anti-proliferatiivista aktiivisuutta YC suoritettiin H1993-soluissa.

morfologiset muutokset YC-käsiteltyjen solujen havaittiin alle faasikontrastimikroskoopissa 24 tunnin kuluttua inkubaation. Solumäärät määrä väheni pitoisuudesta riippuvalla tavalla, ja monikulmion kontrollisolujen muutettiin ahdas ja epäsäännöllinen dendriittiä-solujen muoto (kuvio 1 D).

vaikutukset YC on AMPK signalointireitille

selventämään lisäksi antiproliferatiivisia mekanismi YC, sääntely solun signaalinvälitysreitin liittyvät syöpäsolujen kasvua analysoitiin Western blot. AMPK pidetään keskeisenä molekyyli, joka ohjaa solujen kasvua, lisääntymistä ja autophagy. 24 tunnin kuluttua hoidon YC, proteiinin taso p-AMPK lisääntyi merkitsevästi, ja taso p-asetyyli-CoA karboksylaasi (ACC), alavirran tavoite AMPK, sittemmin vähentynyt pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A ). Koska AMPK aktivointi on hyvin varhainen tapahtuma [19, 20], aktivointi AMPK YC seurattiin myös lyhyessä ajassa. P-AMPK tason mitattiin jopa 8 tuntia käsittelyn jälkeen YC (1 uM). Proteiini taso p-AMPK kasvoi merkittävästi 2 tunnin kuluttua inkuboinnin ajan riippuvalla tavalla viljellyissä YC-käsiteltyjen H1993-soluja (kuvio 2B). Aktivoituminen AMPK YC vahvistettiin edelleen kanssa esikäsittely yhdistettä C (erityinen estäjä AMPK) tai metformiini (AMPK aktivaattori). H1993-soluja esikäsiteltiin yhdisteen C (20 uM) tai metformiinia (10 mM) 1 h ja sitten yhdessä käsiteltiin YC (1 uM) ja vielä 2 tuntia. Yhdiste C tukahdutti ilmaus aktivoitua AMPK (p-AMPK), mutta co-hoidossa YC talteen AMPK aktivointia. Samoin, YC myös merkittävästi parannettu metformiini-aktivaatio AMPK (kuvio 2C). Lisäksi YC tehokkaasti aktivoinut p-AMPK tason erilaisissa NSCLC solulinjoissa (kuvio 2D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että AMPK voi olla kohdeproteiinin anti-proliferatiivista aktiivisuutta YC ihmisen NSCLC-soluja.

(A) H1993-soluja käsiteltiin 24 h: n konsentraatiot YC ja proteiini ilmaisut olivat mitattuna Western blot-analyysi. (B) H1993-soluja käsiteltiin eri lyhyen aikaa pistettä 1 uM YC ja proteiini ilmaisuja mitattiin Western blot-analyysi. (C) H1993-soluja esikäsiteltiin 1 tunnin ajan 20 uM yhdistettä C, joka on tunnettu AMPK inhibiittoria tai 10 mM metformiinin, joka on AMPK aktivaattori. Sitten, 1 uM YC käsiteltiin tai yhdessä käsiteltiin 2 h ja proteiini ilmaisuja mitattiin Western blot-analyysi. (D) H358, H460, Calu-1, H1299, A549 ja H1993-soluja käsiteltiin 2 tunnin ajan 1 uM YC ja proteiini ilmaisuja mitattiin Western blot -analyysillä.

vaikutukset YC on mTOR signalointireitille

on hyvin tunnettua, että AMPK säätelee negatiivisesti mTOR signalointireitin. Koska AMPK aktivoitiin YC on H1993 soluissa, me tutki tarkemmin sitä YC vaikuttaa myös mTOR signalointireitille. Huomasimme, että YC vaimentua aktivoituminen mTOR (p-mTOR (Ser2448)). Siksi mTOR liittyvä loppupään proteiini ilmaisuja olivat edelleen määritettiin. Koska YC ei moduloida tasot mTORC1 liittyviä proteiineja, kuten 4E-sitova proteiini 1 (4EBP1), eukaryoottinen translaation aloitus- tekijä 4E (EIF4E), p70S6 kinaasi 1 (p70S6K1), ja ribosomaalisen proteiinin S6 (RPS6) (kuvio 3A) , YC edelleen analysoitiin vaikutus toisen mTOR monimutkainen, mTORC2, modulaattorin aktiinisytoskeletonin organisaation. Tämän seurauksena, YC tukahdutetaan mTOR autofosforylaatiota on Ser2481, molekyyli- biomarkkeri mTORC2 aktiivisuutta (kuvio 3B). Sen tutkimiseksi, YC esti mTORC2 toimintaa vaikuttamalla yhdistys mTOR kanssa rictor, rictor immunosaostettiin YC-käsitellyistä soluista, ja mTOR ja rictor vasta-aineet todettiin immunoblottauksella vastaavasti. Kuten kuviossa 3C, YC häiritsi yhdistyksen mTOR ja rictor, ja nämä tapahtumat myöhemmin tukahdutti aktivoitumista mTORC2 liittyvän loppupään tavoitteita kuten Akt, proteiinikinaasi C alfa (PKC-α), ras liittyvät C3 botuliinitoksiinia alustan 1 (Rac1), ja rihmamaisia ​​aktiini (F-aktiini) by YC (kuvio 3B). YC myös aktivoida ilmentymistä solun adheesiomolekyyli E-kadheriinin, negatiivinen säätelijä F-aktiini on H1993-soluissa (kuvio 3B). Suppressiivinen vaikutus YC ekspressioon F-aktiini on vahvistanut myös immunosytokemiallisessa analyysi (kuvio 3D), mikä viittaa siihen, että YC estää tehokkaasti solun tukirangan organisaatiossa NSCLC-soluja. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​sen havainnon kanssa, solun morfologiset muutokset hoitoon YC, että H1993-soluissa.

(A) H1993-soluja käsiteltiin 24 h ilmoitetuilla pitoisuuksilla YC ja ilmaisuja mTORC1 signaloinnin liittyviä proteiinit mitattiin Western blot-analyysi. (B) H1993-soluja käsiteltiin 24 h ilmoitetuilla pitoisuuksilla YC ja ilmaisuja mTORC2 signalointi-sukuiset proteiinit mitattiin Western blot-analyysi. (C) vuorovaikutus mTOR ja rictor on analysoitu immunosaostuksella rictor seuraavat immunobloteista solulysaateista (alempi paneeli) ja immunosaostumien (ylempi paneeli), jossa mainituilla vasta-aineilla. IP: immunosaostus. (D) H1993-soluja käsiteltiin 24 tunnin osoitetuilla pitoisuuksilla YC ja F-aktiinin ilmentymistä mitattiin immunosolukemiallisella.

Effects of YC on hyökkäyksen ja maahanmuuttoa

on tunnettua, että epäsymmetrinen kertyminen F-aktiini liittyy solujen invaasiota ja muuttoliike. YC tukahdutti ilmentyminen F-aktiini in NSCLC soluissa. Siksi olemme edelleen arvioitiin vaikutusta YC on syöpäsoluinvaasiota ja muuttoliike. Hoitoon YC 24 h esti migraation syöpäsolujen haavan paranemista määritys pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4A). Lisäksi Matrigel invaasiomääritys suoritettiin tutkia, YC vaikuttaa invasiivisuus pahanlaatuisten syöpäsolujen. YC esti syöpäsolujen siirtymässä Matrigel kammioon pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että YC esti migraation ja invaasion syöpäsolujen, joka on osa liittyy tukahduttaminen aktiinitukirangan organisaation kautta downregulation F-aktiini ja säätelyä E-kadheriinin ilmentymisen.

(A) H1993-soluja inkuboitiin 12-kuoppalevyllä 24 tunnin ajan, haavoittuneen keltainen kärki, ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla YC. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa. (B) H1993-soluja käsiteltiin 48 h: n osoitetut pitoisuudet YC. Solu invaasiomääritys suoritettiin Matrigel päällystettyjä kammion, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

antiproliferatiivisia vaikutuksia yhdistelmä syövän kemoterapia-aineiden

lisäksi tutkittiin, mikä vaikutus YC yhdessä gefitinibin tai rapamysiinin H1993 soluproliferaatioon. Useissa tutkimuksissa on raportoitu suotuisia vaikutuksia yhdistelmän gefitinibin, EGFR-estäjä, jolla on mTOR-inhibiittorit prekliinisissä mallissa. Tässä tutkimuksessa, yhdistelmä YC gefitinibin kanssa näkyy merkittäviä synergistisiä inhiboivia vaikutuksia H1993-soluja (kuvio 5A). Lisäksi, yhdistelmä rapamysiinin (an mTORC1 estäjä) ja YC esti tehokkaasti solujen lisääntymistä H1993-solujen verrattuna rapamysiinillä yksinään (kuvio 5B). On tunnettua, että rapamysiini estää mTORC1 ja ei estä mTORC2. mTORC1 esto tukahduttamatta mTORC2 voi aktivoida PI3K /Akt ja edistää kasvainten selviytymistä. Näin ollen tämä tulos viittaa siihen, että kasvun estäminen YC yhdessä rapamysiinin voisi johtua alas-säätely mTORC2 YC.

Soluja käsiteltiin YC yksin tai yhdessä gefitinibin kanssa tai rapamysiini-48 h . Soluproliferaatioon mitattiin käyttämällä SRB-määritystä. (A) YC yhdistettynä gefitinibin (B) YC yhdistettynä rapamysiinin.

Estovaikutus kasvaimen kasvua YC on H1993 soluissa istutettu ksenografti hiirimallissa

anti- kasvain aktiivisuus YC arvioitiin käyttämällä

in vivo

nude mouse ksenograftimallissa laakeri H1993 soluja. Kun kasvaimen tilavuus oli noin 90 mm

3 jälkeen istutettu kanssa H1993 soluja, YC (0,5 tai 1 mg /kg YC) tai gefitinibin (10 mg /kg) annettiin oraalisesti hiirille kerran päivässä 21 päivän ajan. Kasvaimen tilavuus vehikkelillä käsitellyssä kontrolliryhmässä oli noin 750 mm

3 30 päivää sen jälkeen, kun solut implantoitiin ihon alle oikeaan kylkeen alueella kunkin hiiren. Verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään ryhmät, YC inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua 33,4% ja 38,8% 0,5 mg /kg ja 1,0 mg /kg, vastaavasti, lopussa kokeiden (kuvio 6A). Kasvaimen painot olivat myös merkittävästi inhiboi hoidossa YC (kuvio 6B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin hoidossa gefitinibin (10 mg /kg). Ei painonmuutokset ja selvä myrkyllisyyden havaittiin

in vivo

kokeissa YC (kuvio 6C).

(A) H1993 solua injektoitiin s.c. osaksi paljaiden hiirien kylkiin ja kasvaimia, ja niiden annettiin kehittyä 21 päivää. Kun ne oli noin 90 mm

3, esitettynä pitoisuutena YC aloitettiin. Kaikki tutkimuksessa lääkkeet annettiin suun kautta kerran päivässä 21 päivän ajan. Kasvaimen koot seurattiin joka 4. ~ 6 päivää. (B) määrä ja paino kunkin -tuumoriksenografti mitattiin päättymisen kokeen päivänä 21. (C) Eläimet on kontrolli- ja testiryhmään punnittiin joka 4. ~ 6 päivää. Keskimääräinen kehon paino kussakin ryhmässä on esitetty.

Lisäksi, biokemiallinen analyysi kasvaimen kudosten vahvisti myös aktivointi AMPK käsittelemällä YC käyttäen Western-blot (kuvio 7A) ja immunohistokemiallinen analyysi (kuvio 7B), annoksesta riippuvalla tavalla. YC myös osoitti inhibition ilmentymisen lisääntymistä biomarkkerit Ki-67 (kuvio 7C) ja proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) (kuvio 7D) kasvainkudoksissa. Nämä tiedot osoittivat, että YC ehkäistä tehokkaasti kasvaimen kasvua H1993 solujen

in vivo

, ja sen antituumorivaikutuksen saattaa osittain liittyä aktivoinnista AMPK signalointireitin.

Proteiini uutteet, jotka ovat peräisin kasvaimeen kudoksista H1993 ksenograftimallissa. (EN) AMPK ilmaisuja mitattiin Western blot-analyysi. (B) p-AMPK ilmentyminen mitattiin immunohistokemiallisesti. (C) Ki-67 ilmentyminen mitattiin immunohistokemiallisesti. (D) PCNA ilmentyminen mitattiin immunohistokemiallisesti.

Keskustelu

Luontaistuotteet ovat ollut tärkeä rooli lääkekehityksen ja kehitys [21]. Erityisesti kasvipohjaisia ​​maanpäällisten luonnontuotteet ovat olleet arvokkaita lähteitä terapeuttisia aineita. Yuanhuacine (YC), joka on daphnane diterpenoidinen, on periaatteessa osa kukkia

Daphne genkwa

. Viimeaikaiset tutkimukset ryhmämme ym raportoitu voimakas antiproliferatiivisia vaikutuksia YC vastaan ​​eri syöpäsolulinjoja [8, 22-24]. Yksi uskottava mekanismi sisältää kohdentamista topoisomeraasi-DNA-kompleksit, ja YC pidetään DNA-vaurioittava aine [25]. YC osoitti myös induktion G2 /M vaiheessa solukierron pysähtymisen ihmisen virtsarakon ja paksusuolen syöpäsoluissa [26]. Kuitenkin tarkka molekyylimekanismi YC on syövän vastaista aktiivisuutta ihmisen keuhko- syöpäsoluja, erityisesti ei-pienisoluisen keuhkosyövän solu kasvu pysyi selvittämättä. Tämä tutkimus osoittaa, että YC säätelee AMPK /mTOR-signalointireitin ja estää aktiinisytoskeletonin organisaatio ihmisen keuhkojen H1993 syöpäsoluja.

Viimeaikaiset tutkimukset paljastivat, että AMPK /mTOR signalointipolkujen ovat vahvasti kytketty säätelyssä syöpäsolujen kasvua, leviämisen, ja selviytymistä. Erityisesti aktivointi AMPK säätelee negatiivisesti syöpäsolun kasvua alavirran mTOR signalointireittejä [26]. Monet luonnontuotteet peräisin olevat yhdisteet myös galegine iältään

rohtovuohenherne

[27], resveratrol punainen rypäleistä, quercetin läsnä paljon hedelmiä ja vihanneksia, ginsenoside alkaen

Panax ginseng

, kurkumiinista

Curcuma longa

, berberiini alkaen

coptis chinensis

, epigallokatekiinigallaattia vihreästä teestä, theaflavin mustasta tee [28], ja hispidulin lumesta lotus [29] ovat osoittaneet syövän vastaisen aktiivisuuden aktivoituminen AMPK reittejä. Tässä tutkimuksessa olemme myös havainneet, että YC tehokkaasti aktivoi AMPK ja downregulates mTORC2 liittyvän signalointireitteihin. Aktivoituminen AMPK YC havaittiin tapahtui varhaisessa tapahtuma H1993 soluissa ja aktivaation AMPK vahvistettiin myös yhteistyössä käsittelemällä AMPK estäjän (yhdiste C) tai aktivaattori (metformiini). Nämä havainnot viittaavat siihen, että antiproliferatiivista aktiivisuutta YC on osa liittyy aktivointi AMPK ihmisen NSCLC-solut.

AMPK osoittaa useita loppupään kohde kuten ACC, mTOR, p-p53, ja COX 2 syöpäsoluissa.