Krooninen sairaus

tiivistelmä

Double minuutin kromosomeja (DMS) on merkittäviä vaikutuksia syövän etenemisen vuoksi onkogeenien usein monistettu niitä . Olemme aikaisemmin havainneet funktionaalisesti määrittelemätön geeni monistettiin DMS, Ribosomaalisen L22-like1 (

RPL22L1

). Suhde

RPL22L1

ja syövän etenemistä on tuntematon. Täällä,

RPL22L1

leimasi sen roolista munasarjasyöpä (OC) etäpesäke ja sen taustalla olevaa mekanismia tutkittiin. DNA kopiomäärä ja mRNA ilmaus

RPL22L1

OC soluissa analysoitiin käyttäen saatuja tietoja Cancer Genome Atlas ja Gene Expression Omnibus tietokantaan. Immunohistokemiallinen analyysi, kliinisten OC näytteiden suoritettiin ja niiden väliset suhteet ekspressiotaso ja kliinis tekijät arvioitiin. Lisäksi

in vivo

ja

in vitro

analyysit suoritettiin ymmärtää roolin

RPL22L1

OC. RPL22L1 ilme oli suurempi OC yksilöiden kuin normaaleissa kudoksissa, ja sen ekspressiotaso oli hyvin korreloi positiivisesti invaasion ja imusolmuke etäpesäke (

P

0,05).

RPL22L1

yli-ilmentyminen merkittävästi parannettu vatsaonteloon ksenograftin kasvaimen kehitystä nude-hiirissä ja edistänyt hyökkäyksen ja muuttoliike

in vitro

. Lisäksi

RPL22L1

pudotus estettiin merkittävästi UACC-1598-solujen invaasio ja muuttoliike. Edelleen,

RPL22L1

yli-ilmentymistä säädellään ylöspäin mesenkymaaliset markkereita vimentiinin, fibronektiiniä, ja α-SMA, vähentää ilmentymistä epiteelin markkerit E-kadheriinin, α-kateniinin, ja β-kateniinin.

RPL22L1

estäminen vähensi ilmaus vimentiinista ja N-kadheriinin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että

RPL22L1

indusoi epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT). Tuloksemme osoittivat, että DMS monistettu geeni

RPL22L1

on kriittinen ylläpitämisessä aggressiivinen fenotyyppi OC ja puhkeamisessa solujen etäpesäke indusoimalla EMT. Se voitaisiin käyttää uutena prognostinen markkeri ja /tai tehokas terapeuttinen kohde OC.

Citation: Wu N, Wei J, Wang Y, Yan J, Qin Y, Tong D, et al. (2015) Ribosomaalisen L22-like1 (

RPL22L1

) Edistää munasarjasyöpä etäpesäke indusoimalla epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon. PLoS ONE 10 (11): e0143659. doi: 10,1371 /journal.pone.0143659

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 05 elokuu 2015; Hyväksytty: 06 marraskuu 2015; Julkaistu: 30 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: DNA kopiomäärä analyysitiedot voidaan saada oncomine.org (https://www.oncomine.org/resource/main.html) ja kaikki yksityiskohtaiset vaiheet ovat paperi. Kaikki muut asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee ohjelman Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team University (Grant nro IRT1230 ja YJ), National Natural Science Foundation of China (Grant nro 81371617 ja YJ), Outstanding Nuorten perusta Heilongjiangin maakunnassa Kiinassa (Grant nro JC201215 ja YJ).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OC) on toiseksi yleisin gynekologisten maligniteetti ja ensimmäinen kuolinsyy [1]. Cancer etäpesäke, pikemmin kuin ensisijainen kasvaimia, ovat vastuussa suurimmasta syöpäkuolemista [2]. Puuttumisen vuoksi lopullisten ensioireita ja asianmukaista markkereita OC diagnoosin varhaisessa vaiheessa, suurin osa potilaista diagnosoidaan myöhäisvaiheen OC mukana etäpesäke, joka on tyypillisesti 5 vuoden pysyvyys 30% [3]. On tärkeää ymmärtää molekyylitason mekanismeja OC etäpesäkkeitä, ja määrittää tehokas, spesifinen ja herkkä molekyyli tavoitteet, jotka voidaan soveltaa etäpesäkkeiden diagnoosi, ennuste, ja yksilöllinen kohtelu.

Double minuutin kromosomeja (DMS) ovat sytogeneettinen tunnusmerkkejä geenimonistuman [4]. DMS näkyvät erilaisten ihmisen syöpäsoluja, mutta ei normaaleissa soluissa [5]. Kuten kromosomin kuljettavien amplifikaatiot genomisia DNA-sekvenssejä, DMS edistää syövän muodostumisen ja etenemisen, onkogeenit ovat usein läsnä monistetut sekvenssit ja proteiinit ne koodaavat ovat usein yli-ilmentynyt [6]. Esimerkkejä geeneistä monistettiin DMS sisältävät

MYC

paksusuolen syöpä [7],

MYCN

neuroblastoomakasvaimissa [8],

EGFR

glioomis- [9], ja

EIF5A2

[10, 11] munasarjasyöpä [12]. DMS ovat ajoneuvojen monistettujen geenien myös monia onkogeenien toiminnan tutkimuksessa monistettavien geenien DMS on hyvä tapa tutustua ehdokas onkogeenien.

Tiimimme aikaisemmin tunnistettu 3q26.2 kuin alkuperää DMS ihmisen munasarjasyövän solulinja UACC-1598, ja useita geenejä co-monistettiin samassa munasarjojen DMS, mukaan lukien

MYCN

,

EIF5A2

, ja

RPL22L1

[13 ]. Molemmat

MYCN

ja

EIF5A2

tärkeä rooli syövän etenemiseen. Kuitenkin suhde

RPL22L1

ja syöpä ei ole tiedossa.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että

RPL22L1

on yleisesti yliekspressoitu kliinisessä OC yksilöiden ja sen ilme taso liittyy vahvasti tuumorin eteneminen ja metastaasit.

in vivo

koe osoitti, että pakko ilmentymistä

RPL22L1

edistää vatsaonteloon ksenograftin kasvainten kehittymistä nude-hiirissä, ja tehostaa solumigraatio ja invaasiota

in vitro

. Lisäksi koputtavat se alas pieniä häiritseviä RNA (siRNA) estää maahanmuutto- ja invaasion

in vitro

. Tämän prosessin aikana

RPL22L1

yli-ilmentyminen johti kohonnut ilmentyminen mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista ja α-SMA, ja vähentynyt ilmentyminen epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin, α-kateniinin, ja β-kateniinin osoittaa, että induktio epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) voi selittää havaitun kasvaa motiliteettia ja invaasion kyky etäpesäke. Tuloksemme osoittivat, että

RPL22L1

tärkeä rooli prosessissa OC etäpesäke.

Materiaalit ja menetelmät

Ethic selvitys

Tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean Harbin Medical University seuraavien viitenumero, HMUIRB20150023. Munasarjasyöpä kudossiruina (TMA) immunohistokemiaan hankittiin US Biomax- (ov951, ov1912, ov6161, Rockville, MD, USA) ja Xin Chao (Hova-Can90PT-01, Shanghai, Kiina). Molemmat yhtiöt tarjotaan eettisiä lausuntoja vahvistaa, että paikallisten eettisten komiteoiden hyväksytty suostumuksensa menettelyt, kaikki osallistujat edellyttäen kirjallinen tietoon perustuva suostumus ja kaikki oli yritetty suojata potilaiden yksityisyyttä ja anonymiteetin. Eettinen lausunnot tarjoama yritysten ja protokollan kokeilu oli tarkastettu huolellisesti ja hyväksynyt eettinen komitea Harbin lääketieteellinen yliopisto (HMUIRB20150023). Neljä viikkoa vanhoja BALB /c-hiiriä (erityiset-patogeenittomassa) ostettiin SLAC (Shanghai, Kiina) ja sijoitettu Harbin Medical University Animal Laboratory. Hiiriä pidettiin standardoiduissa valoa kontrolloiduissa olosuhteissa huoneenlämmössä (24 ° C) ja 50% kosteudessa, on vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia suuntaviivojen Laboratory Animal käyttö Harbin Medical University. Protokolla hyväksyttiin eettisen komitean Harbin lääketieteellinen yliopisto (HMUIRB20150023) ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen munasarjasyövän solulinja UACC-1598, SKOV3, HO-8910, ja HO-8910PM ostettiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Kaikki solut viljeltiin seuraten kuvattuja menetelmiä ATCC (Manassas, VA, USA), ja oli todennettu vuonna 2012 Micro-lukea Genetics Company (Peking, Kiina) käyttäen lyhyitä tandem uusintaa.

Valmistelu of metafaasivaiheeseen leviää ja fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) analyysi

Solut kerättiin metafaasissa leviämisen mukainen valmiste kuvattujen menetelmien aiemmissa tutkimuksissa [14, 15] ja värjättiin Giemsa. Kaksi BAC-klooneja, GFP-RP11-355H10, joka kattaa nimenomaisesti

MYCN

(monistettiin UACC-1598 ja sijaitsee DMS [13]), ja Cy3-RP11-726H11 varten

RPL22L1

, valittiin DNA-koettimet ja hybridisoitiin metafaasissa leviää solujen kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Kromosomeja vastavärjättiin DAPI (4, 6-diamino-2-fenyyli). Kuvat otettiin käyttäen Leica DM5000 B fluoresenssimikroskooppia (Wetzlar, Saksa), ja analysoitiin käyttäen MetaMorph Imaging System (Universal Imaging Corporation, West Chester, NY, USA).

DNA kopiomäärä ja geenien ilmentymisen analyysi

Oncomine DNA Copy Number Aineistot (https://www.oncomine.org/resource/main.html) sisältää tiedot talletetaan Cancer Genome Atlas (TCGA Munasarjojen 2 Dataset, http: //TCGA-data. nci.nih.gov/tcga/) käytettiin määrittämään eroja DNA: n kopioiden määrän välillä OC ja normaali veren /munasarjakudoksessa. 607 munasarjojen vakavien kystadenokarsinooma, 431 normaali veren, ja 130 normaalin munasarjan kudoksessa analysoitiin. Tiedot saatiin seuraavien vaiheiden kautta: tyyppi geenin nimi:

RPL22L1

hakukenttään ja selata puu Valitse Ensisijainen Suodattimet Aineistot tyyppi DNA Kopioi numero Datasets. Tulos TCGA Munasarjojen 2 on suoraan ensimmäinen, ja kuvaaja oli vasemmalla. Napsauta histogrammin painiketta vasemmassa yläkulmassa kuvaajan otsikon saada histogrammin kuvaaja. On ryhmä suodattimet kaavion yläpuolella otsikko, klikkaa kolmiosymboli, valikossa valitun ”Syöpä ja Normal Type” tehdä analyysi ryhmitelty syövän ja normaali näytteitä. Tietojen saanti edellyttää akateemisen sähköpostitilin. Tekijät pitäisi ottaa yhteyttä kirjautumistietoja tarvittaessa.

Kaksi itsenäistä microarray geenien ilmentymisen aineistoja käytettiin. Molemmat aineistot luotiin käyttäen Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array alustan (Santa Clara, CA, USA). Raw.CEL tiedostot kahden aineistoja olivat ladattavissa Gene Expression Omnibus (GEO) verkkosivuilla (GSE27651 ja GSE28450) [17, 18], ja normalisoitu käyttäen RMA (vankka multi-array keskiarvo) algoritmia [19].

qRT-PCR

Yhteensä RNA kunkin solulinjan uutettiin käyttäen High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel-Stadt, Sveitsi) seuraten valmistajan ohjeita. PrimeScript

® RT Reagent Kit Perfect Real Time (Takara, Dalian, Kiina) käytettiin käänteiskopioitua kokonais-RNA. CDNA kvantitoitiin käyttäen LightCyclerTM

® 480 SYBR Green I Master (Roche) LightCycler

™ 480 II Real Time System (Roche). Spesifisten alukkeiden ihmisen

RPL22L1

ja

GAPDH

olivat seuraavat:

RPL22L1

forward-aluke, 5′-AGAAGGTTAAAGTCAATGG-3 ’ja reverse-aluke, 5’-ATCACGAAGATTGTTCTTC- 3 ’;

GAPDH

forward-aluke, 5′-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3 ’ja reverse-aluke, 5’TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3’. Expression of

RPL22L1

näytteissä normalisoitiin kuin

GAPDH

ja kertamuutosta ilmentymisessä laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Western blot analyysi

Solut hajotettiin 4 ° C: RIPA (8990, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Solulysaatteja, jotka sisältävät 40 ug kokonaisproteiinia kustakin näytteestä ladattiin 12% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (Millipore, Billerica, MA, USA). Blokattiin 10% blokkausliuosta (Roche), membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden ja sen jälkeen 1-h inkubointi anti-hiiri /anti-kaniini-vasta-ainetta (200-332-263 /610-132-007 , Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) huoneen lämpötilassa. Kuvat saatiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) ja rajataan Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA), edustaja viisi toisistaan ​​riippumatonta koetta. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. Yksityiskohdat ensisijaisen vasta annetaan Lisävihkoehdotuksen S1 teksti.

Tissue mikrosirujen

The OC kudossiruina (TMA) ostettiin USA Biomax- (ov951, ov1912, ov6161; Rockville, MD, USA) ja Xin Chao (Hova-Can90PT-01, Shanghai, Kiina). Hyväksyntä tässä tutkimuksessa on saatu ennen se aloitettiin paikallisen alueellisen eettisen komitean. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat.

immunohistokemia

immunohistokemia (IHC) suoritettiin käyttäen PowerVision

™ kaksivaiheinen Histostaining Reagent (Zhongshan Golden Bridge, Peking, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, TMA kohdat poistettiin parafiini ja nesteytyksestä. Antigeenin haku, TMA dioja olivat mikroaaltouuni-käsiteltiin 10 mM sitraattipuskurissa (pH 6,0), 8 minuutin ajan. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan. TMA kalvot inkuboitiin 1:50 monoklonaalisia ihmisen RPL22L1 (1:50) yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Sitten lasit peräkkäin inkuboitiin vuohen anti-kani-IgG-vasta-piparjuuriperoksidaasi konjugaattien 30 min ajan 37 ° C: ssa, ja 3′-3 ’diaminobentsidiiniä käytettiin kromogeenin substraattina. Lopuksi kaikki diat vastavärjättiin varten ytimet hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Sillä negatiivinen kontrolli, ensisijainen vasta-aine korvattiin normaalilla kaniinin IgG. RPL22L1 immunoreaktiivisuus TMA näytteissä arvioitiin kolme patologia. Intensiteetti immunoreaktiivisuus on TMA luokiteltiin asteikolla 0-3 perustuu yhteisymmärrykseen kolmesta tutkijat.

Vektorit

RPL22L1

-ORF monistettiin PCR ja kloonattiin pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SiRNA (h) ja ohjaus siRNA ostettiin RiboBio (Q000200916-1-B, Guangzhou, Kiina). Lusiferaasireportteri plasmidi pGL4.17 luovutti ystävällisesti Dr. ZH Zhong (Department of Microbiology, Harbin Medical University, Harbin, Kiina).

Transfektio

Kaikki plasmidit ja siRNA: ita transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden.

Nude hiiren ksenograftimallissa

eläinkokeiden hyväksyttiin eettisen komitean Harbin lääketieteellinen yliopisto (HMUIRB20150023) ja suoritettiin suuntaviivat Laboratory Animal käyttö Harbin Medical University. Neljän viikon ikäiset BALB /c-nude-naarashiirillä oli satunnaistamisesta määritetty kussakin ryhmässä viisi hiirtä ryhmää kohti. Kuhunkin hiireen injektoitiin 1 x 10

6-soluja (200 ul: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta [PBS]). Kasvaimen kasvu mitattiin kahdesti viikossa kautta bioluminescence kuvantaminen. Hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti 150 ug /g D-lusiferiinin (BIOSYNTH, Naperville, IL) PBS: ssä, ja ne nukutettiin 2,5% isofluraania. Fotonit säteilevä hiiret kirjannut IVIS Lumina (Advanced Molecular Vision, Lincolnshire, UK) ja esitetään pseudo-värikuvia päällekkäin harmaa-asteikon kehon kuva. Kaikki hiiret lopetettiin CO

2 hengitettynä 30 päivän kuluttua ruiskutetaan. Varmistaakseen kuolemaa seuraavan CO

2 tukehtumisen, kaula sijoiltaan suoritettiin.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

TranswellTM solumigraatioon ja invaasiota analyysit suoritettiin käyttäen Corning 8,0 mm TranswellTM insertit (8 -μm huokoskoko, 24-kuoppainen levy) ja BD BioCoat

™ matrigeelin

™ Invasion Chambers (Corning Incorporated Life Sciences, Tewksbury, MA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

Haavojen paraneminen määritys

yksisolukerros oli naarmuuntunut on 10 ui pipetin kärki (in 6-kuoppalevylle). Valokuvat (suurennus, × 40) otettiin välittömästi ja jokaisen 24-h haavan tekemisen kunnes haavat ilmeisesti parantuneet. Kutakin määritystä varten kokeet suoritettiin yhdeksän eri asennoissa ja koko määritys toistettiin kolme kertaa.

immunofluoresenssi

Solut kiinnitettiin metanolilla ja blokattiin 1-h 10% tavallista vuohen seerumia, 0,3% naudan seerumin albumiinia, 0,05% saponiinia, ja 0,3% Triton X-100 PBS: ssä. Ensisijainen vasta-aineita lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Solut myöhemmin pestiin PBS: llä ja inkuboitiin fluoresenssileimattuja sekundäärinen vasta-aine. Fluoresenssimikroskooppia (Leica) käytettiin kaapata kuvia.

Tilastot

RPL22L1 proteiinin ekspressiotasot TMA analysoitiin Wilcoxonin allekirjoitettu-rank testejä. Χ

2 testiä käytettiin tutkimaan assosiaatioita geeniekspressiota ja kliinisten parametrit. Muut tiedot ilmaistiin keskiarvoja ± SD ja tilastollinen merkitys erot kahden ryhmän arvioitiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​riippumatonta Opiskelijan

t

-testaukset. Tilastollinen merkittävyys julistettiin jos

P

0,05. Laskelmat suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 (IBM, Armonk, NY, USA).

Tulokset

RPL22L1

monistettiin kautta DMS ja yliekspressoitu UACC-1598-soluissa

OC solulinja UACC-1598 sisälsi monistettujen geenien muodossa DMS. Oncogene monistuksella DMS edustaa kasvaimen, mutta ei esiinny normaaleissa soluissa (kuvio 1A). Käyttämällä FISH-analyysi, havaitsimme monistettu alueilla

RPL22L1

että yhteistyössä paikallistaa

MYCN

DMS (kuvio 1 B). Lisäksi havaitsimme monistuminen

RPL22L1

normaaleissa munasarjan kudoksissa, ihmisen lymfosyyteissä, ja UACC-1598-soluissa käyttämällä PCR (Kuva 1C). Tutkimme myös monistamisen

RPL22L1

toisessa kolme munasarjasyövän solulinjoissa (S1 kuvio). RT-PCR vahvisti ilmaus

RPL22L1

eri näytteissä (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että

RPL22L1

monistettiin kautta DMS UACC-1598-soluissa.

(A) edustaja kuvaa metafaasikromosomeissa of UACC-1598 ja normaalin ihmisen lymfosyyttejä. Nuolet osoittavat DMS UACC-1598-solujen (suurennos, × 1000). (B) edustavat kuvat FISH-analyysillä. Metafaasikromosomit of UACC-1598 ja ihmisen lymfosyyttejä havaittiin DNA-koettimilla. (A) punainen koetin osoittaa

RPL22L1

ja (b) vihreä koetin osoittaa

MYCN

; (C) sekä koettimet sijaitsevat samassa lokukseen DMS kuten on osoitettu nuolilla, (d) punainen koetin osoittaa

RPL22L1

normaaleissa ihmisen lymfosyyteissä (suurennos, x 1000). (C) DNA: n monistuksen tasot

RPL22L1

havaita PCR, (D) RT-PCR tulosta mRNA: n ilmentymisen tasojen

RPL22L1

eri näytteissä.

DNA kopiomäärä ja ilmentymisen taso

RPL22L1

kliinisissä OC näytteistä

määrittämiseksi monistuminen

RPL22L1

kliinisissä käytimme Oncomine tietokannassa (https: //www .oncomine.org) analysoida DNA kopiomäärä profiilit

RPL22L1

on TCGA munasarjojen aineisto (TCGA munasarjojen 2, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [20 , 21]. Tämä aineisto selvästi kasvanut merkittävästi DNA kopioluku

RPL22L1

OC verrattuna normaaliin verta ja munasarjojen kudoksiin, kynnyksen

P

10

-4 (kuvio 2A).

(A) DNA-kopiomäärä profiilit

RPL22L1

in munasarjojen serous kystadenokarsinooma datasarjan rekisteröityjen Oncomine tietokannassa (TCGA Munasarjojen 2 aineisto) . Kaksi itsenäistä microarray geenien ilmentymisen aineistot (B) GSE29405 ja (C) GSE27651 GEO verkkosivuilla käytettiin tutkimaan ilmentymisen taso

RPL22L1

OC. Raw.CEL tiedostot kaksi tietokantaa on ladattu ja normalisoitiin RMA.

RPL22L1

oli korkeammin ilmaistu OC kuin normaalissa munasarjakudoksen (*

P

0,05, itsenäinen Opiskelijan

t

-testi). Edustavia kuvia RPL22L1 proteiinin ilmentymisen (D) OC ja (E) sovitetun viereiseen normaaliin kudokseen IHC (suurennos, × 400).

Lisäksi saimme julkisesti saatavilla GEO ilmaus aineistoja analysoida ilmaisun on

RPL22L1

OC näytteissä. Kaksi GEO aineistoja perustuu Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array käytettiin arvioimaan

RPL22L1

mRNA ekspressiotasot OC ja normaali munasarjojen kudoksiin. Kussakin kaksi aineistot,

RPL22L1

ekspressio oli merkittävästi suurempi OC kuin normaali munasarjojen kudoksissa (kuvio 2B ja 2C,

P

0,05, Studentin t-testi).

edelleen tutkia proteiinin ilmentymisen taso

RPL22L1

kliinisistä näytteistä, neljä OC TMA käytettiin IHC analyysejä. Värjäys intensiteetti arvioitiin indeksillä 0-3 solun tumassa ja sytoplasmassa (S2 Kuva). RPL22L1 selvästi ilmoitti korkeammin OC solulimassa kuin viereisen normaaleissa kudoksissa (kuvio 2D ja 2E) (

P

= 0,008, Wilcoxonin allekirjoitettu-rank test).

Tutkimme assosiaatioiden RPL22L1 proteiinin ekspressiotasot ja ennusteeseen viittaavia muuttujia. RPL22L1 ilmentymistä sytoplasmassa OC solujen voimakkaasti yhteydessä vaiheessa invaasio, ja imusolmuke etäpesäke (

P

0,05, Pearsonin χ

2 testiä, taulukko 1). Nämä tulokset osoittivat, että ilmentyminen

RPL22L1

on yleisesti korkeampi kliinisissä OC yksilöitä, ja sen ekspressiotaso liittyy syövän etenemiseen, erityisesti invaasio ja imusolmuke etäpesäke.

RPL22L1

parannettu vatsaonteloon ksenografti kasvainten kehittymiseen

in vivo

havaitsemiseksi roolin korkean tason

RPL22L1

kasvaimen etenemiseen, me valinnut OC solulinjan alhainen RPL22L1 ilme, SKOV3, edelleen toiminnallisia tutkimuksia (kuvio 3A). SKOV3- solut pysyivät transfektio lusiferaasin aikaisemmin ja sitten vakaa transfektion

RPL22L1

(kuvio 3B ja 3C). Tutkia roolia

RPL22L1

kasvaimen etenemisen

in vivo

, me intraperitoneaalisesti SKOV3-RPL22L1 ja ohjaus soluja nude-hiiriin. Ksenosiirrettyjä kasvaimet mitattiin käyttäen bioluminesenssin on 30

päivänä injektion jälkeen, alueen ksenograftin kasvaimen hiirten SKOV3–RPL22L1 solut injektoidaan oli suurempi kuin kontrolli solut injektoidaan (kuvio 3D). Tuloksena ehdotti, että korkean tason

RPL22L1

edistää kasvainten kehittymistä.

(A) ilmentyminen RPL22L1 in UACC-1598 ja SKOV3- solut tutkittiin Western blot. Expression of

RPL22L1

in SKOV3-RPL22L1 ja ohjaus solut tutkittiin (B) western blotit ja (C) qRT-PCR. (D) Neljä viikkoa vanhoja nude-hiiriin intraperitoneaalisesti SKOV3-RPL22L1 tai kontrollisoluja ja bioluminesenssi kuvat on otettu sen jälkeen, kun 30 päivää. (Bar: keskiarvo ± SD; *

P

0,05, itsenäinen Opiskelijan

t

-testi).

RPL22L1

edistetään OC solujen migraation ja invaasion

vahvista roolin

RPL22L1

OC soluissa, UACC-1598-soluja käsiteltiin kolmea erityistä siRNA vastaan ​​

RPL22L1

(siRNA-1, siRNA -2, ja siRNA-3). Koska siRNA-2 näytteillä tehokkain knockdown endogeenisen

RPL22L1

, se valittiin myöhempää analyysejä (S3 kuvassa). Paitsi SKOV3-RPL22L1 ja ohjaus soluja, käytimme vielä kaksi OC solulinjoista HO-8910 ja HO-8910PM pienemmillä

RPL22L1

ilmaisun ohimeneviä transfektoitu

RPL22L1

edelleen toiminnallinen tutkimus (S3 Kuva). Vaikutus

RPL22L1

soluliikkuvuus leimasi haavan paranemista, siirtokuoppaan muuttoliike, ja Matrigeliä invaasio määrityksissä. Knockdovvn

RPL22L1

in UACC-1598-soluissa (1598-siRPL22L1) aiheutti selkeä ression solujen maahanmuuton ja hyökkäystä. Yli-ilmentyminen

RPL22L1

in SKOV3-RPL22L1, HO-8910 (8910-RPL22L1), ja HO-8910PM (8910PM-RPL22L1) soluja voitaisiin lisätä merkittävästi solujen muuttoliikettä ja invaasiota (

P

0,05, kuvio 4). Solujen kasvu analysoitiin MTA määrityksellä,

RPL22L1

ei ollut vaikutusta solujen lisääntymistä (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, korkeatasoinen

RPL22L1

parantaa OC solujen muuttoliikettä ja invaasiota.

(A-D) edustaja kuvaa haavan paranemista määritys solujen (suurennus, × 40). (E-H) Migration solujen havaittiin siirtokuoppaan migraatiokokeessa, ja (I-L) soluinvaasiota arvioitiin käyttäen Matrigel hyökkäystä kammioon. Esimerkkejä soluista, jotka kulkeutuivat kalvon läpi (vasen paneeli), pylväät osoittavat rinnakkaisessa kokeessa (suurennos, × 100, Bar: keskiarvo ± SD *

P

0,05, itsenäinen Opiskelijan

t

– testi).

ilmaisu taso

RPL22L1

vaikutteita OC solulinja EMT

on käynyt yhä selvemmäksi, että EMT on olennainen osa etenemistä epiteelin -johdannainen kasvaimia [22, 23]. Huomasimme, että SKOV3–RPL22L1 solut ilmensivät kara-muotoinen ja sidekudosta morfologia taas 1598-siRPL22L1 solut osoittivat kutistuminen muotoja ja lisääntynyt solujen soluadheesiota (S4 kuvio). Siksi me tutki

RPL22L1

aiheuttama EMT voisi selittää

RPL22L1

-välitteisen muutoksia soluissa motiliteetin ja hyökkäystä. Biochemical tunnusmerkkejä EMT kuuluu menetys ilmaisun epiteelisolujen markkeriproteiinien ja samanaikainen kasvu mesenkymaalisten merkki ilmaisun [22, 24]. Western-blotit ja immunofluoresenssilla analyysejä käytettiin lauseketta epiteelin ja mesenkymaalisten markkereita. Sen jälkeen kohdunulkoinen yli-ilmentyminen

RPL22L1

vuonna SKOV3- soluissa, ilmaus epiteelin päättäjille, kuten E-kadheriinin, β-kateniinin, ja α-kateniinin väheni, kun taas ilmaisun vimentiinista, α-SMA, ja fibronektiini lisätään (kuvio 5A ja 5B). Vuonna 1598-siRPL22L1 solujen ilmentymisen tasot mesenkymaalisten markkereita vimentiinista ja N-kadheriinin hajosivat (kuvio 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus taso

RPL22L1

vaikutteita EMT OC-soluissa.

(A) Western-blotit oli vähäisempää epiteelin markkerit (E-kadheriinin, β-kateniinin, ja α- kateniinin) ja korkeamman mesenkymaalisten markkereita (vimentiinista, α-SMA, ja fibronektiini) in SKOV3-RPL22L1 verrattuna hallinnassa soluissa. (B) JOS analyysi osoitti alentuneesta epiteelin markkereita (α-kateniinin ja β-kateniinin) ja kohonneet mesenkymaalisten markkereita (fibronektiini ja vimentiinista). (C) Western blot-analyysi osoitti, että knockdovvn

RPL22L1

siRNA johti alentunut taso mesenkymaalisten markkereita (vimentiinista ja N-kadheriinin) in UACC-1598-soluissa.

Keskustelu

DMS ovat pahanlaatuisia sytogeneettisten markkereita ja ovat tiiviisti korreloivat kasvaimen etenemistä [4]. Aikaisemmin olemme todenneet, että

RPL22L1

monistettu DMS, mutta sen toiminta on epäselvä. Monet onkogeenit monistetaan kautta DMS pahanlaatuisten syöpäsolujen [34.38.39], kuten

EIF5A2

ja

MYCN

, jotka molemmat sijaitsevat samassa lokuksessa kuin

RPL22L1

DMS. Olemme päätellä, että

RPL22L1

voi osallistua OC etenemistä, ja vahvistanut tämän sarjassa

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä.

käyttäminen julkisesti saatavilla TCGA ja GEO ilmaisun aineistot löysimme molemmat DNA kopiomäärä ja mRNA ilmaus

RPL22L1

oli merkitsevästi korkeampi OC kudoksissa kuin normaaleissa munasarjan kudoksissa. Proteiinin ilmentyminen

RPL22L1

tutkittiin IHC neljällä OC TMA. Olemme havainneet, että RPL22L1 ilme oli usein korkeampi OC kudoksissa verrattuna normaaliin viereiseen munasarjakudoksen (

P

= 0,008, Wilcoxonin allekirjoitettu-rank testi). Lisäksi löysimme ekspressiotaso korreloi merkitsevästi taudin vaiheessa (81,7% vaiheessa 2-4 vs. 64,5% vaiheessa 1) invaasio syvyys (81,9% vuonna T2-T4 vs. 64,5% T1), ja imusolmukkeesta etäpesäke (86,6 % kanssa vs. 70,3% ilman etäpesäkkeitä), mikä viittaa siihen, että korkea RPL22L1 OC solut voivat helpottaa invasiivisen /metastaattinen fenotyyppi. Nämä havainnot korostavat potentiaalisesti tärkeä rooli

RPL22L1

kuin taustalla biologinen mekanismi kehittymistä ja etenemistä OC.

tulokset IHC analyysi osoitti, että

RPL22L1

voi osallistuu patogeneesiin OC etenemisen erityisesti etäpesäkkeitä. Vahvista Tämän hypoteesin nude mouse -tuumoriksenografti, haavan paranemista, siirtokuoppaan muuttoliike, ja matrigeelin invaasio määritykset suorittaa roolin tutkimiseksi

RPL22L1

säätelyssä OC soluissa liikkuvuutta, invaasio. Yli-ilmentyminen

RPL22L1

ilmeisesti edistää kasvainten kehittymistä

in vivo

ja lisäsi maahanmuutto ja hyökkäys kyky kolmen OC solulinjojen

in vitro

. Lisäksi knockdown endogeenisen

RPL22L1

siRNA in UACC-1598-soluissa esti maahanmuutto- ja invaasion

in vitro

. Muuttoliike ja hyökkäys on kaksi tärkeää vaihetta tuumorimetastaasissa [25], ja nämä toiminnalliset analyysit viittasivat vahvasti siihen, että

RPL22L1

tärkeä rooli tuumorimetastaasissa kautta parantaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Monet biologiset prosessit liittyvät maahanmuuttoon ja invaasio kuten EMT, keskeinen tapahtuma kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [26]. Yli-ilmentyminen

RPL22L1

vähentää ilmentymistä epiteelin markkeriproteiinien (E-kadheriinin, β-kateniinin, ja α-kateniinin) ja lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaaliset markkereita (vimentiinin, α-SMA, ja fibronektiini), jotka ovat biokemiallisia tunnusmerkkejä EMT [24, 27, 28]. Kuitenkin, kun knockdovvn

RPL22L1

in UACC-1598-solujen mesenkymaaliset markkereita vimentiinista ja N-kadheriinin olivat ilmeisesti alassäädetty. EMT on ratkaiseva rooli etäpesäkkeitä ja tämän prosessin aikana solujen saada muuttoliikkeen ja invaasio valmiuksia, jotka edistävät etäpesäkkeitä [29, 30]. Näin ollen meidän päätellä, että yli-ilmentyminen

RPL22L1

todennäköisesti indusoi EMT edistää solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden.

RPL22L1 on paralogi on RPL22, joka on RNA-sitovan proteiinin osa 60S ribosomaalisen alayksikön. Ribosomaalinen proteiinit ovat olennaisimpia ribosomien jossa solun proteiinien syntetisoidaan. Tähän mennessä noin 80 ribosomaalisen proteiineja on tunnistettu. Lisäksi niiden keskeinen tehtävä proteiinisynteesiä, jotkut ribosomaalisen proteiinit ovat mukana extra-ribosomaalisen toimintoja, kuten DNA: n korjaukseen, apoptoosin, transkription sääntely, ja käännös sääntely [31-36]. Yhä useammat raportit ovat ehdottaneet, että ribosomaalinen proteiineilla on onkogeeninen [37-39]. Äskettäin

RPL22

on todettu olevan mutatoitunut tai alassäädetty erilaisissa syövissä, mukaan lukien T-akuutti lymfaattinen leukemia, invasiivinen rintasyöpä, ja keuhkon adenokarsinooma. Lisäksi

RPL22

suoraan tukahduttaa ilmaisun

RPL22L1

mRNA, ja puute RPL22 aiheuttaa korvaava kasvu RPL22L1 [40, 41]. Nämä tutkimukset ort meidän arveluihin roolista on

RPL22L1

syövän etenemiseen.

Yhteenvetona tuloksemme ehdotti, että

RPL22L1

tärkeä rooli OC etenemisen edistämällä solujen invaasio ja etäpesäkkeiden kautta asiakkuutta EMT. Kuten

RPL22L1

on DM suorittaa monistettu geeni, meidän tiedot voivat auttaa selittää tehtävä DMS syövässä.