Krooninen sairaus

tiivistelmä

estrogeenireseptori (ER) β variantti ERβ2 ilmaistaan ​​aggressiivinen kastraatio kestävä eturauhassyöpä ja on osoitettu korreloivan pieneni eloonjäämiseen. Genominlaajuisten ilmentymisen analyysin jälkeen ERβ2 ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa osoitti, että hypoksia oli yliedustettuna teema. Tässä osoitamme, että ERβ2 vuorovaikutuksessa ja stabiloi HIF-1α proteiinin normoksia, aiheuttaen siten niukkahappiseen geeniekspression allekirjoitus. HIF-1α tiedetään stimuloivan etäpesäkkeiden lisäämällä ilmentymistä Twist1 ja lisätä vaskularisaatiota suoraan aktivoimalla VEGF ilmaisua. Huomasimme, että ERβ2 vuorovaikutuksessa HIF-1α ja piggybacks että HIF-1α elementin läsnä proksimaalisen Twist1 ja VEGF promoottorit. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ainakin osa kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle ERβ2 välittyy HIF-1α, ja että kohdistaminen tämän ERβ2 – HIF-1α vuorovaikutus voi olla strategia eturauhassyövän hoitoon.

Citation: Dey P, Velazquez-Villegas LA, Faria M, Turner A, Jonsson P, Webb P, et al. (2015) estrogeenireseptorin β2 indusoi Hypoksia allekirjoitus Gene Expression vakauttaa HIF-1α eturauhassyövässä. PLoS ONE 10 (5): e0128239. doi: 10,1371 /journal.pone.0128239

Academic Editor: Sonia Rocha, University of Dundee, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 26 marraskuu 2014; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2015 Julkaistu: toukokuu 26, 2015

Copyright: © 2015 Dey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki microarray tiedostot ovat saatavilla NCBI: n Gene Expression Omnibus tietokantaan (hakunumero GSE35095).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) myöntää HIRP100680 ja RP110444, Texas Emerging Technology Fund alla sopimuksen no. 300-9-1958, Robert A. Welch Foundation (Grant E-0004), Ruotsin Cancer Fund ja Marie Curie FP7-PEOPLE-2011-COFUND (KASVU 291795) kautta VINNOVA ohjelma Mobility kasvua (ja C. W.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on hitaasti etenevä sairaus, aluksi hoidettavissa androgeeni- vajaushoidon (ADT) [1], mutta yleensä toistuvat entistä aggressiivinen muoto, joka on androgeeniriippumattomaksi [2, 3]. Useimmat aggressiivinen eturauhasen syövät ilmentävät korkeita androgeenireseptorin (AR), ja lisäksi käyttää erilaisia ​​mekanismeja aktivoida AR ilman sen ligandin. Esimerkiksi syöpä voi hankkia kyky syntetisoida AR-ligandeja, fosforyloivat AR tai vaihtoehtoisten silmukoinnin, luoda konstitutiivisesti aktiivinen AR [4]. Sitä vastoin ilmaus tärkeimmät isomuodon estrogeenireseptorin β (ER /ESR2), ERβ1, aikana on pienentynyt eturauhassyövän etenemisen [5-8]. ERβ1 on osoitettu alas-säätelemään AR, joten kun ehtyminen ERβ1, ilmentymisen AR on olennaisesti kasvanut [9]. Lisäksi, ERβ1 on äskettäin osoitettu aiheuttavan apoptoosia eturauhassyövän solulinjoissa aktivoimalla FOXO3a /PUMA reitin [10]. ERβ1 on myös osoitettu estävän epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) säätelemällä propyylihydroksylaasia domeeni 2 (PHD2 /EGLN1) ja sen jälkeen laskeva hypoksian indusoima tekijä 1α (HIF-1α /HF1A) tasot [11, 12]. Päinvastoin, ER silmukointivariantti ERβ2 [13] on ilmaistu myöhäisessä vaiheessa metastaattisen eturauhassyövän ja ydinvoiman ERβ2 ilmaisun korreloi vähentynyt eloonjäämiseen [14]. ERβ2 sisältää katkaistun ligandia sitovan domeenin (LBD) ja ainutlaatuinen C-päätteen aminohapposekvenssi, jota koodaa ainutlaatuinen vaihtoehtoinen ERβ2-spesifisiä eksoni kutsutaan cx [13]. Tämä ER isoformi puuttuu kyky sitoa ligandiin, homodimerize ja aktivoi kanonisen ERβ1 geeniekspressiota polkuja, mutta voi heterodimerisoitua ERa mikä rajoitti ERa toimintaa [13]. Nuclear ERβ2 lisää invasiivisuus PC3-solujen [14] ja lisää solujen lisääntymistä ja ilmentymistä Twist1 (TWIST1) ja c-Myc (MYC) sekä PC3 ja 22Rv1 soluja, mikä osoittaa mahdollisia onkogeenisiä rooleista ERβ2 eturauhassyövässä [15].

lisääntyvä kasvain on usein alttiina hypoksinen kunnossa, koska sen suurempi metabolisen tarpeet ja puute uudissuonittuminen pysyä sen vaatimuksiin. Hypoksia edistää neuroendokriinisiksi erilaistuminen eturauhasen kasvain, joka lisää sen aggressiivisuutta [16]. Transkriptiotekijää HIF, 1α on keskeinen tekijä vasteen solujen hypoxia. Soluissa normaalin happipitoisuus, HIF-1α hydroksyloituu propyylihydroksylaasia, entsyymiä, joka käyttää happea kofaktorina ja on aktiivinen vain alle normoxic edellytyksellä [17]. Prolyyli hydroksylaatio aiheuttaa HIF-1α vuorovaikutuksessa Von Hippel Lindaun tekijä (VHL), mikä johtaa ubikitinaation ja hajoaminen HIF-1α jota proteasomin monimutkainen [18-21]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että HIF-1α-proteiinia voidaan stabiloida ilman laskua happi jännitteitä tekijät häiritsemällä hapen vaikutuksesta HIF-1α hajoaminen [22-24]. Stabiloinnin jälkeen, HIF-1α siirtyy tumaan ja aktivoi geenien transkriptiota mukaan angiogeneesiä. Vuonna syöpiä, HIF-1α muuttaa geenien ilmentymisen mikä lisää kasvainten aineenvaihduntaa ja etäpesäkkeiden, joka luo hyvin aggressiivinen kasvain. Esimerkiksi HIF-1α-riippuvainen säätely Twist1 ilme on keskeinen vaihe etäpesäkkeitä [25]. Koska ERβ2 on ehdotettu kasvaimia synnyttävän rooli eturauhassyövän, ja sen silmukointivariantti ERβ1 on tuumorisuppressorina tiedetään estävän HIF-1α, me täällä tutkimme, ERβ2 voi lisätä HIF-1α vakauttamista, ja onko tämä mekanismi taustalla korrelaatio molempien tekijöiden aggressiivinen, metastaasien, eturauhasen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja soluviljelmä

22Rv1 ja PC3-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC). 22Rv1 soluja ylläpidettiin RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma, St. Louis, MO), 25 mM HEPES-puskuria ja 2 mM L-glutamiinia (Invitrogen Carlsbad, CA), kun taas PC3-solut ylläpidettiin RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). Kaikissa kokeissa käytetyt solut alla passage 30.

HIG2 lusiferaasiplasmidin on kuvattu aiemmin [26], PXP2-Twist1-LUC ja PXP2-mTwist1-LUC on kuvattu [25].

Rakentaminen indusoituvan järjestelmän ERβ2 ja biotiini-ligaasia ilmentävät PC3-solujen (PC3 BirA) B

transposoni-pohjainen järjestelmä välittävä doksisykliini-säädellään ilmentyminen ERβ2 käytettiin pysyvästi transfektoida 22Rv1 ja PC3 eturauhasen syöpäsoluja. Nämä solulinjat on kuvattu muualla [15]. Rakentamiseen PC3 soluja, jotka ilmentävät biotiini-ligaasia, PC3-solut transfektoitiin pBirA ekspressoivan plasmidin

Escherichia coli

biotiini holoentsyymin syntetaasin (BirA) päässä aktiinipromoottori ja valita G418 500 ug /ml. Kahden viikon jälkeen kloonit eristettiin ja niistä määritettiin biotinylaation aktiivisuus.

Protein uutteen valmistamiseksi

valmistamiseksi koko-solu-uutteet, solut pestiin kahdesti PBS: llä, lyysattiin 10 kertaa hematokriitin lysis puskuria [0,1% Nonidet P-40, 250 mM KCI, 5 mM Hepes, pH 7,9, 10% (tilavuus /tilavuus) glyserolia, 4 mM NaF, 4 mM natriumortovanadaattia, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM ditiotreitolia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, proteaasiestäjäseostabletit, PhosStop (Roche, Indianapolis, IN)] 15 minuutin ajan jäillä ja sentrifugoitiin sitten 14000 x

g

10 minuuttia.

Western blotting

Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia ladattiin SDS-PAGE 10% bis-Tris geeli Tris-ajopuskurissa ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille jälkeen elektroforeettisen erotuksen. Kalvot blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta 0,1% TBST puskuriin ja tutkittiin anti-ERβ2 (tuotettu laboratoriossa), Twist1 (sc-15393), ja HIF-1α (sc-10790) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Ensisijainen vasta-aineita käytettiin 1: 200-1000 laimennoksia, ja sekundääristä vasta-ainetta käytettiin 1: 10000.

RNA ja reaaliaikainen PCR-

RNA uutettiin Qiagen mRNA Extraction Kit standardin protokollan. cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: First Strand mukainen järjestelmä protokollaa (Invitrogen Inc. NY). Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Green I värjätä master mix (Applied Biosystems Foster City, CA). Alukkeita (Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville, IA) olivat: 18s rRNA eteenpäin (F), 5′-CCT GCG GCT TAA TTT GAC TCA-3 ’ja reverse (R), 5′-AGC TAT CAA TCT GTC AAT CCT GTC C-3; glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi F, 5’-TGA CAA CTT TGG TAT YCG TGG AAG G-3 ’ja R, 5′-AGG CAG GGA TGA TGT TCT GGA GAG-3′ (viite-geenit); ERβ2 F, 5-ACT TGC TGA ACG CCG TGA CC-3 ja R, 5’-CCA TCG TTG CTT CAG GCA A-3 ’; Twist1 F, 5’-GGA GTC CGC AGT CTT ACG AG-3 ’ja R, 5′-TCT GGA GGA CCT GGT AGA GG-3’. qPCR reaktiot suoritettiin 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) käyttäen optimoitua edellytykset SYBR Green I värjätä järjestelmä: 50 C 2 minuuttia, 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40-50 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekuntia ja 60 C: ssa 50 sekuntia. Optimaalinen alukekonsentraatio määritettiin alustavissa kokeissa ja vahvistusta spesifisyys varmistettiin dissosiaatiokäyrä analyysi.

In vitro käännös ja bakteeriekspressiovektoreilla

HIF-1α ja ERβ2 käännettiin käyttäen TNT Nopea kytketyt transkriptio /käännös Systems (Promega Madison, WI). Lyhyesti, 0,2 ug HIF-1α tai ERβ2 ekspressiovektoreita (T7) lisättiin alikvootti TNT Nopea master mix ja inkuboitiin 50 ul: ssa 60 minuuttia 30 ° C: ssa. In vitro synteesi proteiinin varmistettiin SDS-PAGE: lla. Sillä bakteeriekspressiovektoreilla BL21-DE3 bakteerisoluja käytettiin ilmaisemaan His-LBD-ERa, His-LBD-ERβ1, His-LBD-ERβ2 ja His-LBD-ERβ2ΔCX ilmentämisplasmideja.

Vedä alas PC3 tai HEK293 solut

PC3-solut transfektoitiin 3 ug: BirA (biotiini-ligaasi) ekspressioplasmidin, 3 ug plasmidi, joka sisältää biotinylaatio konsensus merkitty reseptorien B7TEV-ERa, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2 ja B7TEV-ERβ5 yhdessä 3 ug pcDNA3 HA-HIF-1a-”Addgene plasmidi 18949” tai pcDNA3 HA-HIF-1a-P405 /A-P564 /A ”Addgene plasmidi 18955” tai pcDNA3 HA-HIF-1a-Δ401-603 (pcDNA3 HA-HIF-1αΔODD) ovat kuvanneet Kondo

et al

ja Yan

et al

. [27, 28] 100 mm: n kudosviljelymaljalla. Varten HEK293-solut biotiini-ligaasia transfektoitiin. 48 tunnin kuluttua solut kaavittiin, pelletoitiin ja lyysattiin 300 ui NETN (20 mM Tris (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40), sonikoitiin ja sentrifugoitiin jätteiden poistamiseksi. 10 ui streptavidiini magneettisten helmien (Pierce Rockford, IL) pestiin NETN ja inkuboitiin 300 ul: solu-uute 2 tuntia kylmässä huoneessa. Helmet pestiin (3 x 10 minuuttia kierto) 300 ul: NETN ja keitettiin 20 ul: lla 2 x näytepuskuria [125 mM Tris-HCI (pH 6,8), 4% SDS, 20% (tilavuus /tilavuus) glyserolia, ja 0,004 % bromifenolisinistä] ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle Western blot. Blotti koetettiin HIF-1α-aineella (Santa Cruz Dallas, TX) 1: 1000 laimennus ja sekundaarinen vasta-aine 1: 10000 laimennos.

In-vitro pull alamäkiä

2 pl

vuonna vitro

käännetty HIF-1α-proteiinia inkuboitiin 25 ui bakteerien lysaattia, joka sisälsi His-ERβ2 (LBD) yön yli, ja kompleksit adsorboitiin nikkelin agaroosihelmiä 2 tuntia. Helmet pestiin kolme kertaa jääkylmällä NETN (20 mM Tris (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40). Komplekseja keitettiin 20 ul: lla 2 x näytepuskuria, altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle Western analyysejä. Blotti koetettiin anti-HIF-1α-aineella (Santa Cruz). Ensisijainen vasta-aineet olivat 1: 1000 laimennus, ja sekundaarinen vasta-aine 1: 10.000.

Nisäkkäiden 2 hybridimäärityksessä

ERβ2 kloonattiin Gal4DBD ilmentävien plasmidin PM2 kehyksessä Gal4DBD domain käyttäen BamHI ja Hindlll restriktiokohdat tekemällä PK2-ERβ2. PVP16 plasmidi (Clontech) käytettiin kloonaamaan N-terminaalista HIF-1α (aminohapot 1-401), happi epävakautta domeeni (aminohapot 401-603) ja C-terminaalisen domeenin (aminohapot 603-826) kehyksessä kanssa VP16 aktivaatiodomeenissa avulla BamHI- ja Pstl-restriktiokohdat. Vuorovaikutuksen määrityksissä PC3-soluissa Gal4 reagoiva toimittaja FR-LUC 300 ng, PM2-ERβ2 500 ng ja VP16 sulatettu HIF-1α verkkotunnuksia 200 ng transfektoitiin käyttäen PEI menetelmää transfektion kuten ovat kuvanneet Longo et al. [29]

Microarray ja bioinformatiikan analyysit

kaksivärinen vertaileva mikrosiruanalyysi kattaa täysin tunneta proteiinia koodaavan transcriptome of 39600 selostukset ja variantteja käyttämällä Human OpArray paneelit hankittiin mikrosirut Inc. ( Huntsville, AL). Array täydennettiin 133 oligonukleotidien nimenomaan syntetisoitiin yksityiskohtaista ja vankka analyysi tumareseptorien, -silmukointivariantteja ja jaksoihin. Microarray-analyysi suoritettiin oleellisesti kuten Richter

et al

. [30]. Kunkin cDNA-synteesi, 20 ug kokonais-RNA: ta käytettiin, ja kukin vertailu toistettiin ja väriaine vaihtuneet. Bioinformatiikan analyysit suoritettiin käyttäen GenePix, R, ja Pathway Studio -ohjelmisto (Elsevier, Philadelphia, PA). Ilmentyvät eri geenit määriteltiin käyttäen p-arvo cut-off p = 0,005 yhdistelmänä M-arvo (log2 kertamuutosta) katkeaminen +/- 0,3. Enrichment analyysi geeni ontologian (GO) biologisten prosessien suoritettiin Fisherin testiä käyttäen ohjelmiston geenin sarjaa. Pathway kuvat suunniteltiin Pathway Studio. Microarray data on saatavilla NCBI: n Gene Expression Omnibus hakunumerolla GSE35095.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

subkonfluenteista PC3 ja 22Rv1 soluja (90%) kasvatettiin 150 mm lautasen ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin sitten PFA (1%) 10 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä + proteaasi-inhibiittori, kaavitaan 150 ui uudelleensuspendointipuskuria, ja sentrifugoitiin (4000 rpm, 10 minuuttia). Pelletit resuspendoitiin 750 ul: ChIP lyysipuskuria (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Triton 1%, proteaasi-inhibiittori) ja soluja pidettiin jäillä 30 minuutin ajan. Solulysaatit sonikoitiin (60 pulssia, 30 sekuntia kutakin) 30 sekunnin tauko 4 ° C: ssa. Seuraavat sonikoimalla, 25 ui näytettä kerättiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa (input). Loput 125 ui solu- lysaattia fraktiota käytettiin seuraavissa vaiheissa. Näytteet olivat esiabsorboitiin 20 ul: aan G-proteiiniin kytketty FLAG-leimattua magneettisten helmien 4 ° C: ssa 2 tunnin ajan ja supernatantti kerättiin. Sen jälkeen näytteet jaettiin kahteen fraktioon, ja vasta-aineita FLAG (2,5 ug) tai lgG: illä (2,5 ug) lisättiin ja inkuboitiin yön yli. Seuraavana päivänä, helmet pestiin kolme kertaa ChIP hajotuspuskuria, kun siru pestä paljon suolaa (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, Triton 1%), ja lopuksi kerran ChIP pesupuskurilla (Tris 10 mM LiCl 250 mM, NP40 0,5%, EDTA 0,1 mM). Helmet suspendoitiin uudelleen 40 ui eluutiopuskuria (Tris 50 mM, SDS 1%, EDTA 10 mM) ja inkuboitiin 65 ° C: ssa yön yli, jossa on pieni reikä korkin. Tulo kerättiin aikaisemmin sijoitettiin myös 65 ° C: ssa. Seuraavana päivänä, näytteet puhdistettiin käyttäen PCR-puhdistuskittiä (Qiagen) ja käytettiin qPCR-analyysi käyttäen seuraavia alukkeita. pHRE-Twist1 promoottori (F) 5′-CGGGGGAGGGGGACTGGAAAGC-3 ’; (R) 5’-AGGCCTCCTGGAAACGGTGCCG-3 ’, VEGF-promoottori: (F) 5′-ACAGACGTTCCTTAGTGCTGG-3′; (R) 5’-AGCTGAGAACGGGAAGCTGTG-3 ’.

Tilastot

Arvot on ilmaistu keskiarvona 95%: n luottamusväli. Pariton kaksisuuntainen

t

-testiä käytettiin vertaamaan eroja kahden ryhmän välillä. Merkitys esitetään *

p

0,05, **

p

0,005, ja ***

p

0,001, ja ei-merkittäviä eroja on esitetty NS.

tulokset

Microarray ja bioinformatiikan analyysi eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät ERβ2 osoittavat lisääntyneen ilmentymisen osallistuvien geenien hypoksinen vastauksena

Olemme aiemmin osoittaneet, että ERβ2 lisääntynyt ilmentymistä EMT liittyvien geenien Twist1 ja Slug (SNAI2) eturauhassyöpäsoluissa [15]. Täällä suoritimme transcriptomic tutkimus tutkia vaikutuksia ERβ2 puolueettomasti. Vertasimme PC3-solut, jotka ilmentävät stabiilisti ERβ2 kanssa ohjaus soluja, ja löysi 585 geenien merkittävästi muuttaa käyttämällä meidän määritelty cut-off. Mielenkiintoista, TGFB2, jonka tiedetään stimuloida HIF-1α, oli yksi erittäin ylössäädelty geenit (lähes 9-kertainen, mukaan microarray). Analysoimalla rikastaminen geenin ontologian luokkien joukossa geenien, ”

vastauksena hypoksia

” oli toiseksi yliedustettuna (s = 8.0e-6), toinen vain ”geenien ilmentymistä (taulukko 1). The ’

Vastaus hypoksia

”ryhmään kuului 17 merkitsevästi geenien (TGFB2, EGLN1 (PHD2), EGLN3 (PHD3), Smad3, HSD11B2, CAT, CCL2, CDKN1B, MMP13, PLOD2, IL1B, Plau, SCNN1G , CRYAB, IL18, ITPR1, SOD2, ADM). Lisäksi, rikastettu osa-verkon, joka on määritelty geenit ovat ilmentymistä kohteena vastaavan solmun, ”naapurit HIF-1α” oli kaikkein yliedustettuna yksi (p = 1.5e-09) ja 41 säänneltyä jäsenten (taulukko 2). Lisäksi monet ERβ2 aiheuttama geenien havaittiin olevan osallisena angiogeneesissä (taulukko 2), joka oli myös yliedustettuna teema (p 0,05). Näistä geeneistä, SOD2, SCNN1G, CD24, HIG2, IGF2 ja TGF-β2 ovat kaikki stimuloidaan HIF-1α [26]. Myös ”

glukoosiaineenvaihdunnan prosessin

joka HIF-1α tiedetään säännellä, oli yliedustettuna (p 0,007), joista 9 geenit (PFKP, AKT1, IGF2, GOT2, PGM5, CRYAB, GBE1, UGP2, FABP5). Siten mikrosiruanalyysi selvästi hypoksia ja HIF-1α toimivat pääteemoja ERβ2 toiminto (katso S1 Kuva kelvollisista geenejä).

Validoida näitä tietoja, olemme analysoineet ilmaus HIF-1α PC3 ja toinen eturauhassyövän cell line-22Rv1, jotka ovat yli-ilmentävien ERβ2. Havaitsimme kasvu HIF-1α-proteiinin tason ERβ2 ilmentävät versus kontrolli soluja, mutta ei muutoksia vastaavan mRNA tasolla (kuvio 1A-1D). Tämä sopii meidän microarray tuloksia, joita ei havaittu muutosta HIF-1α transkription tasolla, mutta osoitti muutos HIF-1α toiminnot (perustuen rikastetun polkuja). Edelleen, ERβ2 riippuva kasvu HIF-1α-proteiinin tasot vahvistettiin liitettävä ERβ2 riippuva kasvu HIF-1α aktiivisuutta. Lusiferaasiaktiivisuus toimittaja ohjaa HIF-1α-riippuvainen hypoksia geenin, 2 (HIG2 /HILPDA) promoottori (HIG2-A-luc) [26] lisättiin, kun läsnä oli transfektoitu ERβ2 ekspressiovektorin (kuvio 2A-2C). Aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että ERβ2 ilmentäviä PC3-soluja on kohonnut taso Twist1 [15]. Tässä osoitamme, että ERβ2 myös lisääntynyt aktiivisuus lusiferaasireport- ohjaa HIF-1α-riippuvainen Twist1 promoottorin LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa ja että tämä vaikutus oli riippuvainen HIF-1α-vaste-elementin (kuvio 3A-3C). Tämä osoittaa, että HIF-1α toimintaa yleisesti paranee eturauhasen soluissa, jotka ilmentävät ERβ2.

. Western blot otteista ohjaus ja kaksi erilaista 22Rv1 ja PC3 ilmentävien kloonien ERβ2 määritettiin kanssa HIF-1α-vasta. B. suhteellinen mRNA ilmaus ERβ2 ja HIF-1α on ERβ2clones on 22Rv1 solulinjan. Kaavio esittää datan kertainen muutos kontrolliin verrattuna (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± SEM.) Lasketaan Opiskelijan

t

-testi, * p≤0.016). C. Suhteellinen mRNA ilmentymistä HIF-1α on ERβ2 # 2 klooni 22Rv1 solulinjan. Kaavio esittää datan kertainen muutos kontrolliin verrattuna (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± sem) lasketaan Opiskelijan

t

-testi, ** p≤0.006).

. Kaavamaisen ääriviivat HIG2 promoottorikonstruktiin, jossa (X) edustaa sekvenssi HIF-1α vaste-elementit (HRE). B. Kasvava määrä ohimenevän transfek- ERβ2 ekspressioplasmidin osaksi PC3 soluihin peräkkäin aktivoi transfektoitiin HIG2 promoottori, kuten on esitetty lusiferaasianalyysissä of HIG2-A-LUC. Kaavio esittää datan kasvu luminenssi transfektoitujen solujen lisääntynyt pitoisuus ERβ2 (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± SEM.) Lasketaan Opiskelijan

t

-testi, *** p≤0.0002). Vertailu pitoisuuksien-0 ug 1000 ug. C. lisääminen ekspressioplasmidin HIF-1α aktivoi HIG2 promoottori PC3 solulinjoissa. Kaavio esittää datan kasvu luminenssi transfektoitujen solujen HIF-1α (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± sem) lasketaan Opiskelijan

t

-testi, **** p≤0.0001).

. Kuvaus Twist1 promoottorikonstrukteja käyttää. B. LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu Twist1-promoottori-lusiferaasireporttiterilla ja kasvava pitoisuus ERβ2 ekspressioplasmidin. Kaavio esittää datan kasvu luminenssi transfektoitujen solujen lisääntynyt pitoisuus ERβ2 (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± SEM.) Lasketaan Opiskelijan

t

-testi, ** p≤0.0034). C. transfektio Twist1-promoottori-lusiferaasireporttiterilla kanssa (Twist) tai mutantit (mTwist) HIF-1α elementin yhdessä IImentämisplasmidien HIF-1α tai ERβ2 LNCaP-soluissa. Kaavio esittää datan kasvu luminenssi transfektoitujen solujen lisääntynyt pitoisuus ERβ2 (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± sem) lasketaan Opiskelijan

t

-testi, **** p≤0.0001, # ## p≤0.002).

ERβ2 suoraan vuorovaikutuksessa HIF-1α aiheuttaa vakauttaminen

Koska ERβ2 kasvattaa ilmentymisen HIF-1α-proteiinia, mutta ei mRNA, me arveltu, että HIF-1α stabilointi tapahtuu läpi proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen ERβ2 ja HIF-1α. Tämän hypoteesin testaamiseksi, kiinnitimme bakteereilla ilmaistaan ​​LBD of ERa, ER ja ERβ2 kiinteään alustaan ​​ja määritetty vuorovaikutus

in vitro

käännetty HIF-1α. HIF-1a sitoutuu voimakkaasti ERβ2, mutta ei vastaavia määriä villityypin ERa tai ER LBD. Tämä vuorovaikutus oli riippumaton ERβ2 spesifiset sekvenssit, koska katkaisu aminohappoa koodaa ERβ2-spesifinen eksoni ei poista HIF-1α sitoutuminen (ERβ2ΔCX) (kuvio 4A). Pull-down biotiini-tagged keskeiset vaatimukset ilmaistaan ​​PC3-soluissa paljasti spesifisen vuorovaikutuksen transfektoiduissa HIF-1α kanssa ERβ2 ja ERβ2ΔCX ja vain vaatimaton vuorovaikutus ERβ1 (kuvio 4B). Koska ERβ5 on sama aminohapposekvenssi, ja on typistetty samaa aminohappoa kuin ERβ2, eli vain pieniä C-terminaaliset peptidit on erilainen näiden kahden välillä varianttien päätimme testata tämän variantin ja tutkia sen vuorovaikutuksessa HIF-1α. Kuten kuviossa 4B, ERβ5 vuorovaikutuksessa voimakkaasti HIF-1α.

. His-merkitty LBD-ERβ2 kaatamaan nikkelin -agaroosihelmien on

in vitro

käännetty HIF-1α verrattuna His-LBD-ERa, His-merkitty LBD-ERβ1, His-merkitty LBD-ERβ2 ja His tagged ERβ2ΔCX TNT on kaista vain kytketty retikulosyyttilysaatti. B. ilmentäminen biotiini-ligaasia BirA, HA-HIF-1α, ja N-terminaalisen biotiinin konsensus fuusioituna reseptorin rakentaa B7TEV-ERa, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2, B7TEV-ERβ5, ja B7TEV-ERβΔCX PC3-soluissa. Solu-uutteet alistettiin sitten avattavasta streptavidiinilla magneettisia helmiä, ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen tunnistus HIF-1α-vasta-ainetta.

happi epävakautta domeeni (pariton) ja HIF1α ei tarvita vuorovaikutukseen jossa ERβ2 ja ERβ5

tutkimiseksi, jos happi epävakautta verkkotunnuksen HIF-1α vaadittiin vuorovaikutuksessa ERβ2 rakensimme ekspressioplasmidin HIF-1α aminohappojen 401-603 poistettu kuten aiemmin on kuvattu [31] . Sitten yhteistyössä immunosaostettiin tämä deletoitu HIF-1α biotinyloidulla ERβ2 ja ERβ5. Kuten voidaan nähdä kuviosta 5A HIF-1α kanssa Poistetaan ODD (Δ401-603) vuorovaikuttaa yhtä voimakkaasti kuin villityypin osoittaa, että ODD verkkotunnus on tarpeeton vuorovaikutusta. Kartoittaa vuorovaikutuksen lisäksi käytimme nisäkkään kaksi-hybridi-määrityksessä, jossa N-terminaalisessa päässä, pariton domeenin ja C-terminaalisen pään HIF-1α fuusioitiin VP16 ja transfektoitiin PC3-soluja yhdessä Gal4DBD fuusioitunut ERβ2 ja reportteri Gal4 sitoutumiskohdat edessä lusiferaasin. Kuten voidaan nähdä kuviossa 5B vuorovaikutus tapahtuu edullisesti N-päähän HIF-1α.

. PC3-solut transfektoitu ilmentävien plasmidien GFP, HIF-1α, HIF-1α ΔODD, BirA (biotiini ligaasi), ERβ2 ja ERβ5 N-terminaalista biotinylaation konsensus. Komplekseja vedetty alas streptavidiinilla magneettisten helmien. Purettiin HIF-1α ja HIF-1α ΔODD havaittiin käyttäen anti-HIF-1α-vasta. B. transfektointi 200 ng FR-lusiferaasin yksin, 500 ng PK2-ERβ2 ja 300 ng joko VP16-N-aikavälin HIF-1α (aminohapot 1-401), VP16- ODD HIF-1α (aminohapot 401-603) tai VP16-C aikavälin HIF-1α (aminohapot 603-826). Mittaaminen Lusiferaasiaktiivisuuden 24 tuntia transfektion jälkeen.

On tunnettua, että proliinin 405 ja 564 HIF-1α alle normoksia ovat hydroksyloituu proliini hydroksylaaseja (PHD: n) ja sitten tunnustettu VHL kertoimella ja sen jälkeen suunnattu hajoaminen [32]. Halusimme saada selville, jos ERβ2 ja ERβ5 vuorovaikutus HIF-1α riippuu hydroksylaatio näitä proliinien jotta vuorovaikutus olisi vielä tapahtua happiolosuhteissa. Kuviossa 6, osoitimme, että WT ja P405 /A-P564 /A mutatoitunut HIF-1α voimakkaasti vuorovaikutuksessa ERβ2 riippumatta hävittämisestä prolyyli hydroksylaation sivustoja viittaa siihen, että vuorovaikutus tapahtuu sekä aikana normoksia ja hypoksiaa.

PC3-soluissa transfektoitu GFP, HIF-1α, HIF-1α P405 /A-P564 /A, BirA (biotiini ligaasi), ERβ2 ja ERβ5 N-terminaalista biotinylaation konsensus. Komplekseja vedetty alas streptavidiinilla magneettisten helmien.

ERβ2 rekrytoimista HIF-1α vaste elementtejä Twist1 ja VEGF promoottorit

Lopuksi tutkimme, ERβ2 voi sitoutua HIF -1α elementteihin käyttäen chip qPCR. Havaitsimme kohonnut ERβ2 palvelukseen HIF-1α vastaus elementtejä HIF-1α riippuvainen Twist1 ja VEGF promoottorit sekä PC3 ja 22Rv1 soluja. Kuitenkin, ERβ2 ei sitoudu promoottorien klassisen estrogeenin vaste tekijä pS2 geeni (kuvio 7A ja 7B).

PC3-solut (A) ja 22Rv1 soluja (B) ilmentävät doksisykliini-säännelty ERβ2 ilme tämä ER isoformi sitoutuu HRE (HIF-1α vaste tekijä Twist1 promoottori) ja VEGF promoottori (HIF-1α vaste tekijä VEGF promoottori), mutta ei pS2 (ERE) promoottori. ChIP-qPCR tulokset on esitetty ei-spesifistä lgG: tä ja tietyn anti-M2-FLAG-vasta-aineen immunosaostus. ERβ2 sitoutuminen rikastettu vain HIF-1α elementin sisältävien Twist1 ja VEGF promoottorit mutta ei pS2 promoottori puuttuu HIF-1α elementin. Kaavio esittää datan kasvu sitoutumisen FLAG että Twist1 (pHRE) ja VEGF promoottori (keskiarvo kolmesta erillisestä kokeesta (± sem) lasketaan Opiskelijan

t

-testi, * p≤0.028, # # p≤0.041 (PC3-solut) ja ** p≤0.0049, ## p≤0.0481 (22Rv1 solut).

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että ERβ2 sitoutuu ja stabiloi HIF-1α ja lisäksi on co-rekrytoimista avain HIF-1α elementtejä HIF-1α geenien siten parantaa aktiivisuutta HIF-1α aikana happiolosuhteissa eturauhasen syöpäsoluja.

keskustelu

Response normaalien kudosten hypoksia on ratkaisevan tärkeää asianmukaisen vaskularisaation ja myöhemmin verenkiertoa hapetettujen ja antaa ravinteita kudosta. kasvava kasvain tulee hypoksinen päästessään yli 1 mm kooltaan [33]. välittömänä vastauksena hypoksia on vähentynyt prolyylispesifinen hydroksylaation HIF-1α mikä lisää vakauttamiseen tämän proteiinin. Tämä johtuu siitä, VHL, joka indusoi ubiquitinylation ja myöhemmän hajoamisen HIF-1α mukaisesti happiolosuhteissa, ei voi sitoutua HIF-1α puuttuessa prolyyli-hydroksylaation. Vakauttaminen HIF-1α mahdollistaa sääntely liittyvien geenien angiogeneesiin, kuten VEGF, joka erittyy kasvain, houkuttelee endoteelisolut sitoutumalla niiden pinta VEGF-reseptorit jolloin lisääntynyt kasvaimen vaskularisaation ja kasvua. HIF-1α myös lisää liittyvien geenien ekspressiota glykolyysiin, mukauttaa kasvaimen hengissä olosuhteissa alhainen happipitoisuus [34], ja geenit, jotka osallistuvat eteneminen ja metastaasit, kuten Twist1 [25].

Expression of ERβ2 korreloi huonompi ennuste eturauhasen syöpä [14] ja ERa-negatiivinen rintasyöpä [35], mutta mahdollisia onkogeenisiä toimia ERβ2 ei ymmärretä. Osoitamme tässä, että on olemassa vahva korrelaatio ERβ2 ilmaisun ja HIF-1α-proteiinin tason mutta ei mRNA tasolla eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3 ja 22Rv1. ERβ2 lisää aktiivisuutta HIF-1α riippuvainen promoottoreita ja rekrytoimista Twist1 ja VEGF promoottorit, todennäköisesti kytkettynä ja HIF-1α. Yhdessä havainnot edellä mainitut viittaavat siihen, että HIF-1α välittää kasvaimia synnyttävän vaikutuksen ERβ2 kautta ei-klassisen signalointireitin jossa ERβ2 sitoutuu, ja stabiloi HIF-1α alle normoxic olosuhteissa. Tämä on linjassa muiden tutkimukset osoittavat, että HIF-1α vuorovaikutuksessa proteiinien vakauttaa HIF-1α estämällä sen hajoamista [22-24].

Yllättäen vaikka huomasimme, että ERβ1 ei ole vuorovaikutuksessa tehokkaasti HIF-1α, joka korreloi sen kyvyttömyys aiheuttaa HIF-1α reagoiva geenejä, ainutlaatuinen viimeinen eksonin ERβ2 ei vaadita HIF-1α sitova. Ilmeisesti katkaisu ERβ1 C-pään paljastaa uuden proteiinin pinnalla välittävä vuorovaikutus HIF-1α.

On epäselvää, saadaanko jos ERβ2 lauseke korreloi tasojen Twist 1 tai muu HIF-1α kohdegeenien kliinisissä näytteet. Tuore tutkimus Ragnum et al. [36] osoittaa, että androgeenipuutteen terapia (ADT) aiheuttaa alentuneen ilmaus monien geenien liittyy hypoksia. Ehdotamme, että ilmaus ERβ2 tai ERβ5 voi vaikutusten lieventämiseksi ADT happivajaus sidoksissa geenien eturauhasen kasvain ja siten aiheuttaa kastraatio vastuksen tuloksena on huonompi tulos. Todellakin, meidän havainnot kuin hypoksinen vakauttaminen HIF-1α viittaavat siihen, että saattaisi olla mahdollista kehittää pienimolekyylisiä häiritsemättä ERβ2 ja ERβ5 aiheuttama HIF-1α vakauttaminen käytettäväksi terapiassa tiettyjä aggressiivisia muotoja eturauhassyöpä. Katsaus kuvattujen havaintojen esitetään kuviossa 8.

Ehdotettu malli, jolla ERβ2 stabiloi HIF-1α ja rekrytoimista VEGF ja Twist1 promoottorit.

Yhteenvetona ilmaus ER variantit ERβ2 ja ERβ5 on aiemmin osoitettu korreloivan aggressiivinen eturauhassyöpä.