Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eri mekanismit p120-kateniinin (p120ctn) isoformit ”1/3 säätely solusyklin etenemisen vielä ole selvitetty tasalla.

menetelmät ja havainnot

Huomasimme, että molemmat sykliini D1 ja sykliini E voi tehokkaasti palauttaa palauttaminen p120ctn-1A tai p120ctn-3A p120ctn köyhdytetyn keuhkosyövän soluja. Kun ilmaisua sykliini D1 on estetty kotransfektoimalla siRNA-sykliini D1 p120ctn köyhdytettyä solujen palauttamiseksi p120ctn-1A tai 3A: n ilmentyminen sykliini E oli hieman vähentynyt, ei lisääntynyt, mikä tarkoittaa, että p120ctn isoformit 1 ja 3 voi päivit- säännellä sykliini E suoraan vaan voivat tehdä sen kautta ylössäätöä sykliini D1. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen p120ctn-1A kasvoi β-kateniinin ja sykliini D1 ilmentymisen, kun taas kotransfektion siRNA kohdistaminen β-kateniinin poistetaan vaikutus p120ctn-1A säätely ylöspäin sykliini D1, mikä viittaa rooliin β-kateniinin välittämisessä p120ctn-1A: n sääntelyä toiminto sykliini D1 ilme. Toisaalta, yliekspressio p120ctn isoformin 3A pienentää ydin- Kaiso lokalisointi, mikä vähentää sitoutumista Kaiso KBS sen sykliini D1-promoottorin ja siten parantaa ilmentymistä sykliini D1-geeni vapauttamalla repressorin vaikutuksen Kaiso. Koska yli-ilmentävät NLS-p120ctn-3A (p120ctn-3A ydinvoiman tavoite lokalisointi plasmideihin) tai estämällä tumasta p120ctn-3 by Leptomycin B (LMB) aiheutti translokaatiota Kaiso tumaan, on todennäköistä, että tumasta Kaiso on p120ctn- 3-riippuvaista.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että p120ctn isoformit 1 ja 3 säätää ylös sykliini D1, ja siten sykliini E, jolloin solun proliferaation edistäminen ja solusyklin etenemisen keuhkossa syöpäsolut luultavasti kautta eri proteiinin välittäjiä, nimittäin, β-kateniinin isoformin 1 ja Kaiso, negatiivinen transkriptiotekijä sykliini D1, isoformille 3.

Citation: Jiang G, Wang Y, Dai S, Liu Y , Stoecker M, Wang E, et ai. (2012) P120-kateniinin isoformien 1 ja 3 lisääntymisen säätelemiseksi ja Cell Cycle of Lung Cancer Cells kautta β-kateniinin ja Kaiso Vastaavasti. PLoS ONE 7 (1): e30303. doi: 10,1371 /journal.pone.0030303

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2011; Hyväksytty: 13 joulukuu 2011; Julkaistu: 20 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (myöntää 81071905 on EnHua Wang, 30901475 Yan Wang, 81071717 ja Shundong Dai, ja 30.900.562 Yang Liu). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpäsoluja, β-kateniinin, joka on keskeinen tekijä kanoninen Wnt-signalointireitin aktivaatio, kertyy sytoplasmaan ja translokoituu tumaan ja muodostaa kompleksin transkriptiotekijän Lef /TCF (Lef, lymfoidiset tehostajana tekijä; TCF, T-solu-tekijä proteiini), joka myöhemmin aktivoi Wnt-reagoiva geenejä, mukaan lukien sykliini-D1 [1]. Aiemmin olemme raportoineet, että yksi p120ctn isoformien, p120ctn-1, voivat säätää ylös β-kateniinin ilmentymistä, kun taas toinen p120ctn isoformi, p120ctn-3, ei voinut [2] – [3]. Mielenkiintoista on, että sekä p120ctn isoformit 1 ja 3 voisivat vaikuttaa solujen proliferaation ja solusyklin etenemisen, joiden tiedetään välittyvän sykliini D1 [2] – [4]. Siksi on järkevää spekuloida, että p120ctn-1 säätelee solujen lisääntymistä ja solukierron läpi β-kateniinin aiheuttama ylössäätöä sykliini D1. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismi, jonka p120ctn-3 säätelee solujen lisääntymistä ja solusyklin etenemisen on vielä epäselvä tällä hetkellä.

edellinen tutkimus osoitti, että Kaiso, ydinvoiman BTB /POZ-ZF (BTB, Broad monimutkainen, Tramtrack, Bric à brac; POZ, rokkovirus ja sinkkisormen, ZF, sinkkisormi) transkriptiotekijä, voi sitoutua p120ctn keuhkosyövän kudosten ja keuhkosyövän soluja [5]. Vaikka tiedetään olevan osa Kaiso /p120ctn monimutkainen, kunkin yksittäisen p120ctn isoformi voisi omistaa eri affiniteetilla, kun taas sitoutuminen Kaiso [6]. Kohteisiin, promoottorialueen sykliini D1 sisältää KBS (Kaiso-sitoutumiskohdat), konsensus-DNA-sekvenssi, joka voi tunnistaa Kaiso [7] – [8]. Näin ollen, sykliini D1 voi olla myös mahdollinen alavirran kohde geenin Kaiso [9] – [10].

Koska sitova domeeni Kaiso kanssa p120ctn on täysin päällekkäin tietyn DNA-sekvenssin KBS elementin sykliini D1 promoottori [9] – [11], oletamme, että p120ctn-3 voisi kilpailla KBS on sykliini D1-geeni sitoutumaan Kaiso ja kumoaa Kaiso välittämä tukahduttaminen sykliini D1, mikä parantaa ilmaus sykliini D1 sekä sykliini E , mikä viime kädessä edistää solusyklin etenemisen. Testata hypoteesia esillä olevassa tutkimuksessa olemme rekonstruoitu p120ctn-1A ja 3A vastaavasti p120ctn köyhdytetyn soluissa ja yli-ilmentynyt tai pudotti Kaiso tai β-kateniinin testaamaan vaikutukset ilmaus sykliini D1 ja sykliini E Tavoitteena oli tutkia mahdolliset eri molekyylitason mekanismeja, joiden p120ctn-1 ja 3 säätelevät solujen proliferaation ja solusyklin keuhkojen syöpäsoluja. Kaksi deleetiomutanttien p120ctn isoformin 1, jotka vaihtelevat niiden N-terminaalista rakenteet, rakennettiin tutkia eri toimintoja p120ctn-1 ja 3.

Tulokset

Sekä p120ctn 1A ja 3A voisi up-säännellään sykliini D1 ja sykliini E ilmaisun, joka vaikuttaa solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen keuhkojen syöpäsoluja

Onko p120ctn toimii tuumorisuppressorina tai etäpesäke promoottori riippuu paljolti jos ilmaus E-kadheriinin on alas -regulated, täysin menetetty solusta-soluun risteykseen tai ehjän [12]. Siksi on tärkeää määrittää, onko E-kadheriinin on lokalisoitu kalvolle ihmisen keuhkosyövän soluja. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että ei ole näkyvää membranous lokalisaatio joko p120ctn-1/3 tai E-kadheriinin proteiinit A549 tai SPC solulinjoista (kuvio S1). He sen sijaan osoittivat pääasiassa sytoplasmista jakeluun. Sen jälkeen p120ctn pudotettiin vuonna A549-soluja, ilmaisuja sykliini D1 ja sykliini E vähensi merkittävästi tasoilla sekä proteiinia (kuvio 1A) ja transkripti (kuvio S2A). Mukaisesti, proliferaatiota ehkäistä tehokkaasti (

p

0,01, kuvio 1 B), osoitetaan enemmän G

1 vaiheessa olevien solujen ja vähemmän S-vaiheessa soluja havaittiin (

p

= 0,001 kuvio 1C). Lisäksi sykliini D1 ja sykliini E voi tehokkaasti palauttaa palauttamista p120ctn-1A tai p120ctn-3A p120ctn köyhdytettyä A549-solut (kuvio 2A ja kuvio S2B), ja solun proliferaation ja solusyklin voidaan myös palauttaa, oletettavasti vastaa repletion sykliini D1 ja sykliini E (

p

0,05, kuva 2B ja C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin SPC-K2 solut, joissa p120ctn ilmentyminen perustuslaillisesti köyhdytettyä (kuvio S3).

(A) tulokset Western blot-analyysi osoitti, että proteiinit sykliini D1 (*,

p

= 0,001) ja sykliini E (*,

p

= 0,004) olivat merkittävästi vähentynyt jälkeen p120ctn pudotettiin vuonna A549-soluja. (B ja C) tulokset MTT ja virtaussytometria osoitti tukahdutetaan soluproliferaatioon kyky, lisääntynyt G

1 vaihe soluja (*,

p

= 0,001) ja vähensi S-vaiheen soluja (*,

p

= 0,001) havaittiin A549 soluja tippuu alas p120ctn. Kaikki vertailut tehtiin ryhmien A549-soluja tai soluja, jotka on transfektoitu pelkällä vektorilla.

(A) p120ctn-1A tai 3A plasmidit transfektoitiin A549-solut köyhdytetty p120ctn (si-p120 + 1A tai si-p120 + 3A), joka osoittaa selvästi talteen proteiini tasoilla sykliini D1 (*,

p

0,001, **,

p

0,001) ja sykliini E (*

p

0,001, **,

p

0,01). (B ja C) tulokset MTT ja virtaussytometria osoitti, että solujen lisääntymistä on tosiasiallisesti palautettu (

p

0,01), G

1 vaihe solut laski merkittävästi (*,

p

= 0,001, **,

p

= 0,004) ja S-vaiheen solut huomattavasti (*,

p

= 0,004, **,

p

= 0,028 ) jälkeen p120ctn köyhdytettyä A549-soluja transfektoitiin p120ctn-1A tai 3A. Kaikki vertailut tehdään ryhmien A549-soluja ja soluja, jotka on transfektoitu pelkällä vektorilla.

Sitten todettiin, että sykliini-D1 ehtyminen siRNA A549-soluissa johti myös vähentää sykliini E ilmaisun ( Kuvio 3A ja kuvio S4A), solujen proliferaatio (

p

0,01, kuvio 3B), korkeus G

1 vaiheessa olevien solujen ja väheneminen S-vaiheessa olevien solujen (

p

= 0,009, kuvio 3C), joka oli verrattavissa häiriöitä p120ctn. Sen sijaan, ei muutosta sykliini D1 ilmentyminen havaittiin, kun sykliini E oli kulunut loppuun siRNA (kuvio 3A ja kuvio S4A), mikä viittaa siihen, yksisuuntainen sääntely suhde sykliini D1 ja sykliini E Mielenkiintoista on, että kun siRNA-sykliini D1 oli kotransfektoitu p120ctn isoformi 1 tai 3 soluihin tyhjentynyt p120ctn ekspressio sykliini E ei kasvanut, mutta väheni hieman (kuvio 3D ja kuvio S4b), ja samanlainen ilmiö havaittiin, kun sykliini D1 on estetty monoklonaalinen vasta-aine inkuboimalla (100 ng /ml, 48 h) p120ctn rekonstruoitu soluissa (kuvio S5). Tämä havainto viittaa siihen, että p120ctn isoformeja 1 ja 3 voinut säätää ylös sykliini E suoraan, mutta saattaa tehdä niin kautta ylössäätöä sykliini D1. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että p120ctn edistää solusyklin etenemistä jopa säätelevä sykliini D1, joka myöhemmin parantaa ilmentymistä sykliini E.

(A) sykliini D1 ehtyminen siRNA A549-soluissa vähentänyt sykliini E ilme, mutta toisaalta ilmaus sykliini D1 ei merkittävästi muuttunut (

p

= 0,944) soluissa kanssa pudotti sykliini E siRNA, mikä viittaa yksisuuntainen sääntely suhde sykliini D1 ja sykliini E (B ja C) sykliini D1 ehtyminen tukahdutetaan solujen lisääntymistä (

p

0,01), kohonnut G

1 vaiheessa olevien solujen (

p

= 0,016) ja väheni S-vaiheen soluja (

p

= 0,009). (D) jälkeen kotransfektoimalla siRNA-sykliini D1 p120ctn isoformi 1 tai 3 soluissa tyhjentynyt p120ctn 48 tuntia, ilmentyminen sykliini E ei lisääntynyt, mutta se väheni hieman. Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että p120ctn edistää solusyklin etenemistä jopa säätelevä sykliini D1, joka myöhemmin parantaa ilmentymistä sykliini E. Vertailu tehdään kontrolliryhmään transfektoitujen solujen ei-kohdennettu siRNA tai pelkällä vektorilla.

p120ctn isoformin 1 voi säätää ylös sykliini D1 ilmentyminen kautta β-kateniinin

Koska olemme vahvistaneet, että molemmat p120ctn-1A ja p120ctn-3A voisi säätää ylös sykliini D1, nousi esille kysymys siitä, taustalla molekyylitason mekanismit olivat samat kahden isoformia. Voit vastata tähän kysymykseen, p120ctn-1A ja p120ctn-3A olivat vastaavasti transfektoitiin p120ctn tippuu alas SPC soluja, jotka oli nimetty SPC-K2. Yli-ilmentymisen p120ctn-1A voisi parantaa β-kateniinin lauseke (* p = 0,001, kuvio 4A), mutta yliekspressio p120ctn-3A ollut olennaisesti mitään vaikutusta β-kateniinin proteiini (** p = 0,769, kuvio 4A). Kohteisiin, ei p120ctn-1 eikä 3 näytti olevan vaikutusta transkription β-kateniinin (* p = 0,463, ** p = 0,401, kuvio 4B).

SPC-K2-solut transfektoitiin p120ctn -1 tai 3A vastaavasti, ja ilmentymistä β-kateniinin ja Kaiso mitattiin western blot (A) ja RT-PCR: llä (B). Proteiinin ilmentyminen β-kateniinin oli merkittävästi lisääntynyt (*,

p

= 0,001) soluissa, jotka on transfektoitu p120ctn-1A-cDNA, mutta se ei osoittanut merkittävää muutosta (**

p

= 0,769) in p120ctn-3A yliekspressoivia SPC-K2. Kumpikaan p120ctn-1 eikä 3 voivat vaikuttaa transkriptioon

β-kateniinin

(*

p

= 0,463, **

p

= 0,401) tai ilmaus Kaiso. Kaikki vertailut tehdään ryhmään soluja, jotka on transfektoitu pelkällä vektorilla.

Kuten kuviossa 5 on esitetty, down-regulation β-kateniinin siRNA (si-β-cat) vähensivät sykliini D1 ilmentyminen A549, ja nakutuksen alas p120ctn (si-p120) vähensivät aktiivisesti β-kateniinin ja sykliini D1. Lisäksi aktiivinen β-kateniinin ja sykliini D1 tasoja voidaan palauttaa transfektoimalla p120ctn-1A (si-p120 + 1A). Kuitenkin sykliini D1 ilmentyminen ei ollut palautettu kotransfektoimalla p120ctn-1A ja siRNA -β-kateniinin (si-p120 + 1A + si-β-kissa), mikä viittaa siihen, että p120ctn-1A sääteli sykliini D1 kautta β-kateniinin. Transfektio p120ctn-3A soluissa tyhjentynyt p120ctn (si-p120 + 3A) ei säätää ylös aktiivinen β-kateniinin tasoilla, mutta voi silti merkittävästi palauttaa sykliini D1 ilmentyminen, mikä tarkoittaa, että p120ctn-3 up-säätelee ilmentymistä sykliini D1 riippumattomien ja β-kateniinin. Lisäksi, kun p120ctn-3A oli kotransfektoitiin A549-solut köyhdytetty sekä p120ctn ja β-kateniinin (si-p120 + 3A + si-β-cat), sykliini D1-ekspressio oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna ryhmän tyhjentynyt p120ctn ja β-kateniinin ilman restituting p120ctn-3A (si-p120 + si-β-kissa); toteaa, ei muutosta aktiivisen β-kateniinin tason havaittiin p120ctn ja β-kateniinin dual köyhdytettyä soluissa, huolimatta niiden ilmeinen palauttamista p120ctn-3A (si-p120 + 3A + si-β-kissa). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kokeissa suoritettiin SPC-soluissa (kuvio 5). Kaksi mielenkiintoista havaintoja havaittu tutkimuksessamme. 1). Vaikutus p120ctn-1A sykliini D1 ilmentyminen vaikutti olevan näkyvämpi kuin p120ctn-3A, koska ilmaus sykliini D1 aiheuttama palauttamista p120ctn-3A oli aina alhaisempi kuin aiheuttama palauttamista p120ctn-1A tai jopa pienempi kuin käsittelemättömät solut; 2). Palauttaminen sykliini D1 aiheuttama palauttamista p120ctn-3A soluissa köyhdytetyn sekä p120ctn ja β-kateniinin (si-p120ctn + 3A + si-β-kissa) näytti olevan puutteellinen verrattuna soluihin tyhjentynyt p120ctn yksinään ( si-p120 + 3A). Ero näiden kahden ryhmän saattavat selittyä endogeeninen β-kateniinin jälkimmäisessä, joka tukahdutti synergistisesti siRNA-β-kateniinin entisen.

ilmentyminen aktiivisen β-kateniinin ja sykliini D1 oli merkitsevästi pienempi A549-soluja (β-kateniinin, +

p

0,001, ++

p

0,001, sykliini D1, +

p

= 0,003, + +

p

= 0,004), kun β-kateniinin tai p120ctn oli häirinnyt (si-β-kissan tai si-p120). Ilmaisu aktiivisen β-kateniinin (*

p

= 0,001) ja sykliini D1 (*

p

0,001) piristyi kun p120ctn-1A ilmentyminen entistää p120ctn-1A cDNA transfektio ( si-p120 + 1A). Kotransfektion p120ctn-1A ja siRNA kohdistaminen β-kateniinin (si-p120 + 1A + si-β-cat) ei osoittanut mitään muutosta sykliini D1 (

Δ

p

= 0,248) ilmentymistä, viittaa siihen, että p120ctn-1A up-regulation sykliini D1 kautta β-kateniinin. Palauttaminen p120ctn-3A (si-p120 + 3A) ei lisännyt ilmentymistä aktiivisen β-kateniinin (**

p

= 0,891), mutta voi silti palauttaa ilmaus sykliini D1 (**

p

= 0,001), mikä tarkoittaa, että p120ctn-3 up-regulation ilmentymistä sykliini D1 riippumaton β-kateniinin. Kotransfektoimalla p120ctn-3A ja siRNA: t kohdistaminen p120ctn /β-kateniinin (si-p120 + 3A + si-β-kissa) voisi lisätä merkittävästi sykliini D1 ilmentyminen A549 solulinjassa verrattuna ryhmään p120ctn /β-kateniinin siRNA transfektio yksin (si-p120 + si-β-kissa,

ΔΔ

p

0,01), kun taas, kotransfektoimalla p120ctn-3A ei näytä olevan vaikutusta tasoilla aktiivisen β kateniinin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin SPC-soluissa. Huomaa, vaikka sykliini D1 ilmentyminen palautuu palauttamista joko p120ctn 1A tai p120ctn 3A, pelastus vaikutus on merkittävämpi by p120ctn 1A kuin p120ctn 3A. Ero ryhmän si-p120 + 3A ja ryhmä Si-p120 + 3A + si-β-kissa voidaan selittää vaikutuksena haima β-kateniinin entisessä. Tämä vaikutus haima β-kateniinin voidaan myös nähdä, että erotus si-p120 ja si-p120 + si-β-cat molemmissa solulinjoissa. Synergistinen vaikutus, tuloksena ylimääräisiä väheneminen sekä β-kateniinin ja sykliini D1 näkyy jälkimmäiseen ryhmään.

β-kateniinin jakelun A549 ja SPC-solujen havaittiin sekä tumassa ja sytoplasmassa alle konfokaali laser mikroskoopilla. Sen signaali tuli huomattavasti heikompaa vastaava subsellulaarisia vyöhykkeiden p120ctn oli tyhjentynyt. Yli-ilmentymisen p120ctn-1A johti voimakkaamman β-kateniinin signaali. Sen sijaan, p120ctn-3A ei ole merkittävää vaikutusta ekspression β-kateniinin (kuvio S6).

edelleen testata toiminnon näiden kahden isoformien, transfektoimme kaksi deleetiomutanttien p120ctn-1, M1 ja M2 , että p120ctn köyhdytettyä A549 (kuvio 6). Tulokset osoittivat, että M1 voivat säätää ylös β-kateniinin, mutta M2 ei, mikä tarkoittaa, että N-56-101 aminohappotähdettä p120ctn-1 ovat välttämättömiä säätelystä β-kateniinin. Näin ollen, se voi johtua poistetaan N-56-101 aminohappotähteiden p120ctn-3 epäonnistua säädellä tason β-kateniinin proteiinia.

kaksi deleetiomutanttien p120ctn-1, M1 ja M2 transfektoitiin p120ctn köyhdytettyä A549-soluja. Tulokset osoittivat, että M1 voi säätää ylös β-kateniinin (***

p

0,001), kun taas M2 voinut (****

p

= 0,175). M1 voisi ajan säätelemään sykliini D1 (***

p

0,001), mutta M2 ei voinut (****

p

= 0,906). Näin ollen, se voi johtua poistetaan N-56-101 aminohappotähteiden p120ctn-3 ei pysty säätelemään β-kateniinin. Kaikki vertailut tehdään ryhmään solujen kotransfektoitiin pelkällä vektorilla.

p120ctn isoformi 3 voi säätää ylös sykliini D1 ilmentyminen säätelemällä ydin- /sytoplasmisen shuttle Kaiso

Sen testaamiseksi, Kaiso on säätelijänä ilmentymisen sykliini D1, me transfektoitiin lyhytaikaisesti Kaiso A549-solut, jotka ilmentävät vain vähäinen määrä Kaiso. Kaiso yliekspressio vähentänyt sykliini D1 ja sykliini E ilmaisu (kuvio 7A ja kuvio S7A). Vastaavasti Kaiso pudotettiin siRNA, siellä tehostui sykliini D1 ja sykliini E ilmaisun SPC soluissa, jotka ilmentävät suhteellisen korkeita Kaiso (kuvio 7B ja kuvio S7b).

(A) Western blot analyysit osoittavat lisääntyneen ilmentymisen Kaiso A549-soluissa, jotka on transfektoitu Kaiso cDNA. Kaiso yli-ilmentyminen huomattavan alassäädetty ilmentymistä sykliini D1 (p = 0,000) ja sykliini E (p = 0,003). (B) Western blot analyysit osoittavat alennettu ilmentyminen Kaiso SPC transfektoiduissa soluissa Kaiso siRNA. Kaiso häiriöitä merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen sykliini D1 (p = 0,001), ja sykliini E (p = 0,012). Yleiset havainnot viittaavat siihen, että Kaiso voisi säätelemään sykliini D1 ja sykliini E (C) Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys vahvisti Kaiso monoklonaalinen vasta-aine voi saostua sykliini D1-geenin promoottorin fragmentti, joka sisälsi KBS. Kaiso voisi sitoutua KBS sykliini D1-promoottorin. Kaikki vertailut tehdään ryhmään soluja, jotka on transfektoitu pelkällä vektorilla.

Käyttämällä BLAST- löytääkseen sykliini D1-promoottorin sekvenssi (GenBank: AY439218.1), olemme tunnistaneet tiettyjä Kaiso sitovan sekvenssin (KBS , TCCTGCNA), joka sijaitsee alueella -1059 bp -1066 bp. Siru määritys oli suoritettiin sitten ja osoittaneet, että Kaiso liittyi KBS on sykliini D1-promoottorin sekä A549 ja SPC-soluja (kuvio 7C).

Co-immunosaostus suoritettiin seuraavasti solufraktioinnin. Analyysit paljastivat, että p120ctn monoklonaalinen vasta-aine voi tehokkaasti saostua Kaiso proteiinin sekä sytoplasmassa ja tumassa, kun taas erityisiä p120ctn-1, 2 monoklonaaliset vasta-aineet (6H11) ei pystynyt tekemään niin (kuvio 8A ja B). Kun toistuva samanaikainen immunosaostus sen jälkeen, kun yli-ilmentyminen p120ctn isoformien 1 ja 3, vastaavasti, on osoitettu, että yli-ilmentyminen p120ctn-3A johtanut yhä Kaiso proteiinia saostettiin p120ctn monoklonaalinen vasta-aine, mutta ei ollut muutosta sen jälkeen, kun yli-ilmentymisen p120ctn-1A kontrolliin verrattuna. Kun erityiset p120ctn-1, 2 monoklonaaliset vasta-aineet (6H11) käytettiin, Kaiso ei myöskään voitaisi saostui p120ctn-1A kasvoi merkittävästi (kuvio 8C). Koska on olemassa pääasiassa p120ctn isoformin 1 ja 3 sekä keuhkosyöpä solulinjat, olemme sitä mieltä, että Kaiso voi sitoutua p120ctn isoformin 3, mutta ei p120ctn isoformin 1 in vivo kun edellä mainitut tulokset.

(A ja B) Co-immunopresipitaatiomäärityksiä osoittivat, että p120ctn monoklonaalinen vasta-aine (alempi paneeli vasemmassa sarakkeessa kuviossa 8A), mutta ei erityisiä p120ctn 1,2 monoklonaalinen vasta-aine (6H11) (alempi paneeli oikealla palstalla kuvio 8A), voidaan tehokkaasti saostaa Kaiso proteiinia sekä tumassa ja sytoplasmassa (kuvio 8B). Kuitenkin Kaiso monoklonaalinen vasta-aine voi tehokkaasti saostaa p120ctn (ylähavaksessa keskimmäinen sarake kuvassa 8A). (C) Co-immunosaostus riittävän p120ctn mAb jälkeen yli-ilmentymisen p120ctn-1 tai 3 isoformin osoitti, että yli-ilmentyminen p120ctn-3 johti enemmän Kaiso proteiinia saostuu A549-soluja. Mitään muutosta ei havaittu, kun p120ctn isoformin 1 oli yli-ilmentynyt, verrattuna kontrolliin. Erityiset p120ctn-1, 2 monoklonaaliset vasta-aineet (6H11) ei saostu Kaiso kun p120ctn isoformin 1 oli merkittävästi lisääntynyt. Huomautus läsnäolo p120ctn jälkeen coprecipitation kanssa 6H11, mutta ilman Kaiso sakkana, mikä viittaa siihen, ei ole merkittävää vuorovaikutusta p120 isoformia 1, 2 ja Kaiso. Koska on olemassa pääasiassa p120ctn isoformit 1 ja 3 sekä keuhkosyöpä solulinjat, olemme sitä mieltä, että Kaiso voi sitoutua p120ctn isoformin 3, mutta ei p120ctn isoformin 1 in vivo.

Kaiso on pääasiassa paikallisia sytoplasmassa SPC soluja, jotka ilmentävät suhteellisen korkeita p120ctn. Sen sijaan lähes kaikki Kaiso proteiinit ovat läsnä ydin- jakelun SPC-K2 soluihin, jotka ovat p120ctn köyhdytettyä. Erilaisia ​​vaikutuksia kahdessa p120ctn isoformia on Kaiso solunosasijaintia tutkittiin seuraavia palauttamista kaksi isoformia vastaavasti SPC-K2 soluihin. Palauttaminen p120ctn isoformin 3 transfektoimalla p120ctn-3A aiheuttama Kaiso n sytoplasminen jakautuminen, kun taas Kaiso pysyi olennaisesti ytimet SPC-K2 soluihin p120ctn isoformin 1 palautettiin transfektoimalla p120ctn-1A (Kuva S8A). Vastaavasti, Kaiso on pääasiassa paikallisia ytimet A549-solut, jotka ilmentävät vain vähäinen määrä p120ctn. Yliekspressio p120ctn-1A ei merkittävästi muuttanut jakelu Kaiso, kun taas yli-ilmentyminen p120ctn-3A johti Kaiso tumasta (kuvio S8B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että korkean tason p120ctn-3A ehkä edistää tumasta Kaiso, mutta p120ctn-1A ei näytä olevan tämän toiminnon.

Lisäksi, kun A549-soluja oli transfektoitu p120ctn-3A inkuboitiin LMB estää tumasta p120ctn isoformin 3, Kaiso todettiin syytä rajoittaa tumassa yhdessä p120ctn isoformin 3. Vastaavasti yliekspressio p120ctn-3A transfektoimalla NLS-p120ctn-3A p120ctn-3A ydin- tavoite lokalisointi plasmidi, osaksi SPC-K2-soluissa johti jakautuminen Kaiso pääasiassa tumassa (kuvio S8B).

edelleen vahvisti sytoplasminen ja ydinvoiman jakelu p120ctn ja Kaiso Western-blottauksella jälkeen solufraktioinnin (kuvio 9A ). Tulokset olivat samankaltaiset kuin vuonna Immunofluoresenssikokeisiin kokeissa kuvatulla tavalla.

(A) transfektio p120ctn-3A A549-soluissa lisäsi merkittävästi Kaiso sytoplasmassa (cyto, *, p = 0,000) ja vähensi Kaiso vuonna nucleus (NE, *, p = 0,000). Ei kuitenkaan ole merkittäviä ero solunosasijaintia Kaiso välillä havaittiin p120ctn-1A yli-ilmentymisen solujen ja kontrollisolujen (cyto, **, p = 0,135, NE, **, p = 0,774). Nämä tulokset viittaavat siihen, että korkean tason p120ctn-3A ehkä edistää tumasta Kaiso, mutta p120ctn-1A ei näytä olevan tämän toiminnon. Inkubointi transfektoiduissa soluissa p120ctn-3A kanssa LMB tai transfektoimalla NLS-p120ctn-3A A549-solujen määrä nousi ydinvoiman p120ctn-3A (*, p = 0,000, tai +, p = 0,000) ja ydinvoiman Kaiso (NE, +, p = 0,000 tai ++, p 0,001), mutta alensi sytoplasminen Kaiso (cyto, +, p = 0,000 tai ++, p = 0,002) verrattuna soluihin vain yli-ilmentynyt p120ctn-3A, mikä tarkoittaa, että tumasta Kaiso on todennäköisesti p120ctn-3-riippuvainen. (B) p120ctn-1A yliekspressio ei muutu sitoutumisen Kaiso KBS sen sykliini D1-promoottori, kun taas p120ctn-3A yliekspressio vähensi sitoutumisen Kaiso KBS sen sykliini D1-promoottori.

muutamia mielenkiintoisia tuloksia havaittiin myöhemmin ChIP määrityksissä. Yliekspressio p120ctn-3A vähensi sitoutumisen Kaiso KBS, kun taas yli-ilmentyminen p120ctn-1A ei muuta sitoutumiseen (kuvio 9B).

Yhteenvetona edellä havainnot viittaavat siihen, että p120ctn-3A todennäköisesti ylä- säädellä sykliini D1 helpottamalla tumasta Kaiso, ja siten, poistamalla negatiivinen vaikutus Kaiso on sykliini D1 geenin ilmentymisen.

keskustelu

osoittaneet, että ehtyminen p120ctn A549 ja SPC soluja, joissa ei ole kalvomainen p120ctn lokalisointi, lisännyt solujen G1 vaiheessa ja laski solujen S-vaiheen sekä vähennetään solujen lisääntymistä, mikä viittaa p120ctn voi vaikuttaa solusyklin etenemisen ja solujen lisääntymistä. Koska alennettu ilmentyminen sykliini D1 ja sykliini E havaittiin p120ctn köyhdytetyn solut, ajateltiin, että p120ctn voi säädellä solusyklin etenemisen ja solujen lisääntymistä muuttamalla ilmentymä sykliini D1 ja sykliini E, olennaiset modulaattorit G0 /G1-S tarkastuspiste [13]. Nicolas T. et ai. kertoi, että p120ctn isoformi 3 voi vaikuttaa solusyklin ja solujen lisääntymistä stabiloimalla sykliini E [4]. Sen sijaan meidän tiedot viittaavat eri mekanismilla se, että lisääntyneen ilmentymisen sykliini E vastasi up-regulation of sykliini D1 soluissa tyhjentynyt p120ctn mutta täynnä joko p120ctn-1A tai 3A. Lisäksi, kun tippuu alas sykliini D1 siRNA soluissa tyhjentynyt p120ctn ekspressio sykliini E ei kasvanut, mutta väheni hieman, vaikka p120ctn isoformi 1 tai 3 ilmeisesti palautettiin kotransfektoimalla joko isoformin DNA-plasmidi. Sama ilmiö havaittiin, kun sykliini D1 on estetty monoklonaalinen vasta-aine inkuboimalla (100 ng /ml, 48 h) p120ctn rekonstruoitu soluissa, mikä on keskeinen asema sykliini D1 säätelyssä sykliini E ilmentymisen joko p120ctn isoformi 1 tai isoformi 3. Lisäksi kun käännös sykliini D1 mRNA A549 keskeytyi siRNA, sekä transkriptio ja proteiini tasoilla sykliini E olivat vastaavasti alassäädetty, mikä viittaa p120ctn ehkä ei vain vakauttaa sykliini E-proteiinia, kuten aiemmin on raportoitu, mutta myös edistää transkription sykliini E, oletettavasti kautta parannettu ilmaus sykliini D1.

tiedot tässä tutkimuksessa osoittanut sekä p120ctn isoformia 1 ja 3 voivat säätää ylös sykliini D1 ilmentyminen, vaikka se ei ole täysin selvitetty, miten eri p120ctn isomuotojen, erityisesti isoformi 3 , saavuttaa tätä toimintoa. Tutkimuksemme osoittivat, että p120ctn isoformi 1 voisi ajan säätelemään β-kateniinin, erityisesti lisäämällä aktiivisen muodon β-kateniinin, kun isoformin 3 voi vuorovaikutuksessa Kaiso. Vaikka p120ctn isoformi 1 yliekspressoitiin A549-soluja, jotka on transfektoitu p120ctn-1A p120ctn-1 /Kaiso kompleksi jäi havaitsematta, mikä on alhainen p120ctn isoformin 1 A549 ei ole syynä tähän havaita proteiinin kompleksi. Siten kysymyksiä on esitetty, miksi isoformin 1 ei vuorovaikutuksessa Kaiso ja miksi isoformin 3 voinut säätää ylös β-kateniinin. Oletimme, että toiminnallinen ero saattaa johtua rakenteellisten muunnelmia näistä kaksi isoformia N-päähän. Ihmisen CTNND1 geeni käsittää 21 eksonia ja koodaa mahdollisesti jopa 48 proteiini-isoformit johtuu useista vaihtoehtoisia välisiä ja eksoni silmukointitapahtumilla [14]. Ihmisen isoformien nimetty 1-4, eroavat toisistaan ​​aloituskodonin käytetty. Useita verkkotunnuksia on tunnistettu p120ctn, mukaan lukien kiertynyt kierre domeeni löytyy vain isoformin 1. Itse asiassa, p120ctn isoformi 1 on pidempi kuin p120ctn isoformin 3 101 aminohappotähdettä N-terminaalissa [14] – [15]. Jotta voitaisiin vastata kahteen kysymykseen edellä, rakensimme kaksi mutantteja p120ctn isoformin 1 typistetyn peptidisekvenssejä N-päässä (M1, M2).

Tuloksemme viittaavat siihen, että yhtäältä poistamista N-terminaalinen 56-101 (N-56-101) aminohappotähteiden p120ctn isoformin 3 mahdollisesti selittää sen puute sääntelyn vaikutus β-kateniinin, kun taas p120ctn isoformin 1, jossa on ehjä N-terminaalinen domeeni, osoitti positiivisen sääntelyn vaikutus (kuvio 6); toiseksi on olemassa N-1-55 aminohappotähdettä, jotka muodostavat kiertynyt kierre verkkotunnuksen, in p120ctn isoformin 1 voi vallitsevasti estää sitä sitoutumasta Kaiso (kuvio S9), mutta N-56-101 aminohappotähteet voivat olla vähäinen rooli niiden vuorovaikutuksessa.

nykyisessä tutkimuksessa osoitimme lisääntynyt aktiivista muotoa β-kateniinin ilman muutosta tran- soluissa yliekspressioon p120ctn isoformin 1A. Toteamus on yhtäpitävä sen kanssa, mitä on aiemmin kuvattu kirjallisuudessa. On raportoitu, että in vivo olosuhteissa, p120ctn isoformi 1 suoraan tai epäsuorasti vuorovaikutuksessa joitakin keskeisiä proteiinien tiedetään säätelevän β-kateniinin vakauden kuten ak- siini ja GSK-3, lisäksi se jakaa β-kateniinin sama sääntelymekanismeja metabolinen vakaus [16]. Yliekspressio p120ctn isomuodon 1 voivat olla enemmän sitoutumiskohdat tuhoaminen-komplekseja, jotka sisältävät ak- siini ja GSK-3β, ja sen seurauksena, aiheuttaa hajoaminen vähenee β-kateniinin korvaamalla sen hävittämisestä-komplekseja. Sitoutumiskohtien p120ctn GSK-3β ja CK1α sijaitsevat N-terminaalinen domeeni p120ctn, ja siten myös p120ctn isoformi 1-proteiinia, jolla on täydellinen N-terminaalinen domeeni, joutuisi sääntelyä destruction- monimutkaisia ​​[16]. Havainnot tässä tutkimuksessa viittaa siihen, että enemmän tietyn toimialueen, nimenomaan N-56-101 aminohappotähdettä, voi olla osallisena hajoamista p120ctn isoformin 1. Sen lisäksi, p120ctn-1 M1 on rakennettu tässä tutkimuksessa on rakenteellisesti sama kuin p120ctn isoformia 2 ja osoitti myös säätely ylöspäin β-kateniinin (kuvio 6), mikä viittaa siihen, että p120ctn isoformi 2 voi myös yhdistää GSK-3β ja CK1α ja säädellä hävittämisestä-kompleksin.

kiertynyt kierre domain