Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelisolujen reaktiota stressiin liittyy signaalien välillä vierekkäisiä soluja, jotka voidaan visualisoida kalsiumia aalto. Joissakin solutyypeissä, tämä aalto on riippuvainen vapautumisen solunulkoisen trinucleotides peräisin vaurioituneiden solujen. Erityisesti solunulkoisen ATP on raportoitu olevan kriittinen epiteelisolujen reaktiota stressiin ja on äskettäin osoitettu olevan yliaktiivista kasvaimet

in vivo

.

Menetelmät /Principal Havainnot

Täällä tunnistamme stanniocalcin-1 (STC1), eritetty pleiotrooppisia proteiinia, kuten kriittinen välittäjänä kalsiumin aallon etenemisnopeus yksikerrosviljelmiin keuhkojen (A549) ja eturauhasen (PC3) epiteelisoluja. Lisääminen STC1 tehostetun ja estää STC1 vähensi kulkema matka solunulkoinen ATP-riippuvaisten kalsiumia aalto. Samat vaikutukset havaittiin, kun kalsium stimuloitiin lisäämällä eksogeenistä ATP. Me paljastaa positiivista palautetta silmukka, jossa STC1 edistää vapautumista ATP soluista

in vitro

ja

in vivo

.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset osoittivat, että STC1 on tärkeä rooli varhaisessa vastauksena mekaanisia vaurioita epiteelisolujen moduloimalla signalointi solunulkoisen ATP: tä. Tämä on ensimmäinen raportti kuvata STC1 kuin muuntimen tai purinerginen reseptorin signalointi.

Citation: Block GJ, DiMattia GD, Prockop DJ (2010) Stanniocalcin-1 säätelee Solunulkoisilla ATP-indusoitu Kalsium Waves in Human epiteelisyöpäsolujen stimuloimalla ATP vapautuminen Bystander Cells. PLoS ONE 5 (4): e10237. doi: 10,1371 /journal.pone.0010237

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 16 joulukuu 2009; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2010; Julkaistu: 20 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Block et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana NIH avustukset P40 RR 17447 ja P01 HL 075161. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Stanniocalcin-1 (STC1) on 247 aminohapon proteiini, jota erittyy soluista kuin glykosyloitu homodimeeri. STC1 kuvattiin alun perin hormonitoimintaa säätelijänä kalsiumin ja fosfaatin homeostaasin kaloissa [1], [2]. Selkärankaisilla, STC1 voi säädellä mineraaliaineenvaihduntahäiriöt [3] kautta modulaatio fosfaatin resorprtion munuaisen [4] ja suolistossa [5]. STC1 myös osallisena irtoamisen oksidatiivisen fosforylaation [6], estämällä syöjäsolujen

in vitro

[7] ja

in vivo

[8], ehkäisy verisuonen permeablization [9], ja sekä pro- ja anti-apoptoottiset vaikutukset [10], [11], [12]. Tähän mennessä mekanismi, jolla STC1 kykenee sen dalmatialaistäpläisiä ei ole vahvistettu. Viime aikoina on tullut selväksi, että STC1 on stressi reagoiva tekijä (Chang et al., 2003), viimeaikaiseen havaintojen että STC1 transkripti nopeasti sääteli seuraavat vahingollista signaalit [10], [13], [14] .

rooli STC1 kalsiumin homeostaasin ja kudosvaurioiden ehdottaa se voi olla osallisena kalsiumin liikkumista ja signalointi, jotka käynnistyvät erilaisia ​​mekaanisia ja muut rasitukset soluihin. Esimerkiksi korjaus epiteeliyksikerroksilla seuraava mekaaninen rikkominen on riippuvainen solujen välisen kalsiumin aalto lisätyistä sivuston häiriötä viereisten solujen [15], [16], [17], [18], [19]. Eteneminen kalsium- aalto on annettu joko kuilu-risteykseen välittämää siirtoa kalsium- tai alhaisen molekyylipainon toisiolähettejä tai vapauttamaan solunsisäisen nukleotidia vaurioituneiden solujen, jotka sitten sitoutuvat reseptoreihin naapurisoluja [20], [ ,,,0],21], [22]. Useat raportit osoittivat, että ekstrasellulaarinen Adenosiinitrifosfaatti (ATP) edistetään korjaus on häirinnyt kulttuureissa stimuloimalla muuttoliike ja leviämisen epiteelisolujen [15], [18]. Viime aikoina kohonnut solunulkoisen ATP visualisoitiin kehittää kasvaimia

in vivo

, ja se voi myötävaikuttaa syöpään solujen eloonjäämistä. [23]

Extracellular nukleotidin moduloida solunsisäisen kalsiumin sitoutumalla perheen reseptorien kutsutaan P2 purinergisille reseptoreihin, joista kukin on eri affiniteetti tiettyä nukleotidia. On olemassa kaksi alaluokkia P2-reseptorin: P2X trimeerisen ionikanavien ja P2Y G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t). Sitoutumaan P2X-reseptorin johtaa konformaatiomuutoksen kanava, joka mahdollistaa kalsiumin ja muiden ionien, kun taas P2Y on G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori, joka käyttää energiaa GTP-hydrolyysin fosfory- fosfolipaasi C (PLC) ligandin sitoutumisen jälkeen . PLC voi sitten lohkaista lipidejä, fosfatidyyli 4,5-bifosfaatin (PIP2), osaksi inositoli 1,4,5-trisfosfaattia (IP3) ja diasyyliglyserolin (DAG). IP3 sitoutuu erityisiä kalsiumionin kanavia Endoplasmakalvosto vapauttamaan kalsiumia sytosoliin. Niistä 12 P2Y reseptorit, vain P2Y

2 on osoitettu sekä sitoa ATP ja pari kanssa G

q G-proteiinin alayksikön aloittaa kalsiumin vapautuminen solunsisäisten myymälöissä [24].

tässä osoitamme, että esikäsittely epiteelisolujen yksikerrosviljelmässä kanssa STC1 paranee dramaattisesti kalsium aallon etenemisnopeus mekaaniset häiriöt kulttuureissa. Sama parannus nähtiin, kun soluja esikäsiteltiin STC1 ja altistettiin eksogeeniselle ATP. Tulosten mukaan STC1 herkistyneet solut ATP ylävirtaan PLC, ja että estämällä endogeenisen STC1 käyttäen neutraloiva vasta-aine inhiboi etenemistä kalsiumin aallon. Tämä työ tarjoaa ensimmäisen todisteita siitä, että STC1 voivat moduloida varhaisessa signalointi tapahtuman jälkeen mekaanisia vaurioita, ja implicates STC1 säätelijänä purinerginen reseptorin signalointi.

Tulokset

STC1 Tehostettu Kalsium aalto lisääminen jälkeen Mekaaninen stimulointi A549 Cells

vaikutuksen tutkimiseksi STC1 vahinkoa aiheuttama kalsiumin modulaatio, konfluentteja yksikerrokset keuhkon epiteelisolujen (A549) oli mekaanisesti stimuloidaan aloittaa kalsiumin aalto. Aallon etenemisnopeus visualisoitiin esi-inkuboimalla yksikerroksinen, jossa läpäisevä membraani väriaine, joka fluoresoi, kun sitovan kalsiumin (Fluo-4).

kuviossa 1A (Elokuva S1 ja S2) on esitetty edustavat kuvat etenemisen kalsium aalto peräisin kaapia sivustosta viereisiin soluihin yli 30 sekuntia. Etäisyys kvantifioitiin mittaamalla etäisyys leikkaus päällä ja etureunan kalsiumin aallon kunakin ajankohtana. Esikäsittely yksittäis- kerroksissa STC1 johti 4-kertainen kalsiumia aalto lisääminen 40 sekunnin jälkeinen raaputtaa (kuvio 1 B), joka edelleen levittää ohi 40 s aikapisteen (Elokuva S2). Sen testaamiseksi, vaikutus oli solutyyppispesifisiä, me toisti nämä tutkimukset Eturauhassyöpätutkimuksessa solulinja (PC3; Elokuva S3, S4). STC1 myös parannettu kalsiumin aallon etenemisen PC3-soluissa.

A) Yhtenäiset A549 yksisolukerrokset leimattiin Fluo-4 ja esi-inkuboitiin tai ilman 500 ng /ml STC1 10 min ennen mekaanista häiriötä. On esitetty kuvia saatu -1, 0, 10, 20 ja 30 s jälkeiset häiriöitä. Kuvat kustakin ryhmästä manipuloitu yhtä käyttämällä kynnysarvoa toimintoa Adobe Photoshop, jotta väärän värin aallon selvyyden (punainen). Nuoli osoittaa kärjessä aalto. B) Mean kulkema kalsium aalto ajan hallinnassa ja STC1 hoitoryhmien välillä A. Virhepalkkien = SD. * = P 0,05. n = 5 elokuvia. C) keskimääräinen suurin etäisyys saavutetaan kalsiumin aallon tai ilman esikäsittelyä 500 ng /ml STC2. NS = Ei merkittävä. n = 3.

tutkimme seuraavaksi STC2, ainoa jäsen stanniocalcin perheen proteiinien [25], voisi vaikuttaa kalsium aallon etenemiseen samoissa olosuhteissa. STC2 ei vaikuttanut kalsiumin aalto (kuvio 1 C).

Kalsium Wave eteneminen oli riippumaton aukkoliitokset mutta Riippuu Solunulkoisilla ATP

Kalsium aallon etenemisnopeus vierekkäisten solujen on aiemmin katsottu johtuvan pienimolekyylinen siirto aukkoliitos solujen välisen viestinnän (GJIC) [20], [26]. Sen tutkimiseksi, onko GJIC oli vastuussa kalsiumin aallon etenemisnopeus, A549 monokerrosten esikäsiteltiin 10, 25, tai 50 uM glykyrretiinihapon (GA), joka on tunnettu estäjä konneksiini-välitteisen GJIC [27]. Eteneminen kalsium- aalto ei ollut vaikutusta, mikä osoittaa, että kalsium vastaus oli riippumaton GJIC (kuva S1).

Toiset ovat raportoineet, että kalsium aallon etenemisnopeus oli riippuvainen vapautuminen ATP vaurioituneiden solujen solunulkoiseen ympäristöön [18], [28]. Sen vahvistamiseksi, että vaurioituneet solut vapautetaan ATP, monokerrosten kaavittiin pipetillä kärjen ja elatusaine mitattiin ATP sisältöä. Esikäsitelty väliaine sisälsi 400-kertaisesti enemmän ATP kuin elatusainetta soluista, joita ei ollut loukkaantunut (kuvio 2A). Vahvistamaan, että A549-solut pystyivät vastaamaan ATP aloittamalla kalsiumvasteeseen, Fluo-4 leimattu monokerrokset hoidettiin ATP ja määritettiin elävien solujen fluoresenssimikroskopialla. ATP hoito nopeasti lisääntynyt keskimääräinen pikseli-intensiteetti mitattiin kiinnostavan alueen (kuvio 2B). Sen tutkimiseksi, onko ATP vapautuu kaavitaan soluja oli vastuussa kalsiumin vasteen elinkelpoisten solujen, media poistettiin A549 monokerrokset ja korvattiin PBS: llä. Yksikerroksiset jätettiin rauhaan tuottamaan ”Ei Vahinko” kunnostettua alustaa, tai loukkaantuneiden kaapimalla tuottamaan henkilövahinkojen ”kunnostetun alustan. Ei Vahinko ja Vahinko elatusaine sitten asetettiin tuore Fluo-4 leimattuja A549-soluja ja kalsium vaste mitattiin fluoresenssimikroskopialla. Vahinko väliaine indusoi vankempi kalsiumvasteeseen kuin No Injury ohjaus (kuvio 3A; kaksi ensimmäistä riviä). Esikäsittely Injury kunnostetun alustan entsyymillä, joka hydrolysoi trinucleotides mononukleotideiksi (250 mU /ml apyraasia) kokonaan poisti kalsiumin vastaus. Samat tiedot saatiin mittaamalla kalsiumin vasteen yksittäisissä soluissa. Jälleen esikäsittely Injury kunnostetun alustan kanssa apyraasia poisti kalsium vaste (kuvio 3B). Vahinko kunnostettu alusta lisäsi myös enimmäiskalsiumpitoisuutta vastaus suhteessa No vamman valvonnan erikseen mitattu soluissa, joka lakkautettiin esikäsittelemällä apyraasia (kuvio 3C).

A) Keskimääräinen ATP pitoisuus vakioitua elatusainetta ohjaus tai mekaanisesti kannustanut A549 yksikerroksia. RLU, suhteellinen lusiferaasi yksikköä. Error Bars = SD. * = P 0,05. n = 3. B) ATP: tä (50 uM) lisättiin yksistään yhtenäisiksi Fluo-4 leimattua A549-solut (pystysuora viiva). Kalsium vaste mitattiin fluoresenssimikroskopialla. n = 4 elokuvia.

A) elatusainetta elinkelpoinen (nro Injury), mekaanisesti häiritsi (Injury) tai mekaanisesti hajotettu lysaattia käsiteltiin 250 mU /ml apyraasia 10 min. (Injury + apyraasia) asetettiin konfluentti kerros Fluo-4 leimattuja A549-solut. Vasen sarake: Ennen lisäys kunnostettua alustaa. Oikea sarake: 10 s hoidon jälkeen kunnostetun alustan. Suurennos = 4 ×. Inset kunkin: Pixel intensiteetti profiilin koko näkökentän. Inset kuvia kunkin hoitoryhmän manipuloitin yhtä käyttämällä kynnysarvoa toimintoa Adobe Photoshop, jotta väärän värin huiput selvyyden (punainen). n = 3 elokuvia. B) Kalsium vaste 10 yksittäisten solujen lisäämisen jälkeen Vamma tai vamma + apyraasia (250 mU /ml 10 min) käsiteltiin kunnostettu alusta. Musta Nuoli: lisäys kunnostettua alustaa. Red Arrow: tausta intensiteetti mittaus. C) Keskimääräinen enimmäisintensiteetti yksittäisten solujen lisäämisen jälkeen Ei loukkaantumisen tai vamma + apyraasia kunnostettu alusta. * = P 0,05; n = 30.

STC1 Tehostettu ATP aiheuttama Kalsium Response

Sen tutkimiseksi, STC1 vaikutti ATP-indusoidun kalsiumin vastaus, Fluo-4 leimattu A549 yksikerroksia esikäsiteltiin 500 ng /ml STC1 10 minuuttia ja stimuloitiin sitten 50 uM ATP: tä. Kalsium vaste mitattiin sitten fluoresenssimikroskoopilla. STC1 parannettu keskimääräinen fluoresenssi määritellyn alueen kiinnostavia yli 2-kertainen (kuvio 4A). Vahvistavan meidän mikroskopia tuloksia, me määrällisesti Kalsiumvasteen käyttäen fluoresenssispektroskopiaa, joka antoi meille mahdollisuuden testata laajempaa pitoisuuksia ATP ja STC1. A549-soluja esi-inkuboitiin 0, 50, 250 tai 500 ng STC1 10 minuuttia. Seuraavat 4 sekunnin perustason käsittelyssä, ATP injektoitiin automaattisesti kuoppiin loppupitoisuuteen 0,5, 2, 10, ja 50 uM. STC1 lisääntynyt kalsiumin vasteen annoksesta riippuvaisella tavalla; kuitenkin, suuremmilla annoksilla ATP, STC1 tarvittiin korkeammissa konsentraatioissa olla tehostava vaikutus. Tiedot näytetään keskimääräisenä päätepiste kalsiumin vaste (kuvio 4B) sekä jatkuva määritys ulottuu 30 s (kuvio 4C).

A) keskimääräinen kalsium vaste Fluo-4 leimattu konfluentteja yksikerrokset A549-solut analysoitiin elävien solujen mikroskopia lisäämisen jälkeen 50 uM ATP: tä ohjaamaan (ATP) tai yksisolukerrosten esikäsitelty 500 ng /ml STC1 10 min (ATP + STC1). Virhepalkkeja = SD. * = P 0,05. n = 3 elokuvia. B) keskimääräinen kalsium vaste Fluo-4 leimattu A549 yksisolukerrokset analysoitiin fluoresenssispektroskopia lisäyksen jälkeen eri konsentraatioiden ATP ja STC1. Tiedot näytetään keskimääräinen signaalin intensiteettiä 25 s lisäämisen jälkeen ATP. Virhepalkkeja = SD. * = P 0,05. n = 4 kussakin kunnossa. C) Jatkuva määritykset B). n = 3 B, C D) mittaus yksittäisten solujen A paljasti pitkittyneen kalsium heilahtelut STC1 esikäsitelty näytteissä.

Olemme huomanneet, että ATP aiheuttama kalsiumin heilahtelut pieni osa (~ 20%) solujen jokaisessa kunnossa. Kun soluja käsiteltiin STC1, nämä värähtelyt edelleen kolmen viimeisen minuutin, kun taas kontrolli-solut eivät värähtelemään kuin 1,5 minuuttia. Ei ollut havaittavissa eroa taajuuden värähtelyjä (kuvio 4D).

STC1 Tehostettu Kalsium Response Upstream PLC Activation

nukleotidi signalointi johtaa solunsisäisen kalsiumin vapautuminen voidaan saada aikaan ATP: joko P2X perheen ionikanavia, tai P2Y G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien [24]. Sen tutkimiseksi, mitkä näistä reiteistä olivat vastuussa kalsiumin induktion mallissamme, Fluo-4 leimattu A549 monokerrosten käsiteltiin P2X antagonisti (NF023), tai P2Y polku antagonisteja (fosfatidyyli-(PI) PLC estäjä, D609, ja PLC estäjä , U73122). D609 ja U73122 vähensi etäisyyttä ja intensiteetti kalsiumin aallon mekaanisen stimulaation 20 s post kaapia (kuvio 5A, B); kuitenkin, mittaus suurin kulkema aalto paljasti, että vain U73122 estivät täysin kalsium aalto (kuvio 5C). D609 ja U73122 esti myös aktivointi kalsiumin lisäyksen jälkeen eksogeenisen ATP: tä, kun taas lisäämällä NF023 ei ollut vaikutusta (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka D609 vähensi etäisyyttä ja intensiteetti kalsiumin aalto, pre-inkubointi solujen kanssa STC1 palautettu etäisyyden aallon. STC1 kyennyt parantamaan kalsiumin aallon kanssa inkuboinnin jälkeen U73122 osoittaa, että STC1 riippui kanoninen PLC aktivointia (kuvio 5D).

A) Fluo-4 leimattuja A549-solut mekaanisesti stimuloitiin puuttuessa (kontrolli) tai läsnäolo joko P2X estäjän (50 uM NF023), PI-PLC estäjä (50 uM D609) tai PLC-estäjä (12,5 uM U73122) t = 20 s vamman jälkeen. n = 5. B) kvantifiointi kulkema kalsiumia aalto A t = 20 s. Virhepalkkeja = SD. * = P 0,05. n = 5. C) Fluo-4 leimattuja A549-solut esikäsiteltiin 30 min NF023, D609, tai U73122 inkuboitiin 500 ng /ml STC1 10 min ennen kaapia. Maksimietäisyys kalsiumin aalto näkyy. Virhepalkkeja = SD. * = P 0,05. n = 3.

STC1 tarvittiin eteneminen Mekaaninen ja ATP-aiheuttama Kalsium Wave

Havainto, että STC1 toimi ylävirtaan PLC sai meidät tutkimaan vaikutusta endogeenisen STC1 kalsiumin aallon etenemisnopeus mekaanisen stimulaation. A549-soluja esi-inkuboitiin 1 ug /ml polyklonaalisella anti-STC1 vasta-aine, joka meillä oli aiemmin osoitettu olevan tehokas estämään STC1 [10]. Sitten solut mekaanisesti edistää ja etäisyys kalsiumin aalto mitattiin. Esikäsittely solujen anti-STC1-vasta-aine vähensi kulkema kalsiumin aallon verrattuna solujen esi-käsiteltiin isotyypin kontrollivasta-aineella. Samoin, esikäsittely solut apyraasia vähensi kulkema kalsiumin aalto (kuvio 6A, B). Lisäksi anti-STC1 hoidetussa ryhmässä näkyy nopeasti taantuman kalsium- aallon (kuvio 6B), sekä vähentynyt kalsiumin vastauksena vieressä kaapia sivuston, mitattuna fluoresenssimikroskopialla (kuvio 6C; Elokuva S5).

A) Fluo-4 leimattu A549 yksisolukerrokset mekaanisesti stimuloitiin, kun läsnä on isotyypin vasta-ainetta (kontrolli), joka on STC1 estävää vasta-ainetta (anti-STC1, 1 ug /ml) tai apyraasia (250 mU /ml) ja määritettiin elävien solujen mikroskopia. B) Etäisyys kalsiumia aallon lisäykseen A. Virhepylväät = SD. * = P 0,05. C) kvantifiointi signaalin voimakkuuden vieressä kaapia sivuston mekaanisen stimulaation. Virhepalkkeja = SD. * = P 0,05.

STC1 Enhanced Release ATP soluista

in vitro

ja

in vivo

Seuraavaksi testasimme ovatko STC1 vaikutti vapauttamaan ATP stimuloimattomasta epiteelisolujen. Medium A549-solujen korvattiin seerumittomalla väliaineella tai ilman 500 ng /ml STC1 10 minuuttia, ja ATP-määritys suoritettiin. Medium alkaen STC1 käsitellyistä soluista sisälsi 2-kertaisesti enemmän ATP (kuvio 7A). Mitään merkittävää eroa ei havaittu lysaatit näistä soluista. ATP-tasot normalisoitiin DNA-pitoisuuden kussakin kuopassa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin hiiren alkion fibroblasteja villityypin ja STC1 siirtogeeniset hiiret (kuvio 7B).

A) A549-soluja stimuloitiin 500 ng /ml STC1 10 min. Elatusaine otettiin talteen ja siitä määritettiin ATP. Kiinnittyneet solut lyysattiin ja mitattiin ATP: tä ja DNA-pitoisuus. ATP-arvot normalisoitiin DNA-fluoresenssin. * = P 0,05; n = 3. B) A549-soluja stimuloitiin 10 uM ATP: 2, 5 ja 10 min. Pitoisuus kunnostettua alustaa ja solulysaateista villityyppisen ja STC1 yli-ilmentävien MEF. * = P 0,05; n = 3. C) Seerumi eristettiin villityypin ja STC1 siirtogeenisiä hiiriä ja niistä määritettiin ATP sisältöä. * = P 0,05; n 17.

Tulokset viittasivat mahdollisuuteen, että systeeminen taso ATP saattavat kohota STC1 siirtogeenisiä hiiriä. Tämän tutkimiseksi hypoteesin, plasmaa villityypin ja siirtogeenisiä hiiriä yli-ilmentävät STC1 kerättiin ja ATP-määritys suoritettiin. Hiiriä, jotka ekspressoivat ihmisen STC1 siirtogeenin kohonneen veren ATP verrattuna villityypin kontrolleihin (kuvio 7C).

Keskustelu

Edellinen havainnot viittaavat siihen, että STC1 on stressin vasteen proteiinia. STC1-proteiini on 80% identtinen välillä kalojen ja ihmisten, ja 98% identtinen välillä hiiret, rotat, ihmiset ja muut nisäkkäät [29]. STC1 tyrmäys hiiret eivät näytä mitään avointa fenotyyppiä [30]; kuitenkin kohonneita STC1 voi muuttaa lihasten toimintaa ja luuston kehitykseen ja lasku lisääntymiseen [31], [32]. STC1 mRNA-tasot olivat nopeasti ylösajettu hypoksia ja altistuksen jälkeen erilaisten sytokiinien, kuten tuumorinekroositekijä-alfan, transformoiva kasvutekijä beeta ja fibroblastikasvutekijä-2 (G. Block, julkaisematon data). Yhdessä nämä seikat tukevat päätelmää, että STC1 moduloi signalointi alkupuolella tapahtumia soluvastetta stressiin.

Tutkiakseen roolin STC1 stressiä, käytimme malli vahingon jossa epiteelin yksikerroksia hajotettiin mekaanisiin ärsykkeisiin kerrata aikaisin tapahtumien haavan [15], [28], [33]. Huomasimme, että STC1 nopeutti ja maksimietäisyys etenemisen ATP-riippuvaisten kalsiumia aalto. STC2 ei vaikuttanut kalsiumin aalto etenemisen jälkeen solujen esikäsittely STC2 ei muuttanut suurinta kulkema aalto. Olemme myös päätellä, että STC1 oli riippuvainen PLC aktivoinnin P2Y G-proteiiniin kytketyn reseptorin reaktiotien, koska PLC-inhibiittori, U73122, pystyi estämään kalsiumin aallon etenemisnopeus läsnä ollessa tai poissa ollessa STC1. Lisäksi toiminnallinen estäminen endogeenisen STC1 käyttämällä vasta-ainetta esti etenemisen kalsiumin aalto.

läsnäolo kaikkialla nukleotidin signaloinnin heijastuu laajan jakautumisen P2-reseptorien eri solutyypeissä [24]. Havaintomme että STC1 voi välittää kalsiumin aktivointia alavirtaan ATP keuhkoissa epiteelisoluissa voidaan soveltaa myös muihin solutyyppeihin ja kudoksiin. Esimerkiksi havaintojen STC1 toiminut selektiivinen L-kanavan estäjää [34] rinnakkain havaintoihin, jotka solunulkoinen ATP voivat hidastaa sydämen sykettä jälkeen traumaattisen shokin [35], [36]. Lisäksi osallistuminen solunulkoisen ATP säätelyssä makrofaagien kemotaksista [16], [18], [37], [38], [39] on samoin on määritelty STC1 [7]. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että STC1 modulaatio purinergistä signalointi voi edistää avointa fenotyypit näytteillä siirtogeenisiä hiiriä ilmentävät konstitutiivisesti STC1.

Vaikka STC1 parantaa kalsiumin vaste alavirtaan solunulkoisten nukleotidien epiteelisoluissa, samaa ei voi olla totta muissa solutyypeissä. Esimerkiksi, STC1 on osoitettu aktivoivan kalsiumin signalointi endoteelisoluissa [9], mutta estää kalsiumin signalointia vasteena MCP-1 makrofageissa [7]. Meidän määrityksessä, STC1 ei ollut vaikutusta kalsiumin dynamiikasta lisätä yksinään A549-soluihin (elokuva S6). Lisäksi ATP eivät saa aiheuttaa kalsiumin vapautuminen kaikissa solutyypeissä, koska ATP on voimakas vaimennin kalsiumin aktivaation hippokampuksen neuronien [40], [41]. Muuttujan vaikutukset ATP heijastuvat myös herkkyyttä solujen ATP, koska eri solutyyppejä vaativat erilaisia ​​pitoisuuksia solunulkoisen ATP aikaan vaikutusta. Kun taas A549-solut reagoivat niin vähän kuin 0,5 uM ATP, makrofagit yleensä tarvitse 100 uM vastatakseen [42]. STC1 voi olla rooli herkistäviä tai tautiherkkyyden solujen eri pitoisuuksia ATP.

alavirtaan seuraukset STC1 aktivaatio ATP-indusoidun kalsiumin vastaus voisi olla tärkeitä seurauksia microenvironmental vihjeitä johtaa normaaliin jännitys-vasteet mekaanisiin ja mahdollisesti myrkyllisiä loukkauksia. Esimerkiksi, rooli STC1 korjauksessa epiteelin haava voi perustua sen kykyä edistää tai estää apoptoosia ATP stimuloitujen solujen [43]. Rooli STC1 on purinergistä signalointi solusta tai organelle kalvot voisivat olla merkittäviä vaikutuksia loppupään kalsiumin liikkuminen sisällä ja välillä vaurioituneet solut. Tämä on ollut haastava osittain siksi, ettei käytettävissä myrkyllisyyskokeissa STC1. Työ olemme esittäneet täällä perustetaan biotestin STC1 toiminnan helpottamiseksi syvempää ymmärrystä sen rakenteen ja toiminnan eri solutyyppejä ja fysiologisia tilanteita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Hiiriä pidettiin ja käytettiin mukaisesti protokollien hyväksymän yliopiston neuvoston Animal Care yliopistossa Länsi-Ontarion.

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen A549 keuhkosyöpä epiteelin solut ja PC3 eturauhassyövän solut saatiin American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA, www.atcc.org). Hiiren alkion fibroblasteja ja plasmaa saatiin villin tyypin ja ihmisen STC1 siirtogeenisiä hiiriä kuten aikaisemmin on kuvattu [44]. Kaikki soluja ylläpidettiin Dulbeccon Minimal Essential Media (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, www.invitrogen.com), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Norcross, GA, www.atlantabio.com) ja 100 U penisilliiniä /100 ug streptomysiiniä (Invitrogen). Reagenssit olivat ostoja seuraavista lähteistä: ATP Teknova (Hollister, CA, www.teknova.com); apyraasia New England Biolabs (Ipswich, MA, www.neb.com); glycyrrhetiinihappoa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, www.sigmaaldrich.com); rekombinantti ihmisen STC1 ja STC2 lippuna-Tagged fuusioproteiini valmistettiin ihmisen soluista BioVendor (Modrice Tšekki, www.biovendor.com); vuohen polyklonaalisia vasta-aineita ja hiiren monoklonaalinen (klooni 380715) anti-STC1 vasta-aine R Melville, NY, www.nikoninstruments.com). Solut ja mikroskooppi oli koteloitu 37 ° C ympäristön kammio (in vivo Scientific, St. Louis, MO, www.invivoscientific.com). Kuvat otettiin 2 kuvaa /s vähintään 1 minuutti käyttäen NIS Elements. 4X tavoite käytettiin (CFI Plan Fluor 4X /0,13 17,1 mm; Nikon Instruments). Fluo-4 viritettiin käyttämällä 488 nm: n virityksellä suodatin, ja havaitaan 520 nm emissio.

mekaaninen stimulaatio A549-solut tehtiin käsin luomalla lineaarinen tyhjästä taipuneella P200 pipetin kärki (epTIP; Eppendorf, Hampuri Saksa, www.eppendorf.com). Jotta näyttää kalsiumin aallot jokaisessa kuvassa selvemmin, kaikki kuvat jokaisessa kunnossa mukautettiin samanaikaisesti käyttäen Adobe Photoshop kynnyksen toiminto niin, että pikseliä edellä mielivaltaisesti asetettu raja muuttui punaiseksi.

fluoresenssispekroskopian

Fluo-4 leimattujen solujen kasvatettu 48 tai 96-kuoppaisia ​​levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa fluoresenssispektrofotometriä varustettu kahdella reagenssin injektorit (Fluostar Omega, BMG Labtech, Offenburg Saksa, www.bmglabtech.com). Ensimmäinen suutin ohjelmoitiin tuottamaan kasvavien annosten ATP jälkeen 4 sekuntia perustason lukema. Toinen suutin ohjelmoitiin tuottamaan reagenssipuskuria ennen ATP niin äänenvoimakkuuden jokaisen lukema pysyi vakiona. Wells analysoitiin 480 eksitaatiolla /520 päästöjen. Tiedot kustakin kunnossa perusviivavähennettyjä. Fluoresenssin voimakkuus mittaukset tehtiin joka 0.5 sekuntia 480 toimintaa ja analysoidaan käyttämällä BMG Omega ohjelmiston data-analyysin ohjelmisto ja Microsoft Excel.

In vitro

ATP -määritykset

ATP analysoitiin käyttäen lusiferaasi-protokolla valmistajan ohjeiden mukaisesti (CellTitre-Glo, Promega, www.promega.com). Jotta epäsuorasti määrittää solujen lukumäärän, 20 ml lusiferaasin reagenssi, johon on lisätty 50 ui DNA väriaineaine (CyQuant; Invitrogen). Yksi tilavuus reagenssia lisättiin yhtä suuri tilavuus elatusaine. Puolet näytteestä määritettiin sitten lusiferaasi ja loput fluoresenssin (480/520 eksitaatiolla /emissiota) käyttäen levylukijaa kykenee havaitsemaan sekä fluoresenssin ja luminesenssin (Fluostar Omega, BMG Labtech).

ATP-määritys in hiiren plasman

Verta kerättiin ihmisen STC1 siirtogeenisiä uroshiirillä (linja 2) [32] ja villityypin urosten (2-4 kuukauden ikäisiä) on sama geneettinen tausta (C57BL /6 x CBA) käyttäen hepariinia hyytymisen estämiseksi. Tyypillisesti 300-400 ui kerättiin hiirtä kohti ja välittömästi sekoitetaan luukun ratkaisu huoneenlämmössä minimoimaan vapautuminen ATP verihiutaleista ja ATP hajoamista ATPaasi [45]. Pysäytin ratkaisu oli 3 mM EDTA, 118 mM NaCl, 5 mM KCI, 40 mM Tricine puskuria, 5 nM nitrobentsyyli thioinosine, 10 uM forskoliinia, 100pM isobutyylimetyyliksantiinin. Veri sentrifugoitiin välittömästi 13000 x g 3 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja 50 ui plasmaa käytettiin kahtena suorittaa epäsuora ATP mittauksia käyttämällä CellTiter-Glo-määritys (Promega) valmis- tajan ohjeiden mukaisesti. Luminoiva signaali mitattiin käyttämällä Berthold Lumat LB9507 luminometrillä ja suhteellinen valoyksiköissä muunnettiin ATP pitoisuudet käyttäen standardikäyrää.

Kuva ja Elokuva-analyysi

Kuva-analyysi tehtiin käyttämällä Nikon NIS Elements (Nikon) tai ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij). Jotta määrällisesti etäisyyden kalsiumin aalto, kuvat hankittiin 10, 20, 30 ja 40 s jälkeiset raaputtaa. Jokaisen kuvan, 5 riviä vedettiin kohtisuoraan reunaan kaapia kärkeen kalsiumin aallon. Etäisyydet linjojen tallennettiin ja oli keskimäärin yli 5 elokuvaa kohden kunnossa.

TILASTOANALYYSI

Jos kaksi resursseja oli vertailtavien, kaksisuuntaista T-testi suoritettiin käyttäen Microsoft Excel. Tilanteissa, joissa on enemmän kuin kaksi resursseja oli vertailtavien, nollahypoteesi hylättiin käyttäen varianssin analyysiä. Counts analysoitiin käyttämällä monen muuttujan kontingenssitaulukkomenetelmillä ja khiin neliö -testi InStat tilasto-ohjelmalla.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kalsium Wave eteneminen oli riippumaton Gap Junction Intercellular Communication. A549 yksisolukerrokset mekaanisesti stimuloitiin seuraavia preinkuboimalla 10, 25 tai 50 uM glycyrrhetiinihappoa ja määritettiin elävien solujen mikroskoopilla. Suurennus = 40 ×.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0010237.s001

(0,30 MB TIF) -iin Movie S1.