Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdennettu toimitus solunsalpaajalääkeaineiden on uusi lähestymistapa syövän hoitoon, joka tarjoaa lisääntyneen valikoivuus ja laski systeemistä toksisuutta. Olemme viime aikoina kehitetty lupaava lääkeaineen jakelujärjestelmä, jossa syöpälääke daunorubisiini (Dau) on liitetty

kautta

oksiimi sidos gonadotropiinia vapauttavan hormonin-III (GnRH-III) johdannaisen käytetään kohdeosa ( GLP-His-Trp-Lys (Ac) His-Asp-Trp-Lys (Dau = AOA) -Pro-Gly-NH

2 GLP = pyroglutamiinihappo, Ac = asetyyli; AOA = aminooxyacetyl). Tämä Bioconjugate kohdistama

in vitro

sytostaattinen /sytotoksinen vaikutus ihmisen rinta-, eturauhas- ja paksusuolen syöpä soluja, sekä merkittäviä

in vivo

kasvaimen kasvua estävä vaikutus paksusuolen syöpä hiirille. Meidän aikaisemmat tutkimukset, H-Lys (Dau = AOA) -OH tunnistettiin pienin metaboliitti läsnä rotan maksan lysosomaalisen homogenaattia, joka kykeni sitoutumaan DNA

in vitro

. Saada syvällisemmin vaikutusmekanismi on Biocon-, muutokset proteiinin ilmentymisen profiilia HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa käsittelyn jälkeen Biocon- tai vapaa daunorubisiini tutkittiin massaspektrometrialla-pohjainen proteomiikan. Tuloksemme osoittavat, että useat aineenvaihduntaan liittyviä proteiineja, molekyyli- kaperonit ja osallistuvien proteiinien signalointi eri ilmaistuna jälkeen kohdennettuja kemoterapian, minkä perusteella voidaan päätellä, että Biocon- kykenee sen sytotoksista toimintaa häiritsemällä useita solunsisäisiä prosesseja.

Citation : Schreier VN, Pethő L, Orbán E, Marquardt A, Petre BA, Mező G, et al. (2014) Protein Expression profiili HT-29 ihmisen koolonkarsinoomasoluissa hoidon jälkeen sytotoksisen daunorubisiini-GnRH-III Johdannaissopimukset Biocon-. PLoS ONE 9 (4): e94041. doi: 10,1371 /journal.pone.0094041

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia

vastaanotettu: Marraskuu 9, 2013 Hyväksytty: 10 maaliskuu 2014; Julkaistu: 09 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Schreier et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Konstanzin yliopiston (Zukunftskolleg, Project 879/08 ja Young Scholar Fund, Project 462/12), Unkarin National Science Fund (OTKA NK 77485 ja K 104045) ja Romanian kansallinen viranomainen tutkimusviranomaisen, CNCS -UEFISCDI (PN-II-RU-TE-2011-3-0038). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Reseptorivälitteisiä lääkeaineen on lupaava lähestymistapa syövän hoitoon, joka voi tarjota lisää selektiivisyyttä ja vähentynyt systeeminen toksisuus verrattuna klassiseen kemoterapiaa (eli anto vapaa syöpälääkkeiden) [1] – [3] . Ottaen huomioon, että reseptorit tietyille säätelypeptidejä, kuten gonadotropiinia vapauttava hormoni (GnRH, tunnetaan myös nimellä luteinisoivaa hormonia vapauttava hormoni, LHRH), ovat erittäin ilmaistaan ​​eri syöpäsolujen suhteellisen vähäinen ekspressio normaaleissa kudoksissa, ne ovat tärkeitä mole- tavoitteet syövän hoidossa [4]. Täten GnRH-johdannainen peptidejä voitaisiin käyttää ohjaavia osia kiinnitystä varten ja sen jälkeen tietyn kemoterapeuttisten aineiden GnRH-reseptorin (GnRH-R) positiiviset syöpäsoluja. Sen jälkeen, kun niiden internalisaatiota reseptorivälitteisen endosytoosin, The bioconjugates käsitellään yleensä lysosomeihin, mikä vapauttaa vapaan lääkkeen tai muodostumista lääkeainetta sisältävän aineenvaihduntatuotteiden [5], [6].

lupaava natiivi GnRH analogia voidaan käyttää kohdeosa on lamprey GnRH-III (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH

2), joka sitoutuu GnRH-R, on merkityksetön hormonitoimintaa vaikutus nisäkkäillä ja kohdistaa suoraan antiproliferatiivinen vaikutus sekä hormoniriippuvaisen ja riippumattaman syöpäsoluja [7] – [9]. Meidän edellinen työ, eri antrasykliini-GnRH-III johdannaisen bioconjugates on suunniteltu, syntetisoitu ja biokemiallisesti tunnettu [10] – [12]. Yksi lupaavimmista lääkeainekuljetussysteemeihin alalla tähän mennessä meidän laboratorioissa koostuu syöpälääke daunorubisiini (Dau) kiinnitetty

kautta

oksiimi sidosta GnRH-III johdannainen, jonka Ser asemassa 4 korvattiin Lys (Ac) [13]. Daunorubisiini (kuvio 1A) on kemoterapeuttinen aine, joka häiritsee solujen lisääntymistä ja jako mekanismeja, kuten tunkeutumiseen DNA esto topoisomeraasi II vapaiden radikaalien muodostuminen, lipidiperoksidaatio jne Huolimatta kliinistä hyötyä hallinnon vapaan Dau seurataan myrkyllisten sivuvaikutuksia, vakavin yksi on kardiotoksisuuden [14], [15]. Siksi kiinnitys Dau GnRH-pohjainen ohjaavia osia tulisi pyrkiä tehostamaan valikoivuus ja vähentynyt systeeminen myrkyllisyys [12]. Olemme äskettäin osoittaneet, että Biocon- GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] (kuvio 1 B) aiheutti

in vitro

sytostaattinen /sytotoksinen vaikutus ihmisen rinta-, eturauhas- ja paksusuolen syövän soluja, IC

50-arvot alhaisissa uM alueella. On tärkeää mainita, että HT-29 paksusuolensyöpä kennoissa Bioconjugate kohdistuva korkeampi sytostaattinen vaikutus (IC

50 = 7,4 ± 2,6 uM) kuin vanhemman Biocon- jossa Dau liitettiin natiivi peptidi hormoni (IC

50 = 27,8 ± 4,2 uM). Lisäksi paksusuolen syöpä kantavissa hiirissä, GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] vaikutuksesta, joka kohdistuu merkittäviä

in vivo

kasvaimen kasvua estävä vaikutus (49,3% kasvaimen kasvun esto verrattuna hoitamattomaan verrokkiryhmään) [13]. Lisäksi H-Lys (Dau = AOA) -OH tunnistettiin pienin lääkettä sisältävän metaboliitti läsnä rotan maksan lysosomaalisen homogenaattia, joka kykeni sitoutumaan DNA

in vitro

[10], [13], tuloksena joilla voitaisiin edistää ymmärrystä sytotoksisen vaikutuksen Biocon-.

(A) daunorubisiinin ja (B) oksiimi bond-sidottu daunorubisiini-GnRH-III johdannaisen Biocon-, GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)].

jotta saat syvällisemmin vaikutusmekanismi GnRH-III [

4Lys (Ac ),

8Lys (Dau = AOA)] Biocon-, muutokset proteiinin ilmentymisen profiilia HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa käsittelyn jälkeen Biocon- tai vapaa Dau tutkittiin massaspektrometrialla-pohjainen proteomiikan. Tuloksemme osoittavat, että useat aineenvaihduntaan liittyviä proteiineja, molekyyli- kaperonit ja osallistuvien proteiinien signalointi eri ilmaistuna jälkeen kohdennettuja kemoterapian, minkä perusteella voidaan päätellä, että Biocon- kykenee sen sytotoksista toimintaa häiritsemällä useita solunsisäisiä prosesseja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

RPMI-1640-väliaine, vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) saatiin Sigma-Aldrich (Budapest, Unkari). Epälineaarinen immobilisoitu pH-gradientti nauhat (IPG nauhat, pH 3-10 NL, 17 cm) ostettiin Bio-Rad Laboratories (München, Saksa), kun taas bikinkoniini- happo (BCA) iinianalyysikitissä oli Pierce tuote (Rockford, USA). Hajotuspuskuria (0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, 10 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 5 mM DTT ja proteaasi-inhibiittorit), nesteytys-puskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 2% Servalyt 3-10), tasapainotuspuskurilla (6 M ureaa, 2% SDS, 30% glyseroli, 2,5 mM Tris-HCl) ja ajopuskuria (25 mM Tris, 192 mM glysiini ja 0,1% SDS) valmistettiin meidän laboratorioissa.

synteesi ja kemiallinen karakterisointi GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate

Biocon- GnRH-III [ ,,,0],

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] valmistettiin yhdistämällä kiinteän faasin peptidisynteesin ja kemoselektiivisellä ligaatiota liuoksessa, kuten aiemmin on raportoitu [13]. Lyhyesti, aminooxyacetylated johdannainen GnRH-III (Glp-His-Trp-Lys (Ac) His-Asp-Trp-Lys (AOA) -Pro-Gly-NH

2) syntetisoitiin Rink Amide MBHA -hartsiin mukaan Fmoc /tBu strategia, käyttäen ortogonaalista suojaava järjestelmä varten lysiinijäämien asemissa 4 ja 8 (Protocol S1). Daunorubisiini liitetty

kautta

oksiimi sidos aminooxyacetylated GnRH-III johdannaisen reaktion, joka suoritettiin liuoksessa (0,2 M natriumasetaatti, pH 5) (kuvio S1). Sen jälkeen puhdistuksen semipreparatiivisella HPLC: Bioconjugate (GLP-His-Trp-Lys (Ac) His-Asp-Trp-Lys (Dau = AOA) -Pro-Gly-NH

2) karakterisoitiin analyyttisellä HPLC: llä ja massaspektrometria (Protocol S2 ja S3 ja kuvio S2).

solut

HT-29 (ATCC: HTB-38) ihmisen paksusuolen karsinooman solut ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FCS: ää , L-glutamiinia (2 mM) ja gentamisiini (160 ug /ml). Solu viljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2.

In vitro

solumyrkkyvaikutuksessa

in vitro

solumyrkkyvaikutuksessa GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate ja vapaa Dau määritettiin MTT-määrityksellä. Useat 3 x 10

3 solua per kuoppa maljattiin 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, soluja käsiteltiin 6, 24, 48 ja 72 h: n Bioconjugate tai vapaa Dau liuotettuna seerumia (pitoisuusalue: 2,6 x 10

-4-10

2 uM). Solut, jotka käsitelty seerumia samaan aikaa käytettiin kontrollina. Sen jälkeen MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. 3,5 tunnin kuluttua inkuboinnin, violetti kiteitä muodostettiin mitokondrion dehydrogenaasi-entsyymin eläviä soluja. Soluja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 1000 g: ssä ja supernatantti poistettiin. Kiteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin ja optinen tiheys (OD) mitattiin λ = 540 ja 620 nm: ssä käyttäen ELISA Reader (Labsystems MS lukija, Suomi). OD

620 vähennettiin OD

540 ja prosenttia sytotoksisuus laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: missä OD

käsitelty ja OD

ohjaus vastasi absorbanssit käsiteltyjen ja kontrolli-soluissa, vastaavasti. Sytotoksisuus% piirrettiin konsentraation funktiona, asennettu sigmoidal käyrä ja IC

50-arvo määritettiin tämän perusteella käyrä. IC

50 edusti pitoisuus Biocon- tai Dau tarvitaan saavuttamaan 50% estäminen

in vitro

.

valmistaminen solulysaateista

valmistelemiseksi solulysaateista , 5 x 10

5 HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa kuoppaa kohti maljattiin 6-kuoppaisille levyille. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, soluja käsiteltiin 72 h, Bioconjugate (pitoisuutena 3 uM) tai vapaasti Dau (pitoisuutena 0,15 uM). Soluja käsiteltiin soluviljelyväliaineessa saman ajan käytettiin kontrollina. Inkuboinnin jälkeen solut sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 1000 rpm: ssä, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, pH = 7,3, ja sitten tilavuus 300 ui lyysipuskuria lisättiin jokaiseen kuoppaan. Näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia jäissä ja sitten eristetty proteiini seoksia sentrifugoitiin 16000 g: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus liukoinen fraktio määritettiin BCA-määrityksellä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Protein Separation by Two Dimensional-natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (2D-SDS-PAGE) B

Alkaen solulysaateista, proteiinit (500 ng /näyte) ensin saostettiin viidellä tilavuudella jääkylmää asetonia -28 ° C: ssa 4 h. Sen jälkeen, kun niiden liukenemisen nesteytys puskurissa, joka sisälsi 0,6% ditiotreitolia (DTT), passiivinen nesteytys 17 cm epälineaarinen IPG liuskojen (pH 3-10) suoritettiin 14 tuntia huoneenlämpötilassa. Isoelektrinen fokusointi (IEF) suoritettiin käyttämällä Bio-Rad Protean IEF solun väline ja seuraavat parametrit: (i) 0-150 V 3 min, (ii) 150 V 30 min, (iii) 150-300 V 15 min, (iv) 300 V: ssa 30 minuutin ajan, (v) 300-3500 V 150 min, (vi) 3500 V: ssa 12 h. Toisen ulottuvuuden, kukin IPG liuska inkuboitiin ensin 20 min tasapainotuspuskurilla, joka sisältää 1% DTT: tä ja vielä 20 min tasapainotuspuskurilla, joka sisältää 2,5% jodiasetamidia (IAA). Liuskat asetettiin sitten 12% SDS-geelille ja elektroforeesi suoritettiin kahdessa vaiheessa: nykyinen ensin asetettu 25 mA /geeli -30 minuuttia ja sitten 40 mA /geeli, kunnes seuranta väriaine saavutti anodinen osa geeli. Tämän erotteluvaiheen jälkeen, proteiinit ennalta 1 tunnin ajan 12% trikloorietikkahapolla ja värjättiin yön yli Coomassie Brilliant Blue G-250 sisältävä liuos. Jälkeen värinpoisto tausta 25% metanolia vedessä (v /v), geelit skannattiin GS-800 kalibroitu kuvantamisen densitometrillä (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Saksa) käyttäen QuantityOne ohjelmistoa. Kutakin näytettä varten kolme rinnakkaista 2D-geelit verrattain analysoitiin käyttämällä PDQuest 8.0 ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Saksa), joka mahdollisti automaattinen tunnistus manuaalinen korjauksia ja kvantifiointiin proteiinitäplien. Merkitys erot proteiinitäplien arvioitiin Studentin t-testiä ja p-arvo pienempi kuin 0,05 pidettiin merkittävänä. Muita valintakriteeri oli kertainen muutos arvo on suurempi kuin kaksi.

In-geeli Tryptic Digestion

Valitut proteiinitäplien manuaalisesti irti ja alistettiin in-geeli tryptinen ruoansulatus aiemmin raportoidun [16]. Lyhyesti, värinpoistoon proteiinin paikoista saatiin aikaan suorittamalla seuraavat vaiheet, jotka toistettiin, kunnes geeli kappaletta olivat avoimia: (i) inkuboimalla geeliä kappaleina asetonitriili-Milli-Q (03:02 v /v) liuottimen seosta 30 min; (Ii) kuivataan käyttäen SpeedVac (Eppendorf AG, Saksa) ja (iii) hydraamalla ne uudelleen 20 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 8,0) 15 minuutin ajan. Sen jälkeen, juuri valmistettu trypsiini- liuosta (12,5 ng /ul sekvenssointilaatua modifioitu trypsiini (Promega, Madison, WI, USA) 20 mM ammoniumbikarbonaattia, pH 8,0) lisättiin kuivattu geeli paloiksi ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 45 min. Sitten trypsiini liuos korvattiin 20 mM ammoniumbikarbonaattia (pH 8,0) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 12 tuntia. Trypsiinikartta peptidit uutettiin geelistä kanssa asetonitriili-0,1% TFA: ta Milli-Q-vettä (03:02, v /v), huoneenlämpötilassa (3 x 60 min).

Massaspektrometrinen analyysi ja proteiini Identification

Tryptic peptidiseokset analysoitiin käänteisfaasilla nestekromatografia-nanospray tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) käyttäen LTQ-Orbitrap massaspektrometriä (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Saksa) ja Eksigent nanoHPLC (CA, USA). Ominaisuudet käänteisfaasi- LC pylväs oli 5 um, 200 Ä: n huokoskoko C18 hartsin 75 pm sisähalkaisija x 10 cm pitkä pala kvartsilasikapillaarikolonnissa (Hypersil Gold C18, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Saksa). Pistämisen jälkeen näyte, pylväs pestiin 5 min ajan 90% eluenttia A (0,1% muurahaishappoa vedessä) ja 10% eluenttia B (0,1% muurahaishappoa asetonitriilissä). Peptidit eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia 10-50% eluenttia B 25 minuutin ajan ja sitten 50-80% eluentti B 5 min, virtausnopeudella 300 nl /min. LTQ-Orbitrap massaspektrometrillä oli toiminut datan riippuva tila, jossa jokainen täysi MS scan seurasi viisi MS /MS skannaa, jossa viisi runsain molekyyli-ionit oli dynaamisesti valittujen ja pirstoutunut törmäyksen aiheuttama dissosiaatio (CID) käyttäen normalisoitu törmäys energiaa 35% LTQ ioni ansa. Dynaaminen syrjäytyminen sallittiin. Tandem massaspektrit vastaavuushaku SwissProt proteiini tietokantaan Mascot (Matrix Science) kanssa seuraavat parametrit: ”trypsiini” pilkkominen yhdellä jäi pilkkominen, kysteiini alkyloimatta iodoacetamide jatkuvana muutos ja metioniinin hapetuksen muuttujana muutos.

tulokset ja pohdinta

optimointi Cell hoito ehtojen kanssa Biocon- ja Free daunorubisiinin

solu käsittely olosuhteissa (inkubaatioaika ja pitoisuus) kanssa GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate ja vapaa Dau valittiin sen perusteella,

in vitro

sytotoksisuustiedot. HT-29 ihmisen paksusuolen syövän soluja käsiteltiin joko Bioconjugate tai vapaa Dau eri pitoisuuksina 6, 24, 48 ja 72 tuntia, vastaavasti. Vapaa Dau aiheuttanut sytotoksisen vaikutuksen jopa 6 tunnin jälkeen, mikä oli jyrkempi ajan. Pienin IC

50-arvo (0,26 uM) määritettiin 72 tunnin kuluttua inkubaation. Sen sijaan Bioconjugate oli sytotoksinen vasta 72 h (IC

50 = 11,5 uM); Näin ollen, käsittelyaika 72 h käytettiin edelleen proteomiikka tutkimuksissa. Valitun solun hoito pitoisuudet olivat alle IC

50-arvot, nimittäin 0,15 pH ilmaiseksi Dau ja 3 uM Biocon-. On tärkeää huomata, eri IC

50-arvot ja näin ollen eri sytotoksisia ominaisuuksia vapaan ja konjugoitujen Dau että voi selittyä niiden mekanismeista soluunottoa, nimittäin passiivinen diffuusio, kun kyseessä on vapaa Dau

vs.

reseptorivälitteisen endosytoosin avulla, jota seuraa solunsisäisen prosessoinnin GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate.

muutokset Protein Expression Profile HT-29 Human Colon Cancer Cells, kun kemoterapeuttisen hoidon

optimoinnin jälkeen käsittelyolosuhteet, HT-29 ihmisen paksusuolen syövän soluja käsiteltiin 72 tuntia GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate tai vapaa Dau. Solulysaatit valmistettiin protokollan mukaan kuvatun Materiaalit ja menetelmät osassa. Proteiinipitoisuus on supernatanttifraktiota määritettiin BCA-määrityksellä, ja se oli keskimäärin 2,34 mg /ml käsittelemättömistä soluista käytettiin kontrollina, 2,94 mg /ml Dau-käsiteltyjen ja 3,18 mg /ml Bioconjugate käsiteltyjä soluja.

proteiinit erotettiin sitten 2D-geelielektroforeesilla käyttäen 3-10 epälineaarinen IPG nauhat ja 12% geelit. Sen jälkeen Coomassie-värjäys, geeli kuvioita verrattiin käyttäen PDQuest 8,0 ohjelmisto. Toisin ilmaistuna proteiinit alistettiin geelissä tryptinen digestio, jota seuraa nanoLC-tandemmassaspektometrisellä analyysi tryptisen peptidin seokset ja tietokantahaku. Kuviossa 2 analysoidaan proteiinit on merkitty nuolella ja näkyy vain ohjaus geelillä. Proteiinit havaittiin eri tavalla ilmaista jälkeen kohdennettua kemoterapian (fold muutos 2; p 0,05, taulukko 1 ja taulukko S1) voidaan luokitella seuraaviin toimintakategorioihin: (i) molekyyli kaperonit, (ii) aineenvaihduntaan liittyviä proteiineja ja (iii) proteiineja, jotka liittyvät signalointi.

(A) käsittelemätön, (B) Bioconjugate-käsiteltyjen ja (C) daunorubisiini-käsiteltyjen syöpäsolujen. Näkyy vain valvontaa geeli, nuolet ja paikka numerot osoittavat merkittävästi erilainen proteiinitäplien.

Yksi molekyyli saattajia, ilmaus lämmön shock 70 kDa proteiini 1A /1B (Hsp70) havaittiin on merkittävästi vähentynyt hoidon jälkeen GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Biocon-, kun taas vapaa Dau ollut merkittävää vaikutusta sen ilmentymistä HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa käsittelemättömiin soluihin verrattuna (proteiini spot P1). Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että stressin aiheuttama Hsp70 on molekyyli chaperone marginaalisesti ilmaistu jännittämättömässä normaaleissa soluissa, mutta yli-ilmentynyt eri syöpäsolujen. Lisäksi, kohonnut ekspressio Hsp70 syöpäsoluissa on liittynyt taudin etenemiseen, etäpesäkkeiden, resistenssi kemoterapiaa ja yleisesti huono prognoosi potilaalle. Nämä toiminnot voidaan selittää sen antiapoptoottisia ominaisuuksia, auttaa solujen hengissä rasittavissa olosuhteissa kuten toiminta solunsalpaajalääkeaineiden [17] – [19]. Alas-säätely HSP70 on havaittu estävän solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Siten Hsp70 on ehdotettu tärkeäksi molekyylitasolla syövän hoidossa ja yritetään kehittää Hsp70 modulaattorit (esim pienimolekyylisiä estäjiä) [20] – [22]. Työmme, hoitoon HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa yhdellä annoksella vapaata Dau ei vaikuttanut ilmaus Hsp70-proteiinin. Mielenkiintoista on, että kiinnitys Dau on GnRH-III johdannaista käytetään kohdeosan johti Bioconjugate kanssa estäviä ominaisuuksia on Hsp70 (taulukko 1).

Toinen proteiinia kaperonitoiminta, joka todettiin eri ilmaistaan HT-29-solujen jälkeen hoidon GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Biocon-, oli kalretikuliini (proteiini spot P2). Tämän vaikutukset proteiinin syöpä on äskettäin tarkastelleet Zamanian

et al.

[23]. Sen yli-ilmentyminen on raportoitu eri syöpäsoluja (esim., Rinta-, virtsarakko-, ruokatorven, haiman, paksusuolen, mahalaukun syövän, jne.), Ja sen on todettu liittyy lisääntynyt invaasio, metastaasin ja heikkoon ennusteeseen [23]. Kun otetaan huomioon nämä aikaisemmat havainnot, kalretikuliini voisi myös edustaa syövän terapeuttisen kohteen, jonka vähentynyt ilmentyminen voisi tarjota terapeuttista etua. Esillä olevassa tutkimuksessa, toisin kuin hoidon vapaa Dau, joka ei ollut merkittävää vaikutusta kalretikuliini ilmaisu, Bioconjugate aiheutti estävä vaikutus (eli verrattuna käsittelemättömissä soluissa, että Bioconjugate käsiteltyjen näytteiden tasoa kalretikuliini oli keskimäärin neljä kertaa pienempi; katso taulukko 1).

verrattuna käsittelemättömiin ja Dau käsitellyn HT-29 koolonin syövän solujen hoidon Bioconjugate johti vähentyneeseen proteiinin ekspressio-isomeraasin (PDI), monitoiminen proteiini joka on tärkeä rooli proteiinin laskostumiseen kataly- muodostumista, jarrutetaan ja uudelleenjärjestely molekyylin sisäinen disulfidisiltojen (proteiini spot P3). PDI tunnetaan toimimaan kaperonina, joka estää aggregaatiota väärin laskostuneita proteiineja. Lisäksi on havaittu, että ekspressio PDI on kohonnut syöpäsoluissa ja tämän proteiinin on ehdotettu biomarkkerina tiettyjen syöpien, kuten paksusuolen syöpä tai rintasyöpä kasvaimien synnyn [24], [25]. Lisäksi Goplen

et al

. ovat osoittaneet, että PDI voimakkaasti ilmentyy invasiivisia glioomasoluihin, jolla on tärkeä rooli tuumorisolun muuttoliikettä ja invaasiota, toimista, jotka voisivat tehokkaasti inhiboida PDI monoklonaalinen vasta-aine, sekä basitrasiinia [26].

lisäksi molekyyli kaperonit, ilmentymisen aineenvaihduntaan liittyvien proteiinien, kuten UDP-glukoosi-6-dehydrogenaasin (UGDH) vaikutti kemoterapeuttisen hoidon (proteiini spot P4). Vaikka vapaa Dau oli myönteinen vaikutus UGDH lauseke, soveltamisen Biocon- oli estävä vaikutus. Viimeksi mainittu voisi edistää syövän hoidossa, koska UGDH antagonisteja on ehdotettu olevan käyttökelpoisia terapeuttisina aineina [27], [28]. Tämä perustuu siihen näkemykseen, että koholla glykosaminoglykaani muodostuminen (esim hyaluronaani), jossa UGDH on avainasemassa, on mukana erilaisia ​​ihmisen sairauksia, mukaan lukien syövän etenemistä [29].

Sekä Bioconjugate ja vapaa Dau vaikutti merkittävästi ilmaus orvaskeden rasvahappoa sitovan proteiinin (E-FABP) (proteiini spot P5). FABPs ovat monipuolisia proteiineja, jotka liittyvät rasva-aineenvaihdunnan, mutta myös ja geenin ekspression muuntamisen, kasvua ja selviytymistä reitit sekä tulehdus- ja metabolisen vasteet [30]. Lisäksi muuttunut FABP ekspressiomalleja kuvattiin eri syöpätyyppien, viittaa siihen, että FABPs on tärkeä rooli syövän synnyssä. Esimerkiksi tuoreessa tutkimuksessa Junqin Li

et al.

On havaittu, että E-FABP, sekä maksa-FABP ja Sydän- tai Muscle-FABP, ovat mukana kehittämässä invasiivisen duktaaliseen rintasyöpä, koska niiden tasot olivat merkittävästi koholla duktaalisessa tunkeutuva karsinooma verrattuna fibroadenoma [31]. Lisääntynyt ilmentyminen E-FABP havaittiin myös kohdun limakalvon syöpä ja solunsalpaajaresistentti haimasyövän solulinjoissa [32], [33]. Näin ollen E-FABP voi edustaa toista molekyylitasolla syövän hoidossa.

Vaikka ei merkittävästi vaikuta kemoterapeuttisen hoidon, ekspressiota Ran-specific GTPaasia aktivoivan proteiinin (jota kutsutaan myös Ran-sitova proteiini 1; RanBP1) (proteiini spot P6) väheni hoidon jälkeen Biocon- (2,21 kertainen muutos, p = 0,05). Ran on pieni GTPaasina joka toimii molekyyli kytkin sitoutumalla joko GTP tai BKT. Yksi olennainen säädin tässä prosessissa on Ran-specific GTPaasia aktivoiva proteiini (RanBP 1), joka myös katalysoi GTP hydrolyysin Ran. On havaittu, että Ran Ran sitovat proteiinit ovat osallisena monenlaisia ​​olennainen solun prosesseja (esim nucleocytoplasmic liikenne, sukkularihmaston kokoonpano, ydin- kirjekuori ja tumahuokonen kompleksin muodostumista) sekä solukuoleman, solujen proliferaatiota ja erilaistumista ja pahanlaatuisiksi (katso [34] tarkistettavaksi). Lisäksi on raportoitu, että ilmaus Ran ja RanBP1 lisääntyy eri syöpätyyppien ja että kumoamisesta RanBP1 voi johtaa solun kuolemaan. Yhdessä nämä tulokset, on ehdotettu, että sekä Ran ja Ran-specific GTPaasia aktivoiva proteiini ovat hyviä ehdokkaita, koska molekyyli tavoitteet syövän hoidossa [34], [35].

Verrattuna käsittelemättömiin HT-29 koolonsyöpäsoluja, ilmentymisen guaniininukleotidiä sitovan proteiinin alayksikkö, beeta-2-like 1 (GNB2L1, joka tunnetaan myös reseptori aktivoitua proteiinikinaasi C 1, RACK1) (proteiini spot P7) vaikutti hoidon kanssa, Bioconjugate, mutta ei merkittävästi (2,25 kertainen muutos; p = 0,0773). Kuitenkin tämän proteiinin ilmentymisen oli merkittävästi erilainen, Bioconjugate

vs.

Dau käsiteltyjen solujen (p = 0,0113), alempi määrä on havaittu Bioconjugate käsiteltyjen solujen. GNB2L1 on todettu olevan ratkaiseva merkitys useiden solunsisäisten signaalitransduktioreitteihin. Mitä sen mahdollisia vaikutuksia syövän kehittymisessä ja etenemisessä, on osoitettu, että RACK1 edistää rintasyöpä lisääntymistä ja invaasio /etäpesäkkeiden

in vitro

ja

in vivo

ja sen ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen. Lisäksi väheneminen RACK1 ilmaisun johti soluproliferaation inhibointi

in vitro

[36]. Samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu myös siinä tapauksessa muiden syöpien, kuten ei-pienisoluisen keuhkosyövän ja paksusuolen syöpä [37].

Yhteenvetona hoidon daunorubisiini-GnRH-III johdannaisen Biocon- aiheutti muutoksia proteiinin ilmentymisen profiili HT-29 paksusuolen syöpäsoluja. Erityisesti molekyyli kaperonit, aineenvaihduntaan liittyvät proteiinit ja proteiinien mukana signalointi vaikutti kohdistettuja kemoterapian, niiden ilme on alas-säädellä Bioconjugate käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin ja Dau-käsiteltyjen näytteiden. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet vaikutuksia näiden proteiinien syöpään, mikä osoittaa, että niiden down-regulation voi olla terapeuttista hyötyä (esim., Hsp70, proteiinidisulfidi-isomeraasin, jne). Viimeaikainen edistyminen syövän hoidossa on ehdottanut, että on tärkeää kohdentaa useampia proteiinia tai signalointireitin. Yksi mahdollinen tapa saavuttaa tämä voitaisiin kohdistaa syövän kemoterapiaa. Perusteella tuloksemme, voidaan päätellä, että GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate kykenee sen sytotoksinen toiminta HT-29 koolonsyöpäsoluihin häiritsemällä useita solunsisäisiä prosesseja ja edustaa lupaava kohdennettua kemoterapeuttista ainetta.

tukeminen Information

Kuva S1.

synteesi oksiimi bond-sidottu daunorubisiini-GnRH-III johdannaisen Biocon-.

doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s001

(TIF) B Kuva S2.

Kemialliset ominaisuudet GnRH-III [

4Lys (Ac),

8Lys (Dau = AOA)] Bioconjugate. (A) analyyttinen HPLC-profiilin ja (B) ESI-ioni ansa massaspektri. Hajanaisuus glykosidisidoksin alle massaspektrometrisia olosuhteissa, mikä johtaa menetykseen daunosamiinilla, merkitään tähdellä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s002

(TIF) B Taulukko S1.

ominaisuudet tunnistetaan proteiineja, joilla on muuttunut ekspressio johtuen kemoterapeuttisen hoidon HT-29 paksusuolen syöpäsoluja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s003

(DOC)

Protocol S1.

synteesi aminooxyacetylated-GnRH-III johdannainen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s004

(DOC)

Protocol S2.

Suuren erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC).

doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s005

(DOC)

Protocol S3.

Massaspektrometrinen analyysi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0094041.s006

(DOC) B