Krooninen sairaus

tiivistelmä

androgeenireseptorin (AR) on edelleen tärkeä tekijä neoplastisten kehittymistä eturauhassyövän (CAP). CaP eteneminen liittyy useita somaattisten AR mutaatiomuutosten että antaa heti AR dramaattinen voitto-of-function ominaisuuksia. Yksi yleisimmistä somaattiset mutaatiot tunnistettiin on Thr877-to-Ala (T877A), joka sijaitsee ligandia sitovan domeenin, joka johtaa reseptoriin, joka kykenee sitoutumisen ja aktivaation eri steroidihormonien ja ligandeja, mukaan lukien estrogeenit, progestiinit, glukokortikoidit, ja useat antiandrogeenit. Yrittäessään määritellä tarkemmin somaattisten mutatoitunut AR voitto-of-function ominaisuuksia, seurauksena sen siveetön ligandin sitova, suoritimme proteomiikka /verkostoanalyysi lähestymistapa luonnehtia proteiinin interactome mutantti T877A-AR LNCaP soluja kahdeksan eri ligandi-erityisiä hoitoja (dihydrotestosteroni, mibolerone, R1881, testosteroni, estradioli, progesteroni, deksametasoni, ja syproteroniasetaatti). Laajentamisessa analyysi multi-ligandikompleksit mutantti T877A-AR havaitsimme merkittävää rikastumista erityisiä komplekseja normaalin ja ensisijainen eturauhasen kasvaimia, jotka oli lisäksi korreloivat tiedetään olevan kliinisiä tuloksia. Tarkempi analyysi tiettyjen mutantti T877A-AR kompleksit osoittivat populaatiokohortteja mieltymykset erottaa ensisijainen eturauhasen sairaus Valkoiseksi (ei latinalaisamerikkalainen) vs. Afrikkalainen Amerikan miehillä. Lisäksi nämä syöpään liittyvien AR-proteiini kompleksit osoittivat ennakoivan selviytymisen tulosten erityisiä korkki, eikä rinta-, keuhko-, lymfooma tai medulloblastoma syöpiä. Tutkimuksemme, kytkemällä data luomia proteomiikka verkon analyysin kliinistä näytettä, on auttanut määrittelemään todellinen ja uusia biologisia reittejä monimutkainen voitto-of-function AR monimutkaisia ​​järjestelmiä.

Citation: Zaman N, Giannopoulos PN , Chowdhury S, Bonneil E, Thibault P, Wang E, et ai. (2014) proteomiikan-Coupled-verkosto analyysi T877A-androgeenireseptorin Interactomes voi ennustaa Clinical Eturauhassyöpä Outcomes välillä White (Non-latinalaisamerikkalainen) ja Afrikkalainen Amerikan ryhmät. PLoS ONE 9 (11): e113190. doi: 10,1371 /journal.pone.0113190

Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2014; Hyväksytty: 04 syyskuu 2014; Julkaistu: 19 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Zaman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki proteomic esitetyt tiedot käsikirjoituksen, ladataan meidän AR-reseptoriin tietokannasta (https://androgendb.mcgill.ca/) Excel-tiedosto, yhdessä täydentävät kuviot /taulukot liittyvät tähän käsikirjoituksen.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Kanadan Institutes for Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca) toiminta-avustuksen MOP-106477 (MT, MP, EW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Merkittävä edistyminen genomista sekvensointia menetelmät ovat mahdollistaneet paremman arvion laajuudesta somaattisten mutaatioiden kertynyt yhteistä kasvainten [1], [2]. Tärkeämpää on sen ymmärtäminen, että tuumorien merkittävästi vaihtelevat geneettisesti välillä potilaasta toiseen ja sisällä yksittäinen potilas on olemassa laaja muun kasvaimen heterogeenisyys ja sisäisen kasvaimen heterogeenisuus [3], [4], [5]. Merkittävä osa näistä geneettisiä muutoksia ovat missensemutaatioita jotka aiheuttavat uusia voitto-of-function ominaisuuksia, jotka tekevät tietyn geenin ennakoivasti ja kasvainten kehittyminen ja kutsutaan kuljettajan mutaatioita. Parempi käsitys näiden uusien ominaisuuksien johtaisi parempaan tulkintaan syövän synnyn, mutta tämä on vaikeaa johtuen suuri määrä erilaisia ​​mutaatioita, ennakoimattomuus voitto-of-function ominaisuuksia, jotka liittyvät somaattiset mutaatiot, mahdollinen laaja vuorovaikutusta eri somaattisten mutantteja ja sitä seurannut valintaprosesseja alulle mikroympäristön tai terapian itse. Tällainen monimutkainen ”järjestelmät” vaativat enemmän globaali ”omiikka” lähestymistapaa ja verkon analyysin sijaan klassisen yksittäinen geeni lähestymistapaa, kerätä enemmän kriittistä tietoa liittyviä neoplastisia evoluution.

Noudattaen uudelleen määritellyt mutaatiostatuksesta maisema kasvainten, eturauhassyöpä (CAP) on myös laaja geneettisiä muutoksia, jotka vaihtelevat yksittäisistä missensemutaatioita, kopioluvun vaihtelu, silmukoitumisvariantteja, geneettinen uudelleenjärjestelyjä ja lyhyitä DNA muutoksia useita geenejä [1], [2], [6] [7], mukaan lukien androgeenireseptorin (

AR) B-geenin. Ei ole odottamatonta, että AR mutaatiot voivat lisätä proteiinin ohjelmistoon tehokkaita uusia toimintoja [8], [9] ja nämä voitto-of-function attribuutteja voi sallia AR toimiakseen poikkeava tavalla. Useita somaattisten CaP AR mutantteja, erityisesti yleisimmin esiintyviä CaP AR mutaatio, Thr877Ala (T877A), on ainutlaatuinen voitto-of-toiminto ominaisuudet: ne voivat sitoa useita luokkia steroidien promiscuously (esim estrogeenit, progestiinit, glukokortikoidit) myöhempien transactivation tai voidaan hyperactivated normaalilla ligandit [10]. Classic antiandrogeeni hoitoja [esim. flutamidi, syproteroniasetaatti (CPA) tai bikalutamidi] ovat tuottaneet, valinnan kautta paine, erityisiä somaattiset AR mutaatioita, esim. Trp741Cys (W741C) ja His874Tyr, jolloin kumouksellista AR jotka ovat täysin aktiivisia ja näiden lääkkeiden [11]. Jopa seuraavan sukupolven antiandrogeeni lääkkeet esimerkkinä enzalutamide (MDV-3100) on herättänyt erityistä AR mutaatioita [12], [13]. Tämä havainto on myös korreloi dramaattinen lasku PSA tasoilla jälkeen antiandrogeenia peruuttaminen [11]. T877A-AR mutaatioita, joka on läsnä myös eturauhassyövän LNCaP, on raportoitu eri yksilöiden esiintyy 25-33% androgeenista riippumaton tai castrate-resistenttejä kasvaimia [11], [14], [15] , [16].

Äskettäin omaa työtämme viittaa vahvasti siihen, että Jälleenkytkentätoiminto ulottuu klassisen roolia transkriptiotekijän ja sisältää uusia ominaisuuksia silmukointi, DNA: n metylaatio, proteasomaalisten vuorovaikutus ja proteiinia muuntamisessa polyribosomien itse [17]. Lisäksi suuri toiminnallisen monimuotoisuuden osien AR komplekseja esimerkki monimutkainen luonne proteiini-proteiini vuorovaikutusten liittyy tuottavan sopivan AR biologinen tuotanto. Nämä uudet AR toiminnot voivat välittää solun prosesseja ja tarjoaa uusia mahdollisuuksia, jotta somaattiset AR CaP mutantit saattavat ”nauttimaan” ja edistää CaP syövän synnyn.

Yrittäessään kuvaavat uusia voitto-of-function ominaisuuksia, jotka liittyvät mutantti CaP haittavaikutus , Proteomisten kytketty verkkoon analyysi. Useita proteomiikkaa-massaspektroskopia tutkimukset tehtiin, jotta täysin luonnehtia proteiinin koostumus T877A-AR ”komplekseja” (interactome) eri luokkien hormoni /ligandi olosuhteet heijastavat promiscuity ligandinsitomis- liittyy T877A. Kriittisesti, mutantti CaP AR voi olla omia ainutlaatuinen kyky läpikäydä ja määrittää uusia vuorovaikutusta. Kytkentä tuottamat tiedot meidän proteomiikka seuloa järjestelmän biologia analyysi on auttanut määrittelemään todellinen ja uusia biologisia muuttujia hoidon AR monimutkaisten järjestelmien kuluessa kliinisen sairauden näkökulmasta.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjoja

LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa saatiin American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD.

Soluviljely, steroidihormonien, ligandit ja stimulaatio kokeissa

LNCaP-solulinja, viljeltiin RPMI 1640-alusta täydennettynä FBS (10%), 37 ° C: ssa, 5% CO

2 T-75 muovi viljelypulloihin. Kun konfluentteja, väliaine vaihdettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% hiili-dekstraania FBS ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Seuraavana päivänä väliaine vaihdettiin tuoreisiin RMPI /hiili-dekstraania FBS yön yli hormoni /ligandi stimulaatio tutkimuksia varten 18 tunnin ajan. Steroidit hormoneja käytettiin seuraavissa lopulliset pitoisuudet, 10 nM dihydrotestosteronin (DHT), 10 nM mibolerone (MB), 10 nM R1881, 10 nM testosteronia + 10 uM finasteridia, 10 nM 17β-estradioli, 10 nM progesteronia, 10 nM deksametasonia, ja 100 nM syproteroniasetaatti (CPA).

Affiniteettipuhdistus ja Western blotting

LNCaP kokosolulysaateille valmistettiin jäädytys-sulatus-menetelmä, 1X PDG puskuria, jossa on hormoni /ligandi [18] . Lysaatit Sitten siirrettyjen α-AR co-immuunisaostuksissa [AR (N20), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] yön yli 4 ° C: ssa. 50% proteiini-A-Sepharose-lietteeseen lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 90 min. Helmet pestiin kolme kertaa pesupuskurilla (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCI, 1% Tween 20) ja suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan 1X SDS-geelin latauspuskuria. Näytteet denaturoitiin keittämällä, ja eroteltiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä ennen hopeavärjäyksellä mukaisesti valmistajan ohjeita (BioRad) tai siirtää nitroselluloosakalvolle Western blot -analyysillä käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta AR (441) (Neomarkers, Fremont, CA) .

Massaspektrometria ja peptidin vertailu

TCEP (tris (2-karboksietyyli) fosfiini) lisättiin proteiinin näytteitä päästä konsentraatioon 5 mM. Näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Yksi ug trypsiiniä lisättiin ja näytteet digestoitiin yön yli 37 ° C: ssa, sitten kuivattiin alas SpeedVac ja liuotetaan uudestaan ​​50 ui ACN 5% /muurahaishappoa (FA) 0,2%.

Kaikki MS-analyysit olivat suoritettiin käyttäen LTQ-Orbitrap hybridi massaspektrometri kanssa nanoelectrospray ionilähteen (ThermoFisher, San Jose, CA) yhdistettynä Eksigent nano-LC 2D pumppu (Dublin, CA) varustettuna Finnigan AS autosampler (Thermo Fisher, San Jose, CA ). Kaksikymmentä ui kutakin näytettä injektoitiin C18 esikolonni (0,3 mm sisähalkaisija x 5 mm), ja näytteet erotettiin C18-analyyttistä pylvästä (150 um sisähalkaisija x 100 mm) käyttäen Eksigent nanoLC-2D-järjestelmä. 76–min gradientti (A /B) 10-60% (A: muurahaishappoa 0,2%, B: asetonitriili /0,2% muurahaishappoa) käytettiin eluoidaan peptidien kanssa virtausnopeuden ollessa 600 nl /min. Tavanomainen MS-spektrit (tutkimus scan) hankittu profiilin tilassa resoluutiolla 60000 m /z 400. Jokainen täysi MS-spektri seurasi kolme MS /MS-spektri (neljä scan tapahtumat), jossa kolme runsain kertolaskua varautuneita ioneja valittiin MS /MS sekvensoinnin. Tandem MS kokeet suoritettiin käyttäen törmäyksen aiheuttama dissosiaatiota lineaarisessa ioni ansa.

Vertailut peptidin runsaus sekä eri kokeellisia paradigmoihin saavutettiin käyttämällä merkkivapaalla määrällisiä proteomiikan [19], [20]. Lyhyesti, raaka datatiedostot Xcalibur ohjelmisto muunnettiin peptidikartassa tiedostot edustavat kaikki ionit mukaan niiden vastaavien m /z-arvot, retentioaika, intensiteetti ja varaustila. Peptidi runsaus oli sitten arvioitiin käyttämällä ”huippu top” intensiteetti arvoja. Intensiteetit peptidien eluoiden useilla fraktiot lasketaan yhteen, ja vain variaatiokerroin (CV), joka mahdollistaa maksimaalisen ionin lähetyksen pidettiin laskea peptidin intensiteettiä. Klusterointi peptidin karttoja eri näytejoukoille suoritettiin peptidi-liittyvä Mascot maahantulopaikkaan hierarkkinen klusterointi erityisiä toleranssit (+/- 15 ppm peptidin massan ja +/- 1 min peptidin retentioaika). Normalisoituminen retentioajan suoritettiin alkuperäisestä peptidin klusterin käyttämällä dynaamista ja epälineaarinen korjauksen että rajataan retentioaika jakauma alle 0,1 min keskimäärin. Toistettavuus muutokset runsaasti kaikkialla olosuhteissa määritettiin käyttäen kaksisuuntainen homoscedastic

t

-testi näytteen jäljittelee tunnistaa peptidin klustereiden

p

-arvot 0,1 käännettävät muutoksia yli 7 standardin poikkeamia. Peptidi klusterit täyttävät nämä valintakriteerit tarkastettiin manuaalisesti validoimiseksi tunnistaminen ja muutosten runsaasti. Expression analyysit suoritettiin tunnistettujen proteiinien vähintään kahden eri peptidisekvenssejä. Expression arvot ja suhteellinen keskihajonta oli saavuttanut keskiarvoistamalla voimakkuuseroille ja keskihajonnat neljästä voimakkain peptidi triplets poistamisen jälkeen syrjäisillä peptidi klustereita. Normalisoitu proteomic tiedot löytyvät taulukosta S1.

Aineistot verkon rakentamisen ja geenien ilmentymisen analyysi

Kaikki AR interactors annettiin NCBI geenin tunnukset. Ihmisen proteiini vuorovaikutus tiedot on koottu monipuolista tietoa resursseista ja merkintä tietokantoja kuten biomolekyylitutkimuksesta Interaction Network Database (BIND), tietokannan vuorovaikutuksessa Proteiinit (DIP), Ihmisen proteiini viitetietokantaan (HPRD), ehjä, ja molekyylien vuorovaikutus tietokanta (MINT), joista useimmat sisältävät kuraattorina -yhteisvaikutustutkimukset ja suuren suorituskyvyn data. Olemme tuottaneet metadata proteiini vuorovaikutusten yhdistämällä nämä tiedot omalla käsin kuratoinut ihmisen signalointiverkolla sisältäviä 4000 proteiineja ja 22000 signalointi suhteet [21], [22], [23].

Proteiini vuorovaikutusverkosto rakennettiin kunkin hormonin käyttämällä manuaalisesti kuratoinut ihmisen signalointiverkolla ja proteiini-to-proteiini-vuorovaikutuksen kautta. Me vain katsoi proteiineja, jotka olivat ≥2.5 kertaa hormonin ehto runsaus (signaali) vs. ajoneuvonhallintajärjestelmän runsaussuuntaukseen MS aineisto, katsotaan merkittävästi läsnä. Verkon, solmu ja linkki ovat proteiini ja vuorovaikutus, vastaavasti. Löytää erittäin toisiinsa alueilla verkon kunkin hormoni, me sijoitettiin kunkin parin vuorovaikutuksen määrän perusteella viereisten solmujen niillä on yhteistä. Tämä antoi meille matriisi, jossa kaikki tulokset kaikkien vuorovaikutusta paria. Hierarkkinen klusterointi levitettiin matriisi ja kynnyspisteytyksen lasketaan osion tiheyden avulla voimme tunnistaa hyvin toisiinsa alueilla (klustereita) kunkin hormonin verkkoja.

Seuraavaksi käytimme näitä proteiinia klusterit ja tunnistettu GO-ehdot (https://www.geneontology.org/), jotka liittyvät merkittävästi kuhunkin proteiinin klustereiden (p-arvo 0,05, hyper-geometrinen). Käytimme myös Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) määritelty väyliä ja suorittaa GSEA jos 25% proteiinista klusterin geenit olivat kautta. Sillä reitit ja GO-termejä, jotka olivat merkittävässä määrin GSEA tulokset (p-arvo 0,05), teimme myös selviytyminen analyysi. Käytimme geenejä, jotka liittyvät näihin GO-ehdot ja suorittaa GSEA käyttämällä GSE21034 [24].

RNA uuttamisen ja mikrosiruanalyysillä

LNCaP-soluja stimuloidaan paneelin edellä kuvatulla tavalla ligandit, ja kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA-näytteet käsitellään sitten Quebec Genome Innovation Centre (McGill University, Montreal, Kanada), sillä mikrosiruanalyysi kanssa Illumina ihmisen HT-12 Expression BeadChip v4 (Illumina, San Diego, CA). Raakadataa käsiteltiin käyttäen R [22], [25].

Kaksi globaali lämpökarttoja tehtiin. Ensimmäinen heatmap sisältää eniten ilmentyvät eri geenistä kunkin hormonin käyttäen t-testiä (p-arvo 0,05), jossa kukin hormoni verrataan kaikkia muita. Toinen heatmap sisältää top 10, 20, 50 ja 100 geenit korkein varianssi. T-testin löytää eniten differentiaalisesti ilmentyvien geenien, jotka ovat ominaisia ​​kullekin hormoni, kun taas varianssi auttaa meitä tarkkailla geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti useiden hormonien. GSEA analyysi tehtiin käyttämällä GSE21034 [24], ja 10, 20, 50 ja 100 geenit, jotka osoittivat korkeinta varianssi.

Progression ja Survival Analysis

geeniekspressioprofiilien, elossaololuku data, ja demografiset tietoa 267 kliinistä eturauhasessa (29 normaali, 181 ensisijaista ja 37 etäpesäkkeitä) saatiin GSE21034 [24]. Rinta-, keuhko-, lymfooma ja varhaissolukasvaimesta aineistot saatiin Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi) [26]. Tutkimme jälkeisen eturauhasen ennustetekijöiden arvoja aliverkon perustuvan geeniekspressioprofiilien primaarikasvainten, ja suoritetaan Kaplan-Meier-analyysi toteuttamalla Cox-Mantel log-rank -testi R kuten aiemmin on kuvattu [22], [25]. Jos p-arvo on alle 0,05, aliverkon käsiteltiin tilastollisesti merkittäviä luokitella kasvainten osaksi ei-metastaattinen ja etäpesäkkeitä. Me kerrostunut toistuvat vs. kertaluonteisia CaP syöpä perustuu seuraavat kriteerit: PSA (≥4 ng /ml), Gleason (≥7), kasvain vaihe (≥3) ja yhdistetty (PSA + Gleason + kasvain).

rakenne valmistelu MD simulointi

kiderakenne DHT (1I38) ja CPA (2OZ7) sidottu T877A mutantti AR-LBD ja testosteroni (2AM9) ja R1881 (1E3K) sitoutuneena villityypin AR LBD ovat saatavilla Protein Data Bank (PDB). Kompleksit sitoutuneita erilaisia ​​ligandeja kuin T877A mutantti AR-LBD olivat edelleen valmis MD simulaatiot Xleap [27] ja AMBER10 [28]. Yleistetty AMBER voimakenttä (GAFF) ja ff99SB [29] parametrejä käytettiin kahdeksan eri ligandeja. Kompleksi solvatoitiin typistetyn octahedron TIP3P [30] veden ruutuun. Välinen etäisyys kotelon seinään ja lähin atomi liuenneen aineen oli 12,0 Å, ja lähin etäisyys liuenneen aineen ja liuottimen atomien oli 0,8 Å. Vastaionit (Cl

-) lisättiin sähköisen neutraalisuuden säilyttämiseen järjestelmän. Kukin järjestelmä minimoitu, ensin soveltamalla harmoninen rajoitukset voimalla vakioita 10 kcal /mol /Å

2 kaikille liuenneen aineen atomit; Toinen, kuumentamalla 100-300 K yli 25 ps vuonna kanoninen ensemble (NVT); ja lopuksi tasapainottamalla säätää liuottimen tiheys 1 atm paineessa 25 ps in isoterminen-isobaarinen ensemble (NPT) simulointi. Harmoninen rajoitukset sitten asteittain vähentää nollaan neljä kierrosta 25-ps NPT simulaatioita. Sen jälkeen ylimääräinen 25-ps simulaatio, 15 ns tuotantoajolla saatiin tilannekuvia kerätään joka 1 ps. Kaikkien simulaatiot, 2 FS aika-askel ja 9 ei-sidottu cut-off käytettiin. Hiukkanen mesh Ewald menetelmä [31] käytettiin hoitoon pitkän kantaman sähköstatiikan ja sidospituudet mukana joukkovelkakirjojen vetyatomit rajoittavat LAUKAISUTÄRÄHDYKSEN [32].

Tulokset

Comparative verkko luonnehdinta T877A AR komplekseja: interactome ja geeniekspressiotutkimuksissa

kyky vangita sekä ligandisitoutuneena ja unliganded täyspitkää villin tyypin AR affiniteettikromatografialla fysiologisissa olosuhteissa on aiemmin antanut meille mahdollisuuden jatkaa proteomiikka lähestymistapa, jotta luonnehtivat komponentit villityypin AR komplekseja. Tämä tehtiin suorittamalla tällaisten kompleksien tryptistä ruoansulatusta seuraa massaspektrometria (MS) määrittää proteiinin tunnistamiseen, itse asiassa luoda AR interactomes aloittanut ligandin sitoutumisen [33]. Meidän MS-tiedot, tarra-vapaa kvantitatiivinen menetelmä on nyt sovellettu useissa eri kokeellinen paradigmoja (katso materiaalit ja menetelmät) [19], [20], joka antoi meille mahdollisuuden saada tietoja, jotka liittyvät proteiinin tunnistamiseen, yhdessä runsaasti, mikä mahdollistaa suoran vertailun stimulaatio olosuhteissa.

tavoitteena ero hormoni stimulaatio olosuhteet voimme selvittää taudin etiologia T877A-AR mutaatio riippuu ligandi ja kofaktorin tila. Siksi käytimme LNCaP-soluja, jotka ilmentävät endogeenisesti T877A-AR mutaatio luonnehtia ligandiin siveetön proteiini interactome komplekseja eri hormonitilat, jotta voidaan tuoda esiin mahdolliset erilliset komplekseja, jotka voidaan liittää taudin etenemistä. LNCaP-soluja stimuloitiin seuraavat hormonit, neljä androgeenit: DHT, mibolerone (MB), R1881: tä, tai testosteronin (läsnä ollessa finasteridi (estää testosteronin ja DHT), ja 17β-estradioli, progesteroni, deksametasoni, tai antiandrogeeninen cyproterone actetate (CPA), yksin tai ilman ligandi /alkoholi-ajoneuvon hallinnan. hormoni stimuloi T877A-AR komplekseja immunopuhdistetun kanssa N-pään erityinen AR-vasta, joka ei häiritse hormonin sitoutumisen AR ligandiin tä sitovaa verkkotunnuksen. eluaatit koeolosuhteiden analysoitiin LC-MS /MS: llä. jotta kasvattaa näyte taajuus peptidin havaitseminen meidän MS-analyysia kukin koetilalle suoritettiin neljä kertaa. meidän proteomiikka tiedot on koottu vain täysin tunnettu proteiinit, täysin geeni ontologian ja toiminta.

Quantitative MS tiedot, kunkin kahdeksan hormoni stimulaatio olosuhteissa, käytettiin luomaan proteiini vuorovaikutuksen kartta (kuvio 1A). proteiini vuorovaikutusverkosto kartta, mahdollistaa visuaalisen suhteen analyysi vuorovaikutuksen kunkin proteiinin mutantti AR. On erittäin todennäköistä, että kaikki proteiinit ovat suorassa vuorovaikutuksessa mutantti AR, mutta voi välittävien proteiinien kanssa. Edelleen ontologisten toiminto luokittelu (katso materiaalit ja menetelmät) perustuu tähän vuorovaikutukseen verkkokartassa, vaativien merkittäviä klustereita vuorovaikutuksessa proteiinien lukumäärän perusteella proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen yhteyksiä. Kahdeksan hormoni stimulaatio T877A-AR-proteiinin luettelot, me sitten systeemisesti soveltaa hierarkkinen ryhmittely analyysin koeolosuhteissa. Hierarkkinen klusterointi lämpöä karttoja edustaa ryhmittely välillä koko T877A-AR agonisti ja antagonisti koehoitoja synnytettiin sitten (kuvio 1 B). Eri koeolosuhteet (hormoni hoidot), vertaileva verkostoanalyysi sovellettiin [21], [22], [23], ja vaikka neljä erilaista androgeeneja on käytetty (DHT, testosteroni, MB ja R1881), Proteomiikan profiilit näiden androgeenireseptorin ligandit eivät eroteltava yhdessä, ja havaitsimme, että progesteroni ja deksametasoni AR kompleksit ovat proteomic profiileja, jotka näyttävät R1881 ja MB, vastaavasti. Lisäksi proteiini-vuorovaikutuksen monimutkainen AR-estradioli-stimuloidun kompleksit oli samankaltaisin AR-DHT vasteen interactome.

. Määrälliset proteiini vuorovaikutusverkosto DHT stimuloi LNCaP. Arvo kunkin proteiinin määritelty myös merkkivapaalla määrällisiä MS, erottuu Sekä väri ja koko, ja osa-vissa proteiini-proteiini vuorovaikutusten. AR on nimennyt musta ympyrä. Määrittää suhde proteiini-vuorovaikutuksen ja geeniekspressiomalleja, hierarkkinen ryhmittely monen paneelin hormoni-stimuloitujen LNCaP-solujen suoritettiin. B. Vuorovaikutus proteiinit tunnistettiin massaspektrometrillä. C. Useimmat vaihtelevasti ilmaistuna geenejä ligandin stimulaation. Vaikka on ehdotettu, että kaikki hormonit kykenevät aktivoimaan androgeeniriippuvaisissa geenin transkription kanssa T877A-AR-mutantti-reseptorin, välillä on eroja AR-proteiinin kompleksit ja AR geeniekspressiomalleja. Tämä klusterianalyysillä osoittaa, että jopa synteettiset androgeenit kuten Mibolerone (MB) ja R1881, on samanlaiset geeniekspressioprofiilien, niiden proteiini-vuorovaikutus kompleksit ovat lähempänä deksametasoni (DEX) ja progesteroni (PGR), vastaavasti, kuin joko luonnollisia androgeenit testosteroni ja DHT. Lisäksi jopa luonnollinen androgeenit (DHT ja testosteroni) voidaan erottaa niiden proteiinikomplekseina. Tämä viittaisi siihen, että on olemassa toimintoja AR yli geenin transaktivaatiota. Proteiinin ja geeniekspression arvot ilmoitetaan suhteessa määrällisten proteiinin jokaisen stimulaation vs. ajoneuvon hallinnan stimulaatiota.

edennyt luonnehtia geeniekspressiomalleja usean paneelin hormoni stimuloi LNCaP. Analyysi useimmat vaihtelevasti ilmaisi geenien välillä hormoni olosuhteet antoivat hierarkkinen klusterointi kuvio, joka oli hyvin erilainen kuin T877A-AR proteiini-vuorovaikutuksen profiilin (kuvio 1 C). On varsin selvää, me jälleen havaittu, että eri androgeenit käytetään näissä stimulaatio profiilit eivät eroteltava yhteen, ja että synteettiset androgeenit, kuten R1881 ja MB, ei ole sama AR stimuloimaa transaktivaation profiilit kuin luonnollinen ligandien kuten testosteronin ja DHT. Lisäksi toiminnalliset ontologisia ominaisuuksien välillä proteiini-vuorovaikutuksen vs. geeniekspressioprofiilien meidän ero ligandin stimuloiduista soluista myös näyttävät olevan hyvin erilainen. Vaativille vaikutus sairauden etenemiseen Näistä profiileista oli erityisen kiinnostavaa.

Muodosta tilastollisesti merkitsevä biologisiin toimintoihin, toteutimme sisällyttäminen Gene Ontologinen (GO) /reitit ehdot käyttäen DAVID (Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Käyttämällä proteiini vuorovaikutuksen tiedot kaikista ligandin stimulaation olosuhteissa suuret ontologinen toiminnot ovat: RNA pol II-riippuvaisen transkription, proteiinin biosynteesin, jossa komponenttien translaatiokoneistolla (translaation aloituksen, venymä tekijät, ribosomaalisen proteiinien ja muiden sääntelyyn proteiinit), RNA aineenvaihdunta (erityisesti silmukointi), DNA: n korjaukseen (kautta vuorovaikutus jäsenten DNA korjaukseen kompleksi), ja proteasomin /ubikinaa- reittiä (katso taulukko S2). Sen sijaan ligandista riippuvan geeniekspression kuvio ontologisia luokkiin sisältyvät reittejä mukana DNA: n replikaatioon, steroidi /sterolin biosynteesin, ja apoptoosi (katso taulukko S3). Näin ollen vaikka AR on klassisesti kuvattu transkriptiotekijän, sen proteomia profiili viittaa siihen, että AR pystyy toimintoja kuin, mitä on alun perin kuvattu geenin aktivaattori.

Rakenteiden analysointi hormonin sitoutumisen T877A AR

tutkimaan mahdollisia mekanismeja, joiden ligandien sitoutumalla mutantti AR luoda erilaista AR vuorovaikutuksessa proteiinien, saimme yksityiskohtainen konformaatiota reseptorin, käyttäen 15 ns molekyylidynamiikkalaskenta (MD) simulaatiotutkimuksia (katso materiaalit ja menetelmät) kahdeksasta eri ligandit. Käyttäen telakointiohjelmaa WILMA (kuva 2), saimme rakenteellisten tietojen mutantti AR sidottu progesteroni, estrogeeni, deksametasoni ja MB. Rakenteellinen tiedot mutantti AR testosteronin DHT, R1881 ja syproteroniasetaatti ovat jo saatavilla ja sellaisenaan, nämä rakenteet toimi lähtökohtana MD simulointitutkimuksiin.

Telakka ohjelma WILMA käytettiin tutkimaan rakenteellisten muutokset ligandia sitovan domeenin T877A-mutaatio, sitoutumisen jälkeen ligandin sitoutumisen. Illustrated on keskimääräinen rakenne T877A-AR mutaatio ligandisitoutumisdomeeni kahdeksalla eri ligandien. A. testosteroni, B. DHT, C. R1881, D. MB, E. estrogeeni (EST), F. progesteroni (PGR), G. CPA, H. deksametasoni (DEX). Punainen laatikko korostetaan muutoksia helix α 11 silmukan sitoutumisen kullekin hormoni ligandiin.

Mutant AR MD simuloinnit tehtiin yli 15 ns sarjoihin. Tarkastaa paikallisen joustavuuden kunkin proteiinin /hormoni monimutkainen, laskimme root-mean-squared poikkeama (RSMD) vaihtelut runkoatomeista kunkin aminohappotähteen kunkin mutantin AR monimutkainen. Tutkimuksessa globulaarisen proteiinin konformaation, yksi tavallisesti mittaa samankaltaisuus kolmiulotteinen rakenne, jonka RMSD Keski hiiliatomia aminohappoja sen jälkeen, kun optimaalinen jäykkä runko superpositio. Merkittävin vaihtelut vastaavat silmukka-alueet välillä α3 /α4, α9, α10 /α11 ja α11 /α12 ja kierteet α11 ja α12 itseltään LBD AR (kuva 3). Voidaan nähdä, että silmukassa α9, α10 ja α11 on joustava alue kaikki kompleksit (Kuvio 3B). Niistä kahdeksan erilaista AR ligandiin sidottu kompleksien testosterone- ja estradioli-sidottu kompleksit osoittavat korkeimman joustavuus, joidenkin loop jäämiä ottaa RMSD vaihtelut peräti 2,4 Å. Vaikka nämä silmukat ovat kaukana hormoni sitovaa tasku, ne altistuvat pintaan ja voi palvella tehtävä potentiaalisina sitoutumiskohtia toisen proteiinin kanssa.

. Päällekkäin keskimäärin rakenteet kaikkien kahdeksan ligandi sitoutuu reseptoriin komplekseja. B. alueet T877A AR-LBD silmukan välillä Helixα9 ja Helixα10 osoitti mahdollisimman joustavasti. C. laajennettu näkymä Helix α11 ja Helix α12 alueilla T877A AR-LBD sidottu kahdeksan eri ligandeihin tutkittu tässä tutkimuksessa. Jäämiä α11 ja α12 ja silmukka niiden välillä osoitti suurempaa joustavuutta verrattuna muihin alueisiin reseptorin jossa T877A sijaitsee. Väri vastaa seuraavaa ligandeista: Green – testosteroni, Cyan- DHT, Yellow-R1881, Pink-MB, Rose- EST, harmaan PGR, Orange-CPA, violetti-DEX.

Toinen suuria eroja havaittu mutantti AR kompleksit ovat kannat α11 ja 12, joiden tiedetään olevan kriittisiä sanele hormonin sitomisesta ja koaktivaattori-vuorovaikutuksia. Jäämiä α11 ja α12 ja silmukka niiden välillä osoitti suurempaa joustavuutta (kuvio 3C). T877A-AR mutaatio sijaitsee α11 mahdollistaa tilavampi hormoneja sitovien tasku ja mahtuu steroidit erilaisia ​​laajennuksia sisällä D-renkaan.

tarkastelu luonne ja koko liuotinpääsyisellä pinta-ala (SASA ) proteiinien on tärkeä väline mitata mahdollisia vuorovaikutus alttiutta naapurimaiden proteiineja. Laskimme keskimääräinen SASA kunkin AR kompleksi 15 ns MD kehityskaari. Ei suuria eroja havaittu joukossa laskettu SASAs erilaisten AR mutantti komplekseja, jotka vaihtelivat 12124 ja 12390 Å

2. Nämä tulokset osoittavat, että erot ovat enimmäkseen liittyvät α11-α12 alueilla AR-LBD, jossa T877A-mutaatio sijaitsee. Siksi päätimme vertailla dynamiikka joukossa kahdeksan eri komplekseja, erityisesti tällä alueella, käyttämällä RMSD matriiseja (taulukko 1). Matriisit, joka olennaisesti kaapata ääriliikkeet, paljastaa alueilla suuri joustavuus, erityisesti CPA ja deksametasoni, verrattuna muihin AR-ligandikompleksit.

Laskennallinen mallinnus on tehty myös useita muita AR somaattiset mutaatiot ligandia sitovan domeenin (LBD), ja näyttää herkkyys laajan hormonin ligandien, mukaan lukien, AR-W741L [34], -L701H [35], [36], [37], [38] , -H874Y [39], [40], [41] ja -F876L [13]. Määrittäminen LBD rakenteen välillä AR-WT ja -H874Y (läsnä 22Rv1 soluissa), jolloin sitoutunut testosteroni, kun läsnä on N-terminaalisen FXXLF motiivin peptidin tai TIF2 koaktivaattoriproteiinin peptidi, todettiin, että kaikki rakenteet noudatettiin kanoninen tumareseptorin LBD kertainen [41]. Lisäksi -H874Y DHT ja R1881 rakenteita sopeutui -T877A ja -W741L LBD sidottu steroidi ja nosteroid ligandit [34], [42]. Kaksinkertainen AR-mutantti solulinjat MDA-PCa-2a ja MDA-PCa-2b, hallussaan L701H ja T877A somaattiset mutaatiot, nämä solut Samantapainen AR transaktivaatiota ja LBD rakenteelliset ominaisuudet yhden AR-T877A mutantti LNCaP-solujen laaja of steroidiligandeja ja antiandrogeenit, mutta ne osoittavat myös lisääntynyt herkkyys kortisolin steroidien [35], [36].