Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sekä S100A14 ja S100A16 ovat jäseniä monimuotoisen S100 proteiinin perheen. Muodostaminen homo /heterodimeerien pidetään yhtenä suurimmista mekanismeja S100 proteiinien suorittamiseen erilaisia ​​solutoiminnoille. Käyttämällä klassisen Hiiva kahden hybridi (Y-2 H) näyttö, tunnistimme S100A16 ainoana vuorovaikutusta kumppani S100A14. Tämä vuorovaikutus varmistettiin samanaikainen immunosaostus kaksinkertainen epäsuoralla immunofluoresenssilla ja kaksinkertainen immunovärjääminen yksilöiden suun okasolusyöpä ja normaali suun limakalvoilla. Toiminnallinen merkitys tämän vuorovaikutuksen tutkittiin käyttämällä retrovirusvälitteisiä yli-ilmentyminen ja knock-down näiden proteiinien useissa syöpäsolujen-linjat. Yli-ilmentyminen ja knock-alas S100A14 johti samanaikaisesti ylös- ja alas-säätely S100A16 proteiinin solulinjojen tutkittu. Kuitenkin, ei ollut ylös-säätely S100A16 mRNA upon S100A14 yli-ilmentyminen, mikä osoittaa, että modulaatio S100A16 ilmaisua ei johtunut tehostetun transkriptionaalista aktiivisuutta mutta mahdollisesti transkription jälkeisen sääntelyn. Vuonna Päinvastoin, yli-ilmentyminen S100A16 liittyi kumpikaan kanssa säätely ylöspäin S100A14 mRNA eikä sen proteiinia, mikä viittaa yksisuuntainen sääntelyn välillä S100A14 ja S100A16. Cellular hoito proteiinisynteesi-inhibiittorin sykloheksimidiä osoitti ajasta riippuvaa solunsisäisen hajoamisen sekä S100A16 ja S100A14 proteiineja. Lisäksi sääntely S100A16 ja S100A14 hajoaminen todettiin olevan riippumaton klassisen proteasomaalisten ja lysosomaalisen reitit proteiinien hajoamista. Lisätutkimukset siis tarpeen ymmärtää toiminnallisen merkityksen tämän vuorovaikutuksen ja mekanismit kuinka S100A14 on mukana säätelyyn S100A16 ilmaisun.

Citation: Sapkota D, Costea DE, Ibrahim SO, Johannessen AC, Bruland O (2013) S100A14 vuorovaikutuksessa S100A16 ja säätelee ilmentäminen ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (9): e76058. doi: 10,1371 /journal.pone.0076058

Editor: Zhihua Liu, Kiinan Academy of Medical Sciences, Kiina

vastaanotettu: 14 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 20 elokuu 2013; Julkaistu: 27 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Sapkota et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Bergenin yliopiston (post-doc rahasto, DS) ja Bergen Medical Research Foundation (DEC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

S100-proteiini perhe on monitoiminen ryhmä EF-käden kalsiumia sitovia proteiineja. Tämä perhe koostuu pienistä happamia proteiineja (10-12 kDa), jotka ilmenevät vain selkärankaisilla solussa ja kudosspesifisellä tavalla. Tähän mennessä 25 S100-proteiini jäseniä on kuvattu ihmisellä. Jäsenet S100-proteiinin on osoitettu säätelevän useita biologisia prosesseja, kuten solusykliä, solun liikkuvuus, signaalitransduktion, proteiini fosforylaatio, transkriptio, solujen selviytymisen ja apoptoosiin, liittyy normaaliin kehitykseen ja karsinogeneesin [1,2]. Huolimatta näistä erilaisia ​​toiminnallisia rooleja, S100 proteiinit eivät omaa mitään entsymaattista toiminta muodostaisi niiden solujen toimintaan [3,4]. Yksi niistä mekanismeista niiden monipuolinen solutoimintojen on kyky enemmistön S100 proteiinien suorassa vuorovaikutuksessa useiden muiden solun proteiinien kanssa, jolloin ne moduloivat niiden toiminnot [3]. Useat jäsenet S100 proteiinit voivat muodostaa homodimeerejä /oligomeerejä (esimerkiksi: S100A4 [5], S100B [6]) tai heterodimeerejä (esim välistä vuorovaikutusta S100A8 ja S100A9 [7], välillä S100A4 ja S100A1 [8], välillä S100B ja S100A6 [6]), ja nämä homo /heterodimer- muodostumisen katsotaan olevan tärkeä niiden solujen toimintoja.

S100A14 on viime lisäksi S100 proteiinin perheen [9,10]. Differential ilmentyminen S100A14 on raportoitu useissa ihmisen syövissä [9,11]. Olemme äskettäin raportoitu roolin S100A14 säätelyssä leviämisen ja invaasion suun okasolusyöpää (OSCCs) [12,13]. S100A14 havaittiin ekspression modu- useita molekyylejä, mukaan lukien p21, MMP-1 ja MMP-9 in OSCC peräisin olevat solut [12,13]. Lisäksi biologinen rooli tämän proteiinin on raportoitu muissa ihmisen syövissä, kuten ruokatorven [14] ja paksusuolen syövissä [15]. Kuitenkin tarkka mekanismi ja molekyylitason signalointi S100A14 ihmisen syövässä, ei täysin ymmärretä. Koska voittopuolisesti kalvo proteiini [12] N-myristoylaatio- site at N-päässä [9], se voidaan spekuloida, että S100A14 saattavat vuorovaikutuksessa muiden proteiinien mahdollisesti mukana signaalinvälitykseen. Näin ollen, S100A14 on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa kalsiumista riippuvaisella tavalla nucleobindin [10], proteiini ehdotettu olevan mukana G-proteiiniin kytketyn signaalin transduktio [16]. Kuitenkin kyky S100A14 muodostaa heterodimeerejä muiden S100 proteiinien ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että S100A14 vuorovaikutuksessa toisen S100 proteiinia, S100A16, ja moduloi sen ilmentymistä ihmisen syövän solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

suun okasolusyöpä johdettuja solulinjoja: CaLH3 [17], H357 [18], VB6 [19] ja OSCC1 [13] viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. HeLa-solut (ATCC, CCL-2

TM) on rutiininomaisesti yllä Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (cat no: D6429, Sigma), johon oli lisätty 10% FCS: ää. Kaikki solulinjat kasvatettiin kosteutetussa ympäristössä, jossa on 5% CO

2 37 ° C: ssa. Kaksikymmentä neljä tuntia ennen hoidon inhibiittorit, 1.0×10

5 1.5×10

5 solua per kuoppa maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Soluja käsiteltiin 0, 50, 100 tai 150 uM proteosomal estäjä MG-132 (cat no: C2211, Sigma) 5 ja 10 tuntia; 0, 50, 100 tai 150 uM lysosomaalisen estäjä kloorikin (cat no: C6628, Sigma) 24 tunnin ajan ja 200 ug /ml inhibiittorin sykloheksimidiä (cat no: # 239763, Calbiochem) 0, 3, 5, 7 ja 8 tuntia. Seuraavat käsittelyt solut lyysattiin 1X RIPA-puskurilla ja käytettiin immunoblottauksella. Expression of S100A16 proteiinin laskettiin suhteessa ilmentymistä GAPDH tasojen (Multi Gauge ohjelmistoa, versio 3.2, Fujifilm Corporation) ja graafisesti prosenttia S100A16 proteiinia jälkeen jäljellä sykloheksimidikäsittelylle (tuloksia ei ole esitetty). S100A16 puoliintumisaika (

t

1/2) laskettiin käyttäen GraphPad prisma 5.03 Windowsille (GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA, www.graphpad.com).

Hiiva kaksi- Kaksoishybridiseulonta (Y-2H-näyttö) B

koodaavat sekvenssit ihmisen S100A14 fuusioitiin lukukehykseen GAL4 DNA: ta sitova domeeni pGBT9-vektorin tuottamiseksi pGBT9-S100A14 syötti konstrukti. Y-2H seulontapalvelun ostettiin Saksan Cancer Research Center, Heidelberg, Saksa. Lyhyesti, pGBT9–S100A14 konstrukti kotransfektoitiin ihmisen cDNA keratinosyytti kirjastojen

Saccharomyces cerevisiae

. Positiiviset kloonit tunnistettiin TRP1 valinta 0 mM 3-aminotriatsolia. Kaikki positiiviset kloonit sekvensoitiin Sangerin sekvensoinnilla. Yksityiskohdat pGBT9–S100A14 syötti rakenne ja Y-2 H seulonta protokollat ​​ovat saatavilla pyynnöstä.

Co-immunosaostus (Co-IP) B

CaLH3 solut hajotettiin jääkylmässä lyysipuskuria ( 1X RIPA-puskuria, cat no: 89901, Pierce Biotechnology), jota on täydennetty proteaasi (Halt proteaasiestäjäseostabletit kit, cat no: 78410, Pierce Biotechnology) ja fosfataasi (Phosphatase inhibiittoricocktailia 2, cat no p 5726, Sigma) estäjät. Solu-uutteet esipuhdistettiin inkuboimalla proteiini A /G Plus-agaroosi (cat no: sc-2003, Santa Cruz) 30 minuutin ajan. Viisisataa mikrogrammaa esiselkeytettiin solu-uutetta inkuboitiin 3 ug polyklonaalista kanin anti ihmisen-S100A14 (cat no: 10489-1-AP, Proteintech) tai polyklonaalinen kaniinin anti ihmisen S100A16 vasta-aine (11456-1-AP, Proteintech) 1 tunti 4 ° C: ssa pyörivän kiekon päällä läsnä ollessa 0-2 mM CaCl

2 tai 2 mM CaCl

2 5 mM EDTA. Vain lysaattia (ilman vasta-ainetta) ja polyklonaalinen anti-MMP-9-vasta-(kissa no: sc-10737, Santa Cruz, isotyyppiä IgG) käytettiin ohjauslaitteet Co-IP. Sen jälkeen 70 ui uudelleen suspendoitua Protein A /G Plus-agaroosi (cat no: sc-2003, Santa Cruz), lisättiin lysaattia-vasta-aineen sekoitus, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa pyörivän kiekon päällä. Inkuboinnin jälkeen helmet sentrifugoitiin 1000 x g 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti heitettiin pois. Helmet pestiin 4 kertaa PBS: llä, suspendoitiin uudelleen ja keitettiin 90 4 ° C: ssa 5 min 30 ul: SDS-näytepuskuria ja immunoblotattu kanin polyklonaalista anti-ihmis-S100A16 (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1 : 500 laimennokset) tai polyklonaalista kanin anti ihmisen S100A14 vasta-aine (10489-1-AP, Proteintech, 1: 1000 laimennosta).

Rakentaminen ja transfektio ilmaisun ja shRNA vektorit

S100A14 ekspressiovektoriin rakennettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Ihmisen cDNA, joka koodaa S100A16 monistettiin käyttämällä alukeparia (F: 5 ’-ATCCCGCGGCAGGGAGATGTCAGACTGCTA-3′ ja R: 5’-TGAGGATCCCTAGCTGCTGCTCTGCTG-3 ’) ja subkloonattiin pRetroX-IRES-ZsGreen1 retroviruksen ekspressiovektoriin (Clontech Laboratories, Inc., CA , USA). shRNA kohdistaminen

S100A14

mRNA muodostettiin käyttäen seuraavia oligonukleotideja: shRNA1 (F: 5′-GATCCCCTTGTGTAAGAGCCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGGCTCTTACACAATTTTTGGAAA-3 ’; R: 5′-AATTTTTCCAAAAATTGTGTAAGAGCCAAAGAATCTCTTGAATTCTTTGGCTCTTACACAAGGG-3′), shRNA2 (F: 5’-GATCCCCAGGGTCTTTAAGAACCTACTTCAAGAGA GTAGGTTCTTAAAGACCCTTTTTTGGAAA- 3 ’, R: 5′- AATTTTTCCAAAAAAGGGTCTTTAAGAACCTAC TCTCTTGAAGTAGGTTCTTAAAGACCCTGGG-3′), shRNA3 (F: 5’-GATCCCCGAACCTACTTCCTAATCTCTTCAAGAGAGAGATTAGGAAGTAGGTTCTTTTTGGAAA-3 ’; R: 5′- AATTTTTCCAAAAA GAACCTACTTCCTAATCTCTCTCTTGAAGAGATTAGGAAGTAGGTTCGGG-3’). Oligonukleotidit ja lisätään RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express-ekspressiovektoriin (cat. No: 632487, Clontech). shRNA kohdistaminen

LacZ

geeniä käytettiin kontrollina S100A14-shRNAs. Syöpäsolu-linjoja tartutettiin retrovirusten johdettu pakkaus (Phoenix A) soluja, lajiteltu (GFP /DsRed merkkiaineena), lisätyistä, todentaa yli-ilmentyminen ja knockdown vastaavien proteiinien ja toiminnallisissa määrityksissä käytettäväksi.

RNA: n uutto, cDNA-synteesi ja kvantitatiivinen RT-PCT (qRT-PCR) B

Yhteensä RNA uutettiin syöpäsolun-ratoihin RNeasy sidekudoksen mini kit-protokollan (kissa ei: 74704, Qiagen Inc. , Valencia, CA, USA). Sen jälkeen valmistajan ohjeiden, 600 nanogrammaa kokonais-RNA muunnettiin cDNA käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit järjestelmä (kissa ei: 4368814, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kaikki qRT-PCR-monistukset suoritettiin ABI Prism Sequence Detector 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, USA), kuten aiemmin on kuvattu [12]. TaqMan-määritys

S100A16

(Hs00293488_m1) ja SYBR vihreä, joka perustuu qRT-PCR: llä (käyttäen samoja alukepareja kuin rakentamiseen S100A14 ekspressiovektori) suoritettiin määrittää

S100A16

ja

S100A14

mRNA syövän solulinjat. Vertaileva 2

-ΔΔ Ct menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen mRNA: n ilmentymisen.

Immunoblot

Kaksikymmentäviisi ja 40 ug proteiinia ratkaistiin NuPAGE® Novex 4-12% tai 10 % bis-TrisTris geeli (Life Technologies, NY, USA) NuPAGE® MOPS /MES SDS ajopuskurin (Life Technologies, NY, USA) ja immunoblotattu polyklonaalisella kanin anti ihmisen-S100A14 (10489-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 1000 laimennosta), polyklonaalinen kaniinin anti ihmisen-S100A16 (11456-1-AP, Proteintech, Chicago, IL, USA, 1: 500 laimennosta) ja monoklonaalinen hiiren anti ihmisen p53 (sc-263, Santa Cruz Biotekniikka, CA, USA, 1: 1000 laimennosta) seuraavan standardin western blot-protokollaa. Anti-GAPDH (sc-25778, Santa Cruz, 1: 5000 laimennosta) käytettiin latauskontrollina. Blotit visualisoidaan tehostetun kemiluminesenssin (SuperSignal

® West Pico, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) ja kuvien havaittiin on Fujifilm Las-4000 skanneri.

Double epäsuoralla immunofluoresenssilla (DIF)

käyttö OSCCs ja niiden vastaavassa normaalissa limakalvolle DIF ja immunohistokemia hyväksyttiin alueneuvoston Lääketieteen ja Health Research Ethics, Länsi-Norjassa. Kirjallinen suostumus saatiin osallistujan tutkimuksen. Viisi um osat OSCCs ja niiden vastaavassa normaalissa limakalvo poistui-paraffinized, vedettömät tavanomaisten menettelyjen mukaan ja lämmön epitooppisup- haku suoritettiin Tris-EDTA-puskuriin (pH 9,0) käyttämällä mikroaaltoja (kissa no: NN-L564W, Panasonic, Osaka , Japani). Sen jälkeen, ensimmäinen ensisijainen vasta-aine (kanin polyklonaalista anti S100A16 vasta-aine, 11456-1-AP, Proteintech, 1:50 laimennosta) levitettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin. Näytteet inkuboitiin Fab-fragmentti vuohen anti-kani IgG: tä (cat no 111-007-003, Jackson Immuno- Research, 01:50 laimennokset) 2 tuntia, jotta kytkentä kanin IgG vuohen Fab [20]. Sen jälkeen näytteet inkuboitiin hiiren anti-GoatDyLight 488IgG (cat no 205-485-108, Jackson Immuno- Research, 01:50 laimennokset) sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan, pestiin, blokattiin 10% vuohen seerumia 1 tunnin ajan ja toinen primäärinen vasta-aine polyklonaaliset kanin anti-S100A14 (cat no: 10489-1-AP, Proteintech, 1: 600 laimennokset), levitettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen, sekundaarinen vasta-aine Vuohen anti-kani Alexa fluor

® 568 (cat no: A-11011, Invitrogen, 1: 200 laimennokset) levitettiin 1 tunnin ajan, pestiin ja objektilasit kiinnitettiin pidentää

® Gold mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää reagenssia DAPI (cat no: P36935, Invitrogen). Näytteet tutkittiin käyttämällä Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsystems, Saksa) konfokaali laser mikroskoopilla.

Yhden ja kahden hengen immunohistokemia (IHC) B

Yhden ja kahden hengen IHC suoritettiin sarja- osissa OSCCs ja niiden vastaavat normaali limakalvo. Yhden IHC ja S100A16 ja S100A14 suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kaksoisindikaattorimenetelmissä IHC, viisi um leikkeet de-paraffinized, vedettömät tavanomaisten menettelyjen mukaan ja lämmön epitooppisup- haku suoritettiin Tris-EDTA-puskuriin (pH 9,0) käyttämällä mikroaaltoja (kissa no: NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japani) . Blokkaamisen jälkeen peroksidaasilla lohko ja 10% vuohen seerumia, leikkeitä inkuboitiin kanin polyklonaalisen anti-S100A16 (cat no: 11456-1-AP, Proteintech laimennokset 1: 200) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin ja anti-kaniini- vasta-aine, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin merkitty polymeeri (cat no: K4011, DAKO, Golstrup, DK) levitettiin, ja reaktio visualisoitiin käyttämällä ImmPACT VIP (cat no: SK-4605, Vectorlabs, California, USA), kuten entsyymisubstraattia, jolloin violetti reaktiotuotetta. Estämään ristireaktiivisuus myöhempien immunohistokemiallinen reaktio, vasta ensimmäisen reaktioita denaturoitiin kuumentamalla yksilöiden pH 6,0 Target Retrieval Buffer (kissa ei: S1699, DAKO, Golstrup, DK) käyttäen mikroaaltoja (1000 wattia 2 minuutin ajan ja 250 wattia viisi ja puoli minuuttia, NN-L564W, Panasonic, Osaka, Japani) [21]. Sen jälkeen leikkeitä inkuboitiin peroksidaasiin lohko ja 10% vuohen seerumia jälleen ja toinen primäärinen vasta-aine (kanin polyklonaalista anti-S100A14, 10489-1-AP, Proteintech laimennokset 1: 1400) levitettiin ja pestiin. Sen jälkeen anti-kani sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin merkitty polymeeri (kissa ei: K4011, DAKO, Golstrup, DK) levitettiin ja visualisoitiin ImmPACT SG (kissa no: SK-4705, Vectorlabs, Kalifornia, USA), joten harmaa reaktiotuote. Näytteet olivat sitten vastavärjättiin hematoksyliinillä (cat no: S3301, DAKO, Golstrup, DK), kuivattu ja asentaa EuKit kiinnitysväliaine. Näytteet tutkittiin käyttämällä Leica DMLB mikroskooppia.

Tilastot

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastoanalyyseihin, Student’s-

t

testi (pariksi) suoritettiin käyttäen GraphPad prisma 5.03 Windowsille (GraphPad Software, San Diego Kalifornia USA, www.graphpad.com), jonka taso merkitys asetettu 5% .

tulokset

S100A16 todettiin vuorovaikutuksen kumppanina S100A14 sekä

in vivo

hiivasoluissa ja

in vitro

suun syöpää peräisin olevat solut

tunnistaa vuorovaikutuksessa kumppaneita S100A14, ihmisen cDNA keratinosyyttien kirjasto seulottiin kanssa pGBT9–S100A14 syötti rakentaa sisään

Saccharomyces cerevisiae

. Out of 54 positiivista kloonia sekvensoitiin, ihmisen S100A16 tunnistettiin 53 kertaa. DCAF8 tunnistettiin vääriä positiivisia vuorovaikutus kumppanin S100A14. Vuorovaikutus S100A14 ja S100A16 proteiinien varmistettiin samanaikainen immunosaostus käyttäen suusyövän johdettu CaLH3 solulinjassa (kuvio 1A). Vaikka edellinen raportit osoittivat välisen vuorovaikutuksen vahvistamiselle muiden S100 proteiinien läsnä ollessa yhä Ca

2+ pitoisuuksia, Emme havainneet lisätä immunosaostuksella välillä S100A14 ja S100A16 yhä Ca

2+ pitoisuuksina (0,5 ja 2 mM CaCl

2) (kuvio 1A). Ei kuitenkaan yhteisvaikutuksia ei havaittu S100A14 ja S100A16 kun 5 mM kaksiarvoisten metalli-ionikelaattorina EDTA käytettiin yhdessä 2 mM CaCl

2 (Kuva 1A). Käänteinen samanaikainen immunosaostus määritys, jossa käytetään spesifistä vasta-ainetta ja S100A16 vahvistivat lisäksi vuorovaikutusta S100A14 ja S100A16 proteiineja (kuvio 1 B).

Viisisataa mikrogrammaa esipuhdistettiin-uutteella CaLH3 soluja inkuboitiin anti-S100A14 vasta- läsnäolo 0-2 mM CaCl

2 tai 2 mM CaCl

2 5 mM EDTA: ta (A) tai anti-S100A16 vasta-ainetta (B), mitä seurasi inkubointi proteiini A /G Plus-Agarose. Immuuni- komplekseja immunoblotattiin anti-S100A16 (A) tai anti-S100A14 vasta-ainetta (B). Vain lysaattia (ilman vasta-aine) ja anti-MMP-9-vasta käytettiin verrokkeina varten Co-IP. (A) M, molekyylipainomarkkeri; kaista 1, tulo; kaista 2, vain lysaatin; kaista 3, ohjaus anti-MMP-9-vasta-aine; kaistat 4-7 (anti-S100A14 vasta-aine): kaista 4, 0 mM CaCI

2; kaista 5, 0,5 mM CaCI

2; kaista 6, 2 mM CaCl

2; kaista 7, 2 mM CaCl

2 5 mM EDTA. (B) kaista 1, tulo; kaista 2, vain lysaatin; kaista 3, ohjaus anti-MMP-9-vasta-aine; kaista 4, anti-S100A16 vasta-0 mM CaCl

2.

S100A14 lokalisoituu S100A16 yksilöillä OSCCs ja normaalin suun limakalvoilla

DIF ja kaksinkertainen IHC oli suoritetaan OSCCs ja niitä vastaavat normaalin limakalvon tutkia Saharan sijainti solun S100A14 ja S100A16. DIF osoitti kalvomainen kolokalisaation S100A16 ja S100A14 proteiineja epiteelisolujen sekä normaalin suun limakalvojen (kuvio 2A1-A4) ja OSCC (kuvio 2B1-B4). Parallel Näiden tulosten kalvo kolokalisaation näiden proteiinien myös havaittu leikesarjojen normaalia suun limakalvojen (Kuva 2C1-C3) sekä hyökkääviä saaren OSCC (hyvin eriytetty leesio) (Kuva 2D1-D3), jonka yksi ja kaksinkertainen IHC.

Cellular lokalisointi S100A14 ja S100A16 tutkittiin suorittamalla DIF ja IHC kohdissa formaliinia kiinteiden ja parafiiniin OSCC ja normaali suun limakalvon kudoksissa. Pääosin kalvomainen lokalisointi S100A16 (vihreä), S100A14 (punainen) ja S100A16 /A14 (keltainen) visualisoitiin epiteelisoluissa normaalin limakalvon (A1-A4) ja OSCC (B1-B4) kudoksiin DIF (Epth, epiteelin; CT , sidekudos). Samoin yhden ja kahden hengen IHC sarjaväylän osissa, pääasiassa kalvo ilmaus S100A16 (violetti), S100A14 (harmaa) ja S100A16 /A14 (sekoitettu väri) havaittiin normaalissa limakalvon (C1-C3) ja OSCC (D1 -D3).

S100A16 proteiinia, mutta ei mRNA: n ilmentymisen säädellään S100A14 eri ihmisen syövän solulinjoista

biologista merkitystä vuorovaikutuksen S100A14 ja S100A16 on seuraava tutkittiin yli-ilmentävät S100A14 useissa ihmisen syövän solulinjojen (CaLH3, VB6, H357, OSCC1 ja HeLa) käyttäen retrovirusvälitteisiä geeniekspression strategiaa. S100A16 proteiinin tasot havaittiin lisääntynyt kaikissa solulinjojen tutkitut jälkeen yli-ilmentyminen S100A14 (kuvio 3A). Lisäksi shRNA välittämä knock-alas S100A14 liittyi tukahduttaminen S100A16 proteiinin CaLH3 ja OSCC1 solulinjoja (kuvio 3B). Kuitenkin, ei ollut kasvua mRNA: n ilmentymisen tasot S100A16 näiden S100A14 yli-ilmentävien syöpäsolujen-linjat (kuvio 3C).

(A) retrovirusvälitteisiä yli-ilmentyminen S100A14 liittyi samanaikainen ylä- sääntely S100A16 proteiinin CaLH3, VB6, H357, OSCC1 ja HeLa solulinjojen (-, valvonta konstruktio, +, S100A14 ekspressiorakenne). (B) lisäksi shRNA välittämä knock-down of S100A14 vuonna CaLH3 ja OSCC1 solulinjoja liittyi down-regulation S100A16 proteiinia (-, valvonta konstruktio, +, S100A14 shRNA rakentaa). (C) ei kuitenkaan ollut mitään vaikutusta mRNA: n ekspressiotasot

S100A16

yli-ilmentävät S100A14 in CaLH3, VB6, ja H357 solulinjat.

S100A14

ja

S100A16

mRNA ekspressiotasot normalisoituivat

GAPDH

mRNA ilmaisun. Virhe pylväät edustavat SEM 3 biologisen rinnakkaisnäytettä tehty 3 teknisiin rinnakkaista. Student’s-

t

testi (pariksi) suoritettiin tilastollista analyysiä.

S100A16 ei säätelemään

S100A14

mRNA tai proteiini ihmisen syövän solu- linjat

seuraava tutkittava, onko S100A16 yli-ilmentyminen liittyy myös samanaikaisesti muutoksen ilmentymistä S100A14 syövän solulinjoista. Ei ollut mitään merkittävää muutosta ei mRNA (kuvio 4A) eikä proteiinin tasot (kuvio 4B) ja S100A14 jälkeen yli-ilmentyminen S100A16 retrovirus- ilmentymiskonstrukteja.

ei ollut vaikutusta mRNA: n (A) tai proteiini (B) ekspressiotasot S100A14 retroviruksen välittyy-ilmentyminen S100A16 on CaLH3 ja H357 solulinjojen (-, valvonta-konstrukti, +, S100A16 ekspressiorakenne).

S100A14

ja

S100A16

mRNA ekspressiotasot normalisoituivat

GAPDH

mRNA ilmaisun. Virhe pylväät edustavat SEM 3 biologisen rinnakkaisnäytettä tehty 3 teknisiin rinnakkaista. Student’s-

t

testi (pariksi) suoritettiin tilastollista analyysiä.

Sekä S100A16 ja S100A14 proteiinit hajoavat solun sisällä mekanismi (t) riippumattomia proteasomaalisten ja lysosomaalisen reittejä

käyttäminen sykloheksimidikäsittelylle, ajasta riippuva hajoaminen S100A16 ja S100A14 havaittiin sekä ohjaus- ja S100A14 yli-ilmentävät CaLH3 soluja (kuvio 5A). Ei ollut merkittävää eroa S100A16 puoliintumisaika (

t

1/2) välillä ohjaus ja S100A14 yli-ilmentävien CaLH3 soluja (~ 4,8 tuntia versus ~ 5,0 tuntia) (kuvio 5A). Proteasomaalisten ja lysosomaalisen reittejä ovat mukana hajoamiseen enemmistön solunsisäisiä proteiineja. Proteasomaalisten estäjä MG-132 estää tehokkaasti proteolyyttisen aktiivisuuden proteasomin [22] ja lysosomaalisen inhibiittori kloorikin estää lysosomaalisen hydrolaaseja vähentämällä happamaksi endosomaaliseen /lysosomaalisen osastoihin [23]. Käsittelemällä CaLH3 ja HeLa-solut, joissa proteasomaalisten (MG-132) ja lysosomaalisen (kloorikin) estäjät, me seuraavaksi tutkittava, onko näistä reiteistä olivat mukana hajoamiseen S100A16. Mitään merkittävää kasvua tasojen S100A16 jälkeen havaittiin inhibitiota proteasomaalisten (data 10 tuntia hoidon MG-132 ei ole esitetty) (kuvio 5B) tai lysosomaalisen väyliä (kuvio 5C). Taso p53, käytettiin positiivisena kontrollina proteasomaalisten inhibition kokeet, lisättiin odotetusti MG-132 käsittelyä (kuvio 5B). Lisäksi mitään merkittävää säätely ylöspäin S100A16 ja S100A14 havaittiin joko valvonnan tai S100A14 yli-ilmentäviä CaLH3 soluja MG-132 (kuvio 5D) tai kloorikin hoidot (kuvio 5E).

(A ) valvonta ja S100A14 yli-ilmentävät CaLH3 soluja käsiteltiin inhibiittorin sykloheksimidiä aikaa kurssin (0, 3, 5, 7 ja 8 tuntia) ja koko solulysaatit immunoblotattiin anti-S100A16 ja -S100A14 vasta-aineita. Suhteellinen S100A16 lauseke (normalisoitu GAPDH-proteiinin ilmentyminen) piirrettiin ajan myötä ja puoliintumisaika (

t

1/2) laskettiin sekä ohjaus- ja S100A14 yli-ilmentävät CaLH3 soluja (tietoja ei esitetty). -, Valvonta konstruktio; +, S100A16 ekspressiorakenne. Cyclo, sykloheksimidi.

(B) CaLH3 ja HeLa solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla proteasomaalisten inhibiittorin MG-132 (0-150 uM) 5 ja 10 tuntia (tietoja 10 tuntia ei ole esitetty), ja kokosolulysaateille immunoblotattiin anti-S100A16 ja -p53 vasta-aineita. Hoidon MG-132 on liitetty säätely ylöspäin p53 (käytettiin positiivisena kontrollina proteasomaalisten esto-kokeen), mutta ei S100A16 sekä solulinjat.

(C) CaLH3 ja HeLa solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla lysosomaalisen inhibiittorin kloorikin (0-150 uM) 24 tunnin ajan ja kokosolulysaateille immunoblotattiin anti-S100A16 vasta-aine. Kloorikin hoitoon ei liity muutosta S100A16 ilmentymisen sekä soluissa-linjat. Suurempina pitoisuuksina 50 uM kloorikin johti liialliseen HeLa solukuoleman ja siten ei käytetä kokeessa. Kloori, kloorikin.

(D) Ohjaus- ja S100A14 yli-ilmentävät CaLH3 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla proteasomaalisten inhibiittorin MG-132 (0-150 uM) 5 tunnin ajan ja kokosolulysaateille immunoblotattiin anti- S100A16 ja -S100A14 vasta-aineita.

(E) Ohjaus- ja S100A14 yli-ilmentävät CaLH3 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla lysosomaalisen inhibiittorin kloorikin (0-150 uM) 24 tunnin ajan ja kokosolulysaateille immunoblotattiin anti- S100A16 ja -S100A14 vasta-aineita. Kloori, kloorikin.

Keskustelu

Huolimatta monipuolinen toiminnallinen rooleja S100 proteiinit, nämä proteiinit eivät omaa mitään entsyymiaktiivisuutta tilille niiden eri solutoiminnoille [3,4 ]. Yksi mekanismeja, joilla S100 proteiinit suorittavat monipuolinen solutoiminnoille kautta vuorovaikutuksessa ja moduloimalla toimintoja muiden efektoriproteiinit. Viime aikoina olemme [12,13] ja muut [14,15] ovat osoittaneet toiminnallista roolia S100A14 ihmisen syövän synnyn. Osallistuminen S100A14 säätelyssä suun syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota, moduloimalla ilmentyminen useiden molekyylien kuten p21, MMP-1 ja MMP-9, raportoivat viimeaikaiset tutkimukset [12,13]. Nämä havainnot johtivat meidät tutkimaan mahdollisia vuorovaikutuksen kumppanit S100A14 jotka voivat moduloida sen solutoiminnoille. Käyttämällä Y-2H näytön tunnistimme S100A16, toisen jäsenen S100 proteiinin perhe, koska ainoa todellinen vuorovaikutus kumppani S100A14. Tämä havainto oli yllättävä useista syistä. Ensinnäkin ottaen huomioon sen monikäyttöisyyden kasvainten synnyssä samanaikaisen modulaatio ilmentymisen useita muita molekyylejä, S100A14 odotettiin vuorovaikutuksessa monien solun proteiinien toteuttamaan sen erilaisia ​​toimintoja. Toiseksi, kun läsnä on N-myristoylaatiokohdat site N-päähän S100A14 proteiinin viittaa siihen, että tämä proteiini voi olla vuorovaikutuksessa muiden proteiinien kanssa mahdollisesti mukana signaalin siirtoon [9]. Kolmanneksi, S100A14 on jo osoitettu olevan vuorovaikutuksessa muiden solun proteiinien kanssa, kuten nucleobindin [10] ja RAGE [14], mutta näitä proteiineja ei havaittu nykyisessä Y-2H-näyttö. Kuitenkin havainnot nykyiseen Y-2H näyttö ovat yhdenmukaisia ​​aiempien Y-2H näytöt eri S100 proteiineja. Samanlainen kuin meidän havaintojen vuorovaikutuksessa kumppaneita muille S100 proteiineja edellisestä Y-2H näytöt ovat myös hallitsee suurelta osin S100 proteiinin isoformin (t) (tarkistetaan 24). Yksi ehdotettu syistä S100 isomuodon hallitsi vuorovaikutuksen Y-2H voisi olla funktio tiukasti kontrolloitua solunsisäisen Ca

2+ pitoisuus (200 nM) hiiva solujen [25], joka on selvästi alle kalsium

K

d arvot monien S100 proteiineja (10-50 uM) ja jotka voivat rajoittaa vuorovaikutusta S100 saalista ja sen ei-S100 vuorovaikutus kumppaneita, jotka vaativat tiukkaa Ca

2+ pitoisuus vuorovaikutuksen tapahtuu. Kuitenkin, toisin kuin monissa muissa S100 proteiinit, rakenneanalyysit ovat ehdottaneet, että molemmat S100A14 ja S100A16 ovat alhainen affiniteetti Ca

2 + ioni sidonta minimaalisin konformaatiomuutoksiin sitoutumisen jälkeen Ca

2+ [26,27] ja siten tiukka Ca

2+ pitoisuus ei välttämättä ole tarpeen, että vuorovaikutus näiden kahden proteiinin. Itse asiassa lisäämällä Ca

2+ pitoisuus kasvoi immunosaostus ei havaittu S100A14 ja S100A16 nykyisessä tutkimuksessa (kuvio 1A). Kuitenkin, ei ole vuorovaikutusta ei havaittu välillä S100A14 ja S100A16 kun 5 mM kaksiarvoisen metalli-ionin kelatoiva käytettiin EDTA: ta (kuvio 1A). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että vuorovaikutus S100A14 ja S100A16 on riippuvainen pohjapinta tasoilla Ca

2+ ja mahdollisesti muita kahdenarvoisia metalli-ioneja solut ja lisäämällä pitoisuus Ca

2+ ei välttämättä paranna vuorovaikutus mahdollisesti koska sekä S100A14 ja S100A16 ovat köyhiä Ca

2 + sidonta kanssa puoliavoin konformaatioon jopa apo-tilassa ja tämä konformaation ei välttämättä muutu, vaikka sitovaa Ca

2 + ioneja.

yhdenmukainen havaintojen Y-2H ja samanaikainen immunosaostus yhdessä lokalisoitu ilmentymä S100A14 ja S100A16 havaittiin OSCCs ja vastaava normaali limakalvo (kuvio 2), mikä osoittaa mahdollinen toiminnallinen merkitys tämän vuorovaikutuksen. Itse asiassa yli-ilmentyminen ja knock-alas S100A14 useissa syöpäsolujen-linjat liittyi samanaikaisesti ylä- ja alas-säätely S100A16 proteiinin (kuvio 3A ja B), mutta ei mRNA (kuvio 3C). Nämä havainnot osoittavat, että S100A14 säätelee ilmentymistä S100A16 ei transkriptionaalisella tasolla, mutta mahdollisesti transkription jälkeisen tai translaation sääntelyä. Että päinvastoin, mitään merkittävää vaikutusta ei havaittu sekä mRNA: n ja proteiinin tasot S100A14 kun S100A16 oli yli-ilmentynyt syövän solulinjoista (kuvio 4A ja B), mikä viittaa siihen, yksisuuntainen asetuksen välillä S100A14 ja S100A16 jossa vain S100A14 säätelee proteiinin runsautta of S100A16. Samanlainen S100A14, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet ero ilmentymisen S100A16 eri ihmisen maligniteettien, mikä viittaa rooliin tämän proteiinin ihmisen syövissä [28]. Kun otetaan huomioon rooli S100A14 suun syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasiota [12,13] ja sen kykyä säädellä ilmentymistä S100A16, se voidaan spekuloida, että S100A14 \\ S100A16 heterodimeeri voi olla toiminnallinen merkitys ihmisen syöpäsoluja.

kun havaitaan kasvua vain S100A16 proteiinia eikä

S100A16

mRNA ilme, kun S100A14 oli yli-ilmentyy syöpäsoluissa, me arveltu, että S100A14 saattaa olla mukana säätelyssä S100A16 proteiinien hajoamista.