Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kehittyvät tulokset viittaavat MikroRNA (miRNA) voi olla tärkeä rooli syövän. Poikkeava ilmentymä miRNA on usein tunnistettu eri ihmisen maligniteettien, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC). Kuitenkin mekanismi, jolla purettu miRNA vaikutusta kehittämiseen CRC on edelleen suurelta osin vaikeasti. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että miR-124 on merkittävästi säädellä vähentävästi CRC verrattuna viereiseen ei-kasvain peräsuolen kudoksiin. MiR-124: n ekspressiota vähentävän STAT3 suoraan sitoutumisen 3′-transloimaton alue (3′-UTR). Yliekspressio miR-124 lisäsi apoptoosia CRC-solujen ja vähentää kasvaimen kasvua in vitro ja in vivo. Kaatamalla STAT3 ilmaisun erityisten siRNA tukahdutti kasvua CRC solujen in vitro ja in vivo, joka muistutti miR-124 yli-ilmentymisen. Lisäksi yliekspressio STAT3: in miR-124-transfektoitujen CRC-soluja tehokkaasti pelasti soluproliferaation inhibointi aiheuttaman miR-124. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-124 toimii tuumorisuppressorina kohdistamalla STAT3, ja vaativat käyttöön miR-124 mahdollisena terapeuttinen työkalu CRC, jossa STST3 on usein hyper-aktivoitu.

Citation: Zhang J, Lu Y, Yue X, Li H, Luo X, Wang Y, et ai. (2013) MiR-124 Estää Growth of Human peräsuolen syövän estämällä STST3. PLoS ONE 8 (8): e70300. doi: 10,1371 /journal.pone.0070300

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 helmikuu 2013; Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 05 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural tiedesäätiö of China (Grant nro 81171447), Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (Grant nro 104518036002006310), Shenzhen tieteen ja teknologian projekti (GJHZ20120616153140827). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi suurin syy kuolemista kaikista ihmisen maligniteettien [1], [2]. Useimmat CRC syntyy satunnaisesti, jossa juokseva mutaatiot

APC /β-catennin, K-Ras, COX-2

, ja

p53

signalointi pitkin prosessi syövän aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden [3 ] – [5]. Lisäksi syöpäsoluja luontainen mekanismit välittävät näitä onkogeenien ja tuumorisuppressorigeenit, vuorovaikutus syöpäsolut ja muiden solujen kasvaimen strooman myös merkittäviä rooleja muokkaamisessa syövän kehittyminen [6]. Menetelmässä matkii luonnollinen valinta, syöpäsolut yhteistyössä kehittyä niiden mikroympäristön ja valitaan niiden kyky uudistaa ympäristöönsä hengissä, leviämisen, ja etäpesäkkeiden kaukaisiin sivustoja [6], [7].

STAT3

on kriittinen yhteys kasvainsolujen ja niiden mikroympäristöihin säätelemällä sekä kasvaimen kasvua ja kasvaimeen liittyvän tulehduksen [8], [9]. Syöpäsoluissa,

STAT3

on merkittäviä rooleja kasvaimen kasvuun ja etenemiseen [10]. Aktivoitu

STAT3

voidaan havaita useita ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuoli-, iho, maha-, rinta-, keuhko- ja muut [10] – [13]. Läsnäolo ydinaseiden-lokalisoitu

STST3

ihmisen syövissä syytöksiä että

STST3

voi toimia onkogeenin edistää syövän kehitystä. Todellakin, ehdollinen poistaminen

STST3

paksusuolen epiteelisoluissa ja hepatosyyteissä johti vähensi kasvainten kehittymistä hiirillä [10], [14]. Hiirimallissa AOM /DSS-indusoidun koliitin liittyvien CRC, poistetaan

STAT3

in enterosyyteissä johti vähentyneeseen kasvaimen kuorman suolessa [15], [16].

STAT3

, aktivoidaan pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten IL-6, kasvaimeen infiltroivien myeloidisoluissa, edistää sekä selviytymisen ja kasvun transformoitujen suolen epiteelisolujen. Poistettu IL-6 tai sen vastaavan reseptorin gp130 AOM /DSS malli johti pienempi kasvaimen kokoa ja määrää, kun taas edelleen voimistaa

STST3

aktiivisuutta tuomalla hyper-aktiivinen gp130 lisännyt kasvaimen halkaisijaa ja kasvaimen count [15], [16].

STAT3

säätelee eloonjäämistä kasvainsolujen aktivoivat geenit, jotka antavat resistenssin apoptoosia vastaan. Nämä

STAT3

: sta riippuvaisen apoptoosin vastaisen geenejä ovat

Bcl-x L, Bcl-2, c-IAP2, Mcl-1

ja

surviviinin

[13], [15 ] – [17]. Poistaminen

STST3

syöpäsoluissa vähensivät ilmentymistä näiden pro-selviytymisen geenejä ja lisäsi syöpäsolujen apoptoosin [10], [15], [16]. Muita

STST3

tavoitteita ovat geenit, jotka edistävät solujen lisääntymistä, kuten

Sykliinit B

ja

D

, ja

c-Myc

[9], [16 ], mikä selittää vähensi kasvainten koot upon

STST3

ablaatio [15], [16]. Edistämällä kasvainsolun eloonjäämistä ja kasvua,

STAT3

toimii signaalin integraattorin mahdollistavat transformoitujen solujen hengissä ja lisääntyä vasteena ärsykkeisiin peräisin stroomasolut kasvaimen mikroympäristössä [5].

miRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t ja ~22 nt, että hiljaisuus geenin ilmentymisen estämällä mRNA: n translaation proteiineihin [18] – [20]. MiRNA arvioidaan säädellä yli 60% geenien nisäkkäillä, joten ne on merkittävä osapuoli solujen käyttäytymistä [21]. MiRNA osallistuvat useisiin solujen toimintoihin, kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin ja erilaistumisen, ja toteutetaan erilaisissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa vaihtelevat kehitystä syöpään [18], [19], [22], [23]. Rooli miRNA syövissä on todistettu hyvin [24] – [27]. MiRNA voivat toimia joko oncogenes tai kasvaimeen synnyssä luonteesta riippuen heidän tavoitteensa. Ensimmäiset todisteet osoittavat osallistumista miRNA syövän tuli tutkimuksen kroonisen lymfaattisen leukemian (KLL), jossa

miR-15a

ja

miR-16-1

usein poistettu [28]. Myöhemmät tutkimukset osoittivat edelleen kasvainta estävä roolit

miR-15a

ja

miR-16-1

tunnistamalla

BCL2

niiden sääntelyn tavoite, joka on anti-apoptoottinen geeni, joka on usein yli-ilmentynyt useissa eri ihmisen syöpiä [29]. Toinen esimerkki kasvaimeen suppressiivisen miRNA on

let-7

perhe, joka estää ekspression

Ras

onkogeeni [30].

Anna-7

perheen miRNA sijaitsevat hauras alueilla ihmisen genomin, ja niiden menetys osoittaa huonon ennusteen ihmisen syövissä [31], [32].

Useita miRNA poikkeava ilme ovat olleet tunnistettu eri ihmisen maligniteettien, mukaan lukien CRC [33] – [35]. Geenit, jotka säätelevät näiden syöpään liittyvän miRNA sisältävät

COX2

,

APC, K-Ras, EGFR

ja, jotka ovat tärkeitä taudin alkamisen ja etenemisen CRC [34]. Niistä miR-124 on mielenkiintoinen kohde tutkia syövän kehittymisessä. On ollut laajoja tutkimuksia roolista miR-124 hermostossa, jossa se säätelee hermosolujen kehitystä ja hermoston plastisuus kohdentamalla Notch signalointi ja muiden geenien hermosolun erilaistumisen ja aktivaation [36]. MiR-124 on säädellä vähentävästi medulloblastoma ja kohdunkaulan syöpä [37], [38], ja on mukana tulehduksellinen palautekehä maksasolukarsinoomassa (HCC) [39]. Rooli miR-124 CRC, ja mekanismi, jonka miR-124 säätelee syövän kehitystä, pysyvät suurelta osin tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tulkita roolin miR-124 CRC kehittämiseen. Osoitamme, että miR-124 on vaimentua ihmisen CRC. MiR-124 tavoitteita, joihin 3’alue (3’UTR) on STAT3 tukahduttaa sen ilmaisua. Vuoteen vähen- tämisessä STAT3, miR-124 indusoi ohjelmoitua solukuolemaa ihmisen CRC soluissa ja estää kasvun CRC kasvaimiin in vivo.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

SW480 ja LoVo ihmisen CRC solulinjat saatiin Solut Bank of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina). Kaikki solut kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, johon oli lisätty 5% CO

2.

MiR-124

esiaste (

Pre-miR-124

), miRNA lähtöaineiden valvonta (

Pre-Salatut miRNA

), antisense

miR-124

oligonukleotidi (

AS-miR-124

), CY3-leimattua

miR -Scramble

, antisense miRNA ohjaus (

AS-salatut

miRNA), siRNA vastaan ​​

STAT3

(

STST3-siRNA

), ja salattu siRNA-oligonukleotidi (

siRNA-ohjaus

) ostettiin Ambion (Austin, TX, USA).

STST3

vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

PcDNA3.0-STAT3

, joka on STAT3 ekspressiovektori rakennettiin laboratoriossamme.

Patient Näytteet ja RNA uuttaminen

Ihmisen CRC näytteet saatiin 90 kirurgisen potilaista osasto gastroenterologian, Pekingin yliopiston Shenzhen sairaalassa. Vieressä normaali limakalvo näytteissä sijaitsevat vähintään 2 cm marginaalit kasvaimen (polyyppi tai karsinooma) käytettiin kontrolleina. Kaikki kasvaimet olivat adenokarsinoomat ottaa mucinous karsinoomat (kun yli 50% tuumorin tilavuudesta oli koostuu musiinia) jätettiin pois. Peräsuolen syöpiä lavastettu mukaan Dukes luokitusjärjestelmän: Dukes A (T1-T2, N0, ja M0; n = 26), Dukes B (T3-T4, N0, ja M0; n = 16), Dukes C (mikä tahansa T , N1-2, M0; n = 38) ja Dukes D (mahdolliset T ja kaikki N ja M1; n = 10). CRC kerättiin potilailta, joille suoritetaan suolen resektiota. Kerätty näytteet varastoitiin nestemäisessä typessä. Kaikki potilaat informoitiin tavoitteet näytteenotosta ja kirjallisen suostumuksensa mukaisesti eettisten ohjeiden Pekingin yliopisto. Tutkimuksen hyväksyi eettisen komitean Pekingin yliopiston Shenzhen sairaalassa. MiRNA uutettiin tuoreista kudoksista käyttäen Ambion Mirvana miRNA eristyspakkausta (Ambion) mukaan valmistajan ohjeiden.

Detection of Aikuinen

miR-124

by TaqMan Reaaliaikainen RT-PCR

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi kypsälle

miR-124

suoritettiin kolminkertaisena käyttäen TaqMan MicroRNA määrityksiä kit (Ambion) mukaan valmistajan ohjeiden. RT-reaktio sisälsi 10 ng kokonais-RNA, 1 mM dNTP, 50U Multiscribe käänteiskopioijaentsyymin, 1,5 ui 10 x RT-puskuria, 0,188 ul RNaasi-inhibiittoria, ja 3 ui 5 x TaqMan MicroRNA RT pohjamaali kussakin reaktiossa (15 ui). RT-reaktio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 16 ° C: ssa 30 min; 42 ° C: ssa 30 min; 85 ° C: ssa 5 min; ja sitten pidettiin 4 ° C. Sen jälkeen, kun RT Reaktion cDNA tuotteet RT reaktio laimennettiin 15 kertaa. PCR suoritettiin 1,33 ui laimennettua tuotteiden 20 ui PCR-reaktiossa, joka sisälsi 1 ui TaqMan MicroRNA määritys ja 10 ui TaqMan Universal PCR Master Mix. Monistus suoritettiin seuraavasti: 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin käyttäen vertailevaa CT menetelmä ja normalisoidaan ilmaus

RNU6B

(Ambion).

Quantitative Reaaliaikainen RT-PCR analyysi

STST3

mRNA Expression

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista transfektoitu

Pre-miR-124

tai valvonnan TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA syntetisoitiin käänteistranskriptaasin M-MLV (Takara, Dalian, Kiina) käyttämällä 1 ug kokonais-RNA: ta ja 50 uM Oligo (dT) aluketta 10 ul: n reaktiotilavuudessa. Käänteiskopiointi suoritettiin seuraava ohjelma: 30 min 70 ° C: ssa, jäähdytettiin sitten jäissä välittömästi, 1 tunnin ajan 42 ° C: ssa, 15 minuutin ajan 70 ° C: ssa ja pidettiin sitten 4 ° C: ssa. RT tuotteet laimennettiin 10-kertaisesti. Reaaliaikainen PCR tehtiin kolmena rinnakkaisena iQ-SYBR Green Supermixiä (Bio-rad, CA, USA) ja Icycler Instrument (Bio-rad, CA, USA) käyttäen 1 ui laimennettua cDNA: ta templaattina 20 ul: n reaktiotilavuudessa. PCR-reaktio suoritettiin seuraavasti: 95 ° C 3 min ja 40 sykliä 95 ° C 20 s, 55 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 20 s. Käytetyt alukkeet real-time PCR ovat:

STAT3

forward-aluke: 5′-ATCACGCCTTCTACAGACTGC-3 ’, Reverse-aluke: 5’-CATCCTGGAGATTC.

TCTACCACT-3′.

GAPDH

eteenpäin aluke: 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 ’, Käänteisaluke: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’. Suhteellinen ekspressio laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Transfektio

RNA oligonukleotidit, solut transfektoitiin SIPORT NeoFX (Ambion) ja 50 nM siRNA: lla tai 100 nM miRNA. Plasmidin, solut transfektoitiin 4 ug DNA: ta 35 mm: n koloihin Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Pelastus kokeessa, solut ko-transfektoitiin 100 nM miRNA ja 3 ug plasmidia 35 mm kuoppiin. Transfektiotehokkuuden arvioitiin CY3-leimattu miR-valloituksen RNA oligonukleotidit tai GFP-proteiinia ekspressoivien vektori plasmidi.

proteomiikan Analyysi

SW480-soluja transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-Salatut

miRNA ohjaus. 48 h transfektion jälkeen, solu-proteiini uutettiin ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, CA, USA). Proteiinit käytettiin 2-DGE kuten on kuvannut Bio-Rad manuaalinen. Massaspektrometria-analyysi suoritettiin klo opetus Center of Biology Experiment, School of Life Sciences, Sun Yat-Senin yliopistossa (Guangzhou, Kiina). 2-DGE ensimmäisen ulottuvuuden isoelektrofokusoinnista suoritettiin pH 3-10 IPG valmis nauhat, ja toisessa ulottuvuudessa erotettiin 8-14% kaltevuus SDS-PAGE.

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

monistettiin 3′-UTR segmentti

STAT3

sisältävät ennustettu

miR-124

kohdepaikkaan PCR SW480 solun genomi-DNA: ta, ja lisätään se Spel /Hindlll alavirtaan lusiferaasigeenin pMIR-SELVITYS lusiferaasiksi miRNA Expression Reporter Vector (Ambion). Mukaan geenipankin sekvenssi

STAT3

, suunnittelimme seuraavat monistamiseksi 3′-UTR

STAT3

PCR: Forward-aluke, 5′-CGGACTAGT AAATGAGTGAATGTGGGTG-3 ’, ja reverse-aluke, 5’-CCAAGCTTTGTTGCTGGAGAAGTAAGAG-3 ’. 3’-UTR segmentti

STST3

kanssa mutantti

miR-124

kohdesivustoa muodostettiin päällekkäisyyksiä-PCR: llä käyttämällä villityypin 3′-UTR rakentaa mallina. Seuraavia alukkeita käytettiin tuottamaan 3′-UTR sisälsi mutantin

miR-124

kohdepaikkaan: 3′-UTR-

STAT3

-M-käänteisfaasi, 5′-CCAGCCCTGAGGACTACACCACAGAAACAACCTAGCC-3 ’, 3’-UTR-

STST3

-M-eteenpäin, 5′-GTTTCTGTGGTGTAGTCCTCAGGGCTGGGATACTTCTG-3 ’. Kaikki positiiviset konstruktit tunnistetaan restriktiodigestiolla ja varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Lusiferaasimäärityksiä

SW480-soluja transfektoitiin lusiferaasin konstrukteja, jotka sisältävät 3′-UTR

STAT3

( villityypin tai mutantti

miR-124

kohdesivustot) ja /tai

Pre-miR-124

tai

Pre-salatut

miRNA ohjaus. 48 h transfektion jälkeen, solut kerättiin Lusiferaasimäärityksiä käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan protokollan mukaisesti.

pMIR-REPORT-β-gal

käytettiin normalisointi.

proliferaatiomääritystä

SW480 ja LoVo solut transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-salatut miRNA

ohjaus kuten edellä on kuvattu. 6 tuntia transfektion jälkeen, solut laskettiin ja ne maljattiin tiheydellä 3 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja 3 x 10

5 solua per 30 mm: n levyn kolmena rinnakkaisena. WST-1-määritykset suoritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen. WST-1-määritys, spektrofotometrialla suoritettiin λ = 450 nm ja λ ref = 690 nm inkuboinnin jälkeen 10 ui WST-1 (Roche, New York, NY, USA) 3 tunnin ajan.

immunofluoresenssimääritystä

SW480 ja LoVo solut transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-salatut miRNA

ohjaus. 48 h transfektion jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,5% Triton X-100 PBS: ssä. Kanin vasta-aineita vastaan ​​

STAT3

(Cell Signaling Technology, BSN, USA) käytettiin primäärisenä vasta-aineena, ja FITC-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Chemicon International, Temecula, CA, USA) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena ja visualisoida

STST3

. Tumat värjättiin DAPI.

Western-blottaus

Yhteensä proteiini eristettiin solulinjoista transfektoitu RNA-oligonukleotidi ja /tai plasmidi-DNA: ta solun lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF ja 1% natriumdeoksikolaattia). Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinin määritys kit. Proteiini Näytteet erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridimembraanille kalvo (Amersham, Buckinghamshire, UK). Blotit tutkittiin vasta-aineiden

STAT3

ja fosforia

STAT3

(Cell Signaling Technology, BSN, USA), mitä seurasi sekundäärinen piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun vasta-aineen. Antigeeni-vasta-kompleksit tehtiin näkyviksi käyttäen tehostettua kemiluminesenssia kit (Roche), kuten valmistajan suosittelemia.

Apoptosis Analyysi

SW480 ja LoVo-soluja transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-salatut miRNA

ohjaus. Transfektion jälkeen 72 tunnin jälkeen solut värjättiin propidiumjodidilla ja anti-anneksiini-V-vasta-aine, ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Eläinkokeet

spesifisiä patogeenivapaita naisten, joilta puuttuu kateenkorva BALB /c-nude-hiiriin , 4-6 viikkoa vanhoja (20-30 g), saatiin Guangdongin lääketieteen koe keskus. Hiiriä pidettiin 5 häkkiä kohti ja niille annettiin vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden Shenzhen-PKU-HKUST Medical Center (Luvan numero: 158). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. SW480 solulinjat transfektoitiin in vitro-RNA-oligonukleotidi ja /tai plasmidi (pcDNA3.0-STAT3) vektori. 24 tuntia transfektion jälkeen, 10

7 elinkelpoista solua suspendoitiin 100 ul: ssa PBS: ää ja ihon alle injektoitiin oikean selän lannerangan alueella nude-hiirissä. Vähintään 7 hiiret käytettiin ryhmää kohti testata vaikutusta miR-124 kasvaimen kasvua. Kasvaimen kasvu arvioitiin mittaamalla kaksiulotteisesta halkaisijat kahdesti viikossa jarrusatulat. Kasvainten tilavuuden (V) laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: V = a x B

2/2, jossa A edustaa suurempi halkaisija ja B on pienempi halkaisija. 40 päivää sen jälkeen, kun solu injektion, hiiret tapettiin kudoksen analyysiin.

immunohistokemiallinen analyysi ja TUNEL Pitoisuus

siirrettyjen kasvainten resekoitiin peräisin hiirten, kiinnitettiin 10% formaliinilla, parafiiniin ja leikataan 4 um: n paksuisia leikkeitä. Kohdat poistettiin parafiini, vedettömät ksyleeniin ja sen jälkeen luokitellaan alkoholit, ja mikroaaltouuni antigeeni noutaa 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0 15 minuuttia). Inaktivoinnin jälkeen altistamalla 3% H

2O

2 10 min estää endogeenisen peroksidaasin, leikkeitä inkuboitiin 10% vuohen seerumilla PBS: ssä 30 minuutin ajan estää ei-spesifisen vasta-aineen sitoutuminen. Leikkeitä inkuboitiin STAT3-vasta-ainetta (Cell Signaling, # 9132) on 1:200 laimennus yön yli 4 ° C: ssa ja sitten pestiin PBS: ssä. Sekundaarinen vasta-aine (biotinyloitua anti-kani-IgG, laimennus 1:200) levitettiin ja leikkeitä inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin peroksidaasilla leimatulla streptavidiinilla monimutkainen 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeitä inkuboitiin sitten liuoksella, jossa oli 3% diamino-bentsidiiniä (DAB) kromogeenina 20 minuuttia. Fromowitz vakio käytettiin semikvantitatiivisesti arvioida värjäyksen STAT3 [37].

TUNEL värjäys suoritettiin 6-pm osat irrotettiin kasvaimista. Osiot poistettiin parafiini ennen leimausreaktion. TUNEL määritys suoritettiin käyttäen TumorTACS In situ Apoptosis Detection Kit (Trevigen Inc. USA). Tämä määritys havaitsee spesifisesti apoptoottisia soluja tarkasteltiin Zeiss mikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

merkitys analyysi mikrosiruja (SAM) käytettiin tunnistamaan miRNA ilmentyvät eri näytteiden välillä (FDR = 0).

MiR-124

ilmaisuja CRC kasvaimia ja viereisen ei-kasvainkudoksista verrattiin jonka U-testi, ja arvioinnissa varhaisen ja pitkälle kasvaimia. Vertailu avulla joukossa kaksi tai useampia ryhmiä on suoritettu käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä tai Studentin t-testiä. Kaikki numeeriset tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. P-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) ja SPSS (versio 11).

Tulokset

MiR-124

on alaspäin säännelty Human CRC

tutkimiseksi ilmaisun profiilia

miR-124

CRC, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä käyttäen TaqMan-määritys 90 pariksi kasvain ja normaali peräsuolen yksilöitä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, löysimme merkittävästi vähentynyt

miR-124

CRC näytteistä (P 0,0001). Verrattuna peräsuolen syövän kudoksissa potilailla, joilla on matala-asteinen CRC (Dukes A ja B), korkea-asteen (Dukes C ja D) CRC kudokset ilmentävät jopa alhaisempi

miR-124

(P = 0,0156; Fig. 1B ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

miR-124

voi olla osallisena patogeneesissä CRC.

(A) qRT-PCR-analyysin ekspression miR-124 CRC verrattuna viereiseen ei-pahanlaatuisten paksusuolen ja peräsuolen kudoksiin 90 potilasta (P 0,0001). PCR-reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena RNU6B sisäisenä kontrollina. (B) Association of miR-124 ilmentymisen tasolla CRC etenemiseen (p = 0,0156).

STST3

on Target on posttranskriptionaalisella tukahduttamisen

miR-124

jotta voitaisiin tunnistaa kohteet miR-124 suoritimme ero proteomiikka analyysi päässä proteiinista SW480-solujen käsittelyn jälkeen joko Pre-miR-124 tai Pre-Salattu miRNA. Erottamisen jälkeen proteiinit isoelektrisen fokusoinnin ja SDS-PAGE, keräsimme 12 proteiinitäplien jotka alassäädetty yli 2-kertaisesti soluissa käsitelty

Pre-miR-124

ja sitten tunnistetaan massaspektrometrialla ( kuva S1A). Niistä,

STAT3

on tuumorigeneesiin.

STST3

on tärkeä transkriptiotekijä, joka säätelee erilaisia ​​fysiologisia ja patologisia prosesseja kuten syöpää. Tyrmäämällä

STST3

paksusuolen epiteelisoluissa vähentänyt kasvainten muodostumista mallia ulcerosa liittyvän CRC hiirissä [15]. Testata, jos STAT3 on välittömänä kohteena miR-124 asetus, amplifioimme 3′-UTR-alueen

STAT3

PCR: SW480 genomisesta DNA: sta ja insertoitiin sen alavirtaan lusiferaasireportterigeenillä on

pMIR- REPORT

vektorina lusiferaasianalyysissä, jossa

pMIR- REPORT β-gal

vektorin kontrolli (Fig. S1Bi). Analyysi TargetScan ohjelmisto paljastui mahdollinen sitoutumiskohta

miR-124

sisällä 3’UTR

STAT3

(Fig. S1Biii). Sen testaamiseksi,

miR-124

sitoutuu 3′-UTR

STST3

ja säätelee

STST3

ilmaisu tämän sivuston kautta, myös rakennettu sivektorissa fuusioitunut

STAT3

3’UTR kätkeminen mutantti

miR-124

vaste (Kuva. S1Bii). Sitten transfektoidut Näiden rakenteiden osaksi SW480 soluihin yhdessä

Pre-miR-124

tai

ennalta Scrambled miRNA

ja mitataan lusiferaasiaktiivisuus. Kuten on esitetty kuviossa. S1C, transfektio

Pre-miR-124

, mutta ei sekoiteta miRNA, merkittävästi vähentynyt lusiferaasiaktiivisuus lusiferaasireportterigeenin kuljettaa WT

STAT3

3’UTR. Sen sijaan ei ole

Pre-miR-124

eikä

Pre-Salatut miRNA

ollut vaikutusta lusiferaasiaktiivisuutta lusiferaasireportteri sisältävän mutantin

miR-124

sitoutumiskohta . Nämä tiedot osoittavat, että

miR-124

suoraan vuorovaikutuksessa 3’UTR

STST3

ja estää sen ilmentymistä.

Tutkimme myös vaikutusta yli-ilmentämään

miR-124

endogeeniseen

STST3

ilmentymistä ihmisen CRC soluissa. Käytimme LoVo ja SW480-solut, joilla on korkea

STST3

ilmaus tehdä tämän kokeilun. Verrattuna soluihin transfektoimattomilla tai transfektoitu

Pre-Scrambled miRNA

,

Pre-miR-124

-transfected ihmisen CRC soluja oli vähentynyt

STST3

ilmaisua osoituksena molemmat immunovärjäyksellä ja Länsi -blottauksella (kuvio. 2A, B). Tärkeää on, että taso aktiivisen (tyrosiinifosforyloitunut)

STST3

vähensi myös vuonna

Pre-miR-124

-transfected CRC soluissa, mutta ei kontrolli (Fig. 2B). Edelleen vahvistaa vaikutuksen

miR-124

on

STST3

ihmisen CRC soluissa, me neutraloidut endogeenisesti ilmaistaan ​​

miR-124

käyttäen antisense (

AS- miR-124

). Sen jälkeen

miR-124

hiljentäminen,

STST3

proteiinin taso oli voimistunut (Fig. 2C). Yhteenvetona nämä tulokset osoittivat, että

STST3

on välittömänä kohteena

miR-124

.

(A-B) vaikutus

miR-124

ilmentymisen vaikutus endogeeniseen

STST3

tasolla ihmisen CRC soluissa. (A) SW480 ja LoVo solut transfektoitiin

Pre-miR-124

ja värjättiin

STST3

immunofluoresenssianalyysin avulla. Green,

STST3

proteiini immunovärjättiin anti

STAT3

; sininen, tumat värjättiin DAPI. (B) SW480 ja LoVo-soluja transfektoitiin

Pre-miR-124

ja

STAT3

proteiinin tasot tutkittiin Western blotting -analyysi. (C) SW480 ja LoVo-solut transfektoitiin AS-miR-124.

STST3

proteiinin tasot tutkittiin Western-blottauksella. (D) tasot

STST3

mRNA kvantifioitiin qRT-PCR-analyysillä transfektion jälkeen Pre-miR-124.

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD ± SD.

miRNA alas-säädellä kohdegeenien hajoamisen kohde-mRNA tai esto mRNA käännös. Tutkia mekanismi

STST3

esto

miR-124

testasimme vaikutus

Pre-miR-124

transfektio on

STAT3

mRNA vakautta. Ei ollut eroa tasojen

STST3

mRNA välillä transfektoiduissa soluissa

Pre-miR-124

ja

Pre-Scrambled miRNA

, mikä viittaa siihen, että miR-124 alaspäin säännellä

STST3

ilmentymisen avulla estämällä käännöksen (Fig. 2D).

MiR-124

inhiboi CRC

Tietäen, että

miR-124

merkittävästi vaimentua CRC, me tutkimme,

miR-124

voi toimia tuumorisuppressorina CRC. Tutkia vaikutukset

miR-124

syövän solujen eloonjäämistä, transfektoimme

miR-124

esiaste ihmisen CRC solulinjoja SW480 ja LoVo, ja mitataan nopeus leviämisen ja apoptoosin. Olemme vahvisti transfektiotehokkuuden ( 90% SW480 ja LoVo-soluja) käyttäen CY3-leimattua miR-Scramble (Ambion, tuloksia ei ole esitetty). Yliekspressio

miR-124

solukuolema osoituksena pyöristäminen morfologia solujen (Fig. 3A). Kasvu sekä syöpäsolulinjojen inhiboitui merkittävästi 48 tunnin transfektion jälkeen on

Pre-miR-124

(Fig. 3B). Apoptoosin induktio seuraavista yliekspressio

miR-124

varmistettiin virtaussytometrillä (FCM) (Fig. 3C).

(A) SW480 ja LoVo-soluja transfektoitiin

Pre- miR-124

tai

Pre-Scrambled

miRNA ja tutkittiin valomikroskoopilla. (B) Soluja transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-Scrambled

miRNA, ja solujen kasvu määritettiin WST1 määrityksellä. Pylväät edustavat keskiarvoa kolmesta riippumattomasta testejä. Bars, SD. *, P 0,05. (C) Cell apoptoosin mitattiin anneksiini V ja propi- jodivärjäyksen.

edelleen merkityksen määrittämiseksi

miR-124

säätelyssä kasvaimen kasvua in vivo, loimme ksenograftimallissa ruiskuttamalla SW480 solut subkutaanisesti nude-hiiriin. Ennen injektiota SW480-soluja transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-Salatut miRNA

. Expression of

miR-124

transfektion jälkeen vahvistettiin TaqMan RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). Olemme havainneet, että 100% hiiristä injektoitiin SW480-soluja, jotka on transfektoitu

Pre-Salatut miRNA

kehitetty mitattavissa kasvaimia jälkeen 10 päivää solujen inokulaation jälkeen. Sen sijaan, kasvain ei ollut näkyvissä kaksi hiirtä injektoitiin SW480-soluja käsiteltiin

Pre-miR-124

. Kasvaimen kasvu arvioitiin mittaamalla kaksiulotteisessa halkaisijat kahdesti viikossa jarrusatulat. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, kasvaimet peräisin soluista käsitelty

Pre-miR-124

olivat huomattavasti pienempiä kuin niillä, joita hoidettiin

Pre-Scrambled miRNA

tai valetransfektoidut (P 0,01) päivänä 40. Keskimäärin kasvaimen paino

Pre-Salatut miRNA

käsitellyn ja käsittelemättömän ryhmissä oli 4,36 ± 1,69 g ja 3,99 ± 1,11 g vastaavasti, kun taas hiirillä ympätty

Pre-miR-124

käsitellyt solut oli 2,42 ± 1,55 g (p 0,01) (Fig. 4B).

STST3

ilmentymisen taso vähensi myös vuonna

Pre-miR-124

-transfected soluperäisissä kasvaimissa verrattuna kontrolli (Fig. 4C), mikä viittaa esto

STAT3

by

Pre-miR-124

säilyy fysiologisissa kunnossa. Yhdenmukaisia ​​sen rooli solukuoleman vitro,

Pre-miR-124

-transfected soluperäisissä kasvain osoitti myös kasvanut dramaattisesti solukuoleman, mikä selittää pienentää kasvaimen kokoa elinsiirron jälkeen (Kuva. 4D).

(A) SW480-soluja transfektoitiin

Pre-miR-124

tai

Pre-Salatut

miRNA. 24 tuntia transfektion jälkeen, 10

7 elinkelpoista solua suspendoitiin 100 ul: ssa PBS: ää ja injektoitiin ihonalaisesti oikeaan selän lannerangan alueella nude-hiirten. Kasvaimen kasvu arvioitiin mittaamalla kaksiulotteisesta halkaisijat kahdesti viikossa jarrusatulat. (B) Kasvaimen painon tutkimuksen lopussa. Päivänä 40 hoidon jälkeen, kaikki eläimet tapettiin ja tuumorit poistettiin ja painotettu. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD vähintään 7 eläintä ryhmää kohti. (C)

STST3

taso vaimentua in

Pre-miR-124-

käsitelty peräsuolen kasvain kudosten. Vasen: edustaja peräsuolen kasvainkudossektioista värjätty vasta-aineella vastaan ​​

STST3

. Oikea:

STST3

värjäytymisen intensiteetti oli luokiteltava patologi ja analysoitiin Fromowitz vakio. (D) Vasen: tuumorisektioiden värjättiin TUNEL määritystä varten apoptoottisia soluja. Oikea: kvantifiointi apoptoottisten solujen määrässä. Pylväät, keskiarvo kolmesta itsenäisestä testejä. Bars, SD, **, P 0,01, ***, P 0,001.

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että

miR-124

on tuumorisuppressori CRC .

MiR-124

Toimii tuumorisuppressorina jonka kohdistaminen

STST3

miRNA tunnistaa tavoitteensa läpi degeneroitunut matching kohdesekvenssien kanssa. Tämän seurauksena kukin miRNA voi estää useiden geenien ekspressiota. Sen varmistamiseksi, että

STST3

on todellakin loppupään välittäjä

miR-124

n estävä vaikutus syövän solujen eloonjäämistä ja in vivo kasvaimen kasvua, suunnittelimme siRNA vastaan ​​

STAT3