PLoS ONE: Mesothelin Virus-Like Particle Rokotukset Controls Haimasyöpä Kasvua CD8 + T-solujen induktio ja harventaminen CD4 + Foxp3 + ICOS- Regulatory T Cells
tiivistelmä
edellinen tutkimus on osoittanut, että Mesothelin (MSLN) on potentiaalinen immunotherapeutic kohde haimasyöpä. Täällä edelleen tutkittu immunogeenisyyttä kimeerisen hiiren MSLN-viruksen kaltaiset partikkelit (mMSLN-VLP: t), niiden kyky rikkoa toleranssin mMSLN, itse-antigeenin, ja avannut mekanismi aikaansaamat immuunivasteet mMSLN-VLP immunisointi käyttämällä haimasyöpä (PC) hiirimallissa. Sen lisäksi, mitä olemme löytäneet kanssa ksenogeenista ihmisen MSLN-VLP (hMSLN-VLP), mMSLN-VLP immunisaatio pystyi murtamaan toleranssia luontainen MSLN ja mount mMSLN erityisiä, sytotoksiset CD8
+ T-solut, jotka johtivat merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuuden ja pidensi elinaikaa käytettäessä potilaalle tehdä PC hiirimallissa. Lisäksi CD4
+ Foxp3
+ säätelijä-T-solujen (Tregs) oli jatkuvasti vähentynyt sekä pernassa ja tuumorikudoksia seuraava mMSLN-VLP immunisaatio ja tämä oli ainakin osittain kohonneet IL-6 tuotannon aktivoitu plasmocytoid dendriittisolujen (pDC) kaltaisia soluja seuraavat mMSLN-VLP immunisaation. Lisäksi mMSLN-VLP käsittely pääosin vähensi taajuus CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Treg alaryhmä. Kuitenkin mMSLN-VLP aiheuttamaa IL-6 tuotanto kasvoi myös ICOSL ilme pDC kaltaisia soluja, jotka tukivat leviämisen immunosuppressiivisten CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg soluja. Tämä tutkimus osoittaa, että mMSLN-VLP immunisointi voidaan ohjata PC etenemisen tehokkaasti asennus immuunivasteen mMSLN, kasvaimen itse antigeenin, ja muuttamalla immunosuppressiivisen kasvaimen mikroympäris- aktivoimalla pdCs kaltaisia soluja ja vähentäminen taajuus CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Treg soluja. Kuitenkin yhdistelmä hoitoja todennäköisesti tarvitse käyttää, jotta voidaan kohdistaa jäljellä CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg soluja.
Citation: Zhang S, Yong LK, Li D, Cubas R, Chen C, Yao Q (2013) Mesothelin Virus-Like Particle Rokotukset Controls Haimasyöpä kasvua CD8
+ T Cell induktio ja harventaminen CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Regulatory T Cells. PLoS ONE 8 (7): e68303. doi: 10,1371 /journal.pone.0068303
Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japani
vastaanotettu: 11 heinäkuu 2012; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2013 Julkaistu: 09 heinäkuu 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Dan L Duncan Cancer Center pilotti avustusta BCM ja National Institutes of Health apurahan CA140828 varten Q. Yao ja AI053831 S. Zhang. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Haimasyöpä on edelleen tuhoisa, erittäin tappava tauti vaikka nykyisen tieteellistä edistystä. Tämä sairaus on valtava haaste kliinikoille ja tutkijoille, koska se on luonnostaan vastustuskykyisiä erilaisia hoitoja [1]. Siksi on kiireellistä kehittää uusia hoitomuotoja haimasyöpä. Niistä viimeisin hoitomenetelmät, syöpä rokotteet ovat osoittaneet lupaavia tuloksia taudintorjuntatarkoituksessa [2]. Monia on raportoitu olevan lupaava asiakkuutta
in vivo
kasvaimen regressio [XPath VIRHE: tuntemattoman muuttujan ”START2”.], [4]. Kuitenkin mekanismi, miten tuumorirokotteet voidaan onnistuneesti ohjata kasvaimen etenemistä on edelleen epäselvä.
Tumor-spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) induktio on osoitettu olevan olennainen hävittämiseksi syöpäsolujen tehokas anti-kasvain rokotteet 5,6 koska CTL: t voivat olla suunniteltuja tietyn antigeenin ilmaisemia syöpäsoluja. Lisäksi asema säätelijä-T-solujen (Tregs) anti-kasvain immuniteetin on huomattavasti tutkittu ja selvitetty [7]. Treg solut tunnistettiin CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ edustavat tärkein estävä lymfosyyttipopulaatiosta [8], [9]. Poistaminen Treg solujen
in vivo
tulehduskipulääkkeen-CD25-vasta-aineen on osoitettu kumota immunosuppressioon, rajoittaa kasvaimen kasvua ja edistää kasvaimen hyljinnän hiirissä [10]. Kostimulatorista molekyyliä ICOS on yksi sääntelyn proteiinien ilmaistaan CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Tregs [11]. Laajennus Tregs voidaan yhdistää ICOS signalointia, joka myös on mukana kehittämässä antigeenispesifisten Tregs [12]. Tuoreessa raportissa on osoittanut, että Foxp3
+ Tregs on kaksi erillistä subsets eri biologisia toimintoja perustuu ICOS ilme. Yksi näistä subsets, CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs, erittää IL-10 ja TGF-β joka tukahduttaa dendriittisolut (DC) ja CD4
+ auttaja-T-solut. Toinen osajoukko, CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Tregs, tuottaa vain TGF-β [13]. Tutkimus osoitti myös, että hiiren Tregs sisältävät hyperproliferatiivisia ja kuoleman altis subsets kanssa ero ICOS ilme [14]. Kuitenkin reaktio näiden kahden Treg osajoukot kasvain immunoterapeuttisia rokotusta ei ole tutkittu.
induktio ja sukupolvi FOXP3
+ Tregs liittyy DC-toiminto [15]. Vaikka sekä tavanomaisten DC (CDCS, myelooinen DC) ja plasmasolumaisiin DC (pdCs) voivat olla vuorovaikutuksessa Foxp3
+ Treg soluja, vain pdCs on raportoitu olevan kyky prime CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs [13]. pdCs tunnetaan ensisijaisena DC osajoukon anti-virus immuunivasteet [16]. Kun aktivointi ja kypsymisen, ne erittävät suuria määriä tyypin I interferonien, jotka aktivoivat muita luontaisia immuunisolujen, kuten CDC: n ja NK-solujen ja sillan adaptiivisen immuunijärjestelmän solut, kuten T-solujen ja B-solujen [17]. pdCs ei vain ole kapasiteettia esittää MHC-II epitooppeja aktivoimiseksi CD4
+ T-soluja, mutta myös rajat läsnä MHC-I epitooppien laajentaa CD8
+ T-solujen [18]. Induktio CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs by pdCs, mutta ei CDC, kytketään ICOS ligandiin ilmaisun pdCs [13].
tehokkuus syövän immunoterapeuttisen lähestymistapojen nojaa vahvasti immunogeenisyyttä suunnattu kasvaimeen liittyvää antigeeniä. Mesothelin (MSLN), on kalvo glykoproteiini normaalisti ilmentyy mesoteelisolujen, mutta yli-ilmentyy useimmissa haimasyöpä [19] – [21]. Rajallinen määrä MSLN ilmentymisen normaaleissa soluissa tekee asianmukaisen terapeuttinen kohde syöpärokotteisiin [22]. Erilaisista rokote lähestymistapoja, jotka kuljettavat ja läsnä kasvaimen antigeenejä isännän, viruksen kaltaisia partikkeleita (VLP) saattaa olla sopivin indusoimiseksi sekä humoraalisia että soluvälitteistä immuunivastetta. Analogiseksi viruksia, kimeerisiä VLP: t voidaan pitää epäpätevä viruksia, joilla on täydellinen viruksen rakennetta ja viruksen proteiinin komponentit stimuloimaan vahvoja soluvasteiden ilman virusnukleiinihapoilla. VLP: t voidaan indusoida ennalta ehkäisevän tai terapeuttisen immuniteetin ei vain kasvaimeen liittyvä virusinfektio, joka voi johtaa kasvaimien syntyyn [23], [24], mutta ne voivat myös estää kasvaimen kasvua erityisesti suunnattu kasvaimeen liittyviä antigeenejä [25]. Olemme aiemmin osoittaneet, että kimeerinen hMSLN-VLP voi tehokkaasti pienentää kasvaimen kasvua vähentämällä taajuus CD4
+ Foxp3
+ Tregs käytettäessä potilaalle tehdä haimasyövän hiirimallissa [21]. Tässä tutkimuksessa olemme edelleen arvioida, onko itse antigeenin mMSLN yhtiöitettiin VLP voi rikkoa toleranssin mMSLN, mount mukautuva immuunivastetta ja valvoa syövän etenemiseen. Edelleen ymmärtää vaikutusmekanismia, jolla VLP immunisaatio voidaan saavuttaa kasvaimen taantumiseen, myös tutkittu ominaisuuksia DC induktion mMSLN-VLP ja sytokiinien mukana tukahduttaminen CD4
+ Foxp3
+ Treg soluja.
tulokset
mMSLN-VLP Rokotukset Estää Haimasyöpä kehityksen ja edistää Survival in on kasvain
meidän edellisessä raportissa, osoitimme, että immunisaatio ihmisen MSLN-VLP voisi valvoa tehokkaasti kasvaimen kasvu hiirimallissa, joka johti parantamiseksi sytotoksisten immuunivasteiden haimasyöpäsoluissa vähentämällä taajuus Treg-solujen [21]. Koska ihmisen ja hiiren MSLN on vain noin 60%: n homologia, voimakas immuunivaste voi johtua ksenogeenisten vaste ihmisen MSLN. Kuitenkin, onko immunisaatio mMSLN-VLP voi rikkoa toleranssin ja aiheuttaa immuunivasteita mMSLN, itse-antigeenin, yhteydessä VLP esityksen, ja onko mMSLN-VLP on samanlainen vaikutus aikaansaamaan kasvaimen vastaisen vasteen moduloimalla Tregs ei ole tutkittu. Arvioida immunoterapeuttista tehoa mMSLN-VLP immunisoinnin, immunisoitiin joko mMSLN-VLP: n tai SIV VLP kontrollina VLP ”selkäranka” tai PBS tuumoria kantavissa hiirissä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, mMSLN-VLP immunisointi vähensi merkittävästi kasvaimen tilavuus (0,92 ± 0,39) verrattuna kahteen kontrolliryhmää (2,49 ± 0,43 SIV-VLP ja 3,18 ± 0,38 PBS kontrolliryhmän) (
p
0,05) . Ei ollut tilastollista eroa kasvaintaakkaa välillä PBS ja SIV-VLP immunisaation ryhmiä. Lisäksi olemme havainneet, että kaikki hiiret, joita käsiteltiin PBS: llä tai SIV-VLP oli 1 ml ja 4 ml askites tai verinen askites vatsaonteloon. Oli vähemmän nestettä ( 1 ml) mMSLN-VLP rokottaa ryhmä. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa. 1B, jossa SIV-VLP immunisaatio, oli hieman pidensi elinaikaa mutta ei tilastollisesti merkitsevä verrattuna PBS kontrolliryhmään (
p
= 0,1947). Päinvastoin, mMSLN-VLP immunisaation merkittävästi pidensivät kasvainta kantavien hiirten verrattuna PBS: n ja SIV-VLP ryhmät (
p
= 0,0012 ja
p
= 0,0198, vastaavasti) . Lisäksi yli 50%: n mMSLN-VLP-immunisoitujen hiirten olivat vielä elossa päivänä 30.
Panc02 soluja (7 x 10
5) on ortotooppisesti istutetaan haiman 8-viikkoa vanhojen C57BL /6- hiirillä päivänä 0. Kolme immunisointia päivinä 3, 13, ja 21 levitettiin ip reitti eri VLP. Hiiret jaettiin kolmeen ryhmään, jotka oli immunisoitu joko 100 ui PBS: ää tai 100 ug /100 ui SIV-VLP, tai 100 ug /100 ui MSLN-VLP. A). Alennettu tuumoritaakka mMSLN-VLP immunisoitu ryhmiä. Tuumorin koko kunkin ryhmän välillä tilastollisesti verrattiin opiskelijoiden t-testiä. *
p
0,05. B). Pitkäaikainen eloonjäämisen mMSLN-VLP-immunisoitujen hiirten ryhmiä Kaplan-Meier Survival Analysis.
P
arvot laskettiin ja listattiin luku. Nämä olivat edustavat tiedot valita neljästä itsenäisestä kokeesta A) viisi tai B) vähintään 9 hiirtä per ryhmä.
mMSLN-VLP Rokotukset Aktivoi CD8
+ T-solujen ja Tuottaa MSLN-Specific Toiminnallinen CD8
+ T-solujen
aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että VLP on suuri kyky aktivoida Th1 suuntautunut immuunivasteita ja spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien rokotetuilla hiirillä [26], [27]. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, oli kasvu taajuus CD8
+ CD62L
– T-solujen jälkeen mMSLN-VLP hoito (46,5% vs. 19,6% PBS: ssä), mikä viittaa siihen, että mMSLN-VLP voi stimuloida yleistä CD8
+ T-solujen aktivaation.
17
päivänä kasvaimen istutuksen jälkeen ja sen jälkeen kerran VLP rokotuksen päivänä 3, hiiret tapettiin immuunivasteen analysointia. FACSCalibur käytettiin hankkimaan ja FlowJo ohjelmistoa käytettiin analysointiin. A). Yleinen CD8
+ T-solujen aktivaation PBS kontrolliryhmässä ja VLP immunisoidut hiiret ryhmissä. Solut eroteltiin CD8
+ T-solujen, T-solujen aktivaation markkeri CD62L ilmentyminen näytettiin histogrammin. B). MSLN-erityisiä tetrameerin
+ CD8
+ T-solujen induktio. Pernasolut värjättiin PE leimatun MSLN erityisiä tetrameerin. C). MSLN-specific IFN-γ tuottavien CD8
+ T-solu induktio. Pernasoluja stimuloitiin uudelleen MSLN peptidillä 6 tuntia, kun läsnä on Golgin tukos yhdisteen
in vitro
. Kiinnityksen jälkeen ja läpäiseväksi, esikäsitelty pernasolujen värjättiin PE-leimatulla anti-IFN-γ-vasta-ainetta. D). MSLN-spesifistä CTL-indusointia vastaan Panc02 soluja. Pernasoluja stimuloitiin uudelleen
in vitro
varten 6 päivää, kun läsnä on IL-2. Esikäsitelty pernasolut laskettiin ja käytettiin tiedoksiannon soluja. Panc 02-soluja käytettiin kohdesoluina. Tiedoksiannon solut ja kohdesoluja sekoitettiin erilaisissa E: T-suhde, ja inkuboitiin 4 tuntia. Prosenttiosuus hajoaminen laskettiin seuraavalla tavalla:% Sytotoksisuus = [(kokeellinen – tiedoksiannon Spontaani – Target Spontaani) /(Target Maximum – Target Spontaani)] x 100. Näkyy olivat edustavia data valitaan kaksi erillistä koetta, joissa viisi hiirtä ryhmää kohti. (Tilastollisesti merkitykset esitetään, * tarkoittaa
p
0,05.).
arvioimiseksi sukupolven mMSLN CD8
+ T-solut hiiren pernasoluissa immunisaation jälkeen , MHC-I: MSLN peptidi tetrameerin käytettiin määrittämään prosenttiosuuden mMSLN CD8
+ T-soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, prosenttiosuus tetrameerin + CD8
+ T-solujen mMSLN-VLP immunisoitu ryhmien välillä oli noin 3-taittuu suurempi kuin PBS-kontrolliryhmän (3,21% vs. 1,18%). SIV-VLP immunisaation ei erityisesti tihentää mMSLN CD8
+ T-solut (1,35%). Näin ollen, mMSLN-VLP immunisointi voi indusoida mMSLN CD8
+ T-soluja.
Aktivoidut efektori CD8
+ T-solut voidaan jakaa kahteen eri ryhmään: sytokiinin erittävät CD8
+ T solut ja sytotoksiset T-lymfosyytit [28]. Jälkeen MSLN-peptidin stimulaatio, MSLN CD8
+ T-solut, jotka erittävät IFN-γ havaittiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, prosenttiosuus MSLN-specific IFN-γ erittävät tiedoksiannon CD8
+ T-solujen mMSLN-VLP immunisoitu ryhmä oli noin 2 taittuu korkeampi kuin PBS-ryhmässä (2,55% vs. 1,42%). Kuitenkin, ei ollut lisälaite on taajuus näiden solujen seuraavista SIV-VLP immunisoinnin (1,77%). Arvioida kapasiteetin VLP-indusoidun CTL: iä suoraan tappaa kasvainsoluja, joka on
in vitro
kasvaimen tappamiseen määritys suoritettiin käyttäen Panc02-soluja kohdesoluina, jonka on osoitettu yli-ilmentää MSLN [21]. Kuten on esitetty kuviossa. 2D sytolyyttinen tehokkuus CTL Panc02 soluihin osoitettiin myös olevan korkein mMSLN-VLP rokotettu ryhmien suhteessa 120:1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tietty efektori CD8
+ T-solujen aiheuttama mMSLN-VLP immunisaatio voi olla tärkeä rooli suoraan valvoa kasvaimen regressio.
mMSLN-VLP Rokotukset vaimentaa Sekä systeeminen ja kasvaimen infiltroivien CD3E
+ CD4
+ Foxp3
+ Tregs
Vaikka olemme osoittaneet, että VLP immunisaatio voi vähentää CD4
+ Foxp3
+ Tregs solujen hiiren perna ja kasvaimen kudos, fenotyyppi ja biologian näiden solujen vielä remainslargely tuntematon [21]. Kuten on esitetty kuviossa. 3, lähes kaikki Foxp3
+ solujen kasvain hiiret olivat läsnä CD3E
+ CD4
+ T-solujen populaatio koska CD3E
+ CD8a
+ Foxp3
+ ja CD3E
+ CD4
-CD8a
-foxp3
+ subsets oli alle 0,5%. Prosenttiosuus CD3E
+ CD4
+ Foxp3
+ Tregs seuraavat mMSLN-VLP immunisaatioon (12,9 ± 1,83%) oli pienempi kuin PBS kontrolliryhmässä (17,81 ± 1,26%) (p 0,05). SIV-VLP immunisaatio johti myös lasku väestön Tregs, vaikkakin, vähemmässä määrin (14,4 ± 2,19%) (p 0,05). Siksi laski Foxp3
+ solujen tuumoreita kantavaa hiirtä kuului tavanomainen CD3E
+ CD4
+ Foxp3
+ Treg solun ryhmä, koska VLP ei aiheuttanut eikä vaikuta CD4
– Foxp3
+ Treg solujen hiiren perna. Siksi VLP immunisaatio voi vähentää systeemistä väestöstä CD3E
+ CD4
+ Foxp3
+ Tregs tuumoria kantavissa hiirissä.
A). Klo 12
päivänä kasvaimen istutuksen jälkeen ja sen jälkeen kerran VLP rokotuksen päivänä 3, hiiret uhrattiin immuunivasteen analyysiä. Noin 10
6 pernasoluja inkuboitiin kanssa sopivasti laimennettua fluoresoiva-konjugoiduilla vasta-aineilla, mukaan lukien CD3E, CD4, CD8, ja Foxp3. Foxp3
+ solut analysoitiin kolmella T solualaryhmiä: CD4
+ CD8
-, CD4
-CD8
+ ja CD4
-CD8
-. Nämä olivat edustavia tietoja kolmen erillisen kokeen kanssa vähintään kolme hiirtä ryhmää kohti. B). CD4
+ Foxp3
+ T-solut eristettiin kasvain pernasolujen tukahdutetaan Tresp solujen proliferaatiota. Viljellään yhdessä CD4
+ CD25
+ Tregs ja CD4
+ CD25
– Tresps (CFSE värjätty) erilaisilla suhteilla 01:08, 01:04, ja 01:02. CFSE leimattu Tresps leviämisen analysoitiin FACS. Numerot CFSE
korkea huippu osoittaa prosenttia jakamattoman soluja. C). Ehkäisevän toiminnan CD4
+ CD25
+ Tregs CD4
+ CD25
– Tresp soluproliferaatiota eri Treg: Tresps suhteet (x-akseli). Y-akselilla on prosenttia tukahduttaminen on Tresp solujen proliferaation aktiivisuutta.
Sen osoittamiseksi, että CD4
+ Foxp3
+ T-solut eristettiin pernasoluja kasvaimen kantavien hiirten joilla on tukahduttava aktiivisuus, me suoritti CFSE-pohjainen Treg tukahduttaminen määrityksessä. Saadakseen eläviä soluja tätä 5 päivää yhdessä viljelemisen määritystä, käytimme CD4 ja CD25 pintamarkkerien eristää CD4
+ CD25
+ Tregs. Suoritimme solunsisäinen värjäys Foxp3 merkki vahvistaa, että suurin osa eristetyn CD4
+ CD25
+ Tregs oli myös CD4
+ Foxp3
+ T-soluja. Kuten osoitettu kuvassa. S1, aidatulla CD4
+ CD25
+ soluja, noin 87% soluista värjättiin positiiviseksi Foxp3
+. CFSE-pohjainen Treg tukahduttaminen Analyysi suoritettiin viljellään yhdessä CD4
+ CD25
+ Tregs ja CD4
+ CD25
– vastaaja-T-soluja (Tresps) (CFSE värjätty) eristettiin pernoista PC tuumoreita kantavaa hiirtä. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, kun mitään Treg-soluja lisättiin, useimmat Tresp solujen koki lisääntymistä ja vain 36,5% jäi jakamaton. Koska suhde Treg solujen Tresp soluihin kasvoi yhdessä viljelemisen, tukahduttaminen Tresp proliferaatiota havaittiin. Prosenttiosuus jakamattoman Tresp solujen kasvoi 36,5% (no Treg lisätty) 50,7%, 62,2%, ja 84,5%: iin Treg: Tresp suhteilla 01:08, 01:04, ja 01:02 vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, ehkäisevän toiminnan CD4
+ CD25
+ Tregs CD4
+ CD25
– Tresp solujen lisääntymistä oli 22%, kun 12,5% Tregs oli läsnä yhdessä viljelemisen, ja se nousi 40% ja 76%, kun 25% ja 50% Tregs oli läsnä, vastaavasti. Nämä tiedot kannattaa vahvasti käsitystä siitä, että CD4
+ Foxp3
+ T-solujen kasvain pernasolujen hallussaan ehkäisevästä aktiivisuutta.
määrittämiseksi fenotyyppi FOXP3
+ Tregs kasvainkudoksissa, immunofluoresenssimenetelmällä värjäys suoritettiin. Kasvainkudoksissa hiiristä, jotka eivät saaneet mMSLN-VLP immunisaation, olemme huomanneet, että useimmat Foxp3
+ Tregs oli tunkeutunut tuumorikudokseen verisuonista ja sijaitsee lähellä kasvainten verenkiertojärjestelmään (Fig. S2A). Lisäksi Foxp3
+ Tregs tuumorikudokseen oli fenotyypin CD4
+ CD8a
– (Fig. S2B), ja suuri osa CD8a
+ T-solut (vihreä värjätyt solut) sijaitsivat vieressä Foxp3
+ T-solut (punaiset värjätään solut) (Fig. S2C). Verrattaessa määrä Foxp3
+ solujen määrä immunisoitujen ja immunisoimattomien ryhmät, Foxp3
+ solut vähennetään VLP-immunisoitujen hiiren kasvaimen kudokset (Fig. S2D). Tämä havainto viittaa siihen, että Foxp3
+ Tregs voi luottaa suora vuorovaikutus CD8a
+ T-solujen käyttämään sen ehkäisevästä vaikutusta CD8
+ T-solu anti-kasvain toiminto immunisoimattomilla hiiren ryhmä, kun taas, VLP immunisaatio vähentää Foxp3
+ Treg väestö ja siten tukahduttaminen kohdistaman Foxp3
+ Tregs tuumorikudokseen voidaan lievittää.
korkeat IL-6 induktio mMSLN-VLP on Osittain vastaa Treg alassäätöä
IL-6: n raportoitiin estävän luonnollisen esiintyvien Foxp3
+ Tregs. Sen arvioimiseksi, onko mMSLN-VLP immunisaatio voisi aiheuttaa IL-6: n tuotantoa, sekä pernasolua JAWSII soluja käytettiin stimulaatio
in vitro
kanssa mMSLN-VLP. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, oli merkittävä nousu IL-6 erittävien DC vuonna mMSLN-VLP hoidetussa ryhmässä verrattuna PBS kontrolliryhmään (22,8% vs. 3,21%). Lisäksi parannettu IL-6 eritys hiiren pernasolujen havaittiin myös kun mMSLN-VLP stimulaatiota. Oli 100-kertainen lisäys tasot erittämä IL-6 pernasoluista, että mMSLN-VLP käsitelty ryhmä verrattuna PBS-kontrolliryhmään. Tämä viittaa siihen, että mMSLN-VLP on kyky stimuloida lymfosyyttien, erityisesti DC, ja aiheuttaa niiden eritystä korkeat IL-6.
A). Lisääntynyt IL-6 tuottavien JAWSII soluja ja kohonnut IL-6 tasot lymfosyyteissä elatusaineissa upon mMSLN-VLP hoitoa. JAWSII soluja stimuloitiin MSLN-VLP (5 ug /ml) 12 tuntia ja intrasellulaarisen IL-6 värjäys suoritettiin. Lymfosyytit valmistettiin pernasta naiiveja B6 hiiriin. Inkuboinnin jälkeen MSLN-VLP: ssa 24 tuntia, supernatantti kerättiin määrittämiseksi IL-6 pitoisuudet Bio-Plex. B). Osittainen pelastaminen estävä vaikutus on mMSLN-VLP stimulaation Foxp3
+ Treg solujen IL-6 neutralointi. MSLN-VLP kanssa tai ilman IL-6 neutraloiva Ab tai isotyyppikontrolli Ab lisättiin lymfosyyttejä viljelmässä 3 päivää. Foxp3
+ solut värjättiin käyttämällä Foxp3 solunsisäisiä -värjäyspakkausta. Tiedot hankittiin virtaussytometria analyysi aidatulla CD3
+ ja CD4
+ T-soluja. Näkyy edustavaa dataa kolmesta viiteen itsenäisestä kokeesta. (Tilastollisesti merkitykset esitetään, ** osoittavat
p
0,01.).
Vastatakseen onko väheneminen Foxp3
+ Tregs by mMSLN-VLP hoito välittämä IL-6, IL-6 neutraloivaa vasta-ainetta aikana VLP stimulaation ja isotyyppikontrolli-vasta-ainetta käytettiin kontrollina. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, prosenttiosuus FOXP3
+ Tregs oli 12,7% CD3
+ CD4
+ aidatulla soluja tuoreesta naiiveja B6 hiiriin 3 päivän inkubaation jälkeen. Kuitenkin prosentuaalinen FOXP3
+ Tregs väheni mMSLN-VLP hoidon kanssa tai ilman isotyypin kontrollivasta-aineella (6,51% ja 6,18%). Näin ollen IL-6 neutraloivan vasta pystyi osittain pelastaa harventaminen FOXP3
+ Treg soluissa noin 32% (8,16% verrattuna 6,18%: in mMSLN-VLP ainoa hoito). Nämä tulokset osoittavat, että IL-6 voi olla rooli vähentäminen FOXP3
+ Tregs by mMSLN-VLP immunisaation.
mMSLN-VLP Rokotusohjelma voi valikoivasti tukahduttaa osajoukon CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Tregs
Functional molekyylit, kuten CTLA-4, CD25 ja CD44 ilmaisi pinnalla FOXP3
+ Tregs ovat välttämättömiä sanelee itseohjautuva, toiminta ja selviytyminen kapasiteetti näiden solut. Edelleen käsitellä sitä, kuinka VLP vaikuttaa Foxp3
+ Treg biologia, useita tärkeitä toiminnallisia molekyylejä värjättiin. Verrattuna PBS-ryhmään, ei ollut ilmeisiä eroja taajuuksilla CD4
+ Foxp3
+ CTLA-4
+ Tregs (Kuva. 5A), CD4
+ Foxp3
+ CD25
+ Tregs (Fig. 5B), CD4
+ Foxp3
+ CD44
hi Tregs (Fig. 5C) seuraava VLP immunisaation. Inhiboiva molekyyli PD-1 ja kostimuloivana molekyyli CD40L oli alhainen ilmentymistaso Foxp3
+ Tregs (Fig. 5D). Prosenttiosuus ja rahalaitosten CD4
+ Foxp3
+ PD-1
+ ja CD4
+ Foxp3
+ CD40L
+ Tregs että VLP ryhmät olivat hyvin samanlaisia kuin arvot PBS kontrolliryhmään. Kuitenkin verrattuna PBS hoitoihin (35,7%), prosenttimäärä CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs vuonna VLP käsitelty ryhmissä nostettiin. Prosentuaalisesti eniten CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg alaryhmä jälkeen havaittiin mMSLN-VLP immunisaatioon (59,8%). Prosenttiosuus on SIV-VLP käsitellyillä hiirillä oli 54,0% (Kuva. 5F). Korreloimalla edellä tiedot väheneminen absoluuttinen määrä FOXP3
+ solujen ja kasvu prosenttiosuuden ICOS
+ solujen Foxp3
+ Treg ryhmä, nämä tiedot viittaavat siihen, että vähentäminen Foxp3
+ Tregs vastaa väestön CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Tregs mutta ei CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs. ICOS voi siis olla kriittinen rooli kasvaimen tukahduttava toiminto aiheuttaman Tregs tuumoria kantavissa hiirissä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka mMSLN-VLP immunisaatio voi vähentää yleinen esiintyvyys Treg-solujen nämä ovat pääasiassa CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Treg solujen alaryhmälle, mutta ne Tregs kuuluvat CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ osajoukko näyttävät säilytettävä.
12
päivänä kasvaimen istutuksen jälkeen ja sen jälkeen kerran VLP rokotuksen päivänä 3, hiiret uhrattiin immuuni vasteen analyysi. Noin 10
6 pernasoluja inkuboitiin kanssa sopivasti laimennettua fluoresoiva-konjugoiduilla vasta-aineilla, mukaan lukien CD4: ää, Foxp3, CTLA-4, CD25, CD44, PD-1, CD40L, ja ICOS. FACSCalibur käytettiin hankkimaan ja FlowJo ohjelmistoa käytettiin analysointiin. Solut aidatulla CD4
+ Foxp3
+ väestö ja histogrammin eri molekyylin sen erilaisissa koeryhmään esiteltiin A). CTLA-4; B). CD25; C). CD44; D). PD-1; E). CD40L; F). ICOS. Näkyy edustavaa dataa kolmen kokeen ainakin kolme hiirtä ryhmää kohti. (Tilastollisesti merkitykset esitetään, ** osoittavat
p
0,01.).
esiintymisen määrittämiseksi sekä Treg solualaryhmiä haiman syöpäpotilailla, kudosnäytteiden analysoitiin immunofluoresenssivärjäyksen. Kuten on esitetty kuviossa. S3A, oli suuri tiheys CD3
+ Foxp3
+ Tregs haiman kasvain kudosten ja yli puolet Foxp3
+ Tregs olivat ICOS
+ (Fig. S3B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Foxp3
+ Tregs tärkeä rooli patogeneesissä haimasyövän, ja molemmat Foxp3
+ ICOS
+ ja Foxp3
+ ICOS
– Tregs osapopulaatioiden ovat mukana immuuni tukahduttaminen kasvainkudoksissa.
mMSLN-VLP hoito Aktivoi pdCs ja ylössäätelee ICOSL on pdCs kautta IL-6 ylläpitää CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg Solut mutta ei CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Treg Solut
Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että pdCs ilmaista korkea ICOSL, ja vuorovaikutus ICOS ja ICOSL on tärkeää homeostaasiin CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg soluihin [13], [29]. Koska mMSLN-VLP immunisaatio vaikuttaa taajuus CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Treg-solujen, mutta ei CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg-solut, yksi mahdollinen selityksiä tätä edullisempaa ylläpitoon CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg soluja voisi johtua mMSLN-VLP välittämää säätelyä ICOSL on pdCs. Tutkia, mMSLN-VLP voi aktivoida pdCs, hiiren DC solulinja, JAWSII, käytettiin. LPS käytettiin kontrollina stimuloiva DC. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, LPS stimulaatio huomattavasti CD11b ilme verrattuna PBS hoitoon (84,6% vs. 28,0%). Kuitenkin, mMSLN-VLP suurelta osin vähentynyt ilmentyminen CD11b (9,14%). Sitä vastoin ilmaus B220 ja Gr-1 oli dramaattisesti säädelty seuraavat mMSLN-VLP hoidon (95,5% ja 86,4%). B220 ja Gr-1 on tunnistettu ensisijaisena markkereita pdCs. Oli vain pieniä määriä B220 ja Gr-1 ilmentymisen seuraavat PBS ja LPS hoitoja (10,3% ja 10,4% PBS, 19,7% ja 17,5% LPS hoidossa). Nämä tiedot osoittavat, että mMSLN-VLP: t voivat edistää pdCs kaltaisia soluja, kun taas LPS: llä on etusija aktivoimiseksi CDC-kaltaisten solujen.
noin 10
7 JAWSII soluja stimuloitiin joko PBS: ää, LPS: ää (1 ug /ml), tai MSLN-VLP (5 ug /ml) täydellisessä alfa median kanssa 5 ng /ml rmGM-CSF. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, solun pinnan markkereita värjättiin ja hankki FACSCalibur. A). Expression of CD11, B220, ja Gr-1, kun erilainen kohtelu PBS, LPS, tai mMSLN-VLP in JAWSII soluissa. B). Expression of ICOSL PBS, mMSLN-VLP tai IL-6 aiheuttama pdCs. C). Expression of ICOS CD4
+ Foxp3
+ Tregs. D). Prosenttiosuus Ki-67 värjäys solujen sekä CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs ja CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– Tregs. Useita solun pinnalla oli tahroja ja analyysi alaryhmän fenotyyppien tehtiin käyttämällä FACSCalibur ja FlowJo ohjelmisto. Näkyy edustavaa dataa kolmesta kuuteen itsenäisestä kokeesta. (Tilastollisesti merkitykset esitetään, ** osoittavat
p
0,01.).
Voit selvittää mMSLN-VLP aktivoitu pdCs kaltaisia soluja ilmaista kohonnut ICOSL, vai mMSLN- VLP indusoi IL-6 voi ylössäätää ICOSL on pdCs, PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) tai IL-6 (20 ng /ml) käytettiin aktivoimaan pernasolujen ja tahra pinta ICOSL aidatulla pdCs. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, prosenttiosuus ICOSL ilmentävien solujen mMSLN-VLP aktivoitu pdCs tai IL-6 aktivoidaan pdCs olivat 12,4% ja 12,3%, vastaavasti, jotka olivat merkittävästi lisääntynyt verrattuna PBS: llä aktivoitu DC: iden (4,95%). Nämä tiedot viittaavat siihen, että mMSLN-VLP: n tai IL-6 aktivoidaan pdCs-, kuten solut eivät ilmentävät korkeita ICOSL.
Olemme osoittaneet, että mMSLN-VLP rokotus indusoi voimakkaasti IL-6: n tuotantoa, joka on osittain vastuussa väheneminen Treg solufrekvenssit, mutta vaikutus IL-6 on CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs subpopulaatio vielä määritettävä. Siksi arvioi mMSLN-VLP tai IL-6 voi myös vähentää yhteensä CD4
+ Foxp3
+ Tregs säilyttäen suuri prosenttiosuus CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs
in vitro
. Hiiren pernasoluja stimuloitiin joko PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) tai IL-6 (20 ng /ml). Vaikka teimme havaita merkittäviä CD4
+ Foxp3
+ Treg downregulation sekä mMSLN-VLP ja IL-6 hoitoryhmään, mielenkiintoisesti, havaitsimme, että IL-6 oli samanlainen vaikutus kuin mMSLN-VLP hoito mikä johti myös kasvuun taajuus CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Tregs solut (Fig. 6C). Tutkimaan edelleen omaisuutta tämän alapopulaation Treg solujen ja onko ICOS ilmentyminen liittyy leviämisen CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg alaryhmästä, Ki-67 ilmentyminen määrittämiseen käytettiin pyöräily solujen. Kuten on esitetty kuviossa. 6D, löysimme merkittävä osuus Ki-67-positiivisia soluja sisällä ICOS
+ Tregs vs. ICOS- Tregs (47,8 ± 8,4% vs. 12,3 ± 3,8%, p 0,001). Tämä osoittaa, että vaikka mMSLN-VLP indusoi IL-6 vähentää koko taajuus Treg solujen se voi myös olla vastuussa lisääntyneestä osuuden jäljellä CD4
+ Foxp3
+ ICOS
+ Treg alaryhmä tehostetun leviämisen of ICOS
+ solujen esittämällä kaksiteräinen miekka.
keskustelu
nopea kehitys syövän rokotteiden tarjoaa suuren lupauksen kasvainten ehkäisyyn ja terapeuttisia [4]. Toisin kuin muut kasvaimen hoitojen, rokotteilla on monia etuja, kuten kehitystä muistin vasteen, kohdentaminen syöpäsoluja ja vähemmän sivuvaikutuksia mm. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että mMSLN-VLP immunisaatio voisi rikkoa sietokyky itse mMSLN ja asentaa vahva immuunivaste mMSLN, ja siksi tehokkaasti vähentää kasvaimen kokoa ja varsinkin pidentää eloonjäämisen kasvainta kantavien hiirten käytettäessä potilaalle tehdä haimasyövän malli . MSLN CD8
+ T-soluja voidaan tehokkaasti indusoida mMSLN-VLP hoitoon ja on todettu edistää kasvaimen kasvun estoa. reitti. A). C). A).