Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

DNA metyylitransferaasi (DNMT) on yksi tärkeimmistä tekijöistä, joka välittää metylaatio syöpään liittyvien geenien kuten TGF-β-reseptorit (TβRs). Tämä puolestaan ​​voi johtaa menetykseen herkkyys fysiologisia tasoja TGF-β in aggressiivinen eturauhassyöpä (CAP). Erityinen mekanismit DNMT roolin korkki pysyy määrittelemätön. Tässä tutkimuksessa kuvaamme mekanismi TGF-β-välitteisen DNMT Cap ja sen yhteyksiä kliinisiin tuloksiin seuraavien eturauhasen.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme ihmisen CaP solulinjoissa vaihtelevalla invasiivisen kyvyn kuvata, miten TGF-β välittää ekspressiota DNMT Cap, ja sen vaikutukset metylaatiostatuksen TGF-β-reseptoreihin ja invasiivisia kyky CaP in vitro ja in vivo. Lisäksi määritimme yhdistyksen välillä DNMT ilmaisun ja kliinisten tulosten jälkeen eturauhasen. Olemme havainneet, että aggressiivinen CaP soluja oli merkittävästi korkeammat TGF-β tasoilla, lisääntyneen ekspression DNMT, mutta alensi TβRs verrattuna hyvänlaatuinen eturauhasen solujen ja vähemmän aggressiivisia eturauhasen syöpäsoluja. Blockade of TGF-β signalointia tai ERK aktivointi (p-ERK) liittyi dramaattinen väheneminen ilmentyminen DNMT, joka johtaa samanaikainen kasvu ilmentymisen TβRs. Blockade joko TGF-β signalointi tai DNMT dramaattisesti vähensi invasiivisia ominaisuuksia korkki. Inhibitio TGF-β käytettäessä TRAMP-C2 CAP-mallia C57BL /6-hiirissä käyttäen 1D11 liittyi downregulation DNMTs ja p-ERK ja heikentynyt kasvaimen kasvua. Lopuksi riippumaton Gleason grade, lisääntynyt DNMT1 ilmentyminen liittyi biokemiallisten uusiutumista leikkaushoitoa eturauhassyövän.

Päätelmät ja merkitys

havainnot osoittavat, että CaP johdettu TGF-β voi indusoida of DNMTs korkki, joka liittyy metyloinnin sen reseptoreihin ja aggressiivinen potentiaalia korkki. Lisäksi DNMTs on itsenäinen ennustaja uusiutunut jälkeen eturauhasen, ja saattaa olla kliinistä merkitystä YMP ennustettavuutta sekä hoidon.

Citation: Zhang Q, Chen L, Helfand BT, Jang TL, Sharma V, Kozlowski J , et ai. (2011) TGF-β Säätelee DNA metyylitransferaasi ilmentäminen eturauhassyöpä, korreloi Aggressiivinen ominaisuudet, ja ennustaa tauti uusiutuu. PLoS ONE 6 (9): e25168. doi: 10,1371 /journal.pone.0025168

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 20 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 26 elokuu 2011; Julkaistu: 30 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Grant Number 2 P50CA090386-06A2 National Cancer Institute, NIH, sekä avustusta National Cancer Institute (U01 CA152738), American Cancer Society, Illinois (# 08-22), Department of Defense (W81XWH -09-1-0311), Portes keskus /Institute of Medicine of Chicago (QZ), American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG 93-037-12), apurahalla Genzyme Corporation, avustusta NorthShore University HealthSystem , ja lahja Mr. Fred L. Turner. Kautta työllisyys SL, JH ja BT, Genzyme Corporation tehtävänä sisältyvät: tarjoamalla reagenssit, tekee ehdotuksia koesuunnitelmia ja auttaa valmistelua käsikirjoituksen. Toinen rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SL, JH ja BT ovat työntekijöitä Genzyme. Ei ole olemassa patentteja tai tuotteita kehitteillä julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

TGF-β on pleiotrooppinen kasvutekijä, joka on ollut mukana useita, ja usein täysin vastakkaista toimintoja, kuten solujen proliferaatiota ja kasvun pysähtymisen, erilaistumista ja apoptoosia [1], [2]. Ilmeinen kysymys näiden erilaisia ​​toimintoja on kuinka TGF- β välittää nämä näennäisesti ristiriitaisia ​​rooleja sekä syövän ja hyvänlaatuinen solujen. Syöpäsoluissa, TGF-β toimii kasvun edistäjänä ja tukien etäpesäkkeitä, kun taas normaaleissa soluissa se näyttää estävän solujen kasvua ja aiheuttaa apoptoosin [3]. Ominaisuudet aggressiivinen eturauhassyöpä (CAP) sisältävät vähitellen menettää herkkyyttä TGF-β ja yli-TGF-β, joka näyttää aloittaa noidankehä varten syövän etenemiseen. Vaikka on hyvin tunnettua, että vähentäviä tai TGF-β-reseptoreihin (TβRs) mahdollistaa syöpäsolujen paeta kasvua estävä vaikutus TGF-β ja saada kasvuetu, solumekanismin (t) taustalla näitä tapahtumia ihmisen CaP soluja määrittelemätön. Aiemmin olemme osoittaneet, että menetys TβRs ilmentymisen promoottorin metylaation liittyy ali TGF-β-välitteisen kasvun estäminen [4].

DNA: n metylaatio suoritetaan DNA: n metyylitransferaaseja (DNMTs). On olemassa ainakin kolme funktionaalista DNMTs, jotka on todettu eukaryoottisissa järjestelmissä. DNMT1 on liitetty pääasiassa huolto- metylaatiovyöhykkeiden, joka tapahtuu solujen replikaation, ja se edullisesti metyloi hemi-metyloitu DNA [5]. Se on ollut laajimmin tutkituista huolto metyylitransferaasi ja on runsaasti kasvaimen soluissa ja kudoksissa. Vertailun vuoksi DNMT2 ei näytä olevan merkittävää metylaatio aktiivisuutta ja DNMT3L todennäköisesti rajoittaa DNA: n metylaation aikana ituradan kehitys [5]. Lopuksi, DNMT3A ja DNMT3B tiedetään olevan de novo methylators CpG sivustoja [6], joka on suurempi metyylitransferaasin aktiivisuus metyloimattoman DNA: n kuin DNMT1 ja se voi osaltaan de novo metylaatio alkionkehityksen aikana [7], [8]. Vaikka DNMT on raportoitu liittyvän joitakin aggressiivinen syöpien, kuten maksasolukarsinoomat, mahasyöpä, ei-pienisoluisen keuhkosyövässä, lymfooma ja eturauhasen syöpiä [9], [10], [11], [12], [13], sen rooli on edelleen kiistanalainen ja koko asetus, koordinointi ja aktiivisuus DNMTs on epäselvä eri syöpiä. Lisäksi mekanismi DNMTs syöpäsoluissa ja sen yhdessä invasiivisia pahanlaatuinen ominaisuudet ja kliinisten tulosten käsittelyn jälkeen ei ole kuvattu.

raportoi äskettäin, että epigeneettisten asetuksen TGF-β-indusoidun Foxp3: n ilmentyminen voi olla välittyvä inaktivoinnin ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasien (ERK), joka voi alas-säädellä DNMTs hyvänlaatuisia soluissa [14]. Kuten edellä on todettu, CaP solujen ja kudosten ovat herkkiä TGF-β-välitteistä kasvun inhibition ja on promoottorin metylaation, jotka vähentävät ilmentymistä TβRs (TβRI ja TβRII) [4], [15], [16]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että epäherkkyys TGF-β joissakin CaP soluissa on ainakin osittain promoottorin metyloinnin TβRs. Nämä havainnot ovat saaneet meidät tutkimaan seuraavat kaksi hypoteesia tässä tutkimuksessa: 1) voi olla ylikuulumisen välillä kasvain peräisin TGF-β ja DNMTs mikä liittyy metylaation syövän; 2) DNMTs voidaan tiiviisti eturauhassyövän etenemistä ja tuloksia seuraavien eturauhasen. Tietääksemme tämä aihe on vielä raportoitu.

tutkimuksen tarkoituksena oli moninkertaiseksi. Ensinnäkin pyrimme tutkimaan vastaavat muutokset DNMT ja TβRs ilmaisun ja ERK aktivoinnin jälkeen hoitaa eturauhassyöpää solujen vaihtelevalla invasiivisia valmiudet ja hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen TGF-β. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus neutraloivan TGF-β-vasta-aineen ilmentymistä DNMTs ja kasvaimen kasvua in vivo käyttäen ksenograftimallissa. Lopuksi määritetään onko aktivointi DNMTs liittyi biokemiallisten uusiutumista eturauhasen.

Materiaalit ja menetelmät

(Yksityiskohtainen selvitys on esitetty menetelmä S1) B

Cell Lines

hiiri CaP solulinja TRAMP-C2-solujen saatiin tri N. Greenberg [12]. Hyvänlaatuinen ihmisen eturauhasen epiteelisolujen linja, RWPE-1, hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). BPH-1-solut ystävällisesti tri Simon Hayward. Neljä variantteja ihmisen CaP PC-3-solulinjojen (PC-3, PC-3M-Pro4, PC-3M ja PC-3M-LN4) vaihtelevalla invasiivisia ominaisuuksia ystävällisesti tri Fidler ja Dr. Pettaway [ ,,,0],17], [18], [19], [20]. Syy valitsimme PC-3 vaihtoehtoja oli, koska nämä variantit ovat peräisin samasta solulinjasta, mutta vaihtelevat niiden aggressiivinen ominaisuuksia. Tulokset signaloinnin asetuksen olivat verrattavissa toisin käyttäen erilaisia ​​CaP solulinjoissa. Joitakin kokeita, solut sulatettu herkkä TGF-β (negatiivisena kontrollina) ottamalla käyttöön TβRIIDN kuten aikaisemmin on kuvattu [21], [22]. Joissakin kokeissa solut käsiteltiin tai ei TGF-β1 tai MEK-inhibiittori U0126 (Promega). Lopuksi, joissakin kokeissa mukana käyttö Anti-TGF-β (1, -2, -3) neutraloidaan mAb (klooni 1D11, lahja Genzyme Corporation), kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. (Menetelmä S1).

TGF-β1 ELISA

RWPE-1, BPH-1, ja kaikki PC3 vaihtoehdot ja vastaavat TβRIIDN tartunnan solulinjoja viljeltiin tuoreessa seerumittomassa elatusaineessa 24 tuntia . TGF-β1 ELISA suoritettiin käyttäen ihmisen TGF-β1 Immunoassay Kit (R Olympus) ja mitattiin A560 nm levynlukijalla käsittelyn jälkeen uuttoliuoksen.

Animal Studies

tutkimus käynnistettiin käyttäen ihonalaista (sc) injektiota hiiren eturauhassyövän TRAMP-C2 transfektoitu HSV1–tk-GFP-lusiferaasi (SFG-nTGL) reportterigeenin ekspressiovektori [27], [28] oikeaan kylkeen alueella 30 C57BL /6-hiiristä kuten aiemmin on kuvattu [25]. Eläimet jaettiin satunnaisesti yhteen kolmesta ryhmästä intraperitoneaalisen injektion erityisten anti-TGF-β neutraloivan vasta 1D11 tai kontrolli vasta-13C4 edellä kuvatulla tavalla [23], [24]. Kaikki hiiret tapettiin 15 vasta-aineiden injektiot ja ryhmän 3 tapettiin samalla aikavälillä. (Menetelmä S1). Tämä tutkimus sai hyväksynnän Institutional Review Board of Northwestern University (Evanston, IL). Northwestern University ACUC hyväksyminen protokollan numero 2007-0565. ”(Letter S1).

rakentaminen kudossiruina (TMA) ja kliinistä hyötyä Assement

Olemassa kliininen tapaus tiedot ja varastoitujen kudoksen perustettu meidän eturauhasen SPORE ohjelman tietokanta Northwestern University käytettiin. Kaikki Koehenkilöiden edellyttäen kirjallinen lupa Northwestern Memorial Hospital ja tutkimuksen hyväksyi Northwestern University Institutional Review Board (IRB määrä on 1480-002, Letter S2). Kaikkiaan 243 eturauhasen saatiin näyte, jossa siihen liittyvät kliiniset tiedot. Sarja eturauhasen TMA oli rakennettu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut eturauhasen yksilöitä, kuten aikaisemmin on kuvattu [4], (menetelmä S1 ja menetelmä S2).

immunohistokemia

Kaikki vasta-aineita vastaan, DNMTs, fosforyloitu ERK (p-ERK), yhteensä ERK (t-ERK), fosforyloitu Smad2, TβRI ja TβRII testattiin ensin ja optimoidaan koko-kudosleikkeiden testi paneelit kuten aikaisemmin on kuvattu [4], [17], [29 ], [30], (menetelmä S1 ja menetelmä S2).

tilastollinen analyysi.

SPSS 10.0.7 ohjelmistopaketti (SPSS, Inc.) käytettiin kaikissa analyyseissä. Kaplan-Meier selviytymisen käyrä analysoitiin log-rank-testiä käyttäen Graphpad Prism 4,02 ohjelmisto (Graphpad Software) (menetelmä S1).

Tulokset

1. DNMTs ilmentyminen liittyy säätelyä alaspäin TβRs ja invasiivisen eturauhassyövän fenotyypit

ELISA-määritys on alun perin suoritettiin sen määrittämiseksi, oliko eroja endogeenisen ilmentymisen tasot TGF-β eri CaP solulinjoissa verrattuna hyvänlaatuinen eturauhasen solulinjoissa. Olemme havainneet, että kaikki PC-3-solulinjojen ilmaistaan ​​huomattavasti korkeampi TGF-β (x 2-6 kertaa) verrattuna BPH-1 ja RWPE-1 (p 0,05). Lisäksi huomasimme, että enemmän invasiivisia soluja (PC-3M ja PC-3M-LN4) erittyy lähes 2 kertaa suurempi lähtötasolle TGF-β1 verrattuna vähemmän invasiivisia solulinjoissa (PC-3 ja PC-3M-Pro4) ( kuva 1A).

. ELISA-määritys osoittaa, että PC-3-solulinjojen näihin merkittävästi (p 0,05) suurempi (x 2-6 kertaa) tasot TGF-β verrattuna hyvänlaatuiseen eturauhasen solulinjojen, BPH-1 ja RWPE-1. Lisäksi PC-3M ja PC-3M-LN4, erittyy lähes 2 kertaa suurempi lähtötasolle TGF-β1 verrattuna PC-3 ja PC-3M-Pro4 soluissa, vastaavasti, jotka ovat vähemmän invasiivisia. B. tymidiininsisällytysmääritys osoittaa, että kasvu RWPE-1 ja BPH-1-soluissa estyy merkittävästi altistuminen TGF-β1. Vertailun vuoksi kasvu PC-3 ja PC-3M-Pro4 solujen vain hieman estyy, ja PC-3M-LN4 ja PC-3M solujen osoita mitään merkittävää vastausta TGF-β1 altistumista. C. Kaikissa syöpäsolulinjoissa (tässä osoitamme, PC-3, kuten esimerkiksi), inhibition TGF-β käyttäen TβRIIDN rakentaa johtaa merkittävästi korkeampiin naiivi TβRII ilmaisun, ja D. korkeampi TGF-β eritystä. Samanlaisia ​​havaintoja löytyy havainnoista invasiivisempiin solulinjat. Vertailun vuoksi ei ollut eroa ilmentymisen TβRII in BPH-1 tai RWPE-1, kun ne infektoitiin TßRIIDN (taulukko S1).

vahvistettiin, että erilaisia ​​eturauhasen solulinjojen käyttäytyä toisin vaste eksogeenista TGF-β1 altistumista. Esimerkiksi, olemme havainneet, että RWPE-1 ja BPH-1-soluissa olivat kaikkein herkimpiä eksogeenisen TGF-β1 niiden kasvu inhiboituu 64,1% ja 61,9%, vastaavasti, 24 tunnin kuluttua hoidon TGF-β1. Vertailun, PC-3 ja PC-3M-Pro4 solut inhiboitui ainoastaan ​​13,7% ja 12,3%, vastaavasti. Lopuksi kasvuvauhti PC-3M-LN4 ja PC-3M ei vaikuttanut TGF-β1 altistus (Fig. 1 B). Mielenkiintoista on, että CaP solulinjoissa, esto TGF-β signalointi, käyttäen vallitsevan negatiivisen tyypin II TGF-β-reseptorin (TßRIIDN) rakentamiseksi, liittyi merkittävästi korkeampi endogeeninen TβRII ilmaisu (käyttäen vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja solunsisäinen domeeni, koska TβRIIDN sisältää vain solunulkoiset ja transmembraanidomeenia, mutta ei solunsisäinen domeeni) (Fig. 1 C) ja korkeamman TGF-β eritystä (Fig. 1 D). Vertailun vuoksi ei ollut eroa TGF-β BPH-1 tai RWPE-1, kun ne infektoitiin retroviruksen TβRIIDN rakentaa (taulukko S1).

Toisin ilmentymisen TGF β, sekä TβRI ja TβRII ilmentyminen väheni merkittävästi enemmän invasiivisia solulinjat, PC-3M-LN04 ja PC-3M, verrattuna PC-3 ja PC-3M-Pro4 solut (Fig. 2A). Blockade of TGF-β signalointia TβRIIDN vektori aiheutti noin kaksi kymmenkertaiseksi ekspression lisääntymisen sekä TβRI ja TβRII kaikissa CaP solulinjoissa (Fig. 2B). Yhdessä tämä viittaa siihen, että lisääntynyt lähtötasolle TGF-β liittyy esto TβRs ilmaisua. Blockade solunsisäisen TGF-β signalointi johti säätely ylöspäin erityksen TGF-β syöpäsoluissa.

. Western blot-analyysit osoittavat, että toisin kuin TGF-β, sekä TβRI ja TβRII ilmentymistä (kuten on kuvattu kuviossa 1 B) on pienentynyt huomattavasti enemmän invasiivisia solulinjat verrattuna vähemmän invasiivisia solulinjat. B. Blockade of TGF-β signalointia TβRIIDN aiheuttaa merkittävää ekspression lisääntymisen TβRIs kaikissa solulinjoissa. C. Toisin ilmentymisen TβRs, yli ilmentyminen DNMTs liittyy invasiivisia solulinjojen verrattuna vähemmän invasiivisia solulinjat. D. Blockade of TGF-β signalointia TβRIIDN aiheutti ≥3-kertaisesti alentunut ilmentyminen DNMTs. Vastaava arvo (suhteellinen suhde TβRs /GAPDH tai DNMTs /GAPDH) näkyy oikeassa kaavioita. (Fig. 2A ja 2B olivat samasta Western Blot kuva, ja kuvio. 2C ja 2D ovat muista yksittäinen Western blot kuva).

Koska promoottori metyloinnin TβRs liittyy pienentynyt ilme [ ,,,0],4], vertasimme ekspressiotasojen DNMTs eri CaP solulinjat. Yleensä, mitä enemmän invasiivisia PC-3M-LN4 ja PC-3M solut osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä DNMTs, verrattuna vähemmän invasiivisia PC-3 ja PC-3M-Pro4 (Fig. 2C). Blockade of TGF-β signalointia TβRIIDN vektori aiheutti ≥3-kertaisesti alentunut ilmentyminen DNMTs kaikissa CaP solulinjoissa (Fig. 2D), ja oli vastaavasti ekspression lisääntymisen sekä TβRI ja TβRII (Fig. 2B). Vastaava arvo (suhteellinen suhde TβRs /GAPDH, tai DNMTs /GAPDH) on esitetty oikealla paneelit. Tämän havainnon myös tukevat lisävarmistusmenetelmää tutkimuksia. Immunoblottaus analyysit osoittivat, että käsittelyn jälkeen 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa), ilmentymistä TβRI ja TβRII PC-3 lisääntynyt dramaattisesti. Sitä vastoin ilmaus sekä TβRI ja TβRII laski merkittävästi hoidon TGF-β ja tämä muutos voidaan ottaa talteen, kun 5-atsa lisätään (kuvio S1A). Samoin, real-time PCR vahvisti, että geenien molempien TβRI ja TβRII lisättiin 2-2,5 taittuu käsittelyn jälkeen 5-atsa PC-3-soluja. Hoito TGF-β tukahdutti ilmauksia TβRI ja TβRII 46% ja 29% vastaavasti (kuva S1B). Olemme myös tunnistaneet metylaatiostatuksen TβRI ja TβRII promoottorit, käyttämällä samaa MSP lähestymistapaa ja sekvensointi menetelmiä [4]. Käyttämällä tätä tekniikkaa, löysimme sama metyloitua sivustoja kuin edellisessä tutkimuksessa [4], että sytosiinin positiot -251, -231, -244, -348, -356 ja -365 että edistäjä TβRI, ja +27, +32 ja -140 varten promoottori TβRII metyloitiin (kuvio S1C). PC-3-solujen on myös osa TβRI ja TβRII promoottorit, jotka ovat metyloimaton. Mielenkiintoista, hoito TGF-β lisäsi metylaatiostatuksen, mutta hoito 5-atsa muuntanut kaikki metyloituja sivustoja metyloitumattomien. Tymidiinin sisällyttäminen määritys osoitti, että leviämisen PC-3-solut vain hieman inhiboi hieman eksogeenisen TGF-β. Vertailun vuoksi 5-atsa-hoito johti merkittävään soluproliferaation inhibointi, riippumatta siitä, onko eksogeenisen TGF-β lisättiin viljelmään tai ei. Ei ollut merkitsevää eroa havaittu hoidon sekä 5-atsa ja TGF-β tai 5-atsa yksinään (P 0,05) (kuvio S1D).

2. DNMTs ilme välittyy fosforyloidun-ERK riippuvaisen reitin

Aiemmat tutkimukset osoittavat, että ERK voivat vaikuttaa DNMT ilmentymistä hyvänlaatuinen soluissa [14]. Siksi pyrittiin määrittämään, onko taso aktivoidun ERK (fosforyloitua ERK, p-ERK) liittyy TGF-β-indusoidun ilmentymisen DNMTs. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ensin määritetty taso p-ERK hyvänlaatuisen eturauhasen solujen ja vertasi sitä tasoa eri CaP solulinjoissa. BPH-1 ja RPWE-1-soluissa ilmaisivat merkittävästi suurempi lähtötasolle p-ERK kuin PC-3-solut (Fig. 3A). Mielenkiintoista on, että ajan kuluessa p-ERK ilmentymisen altistumisen jälkeen TGF-β oli erilainen välillä hyvän- ja pahanlaatuisten solulinjojen. Erityisesti oli aika riippuvainen positiivinen korrelaatio hoidon TGF-β1 ja ilmentymistä p-ERK kaikissa PC-3-solulinjojen. Itse asiassa tämä nopea lisääntyminen p-ERK lauseke (4-kertainen) alkoi 5 minuutin kuluttua TGF-β1 hoitoon. Tasot p-ERK kasvoi edelleen kaikissa myöhemmissä ajan hetkinä aina 30 minuutin jälkeen TGF-β1 lisäksi. Sitä vastoin ilmaus p-ERK oli nopeasti inhiboitui (alle 5 minuuttia) jälkeen TGF-β1 lisäksi median hyvänlaatuisten solujen, tavalla, joka on riippumaton kaikista ERK-proteiinin ilmentymistä (Fig. 3A). Immunofluoresenssitutkimukset käytettiin myöhemmin auttaa määrittämään, onko p-ERK ja DNMTs olivat yhdessä lokalisoitu samaan solun alueilla. Tätä varten konfokaali mikroskooppiset analyysit formaldehydin kiinteitä immuno- PC-3-solujen puuttuessa tai läsnä TGF-β1, osoitti yhteistyön loczalization välillä p-ERK ja DNMTs signaaleja. Vain solut p-ERK immunofluoresenssilla näytteillä DNMT ilme. Sen sijaan, kun PC-3-solut sulatettu herkkä TGF-β1 transfektoimalla kanssa TβRIIDN, tasot sekä p-ERK ja DNMTs vähenivät dramaattisesti määritettynä immunofluorsence värjäytymistä (Fig. 3B). Paremmin lukuina suhdetta TGF-β1, p-ERK ja DNMTs, olemme ensi käytetään reaaliaikaista PCR. Nämä tulokset osoittivat, että altistuminen TGF-β1 24 tuntia lisäsi merkittävästi ilmaus kaikkien kolmen DNMTs (~16.7% -14%) kaikilla PC-3-solulinjojen tutkittu. Käsittelemällä vasta-aineella, joka on spesifinen TGF-β1 (1D11; 5 mg /ml) tai erityiset ERK-inhibiittoria, UO126, johti merkittävästi alas-säätely DNMTs mRNA: n ilmentymisen (~33.9% -52,3%, ja ~41.5% -57,6% vastaavasti Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TGF-β-välitteisen ilmentymisen DNMTs liittyy lisääntyminen p-ERK syöpäsoluissa. Erityisesti kasvain peräisin TGF-β näyttää olevan vastuussa tästä ERK aktivointia, koska saarto alkuperäisen erittyvän TGF-β aiheutti suuren muutoksen ilmentymistä DNMTs (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että kasvaimen peräisin TGF-β välitteinen ERK-aktivointi on vähintään yksi tärkeimmistä välittäjiä TGF-β indusoima DNMTs jotka johtavat TβRs down-regulation by promoottorin metylaation CaP [4], [14]. Käsittelyn jälkeen TGF-β, oli merkittävä kasvu invasiivisia ominaisuuksia CaP soluja. Invasion of CaP solujen inhiboitui joko TGF-β-inhibiittori 1D11, tai p-Erk estäjä U0126 tai DNMT inhibor 5-atsa. Estäminen hyökkäystä U0126 ei voida kumota TGF-β1 hoitoa. Tärkeää on, DNMTs -estäjä 5-atsa voi merkittävästi esti CaP solujen invaasiota, jopa enemmän kuin salpaus TGF-β tai p-ERK (Fig. 3d). Tämä havainto viittasi siihen, että p-ERK oli alavirtaan tekijä TGF-β, ja synergistisesti välittää TGF-β säännelty DNMTs joka tiiviisti invasiivisen valmiutta CaP soluja.

. Hyvänlaatuinen BPH-1 ja RPWE-1-solut ilmentävät merkittävästi suurempi lähtötasolle p-ERK kuin PC-3-soluja. On aika riippuvainen positiivinen korrelaatio hoidon TGF-β1 ja ilmentymistä p-ERK PC-3-solut. Tasot p-ERK jatkavat kasvuaan kaikissa myöhemmissä ajan hetkinä aina 30 minuutin jälkeen TGF-β1 lisäksi. Sitä vastoin ilmaus p-ERK on nopeasti (alle 5 minuuttia) esti jälkeen TGF-β1 altistus hyvänlaatuinen soluissa tavalla, joka on riippumaton kaikista ERK-proteiinin ilmentymisen. B. Immunofluoresenssikoe paljastaa, että vain solut (tämä on PC3 esimerkiksi) ilmentävät p-ERK näytteille DNMT ilme. Sen sijaan, kun PC-3-solut suoritettu herkkä TGF-SS1 by TβRIIDN, tasot sekä p-ERK ja DNMT vähenevät huomattavasti (suurennus: 10 x 20). C. Suoritimme reaaliaikainen PCR paremmin mitata suhdetta TGF-β1, p-ERK ja DNMTs. Altistuminen TGF-β1 lisäsi merkittävästi ekspressiota kaikkien kolmen DNMTs PC-3-soluja. Hoito 1D11, tai MEK estäjä, UO126 liittyy alas-säätely kaikkien DNMT mRNA: n ilmentymisen. D. (Tässä osoitimme aggressiivisin PC-3M näytteenä). Oli merkittävä lisäys solun liikkuvuus kautta Matrigel-pinnoitettu polykarbonaatti kalvon alle hoitoon TGF-β1 (10 ng /ml). Hyökkäys kaikki CaP soluja voitiin estää estämällä TGF-β signaalin 1D11 tai käyttämällä p-ERK-inhibiittoria UO126 tai DNMT inhibiittori 5-atsa erikseen. Esto hyökkäystä UO126 ei voi palauttaa TGF-β hoitoa. Oikea yläpaneeli: Vastaavat lukumäärät invasiivisia soluja. Alhaalla oikealla paneeli: absorbanssiarvot. Tämä tulos osoittaa, p-ERK välitteisen TGF-β-indusoidun DNMT voimistaa invasiivisen kyvyn eturauhassyövän solulinjoissa. (Suurennus, 10 x 10).

3. In vivo validointi vaikutuksia TGF-β on ERK aktivointi, DNMT ilmaisu, ja eturauhassyövän kasvua

vahvistaa, onko TGF-β vastaa aktivoinnin ERK ja säätely ylöspäin DNMTs, joka voi olla mukana kasvaimen etenemiseen in vivo, me kokeita käyttämällä hiiren ksenografti CaP malli, joka osallistuu injektion CaP kasvainsolujen (TRAMP-C2-soluja, stabiilisti transfektoitu HSV1-tk-GFP-lusiferaasireportteri, 5 x 10

6 /kukin hiiri). Kasvaimen kasvu noudatettiin käyttäen lusiferaasi kuvantaminen. Käytimme kolme ryhmää hiiriä ymmärtää paremmin vaikutuksia TGF-β on ERK aktivointia ja DNMT ilmaisu: Ryhmä 1: hiiret (n = 10) saivat säännöllisesti injektioita TGF-β neutraloiva vasta-aine, 1D11. Ryhmä 2: hiiret (n = 10) saivat isotyyppikontrollia vasta-ainetta, 13C4, samalla säännöllisin väliajoin Ryhmä 1. Ryhmä 3: ei saanut mitään hoitoa, kun ksenografti injektion kontrollina. Olemme havainneet, että kasvaimen kasvu estyi merkittävästi anti-TGF-β 1D11-vasta-aine, hoidossa (ryhmä 1) verrattuna kahteen muuhun ryhmään (Fig. 4A, 4B). Itse asiassa, lopussa 45 päivän hoitojakson aikana, yksi kymmenestä hiirillä (10%), tässä ryhmässä oli vapaa kasvain. Jäljellä 9 hiiret, keskimääräinen kasvaimen paino ja tilavuus oli 5,3 g ja 6,85 cm

3, vastaavasti. Vertailun vuoksi kasvainten havaittiin kaikkien hiirten ryhmissä 2 ja 3. Keskimääräinen paino ja tilavuus kasvainten 10 käsiteltyjen eläinten kontrollivasta-ainetta (ryhmä 2) tai ei käsittelyä (ryhmä 3) oli merkitsevästi suurempi (Fig. 4C) . Ei ollut etäpesäkkeitä kaikissa ryhmissä arvioituna bioluminenssina kuvantaminen. Immunohistokemiallinen analyysit primäärikasvaimissa paljasti, että ilmentyminen p-ERK ja DNMTs eläinten ryhmän 1 olivat merkittävästi alhaisemmat kuin muissa ryhmissä (Fig. 4D).

. IVIS 100 kuvantamisjärjestelmä tarkkailuun käytettiin kasvaimen kasvua reaaliaikaisesti. Olemme havainneet, että kasvaimen kasvu estyy dramaattisesti hoidon 1D11 verrattuna ryhmän 2 (13C4 käsittely) ja 3 (Ei hoitoa kontrolli). B. 1D11 hoito inhiboi kasvaimen kasvua ajasta riippuvalla tavalla. C, lopussa 45 päivän hoidon jälkeen hiiret tapettiin ja kasvaimet eristettiin. Keskimääräinen tuumorin paino ja tilavuus oli 5,3 g ja 6,85 cm

3, vastaavasti 1D11 hoitoryhmässä. Vertailun vuoksi keskimääräinen paino ja tilavuus kasvainten 10 käsiteltyjen eläinten valvonnan 13C4 oli merkitsevästi suurempi 15,8 g ja 12,85 cm

3, tässä järjestyksessä. Vastaavat arvot hiirillä, jotka eivät saaneet mitään hoitoa olivat 31,4 g ja 23,39 cm

3, vastaavasti (

P

0,01 joukossa kolme ryhmää). D. immunohistokemiallinen analyysit primäärikasvaimissa paljasti, että ilmentyminen p-ERK, DNMTs eläimillä 1D11 käsittely on huomattavasti pienempi kuin muissa ryhmissä.

4. DNMTs korreloi kliinisiä piirteitä

arvioimiseksi assosiaatio TGF-β ja induktio DNMTs Cap yksilöiden, vertasimme ekspressiotasot TGF-β1, ERK, p-ERK, TβRI, TβRII, p- Smad2, ja DNMTs arkistomuistiin kudoksessa microarray yksilöitä saadaan aikaan eturauhasen ja korreloivat niitä vastaavien potilaiden kliininen ja patologinen ominaisuudet (Taulukko S2. Kukin markkeri annettiin arvo 0 ( 20% cell immunovärjäyksen), 1 ( 20-49% solun immunovärjäyksen), 2 (50-74% solun immunovärjäyksen) ja 3 (75-100% cell immuunivärjäysmenetelmällä) riippuen prosenttiosuutta syöpäsolujen positiivisia immunovärjäystä. positiivinen ja negatiivinen kontrolli värjäytymistä näkyi ”Kuva S2 ”. Olemme havainneet, että korkean tason TGF-β1, p-ERK ja DNMTs yhdistettynä alhaisen ilmentymisen TβRI, TβRII, ja p-Smad2 liittyi haitallisia patologisia ominaisuuksia, kuten suurempi Gleason: n luokka ( Fig. 5A, kuva 5B, taulukko S3). Nämä tulokset vastaavat meidän löydös PC-3M-LN4 ja PC-3M solut, jotka TGF-β aiheuttama DNMTs liittyy kliinisesti aggressiivisempi fenotyyppejä.

. Immunohistokemiallinen analyysi sarjanumero TMA osien potilaalta, jolla Gleason pisteet 8, paljasti suurempi TGF-β, p-ERK, DNMTs, mutta pienempi ilmentyminen TβRI ja TβRII ja p-Smad2 verrattuna leikesarjojen otettu potilaalta, jolla oli alempi Gleason n arvosanalla 6. Nämä tulokset edustavat hallitseva värjäyskuvion nähdä kaikissa potilaan näytettä /kudosmatriisien (suurennus: 10 x 20). Vastaava taajuus (tai prosenttiosuus) värjäytymisen ja värjäyksen voimakkuuden voitiin löytää BB Korkea TGF-β1 ilmentyminen (Pisteet = 3) havaittiin 42,3%, 8,9% ja 7,0%, p-Erk ilmaisun 36,4%, 6,7% ja 13,5%, DNMT1 ilmaisun 27,9%, 1,8% ja 1,3%, DNMT3A ilmaisun 40,6%, 11,9% ja 6,7%, ja DNMT3B ilmaisun 58,7%, 18,3% ja 22,8% korkean (≥8), väli-