Krooninen sairaus

tiivistelmä

maksasolusyövän (HCC) on yleinen sairaus maailmanlaajuisesti ja valtaosa HCC liittyvistä kuolemantapauksista aiheutua paikallista invaasiota ja etäpesäkkeiden. Syöpä kantasolut (CSCS) ovat pieni alapopulaation syöpäsolujen jotka on arveltu olevan vastuussa etäpesäkkeitä. Viime aikoina olemme ja muut ovat tunnistaneet CSC populaation ihmisen HCC solulinjoista ja ksenograftikasvaimissa ominaista niiden ilmentyminen CD133. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismeja, joilla CD133

+ syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja välittävät HCC etäpesäkkeitä ei ole riittävästi analysoitu. Täällä olemme lajiteltu HCC-soluissa käyttäen CD133 syövän kantasoluja (CSC) markkerin magneettinen soluerotte- (MACS) ja osoittivat, että CD133

+ HCC-soluissa ei ainoastaan ​​hallussaan suurempi vaeltavia ja invasiivisen kapasiteetti

vuonna vitro

vaan ovat myös varustettuja parannettu metastaattinen kapasiteetti

in vivo

ja ihmisen HCC näytteitä verrattuna CD133

– HCC-soluissa. Geenin ilmentymisen analyysi CD133

+ ja CD133

– soluja HCC linjan SMMC-7721 osoitti, että G-proteiiniin kytketty reseptori 87 (GPR87) ilmentyy voimakkaasti CD133

+ HCC-soluissa. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia GPR87 sääntelyssä CD133 ilmaisua. Olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen GPR87 sääteli CD133 ilmentyminen, edistänyt CSC liittyvä muuttavien ja invasiivisia ominaisuudet

in vitro

, ja lisääntynyt kasvaimen aloittamista

in vivo

. Kääntäen, vaimentaminen GPR87 ilmaisun vähensivät CD133 ilmaisua. Johtopäätös: GPR87 edistää kasvua ja etäpesäkkeiden CD133

+ syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, ja meidän tulokset voivat paljastaa uudet tavoitteet HCC ehkäisyyn tai hoitoon.

Citation: Yan M, Li H, Zhu M, Zhao F, Zhang L, Chen T, et ai. (2013) G proteiini-reseptori 87 (GPR87) edistää kasvua ja metastaasin CD133

+ Cancer Varsi kaltaisia ​​soluja maksasolukarsinoomassa. PLoS ONE 8 (4): e61056. doi: 10,1371 /journal.pone.0061056

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 19 joulukuu 2012; Hyväksytty 5 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 10 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta National Key Program for Basic Research of China (973) (2009CB521803), National Natural Science Foundation of China (81272438), National Key Sci-Tech Special Project of China (2013ZX10002-11), Program Shanghai Aihe Chief Science (A) (09XD1403600) ja johtava akateeminen Kuri Project Shanghai Municipal Education komitea (J50208). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on yksi yleisimmistä ihmisen syöpien, ja suurin osa HCC liittyvistä kuolemantapauksista esiintyä paikallisen invaasion ja etäpesäkkeiden [1]. Vaikka merkittävää edistystä, useimmat terapeuttiset lähestymistavat eivät poistaa kaikki kasvainsolut, ja jäljellä syöpäsolujen usein johtaa kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke. Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että syöpä kantasolut (CSCS) voi olla vastuussa resistenssin tavanomaiseen hoitoon ja etäpesäkkeitä [2], [3], [4], [5]. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja etäpesäkkeiden ei ole riittävästi ymmärretty.

CD133, 5-transmembraaninen glykoproteiini, on tärkeä solun pinnan proteiini, jonka on todettu olevan syövän kantasolujen markkerina erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [6], [7], [8], mukaan lukien maksasyöpä [5], [9], [10]. Aikaisemmat tutkimus ensimmäinen tunnistettu ja varmistunut, että pienen ala- populaation CD133

+ HCC solujen HCC solulinjoja, jotka osoittivat lisääntynyt kyky muodostaa klooneja

in vitro

ja voimakas tuumorigeenisyystesti

in vivo

[11 ]. Muut ryhmät ovat myös osoittaneet, että CD133

+ HCC soluilla syöpä kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten itseuudistumisen, erilaistuminen,

in vivo

kasvain aloittamista ja kemoterapian resistenssin [12], [13], [ ,,,0],14], [15]. Kuitenkin tiedetään vähän rooli CD133

+ HCC-solut tuumorimetastaasissa.

G-proteiiniin kytketty reseptori 87 (GPR87), joka tunnetaan myös GPR95, on solun pinnan GPR, joka on yli-ilmentynyt monipuolinen syöpien ja sillä on keskeinen rooli tuumorisolun eloonjääminen [16], [17]. Vaikka paljon näyttöä siitä, että GPRs tärkeä rooli säätelyssä solumorfologian, napaisuus ja muuttoliike [18], [19], [20], on olemassa muutamia raportteja toiminta GPR87. Vain kaksi raportit ovat osoittaneet, että GPR87 Knockdown herkistyneet syöpäsolujen DNA-vaurioita aiheuttama kasvun hidastuminen kautta parannettu p53 vakautus- ja aktivointi [16], [21].

Tässä tutkimuksessa olemme eristäneet CD133

+ CSC kaltainen subpopulaatio ihmisen HCC solulinjojen ja osoittaneet, että CD133

+ HCC soluilla vaeltavia ja invasiivisia ominaisuudet

in vitro

ja omistivat metastaattista potentiaalia

in vivo

. Lisäksi selvitimme roolia GPR87 säätelyssä ilmentymisen CD133, mikä puolestaan ​​edistää kasvua ja etäpesäkkeiden syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja HCC.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Hep3B, SNU475 ja PLC /PRF /5 HCC solulinjat ostettiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). SMMC-7721 solulinja saatiin Cell Bank instituutin Biokemian ja solubiologian, Kiina Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). MHCC-97L line tarjosi Maksasyöpä Institute of Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston (Shanghai, Kiina). HCC-LY5 solulinja perustettiin meidän laboratoriossa eristämisen HCC näyte potilaalta, joille oli tehty maksasyövän resektio maksassa Cancer Institute of Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston (Shanghai, Kiina). Kaikkia solulinjoja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM, Sigma-Aldrich, USA), joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (Biowest, Ranska), jota oli täydennetty 100 IU /ml penisilliini G: tä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, USA), ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2.

Cell Isolation by Magnetic soluerotte- (MACS) B

solut leimattiin ensisijainen CD133 /1 vasta-ainetta (hiiren lgG1, Miltenyi Biotec, Saksa), ja CD133

+ ja CD133

– soluja myöhemmin magneettisesti eristettiin käyttäen EasySep PE Selection Kit (StemCell Technologies, Kanada) mukaan valmistajan ohjeita. Puhtaus lajitellut solut arvioitiin Western blot. Trypaanisinisellä värjäystä käytettiin arvioimaan lajitellaan solujen elinkykyä, ja yli 90% elinkelpoisuus pidettiin hyväksyttävänä loppupään kokeita.

lentivirustartunnat Tuotanto ja Cell transduktio

GPR87 ORF-sekvenssi PCR-monistettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita (eteenpäin: 5′-TCGACGCGTATGGGGTTCAACTTGACGCTTG-3 ’, käänteinen: 5′-TTCCATATGGGCAAACATTACACGCAGACAA-3’) ja kloonattiin pWPXL lentiviraalinen ekspressiovektori (Addgene, MA) korvaamalla GFP-fragmentti. CD133 cDNA-klooni (Myc-DDK-merkinnällä ORF klooni Homo sapiens prominin 1 (PROM1), transkripti variantti 1, kun transfektio-ready DNA NM_006017.1) täyspitkä ORF-sekvenssi hankittiin Origene (Origene Technologies, Inc. Rockville) , joka kloonattiin pWPXL lentiviraalinen ekspressiovektori (Addgene, MA) korvaamalla GFP-fragmentti. PLVTHM-shGPR87 ja pLVTHM-shNC vektorit insertoimalla oligonukleotidit (GPR87: 5’CCGGUGCUUUAUCUCAUUATT-3 ’tai 5′-GGACCUUGGUACUUCAAGUTT-3’, NC: 5’TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’) otetaan lentiviruksen pLVTHM vektorin kuvattu Addgene verkkosivuilla.

viruksen pakkaus suoritettiin HEK 293T-soluissa kotransfektion jälkeen on pWPXL-GPR87 tai pLVTHM-shGPR87 vektorin kanssa psPAX2 pakkaus plasmidi ja pMD2.G kirjekuoren plasmidi (Addgene, MA) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Kanada). Virukset kerättiin 72 h transfektion jälkeen, ja viruksen tiitterit määritettiin. Kohdesoluja (1 x 10

5), mukaan lukien SMMC-7721, HCC-LY5, MHCC-97L, PLC /PRF /5 ja Hep3B solujen tartunnan sai 1 x 10

6 yhdistelmä-lentivirusta transduktoivan yksiköiden läsnäolo 6 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich, USA).

immunohistokemiallinen (IHC) Värjäys Human HCC kudokset

Kaksisataa kolmekymmentäkuusi ihmisen HCC kudosnäytteitä saatiin potilailta joille tehtiin kirurginen hoito on Guangxin Cancer Institute (Nanning, Kiina), Qidong Liver Cancer Institute (Qidong, Kiina) tai ensimmäinen Affiliated sairaala Zhejiangin yliopisto (Hangzhou, Kiina). 236 HCC potilaista 190 urosta ja 46 naarasta (keski-ikä: 50,9 vuotta, vaihdellen 21-83 vuotta). Kaikki toimenpiteet suoritettiin konsensus sopimusten mukaisesti ja Kiinan eettisen arviointikomitealle. Kaikki kudosnäytteet kiinnitettiin 4% fosfaattipuskuroidussa neutraali formaliinilla ainakin 72 tuntia ja rutiininomaisesti upotettiin parafiiniin. Kudos-mikroarray muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [22].

Parafiini-upotetun kudoksen array osat (5 um paksu) valmistettiin, ja immunokonjugaattien havaittiin immunofluoresenssilla menettelyjen mukaisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla [11]. Optimaalisen vasta-laimennoksia, valmistajan suositeltu pitoisuuksia käytettiin. Tulokset visualisoitiin ja valokuvattiin käyttämällä Axioskop 2 mikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa), jossa DP70 CCD-järjestelmä (Olympus, Japani).

Reaaliaikainen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio

Yhteensä RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Kanada) ja käänteiskopioitua käyttämällä PrimeScript ™ RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (Takara Biotechnology, Japani). Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) sen jälkeen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Ilmaisu tasot normalisoitiin niitä vastaan, jotka sisäisen viitegeenin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH).

Western Blot

solujen hajoamista, näytteen valmistus, SDS-PAGE erottaminen ja electrotransferation on nitroselluloosakalvoil- suoritettiin käyttämällä standardimenetelmiä. Immunoblottaus suoritettiin käyttämällä hiiren anti-CD133 /1 IgG1 (Miltenyi Biotec) ja visualisoitiin käyttäen SuperSignal West Femto Suurin herkkyys Substrate (Pierce). β-aktiini uudelleenseulottiin latauskontrollina.

In vivo

analyysi Tumor Growth and Metastasis

Kaikki eläinkoetta protokollat ​​Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi Shanghai Medical kokeellinen Animal Care komissio Shanghai Jiaotong yliopisto (hyväksyntä ID. ShCI-12-023). Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja synnynnäisesti immuuni-puutosta ei liikalihava diabeettinen /severe combined immuuni-puutos (NOD /SCID) koirashiirien jaettiin satunnaisesti ryhmiin ja ylläpidetään standardiolosuhteissa mukaan toimielimen ohjeiden.

potilaalle tehdä rokotus, 8 mm: n poikittainen viilto tehtiin ylävatsassa nukutuksessa. Kymmenentuhatta CD133

+ tai CD133

– soluja lajiteltiin SMMC-7721 solut suspendoitiin 50 ui seerumitonta DMEM /matrigeelin (01:01) ja ruiskutetaan vasempaan maksan koru hiiriin käyttäen mikroruiskulla. Kasvaimen muodostumista seurattiin aloittaen 1 viikon kuluttua inokulaation.

in vivo

lusiferaasisignaaliin visualisoida ja mitata käyttämällä

in vivo

kuvantamisjärjestelmä (LB983 NC320, Berthold Technologies GmbH Co. KG, Saksa). Jälkeen 12 viikkoa, kaikki hiiret tapettiin, ja kasvainmassat ja ympättiin hiiren maksan kudosnäytteet leikattiin ja mikroskooppisesti.

Muodosta kasvaimen itseohjautuva eläinmalli, NOD /SCID-hiiriä ensin huuhdeltiin kanssa 20 mg /kg 2-acetaminofluorene (2-AAF), tai 0,2% DMSO: yhden viikon ajan. Seuraavaksi 2/3 vasemman maksan lohko kirurgisesti resekoitiin, ja 10000 CD133

+ soluja tai CD133

– solut, jotka olivat äskettäin eristettiin SMMC-7721 solulinja MACS ruiskutettiin pernaan. Perna resektoitiin 5 minuuttia injektion jälkeen, ja huuhdeltiin 2-AAF tai DMSO jatkui 9 viikkoa. Lopussa yhdeksännen viikon, kaikki hiiret tapettiin, ksenograftin kasvaimen muodostumisen ja etäpesäkkeitä havaittiin sekä maksassa ja keuhkoissa leikeltiin ja tutkitaan mikroskooppisesti [23], [24], [25].

tilastollinen analyysi

Statistical Package of Social Sciences (versio 18.0) (SPSS) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Riippumattoman Studentin t-testiä tai ANOVA käytettiin vertaamaan jatkuvia muuttujia ryhmien välillä, kun taas χ2 analyysi sovellettiin vertailuja dikotomisten muuttujia.

P

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tähdellä käytettiin edustamaan tilastollista merkitystä

P

arvoja joitakin lukuja, esim. * P≤0.05, ** p≤0.01.

Tulokset

CD133

+ HCC Solut Näyttö korkea invasiivinen ja metastaattinen potentiaali

In vitro

CSCS tiedetään olevan parannetun muuttavien ja invasiivisia potentiaalia. Jotta voitaisiin edelleen tutkia metastaattisen potentiaalin CD133

+ HCC-solujen

in vitro

, me lajitellaan SMMC-7721, SNU475, PLC /PRF /5 ja ensisijainen ihmisen HCC-LY5 HCC soluiksi CD133 ilmentyminen MACSilla . CD133 ilmentyminen lajitellut solut vahvistettiin Western blot (kuvio 1A), ja CSC liittyvät ominaisuudet eristettyjä soluja analysoitiin. Mielenkiintoista, vaikka CD133

+ ja CD133

– soluja lajiteltuna SMMC-7721 ja HCC-LY5 solulinjoja ei esiintynyt merkittäviä eroja kasvun (kuvio 1 B), The CD133

+ solut vaelsivat ja tunkeutuu sen suuremmassa määrin kuin CD133

– soluja

in vitro

siirtokuoppaan maahanmuutto- ja matrigeelin invaasiota määrityksissä (kuvio 1 C, D), mikä osoittaa, että CD133

+ solut ovat laajasti vaeltavia ja invasiivisia. Testata proliferaatiopotentiaali vertasimme niiden pesäkkeiden muodostumista kykyjä lisääntymistä ja pehmeä agar pesäkemuodostusta määrityksiä. Tulokset osoittivat, että CD133

+ solut pystyivät aloittamaan suurempia ja lukuisia pesäkkeitä kuin vastaavat CD133

– soluja (kuvio S1, S2), joka osoittaa, että CD133

+ soluja ilmenee pa- kasvu

in vitro

. Rinnalla että, testasimme myös kyky uusiutua on lajiteltu CD133 solujen sferoidiviljelmiä muodostumista määrityksessä. Ensimmäisessä sukupolvi, CD133

+ solut pystyivät tuottamaan suurempia ja pallosia kuin vastaavat CD133

– soluja

in vitro

. Toisessa sukupolvi, CD133

+ solut olivat säilyttäneet päähenkilö (kuva S3). Tulokset osoittivat, että CD133

+ solut näyttävät aktiivista kyky uusiutua

in vitro

perusterveydenhuollossa ja passage kulttuureissa.

(A) eristäminen CD133

+ HCC-solut lajitellaan MACSilla ja havaitseminen CD133 ilmentymisen SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475, ja PLC /PRF /5-soluissa Western blot. (B) kasvukäyrät lajitellun CD133

+ ja CD133

– SMMC-7721 ja HCC-LY5 solut saadaan CCK-8-määrityksessä. (C) TranswellTM migraatiokokeessa of CD133

+ ja CD133

– soluja lajiteltuna SMMC-7721 ja HCC-LY5 solulinjoissa. (D) TranswellTM Matrigel invaasiomääritys of CD133

+ ja CD133

– soluja lajiteltuna SMMC-7721 ja HCC-LY5 solulinjoissa.

CD133

+ HCC Solut Manifest erittäin Metastasoitunut Ominaisuudet

in vivo

edellinen tutkimus osoitti, että CD 133

+ HCC-solut olivat selvästi aiheuttanut tuumoreita ksenograftimallia [11]. Arvioidaan tarkemmin metastaattisen potentiaalin CD133

+ HCC-soluissa, olemme perustaneet potilaalle tehdä eläimen siirremallissa. Tulokset osoittivat, että 10000 CD133

+ SMMC-7721 solut olivat riittäviä indusoimaan kasvainten muodostumista 5/5 (100%) ja maksansisäisten etäpesäkkeiden 2/5 (40%) NOD /SCID 3 kuukauden kuluttua, kun taas vastaava määrä CD133

– soluja vain indusoi kasvaimen muodostumista 3/5 (60%), hiirillä ja ei indusoinut kasvaimen etäpesäke (kuvio 2A, B, C). Hematoksiliini-eosiini (HE) värjäys paljasti samanlaiset histologista ominaisuudet määritellään potilaalle tehdä kasvain elinsiirron (kuvio 2D). Lisäksi edelleen arvioida

in vivo

kasvainsolun itseohjautuva kapasiteettia, jota pidetään metastasoitunut ominaisuus CSCS, eläinmallissa kasvainsolun ohjautuvan perustettiin NOD /SCID-hiiriin. Tulokset osoittivat, että 9/9 NOD /SCID ympätty 10000 CD133

+ HCC solujen kehittynyt kasvaimia ja etäpesäkkeitä, kun taas vähemmän kasvaimia löydettiin maksa NOD /SCID käsitelty vastaavalla määrällä CD133

– solut. Mielenkiintoista, kasvaimet syntyvät CD133

+ solut kasvoivat ja muodostivat syöpäkasvain paikalla resektoitua maksalohko, mikä osoittaa, että CD133

+ HCC-solut ovat hyvin liikkuvia ja näytteille kasvaimen homing kapasiteetti (kuvio 2E F), joka vahvistettiin histopatologinen tutkimus (kuvio 2G, H). Edellä esitetyt tulokset vakaasti osoitti, että CD133

+ solut hallussaan suuri kapasiteetti tuumorietäpesäke

in vivo

HCC.

(A) edustaja

in vivo

bioluminescence kuvantaminen kasvainetäispesäkkeiden NOD /SCID-hiiriin jälkeen potilaalle tehdä elinsiirron kanssa eristetty CD133

+ tai CD133

– SMMC-7721-soluissa (kuva näytetään on tyypillinen ryhmä ortotooppisesti transplantoitu 10,000 solua) (n = 5 kussakin ryhmässä ). (B) Edustavia esimerkkejä NOD /SCID-hiirissä ortotooppisesti transplantoitu CD133

+ tai CD133

– soluja eristettiin SMMC-7721 HCC-solulinjassa. (C) numerot hiirten ilmentää tuumorigeenisyyteen ja maksan etäpesäkkeet CD133

+ SMMC-7721 solut potilaalle tehdä elinsiirron määritykset on esitetty taulukossa. (D) HE värjäys korjatun kasvainten vahvisti ensisijainen HCC fenotyyppi. (E) edustaja

in vivo

bioluminenssin kuvantamiseen kasvaimen etäpesäke NOD /SCID-hiirissä kasvaimen-homing eläinmallissa transplantoitu CD133

+ tai CD133

– soluja eristettiin SMMC-7721 solulinja (n = 9 kussakin ryhmässä). (F) Tyypillisiä esimerkkejä maksan kasvaimen muodostumisen ja etäpesäkkeiden 2-AAF /PHX eläinmallissa oli siirretty CD133

+ tai CD133

– soluja eristettiin SMMC-7721 HCC-solulinjassa. (G) HE värjäys maksakudosta kohdat, kasvain massa CD133

+ HCC soluja 2-AAF /PHX eläin malli osoitti. (H) numerot hiirten ilmentää maksametastaaseista of CD133

+ tai CD133

– SMMC-7721 soluja kasvaimeen ohjautuvat eläinmallissa näkyvät baarissa gragh.

CD133

+ HCC solut näyttö Unique geeniekspressioprofiilien

tutkia molekyylimekanismin taustalla etäpesäke ihmisen maksasyövän, vertasimme maailmanlaajuinen geeniekspressioprofiilien että CD133

+ HCC-soluissa ja niiden CD133

– kollegansa eristetty SMMC-7721-soluissa käyttäen Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Havaitsimme 454 yhteinen ilmentyvät eri geenejä, jotka näkyvät kertamuutos on suurempi kuin 1,5. Näistä 454 geenit, 312 oli säädelty ja 142 olivat alassäädetty. Tunnistetut geenit alistetaan edelleen bioinformatiikan analyysi. Toiminnot differentiaalisesti ilmentyvien geenien liittyi soluadheesiota, muuttoliike, solun tukirangan, kemotaktinen liike ja etäpesäkkeiden (taulukko S1, S2). Niistä geenit, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä CD133

+ ja CD133

– populaatiot, GPR87 todettiin olevan säädelty noin 8-kertaiseksi CD133

+ soluja verrattuna CD133

– soluja. Selventää roolia GPR87 kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeitä CD133

+ HCC-soluissa, ensin tarkasteltiin ilmentymisen GPR87 vuonna lajiteltu HCC solulinjoissa ja ensisijainen ihmisen HCC-soluissa qRT-PCR ja Western blot. Huomasimme, että ekspressiotasot GPR87 että CD133

+ HCC solulinjat olivat korkeammat kuin niiden CD133

– kollegansa (kuvio 3A, C). Sitten testattiin kapasiteettia eri HCC solulinjojen ja ihmisen ensisijainen solujen ilmaista GPR87. GPR87 havaittiin HCC solulinjoissa ja primäärisistä ihmisen HCC-solujen Western blot -analyysillä, vaikka eri määriä (kuvio 3B). Jotta ymmärtää paremmin funktio GPR87 HCC etäpesäkkeitä, me ensin kaksi stabiilit solulinjat ektooppisesti ilmentävät GPR87, SMMC-7721-lenti-GPR87 ja HCC-LY5-Lenti-GPR87 käyttäen lentivirus vektorin. Sitten tutkitaan CD133 ilmentyminen ja CSC liittyvät ominaisuudet näissä stabiilit solulinjat. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen GPR87 in SMMC-7721 ja HCC-LY5 soluissa johti kasvuun mRNA: ta ja proteiinia tasot CD133 (kuvio 3D, E). Ymmärtääksemme paremmin korrelaatio CD133 ja GPR87 ilmaisun HCC kudoksissa, immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin. CD133 ja GPR87 ekspressiota havaittiin kasvaimen yksilöiden, ilmentyminen CD133 korreloi ilmentymisen GPR87 HCC kudoksissa (R = 0,168, P 0,05) (kuvio 3F; Taulukko S3).

(A) suhteelliset mRNA ekspressiotasot GPR87 ja CD133 määritettiin kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktio että CD133

+ ja CD133

– populaatiot lajiteltuna SMMC-7721, HCC-LY5 ja MHCC-97L solulinjoissa. (B) VVestern GPR87 vuonna HCC solulinjoissa ja ensisijainen ihmisen soluja. (C) VVestern GPR87 että CD133

+ ja CD133

– populaatiot lajiteltuna SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475 ja PLC /RFP /5 solua. (D) proteiini ekspressiotasot GPR87 ja CD133 määritettiin Western blot -analyysillä, että SMMC-7721-lenti-GPR87 ja HCC-LY5-lenti-GPR87-soluja. (E) suhteellinen mRNA: n ilmentymisen ja GPR87 ja CD133 määritettiin kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla on SMMC-7721-lenti-GPR87 ja HCC-LY5-lenti-GPR87-soluja. (F) Taulukossa osoitti korrelaation CD133 ja GPR87 ilmaisun HCC kudoksissa.

yli-ilmentyminen GPR87 Up-regulation CD133 Expression ja CSC liittyvät ominaisuudet

vaikutuksen määrittämiseksi GPR87 soluproliferaatioon, olemme analysoineet rooli GPR87 pesäkkeitä muodostumiseen. Kuten kuviossa 4A on kuvattu, yliekspressio GPR87 in SMMC-7721 ja HCC-LY5 soluissa lisäsi pesäkemuodostuksen kapasiteettia verrattuna vastaaviin tyhjä vektori-infektoitujen solujen (P 0,05). Tutkia, yli-ilmentyminen GPR87 voisi myös edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

, me ortotooppisesti ympättiin 2 x 10

6 SMMC-7721-lenti-GPR87 tai SMMC-7721-lenti-ohjaus solujen vasen maksan koru NOD /SCID mikroruiskulla. Gross tutkimus paljasti, että 6/6 hiiret ortotooppisesti ympätty SMMC-7721-lenti-GPR87 solujen kehittynyt kasvaimia 6 viikon, kun taas kasvainten kehittymistä havaittiin vain 3/6 käsitellyillä hiirillä vastaavaa määrää SMMC-7721-lenti-ohjaus soluissa (kuvio 4B). Lisäksi keskimääräinen tuumorin koko hiirissä, siirrostettiin SMMC-7721-lenti-GPR87-soluissa oli 1,6-kertainen suurempi kuin, että hiirillä, jotka inokuloitiin SMMC-7721-lenti-pWPXL soluja.

In vitro

siirtokuoppaan maahanmuutto- ja matrigeeliä invaasio määritykset osoittivat, että SMMC-7721-lenti-GPR87 ja HCC-LY5-lenti-GPR87 vaeltaneet solut ja tunkeutuu suuremmassa määrin kuin tyhjän vektorin-tartunnan saaneiden solujen (P 0,05 ) (kuvio 4C, D). Nämä havainnot osoittavat, että GPR87 voi säätää ylös CD133 ilmentyminen ja edistää etäpesäkkeiden

in vitro

ja kasvu

in vivo

. Vaikka CD133-proteiinin tasojen HCC kudoksissa ilman intrahepaattinen etäpesäke ei korreloi GPR87 lauseke (R = 0,120, P 0,05) (taulukko S4, S5), The CD133-proteiinin tasot HCC kudoksiin intrahepaattinen etäpesäkkeitä korreloi positiivisesti GPR87 lauseke (R = 0,267, P 0,05) (kuvio 4E, F, taulukko 1), mikä viittaa siihen, että CD133 ehkä ajan säädellä ilmentymistä GPR87 metastaattisessa HCC.

(A) Edustavia esimerkkejä proliferaatiomäärityksillä tutkitaan vaikutus of GPR87 yliekspressio SMMC-7721 ja HCC-LY5 soluissa. (B) brutto- ominaisuudet kasvain NOD /SCID ortotooppisesti transplantoitu 2 x 10

6 SMMC-7721-lenti-GPR87 ja SMMC-7721-lenti- pWPXL solut 6 viikon kuluttua (n = 6 kussakin ryhmässä ). (C) TranswellTM migraatiokokeessa in SMMC-7721 ja HCC-LY5 solut yli-ilmentävät GPR87. (D) TranswellTM Matrigel invaasiomääritys in SMMC-7721 ja HCC-LY5 solut yli-ilmentävät GPR87. (E) immunohistokemiallinen värjäys GPR87 ja CD133 HCC kudoksiin intrahepaattista etäpesäke. (F) Taulukossa osoitti korrelaation CD133 ja GPR87 ilmaisun HCC kudoksiin intrahepaattinen etäpesäke.

vaiennettu GPR87 Estää CD133 Expression ja CSC liittyvät ominaisuudet

tutkia toiminnallista roolia GPR87 vuonna CD133

+ HCC-soluissa, me esti ilmentymistä GPR87 PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 ja Huh-7-soluja käyttäen siRNA transfektiota. Virtaussytometrianalyysin paljasti, että hiljentäminen GPR87 vähensivät CD133

+ solujen ilmentymisen 31,4%: sta 24,1% ja 26,7% vuonna PLC /PRF /5-soluissa, mistä 51,3%: sta 13,4% ja 18,5% Hep3B soluissa, 2,2%: sta 1,5% ja 1,0% SNU475 soluissa, mutta mitään muutosta ei havaittu Huh-7-soluissa (kuvio 5).

In vitro

, vaiennettaisi GPR87 PLC /PRF /5 ja Hep3B solujen pienensi mRNA ja proteiini ilmentymistä CD133 (kuva S4). Lisäksi GPR87 shRNA vähensivät solujen kasvua (P 0,05) (kuva S5). Testasimme myös kyky solujen hyökätä, siirtää kapasiteetti seuraavat GPR87 knockdown.

In vitro

siirtokuoppaan maahanmuutto- ja matrigeeliä invaasio määritykset osoittivat, että siellä oli laskua PLC /PRF /5-shGPR87 soluja kuin tyhjän vektorin-tartunnan saaneiden solujen (P 0,05) (kuva S6). Nämä tiedot viittaavat siihen, että GPR87 on merkittävä rooli säätelyssä CD133 ilmentyminen.

virtaussytometrianalyysin tasojen CD133 ilmentymisen GPR87 siRNA-käsiteltyjä soluja, kuten PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 ja Huh- 7-solulinjat.

GPR87 välittää ilmentäminen CD133 HCC Cell Lines

Kuten kokeet edellä on esitetty, olimme osoittaneet, että pudotus on GPR87 voi estää ilmentymisen CD133 ja

in vitro

leviää, kun taas yli-ilmentyminen GPR87 voisi edistää ilmentymistä CD133 ja lisäävät kasvainten etäispesäkkeiden HCC. Tutkimaan edelleen korrelaation GPR87 ja CD133 ilmaisun, olemme laatineet vakaa CD133 yli-ilmentävät solulinjat, SMMC-7721-Lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 ja MHCC-97L-Lenti-CD133 käyttäen lentivirus vektori, tutki GPR87 ilme. Tulokset osoittivat selvästi, että yliekspressio CD133 eivät pystyneet ajan säätelemään GPR87 by qRT-PCR (Kuva 6A, B) ja western-blottauksella (kuvio 6C).

(A) Suhteellinen mRNA ilmaus CD133 in SMMC-7721-Lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 ja MHCC-97L-lenti-CD133 soluja. (B) Suhteellinen mRNA ilmentymistä GPR87 in SMMC-7721-Lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 ja MHCC-97L-lenti-CD133 soluja. (C) VVestern GPR87 ja CD133 in SMMC-7721-Lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 ja MHCC-97L-lenti-CD133 soluja.

Keskustelu

syöpä on systeeminen sairaus, ja etäpesäkkeiden osuus on yli 90% kuolleisuutta syöpäpotilailla [26]. HCC, etäpesäke on yksi arvokkaimmista ennustetekijöiden ja vaikuttaa merkittävästi hoitotuloksia [27]. Äskettäin, syövän kantasoluja (CSCS) on tunnistettu alapopulaation syöpäsoluja, jotka ovat vastuussa kasvaimien synnyn, terapeuttinen vastus, toistumisen ja etäpesäkkeiden [28], [29], [30], [31]. Kuitenkin, molekyylimekanismi CSC etäpesäkkeiden jää epäselväksi. Tutkimalla edelleen tätä mekanismia voi paitsi antaa uutta tietoa HCC vaan myös tunnistaa hyödyllinen molekyylikohteena tehokkaasti hoitoon HCC.

Viime aikoina olemme ja muut ovat tunnistaneet CSC väestön maksasyövän ominaista ilmaus CD133. Kuitenkin yksityiskohtainen metastaattisen ominaisuudet HCC soluja, jotka ilmentävät CD133 jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että CD133

+ HCC soluilla korkea invasiivisen ja metastaattisen mahdollisten

in vitro

. Toisin kuin CD 133

– kollegansa, 10000 CD133

+ SMMC-7721 solut olivat riittävät indusoimaan potilaalle tehdä kasvaimen muodostumisen ja maksansisäisten etäpesäke NOD /SCID-hiirissä 3 kuukauden kuluttua. Lisäksi olemme osoittaneet, että 10000 CD133

+ solut riittävät indusoimaan kokeellisia etäpesäkkeiden yhteydessä spleenic rokotus on kasvaimeen itseohjautuva eläinmallissa, mikä osoittaa, että CD133

+ solut ovat kasvain-homing kapasiteetti

in vivo

.

Viime aikoina lisääntyneen ekspression CD133 on havaittu syövän kantasoluja erilaisia ​​ihmisen ja hiiren syöpiin. Kehittyvät todisteet ovat osoittaneet, että CD133 ilmaisua voidaan säädellä useita tekijöitä, kuten transformoiva kasvutekijä beeta 1 [32], BMP4 [33], microRNA-150 [2] ja interferoni-alfa [4]. Ei kuitenkaan luonnollisen ligandin CD133 ei vielä ole tunnistettu, ja vähän tiedetään sen toimintaa. Esillä olevassa tutkimuksessa vertasimme maailmanlaajuinen geeni-ilmentymisen profiilit CD133

+ HCC CSCS ja CD133

– kollegansa eristetty SMMC-7721-soluissa käyttäen GeneChip analyysin ja havaittiin, että ekspressio GPR87 on CD133

+ HCC solulinjat nostettiin verrattuna niiden CD133

– kollegansa. Tämä havainto osoittaa, että saattaa olla yhteys GPR87 ja CD133 parhaillaan etäpesäkkeiden HCC. Kuitenkaan mitään todisteita on vahvistanut korrelaatio GPR87 ja CD133. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että hiljentäminen GPR87 vähensi CD133 ekspressiotasot. Yli-ilmentyminen GPR87 merkittävästi parannettu migraation ja invaasion HCC-solujen, lisäsivät pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetti

in vitro

ja edistänyt kasvainten muodostumista ja kasvua

in vivo

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GPR87 on kriittinen rooli ilmentymisen moduloimiseksi CD133 ja edistää kasvua ja etäpesäkkeiden HCC-soluissa.

molekyylimekanismi taustalla etäpesäke HCC CSCS vaatii lisätutkimuksia. Tulevaisuuden työ keskittyy valaisemaan taustalla oleva mekanismi GPR87 välittämää sääntely CD133 HCC CSCS ja määrittelemällä molekyylien terapeuttinen tavoitteita HCC CSCS.

tukeminen Information

Kuva S1.

Pesäkkeenmuodostusta määritys CD133

+/- HCC solujen 2D kulttuuriin. Edustavia esimerkkejä proliferaatiomäärityksillä of CD133

+ ja CD133

– soluja eristettiin SMMC-7721 ja HCC-LY5 soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0061056.s001

(TIF)

Kuva S2.

Pesäkkeenmuodostusta määritys CD133

+/- HCC-solut pehmeässä agarissa. Edustavia esimerkkejä proliferaatiomäärityksillä of CD133

+ ja CD133

– soluja eristettiin SMMC-7721 ja HCC-LY5 soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0061056.s002

(TIF)

Kuva S3.

Sferoidiviljelmiä muodostumisen määritys CD133

+/- HCC-solujen

in vitro

.