Krooninen sairaus

tiivistelmä

Transforming kasvutekijä β (TGFli) johdettu kasvaimen microenvironment indusoi pahanlaatuinen fenotyypit kuten epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja poikkeava solu potevilla keuhkosyövässä. TGF-indusoidun translokaatio β-kateniinin E-kadheriinin kompleksit sytoplasmaan on mukana transkription EMT kohdegeenien. PTEN (fosfataasi ja tensin homologi poistetaan kromosomi 10) tiedetään aiheuttavan fosfataasiaktiivisuus sitoutumalla E-kadheriinin kompleksit kautta β-kateniinin, ja viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että fosforylaatio PTEN C-pään häntä voi aiheuttaa sen, että tämän PTEN fosfataasiaktiivisuus . Kuitenkin myös TGFli voi moduloida sekä β-kateniinin translokaatio ja PTEN fosfataasiaktiivisuus kautta fosforylaation PTEN C-terminaalissa on edelleen heikko. Lisäksi rooli fosforylaation PTEN C-terminaalissa in TGF aiheuttama pahanlaatuisia fenotyyppejä ei ole arvioitu. Sen tutkimiseksi, modulaatio fosforylaation PTEN C-terminaalissa voi säädellä pahanlaatuinen fenotyyppejä, tässä loimme keuhkosyöpään solut, jotka ilmentävät PTEN proteiinin mutaatio fosforylaation sivustoja PTEN C-terminaalissa (PTEN4A). Olemme havainneet, että TGF stimulaatio tuotti kaksi-kertainen fosfo- -PTEN /PTEN-suhde. Expression of PTEN4A tukahdutettu TGFp aiheuttama EMT ja soluliikkuvuus jälkeenkin etana ilme. Tuloksemme osoittivat, että PTEN4A voi tukahduttaa EMT läpi täydellisen salpauksen β-kateniinin translokaatio solulimaan, lisäksi estävä vaikutus PTEN4A on TGFp-indusoidun aktivaation Smad-riippumaton signalointireitteihin. Vuonna ksenograftimallia, kasvaimen kasvu suhde oli tukahdutettu soluissa, jotka ilmentävät PTEN4A. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että fosforylaatio sivustoja PTEN C-päässä voi olla terapeuttinen kohde TGF-indusoidun pahanlaatuisia fenotyyppejä keuhkosyövän soluja.

Citation: Aoyama K, Hashimoto N, Sakamoto K, Kohnoh T , Kusunose M, Kimura M, et al. (2013) osallistuminen TGFp aiheuttama fosforylaation PTEN C-pää on TGF-aiheuttama hankinta pahanlaatuiset fenotyyppejä Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (11): e81133. doi: 10,1371 /journal.pone.0081133

Editor: Yulia Komarova, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 toukokuu 2013; Hyväksytty: 18 lokakuu 2013; Julkaistu: 22 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Aoyama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kowa Life Science Foundation ja Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) (21590987 ja 24591162). Tämä tutkimus oli osittain tuettu avustuksen, jonka Diffuusi keuhkosairauksien Research Group terveysministeriön, Labour and Welfare, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Asennus todistusaineisto viittaa siihen, että on tärkeää kasvaimen mikroympäristössä, jossa keuhkosyövän solut ovat vuorovaikutuksessa carcinoma liittyy fibroblastien (valuuttalisiin) ja soluväliaineen (ECM) ja näin ollen hankkia erilaisia ​​pahanlaatuisia fenotyypit, mukaan lukien epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT) ja poikkeava solun liikkuvuus [1,2]. Transformoiva kasvutekijä β (TGFP), joka on yksi kriittisimmistä kudosta jäykistyminen, jotka on johdettu kasvaimen mikroympäristössä aiheuttaa hankinta pahanlaatuinen fenotyyppi, mukana muuttuneen ilmentymisen EMT liittyviä geenejä, kuten etana [3]. Tuore tutkimus osoittaa, että TGF aiheuttama transkription EMT kohdegeenien, kuten fibronektiiniä ja vimentiinista nopeuttavat translokaatio β-kateniinin E-kadheriinin komplekseja solukalvon läpi sytoplasmaan [4]. TGF stimulaatio aiheuttaa myös poikkeavan solun motiliteettia vaikka Smad-riippumaton reittejä, kuten ne, joihin liittyy fokaalisen adheesion kinaasi (FAK) ja fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (PI3K) [5,6]. Vaikka monet Smad riippumatonta reittejä kasvaimen mikroympäristössä negatiivisesti säännellään yhdenmukaistetun lipidi- ja Proteiinifosfataasiin toiminnasta PTEN (fosfataasi ja tensin homologi poistetaan kromosomista 10) [7], keuhkosyövässä, jossa mutaatio PTEN geenin harvoin [8,9], osoittavat usein hyperactivation näistä reiteistä [9-11]. Vaikka PTEN saa aikaan fosfataasiaktiivisuus sitoutumalla E-kadheriinin kompleksit kautta β-kateniinin [12], viimeaikaiset tutkimukset ovat ehdottaneet, että fosforylaatiota PTEN C-terminaalinen häntä voidaan tiiviisti menetys PTEN aktiivisuuden [13]. Rahdar et ai. ehdotti, että korvaaminen neljällä alaniinia (Ala) tähteet, jolloin poistaminen vastaavan seriini /treoniinifosforylaatio sivustoja (S380A, T382A, T383A, ja S385A), parannettu kalvo yhdistys PTEN avoimin konformaatio [14]. Jotkut signalointireitteihin voi moduloida PTEN ilmaisua, mikä laski PTEN fosfataasiaktiivisuus [15,16]; kuitenkin, onko TGFli voi moduloida sekä β-kateniinin translokaatio ja PTEN fosfataasiaktiivisuus kautta fosforylaation PTEN C-terminaalissa on edelleen heikko. Lisäksi tarkka rooli fosforylaation PTEN C-terminaalissa in TGF aiheuttama EMT ja poikkeava solun liikkuvuus ei ole täysin tutkittu. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet, onko TGF voivat moduloida fosforylaation PTEN C-pää, kun keuhkosyövän solujen ja onko neljän Ala substituutio PTEN C- terminuksessa (PTEN4A) voisi inhiboida TGF-indusoitua EMT ja liittyvät poikkeavan solun liikkuvuus. Lisäksi selvitimme oleva mekanismi-eli onko PTEN4A voi moduloida kadheriinin junktionaalinen komplekseja ja signalointireitteihin. Olemme myös arvioitiin vaikutus korvaavien induktion PTEN4A kasvaimen kasvuun

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen linjaus

Kaikki eläinkokeet on tarkastettu ja hyväksytty yliopiston komitea käytön ja hoidon Eläimet Nagoya University Graduate School of Medicine.

Ne tehtiin myös vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti, ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Kaikki hiiret sijoitettiin yksittäin steriilissä barrieritiloissa kanssa fade-in /fade-out 12 tuntia valoa: 12 tuntia pimeyttä. Kun hiiret tapettiin jälkeen kokeiluja, hiiret lopetettiin Anestesialaitteissa yliannostuksen jälkeen on välittömästi niskanmurrolla, minimoida kärsimyksen.

Materiaalit

Monoklonaalinen hiiren anti-PTEN-vasta-aine (klooni 6H2.1) oli Cascade Bioscience (Winchester. Iso-Britannia). Puhdistettu kaniinin anti-fosfo-PTEN (Ser380 /Thr382 /Thr383) vasta, kanin anti-pan Akt vasta-kanin anti-fosfo-Akt (Thr308) vasta-aine, kanin anti-fosfo-Akt (Ser473) vasta-aine, kanin anti-FAK-vasta , kanin anti-fosfo-FAK (Tyr397) vasta-aine, hiiren anti-Smad2-vasta-ainetta, ja kanin anti-fosfo-Smad2 (Ser465 /467) vasta-aine oli peräisin Cell Signaling Technology (Boston, MA). Puhdistettu anti-fibronektiini vasta-aine oli Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Puhdistettu hiiren anti-E-kadheriinin vasta-aine ja anti-β-kateniinin-vasta-aine oli peräisin BD Biosciences (San Diego, CA). Streptavidin (SAV) -Alexa 594 (SAV-594) konjugoidulla anti-hiiri-vasta-aine oli Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). Monoklonaalinen hiiren anti-vimentiinista vasta-aine oli Milliporesta (Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta). Affinity-eristetty kanin anti-aktiini-vasta-aine ja SB 431542, voimakas estäjä TGFp tyypin I reseptori-kinaasien, olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Voiko saada signaali oli peräisin Toyobo Co. (Tokio, Japani). Doksisykliini oli Clontech (Mountain View, CA). PhosSTOP ja WST-1 olivat Roche Applied Science (Mannheim, Saksa). Hoechst33342 oli peräisin Dojindo (Kumamoto, Japani). 1,2,4,5-Benzenetetramine tetrahydrochloride (FAK-estäjä 14) oli Tocris Bioscience (Bristol, Yhdistynyt kuningaskunta).

Plasmidit ja geenitransfektion

Human PTEN (NM_000314) cDNA subkloonattiin pEGFP-C1-vektoriin (Clontech, Mountain View, CA). GFP tai fuusio-geenin GFP-PTEN pantiin pTRE-Tight-vektoriin (Clontech, Mountain View, CA), vastaavasti. QuikChange mutageneesillä Kit (Stratagene, La Jolla, CA) käytettiin perustamaan neljän Ala korvaaminen (S380A, T382A, T383A, ja S385A) on PTEN C-terminaalinen häntä (PTEN4A). Lopuksi GFP että pTRE-Tight vektorin (GFP), GFP-PTEN in pTRE-Tight vektorin (GFPPTENWt), ja GFP-PTEN4A että pTRE-Tight Vector (GFPPTEN4A) perustettiin tässä tutkimuksessa. Perustamisen jälkeen H358 soluja, ihmisen keuhkosyövän solulinjassa kantaen pTet-On Advanced (H358ON), GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A oli kotransfektoitiin Linear hygromysiini Marker (Clontech, Mountain View, CA) käyttämällä Nucleofector ™ II (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD). Valinnan jälkeen hygromysiinillä, yksi kloonia eristettiin. Ihmisen PTEN myös sijoitettiin pcDNA4 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). H1299-solut, muut ihmisen keuhkosyövän solulinjassa, tehtiin elektroporaatio pcDNA4 vain (4HC), pcDNA4 kanssa PTENWt (PTENWt) tai pcDNA4 kanssa PTEN4A (PTEN4A) käyttämällä Nucleofector ™ II. Valinnan jälkeen zeosiinin kanssa, single-kloonit eristettiin.

Solut

Ihmisen keuhkon solulinjat, H358 ja H1299, pidettiin RPMI täydennetty 2 mmol /l L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä , 100 ug /ml streptomysiiniä, 0.25μg /ml fungitsonia, ja 10% FCS: ää [17]. Arvioida vaikutuksen TGFp näihin soluihin, solut käsiteltiin TGF 2 ng /ml ja analysoitiin mRNA-tasoja ja proteiinin tasot osoitettuina ajankohtina ja kuten alla on kuvattu. Vaikutuksen arvioimiseksi PTEN transduktion on TGF stimulaatio, H358ON solut, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A inkuboitiin Dox 1 ug /ml 24 tunnin ajan, ennen kuin TGF käsittelyä kuten edellä on kuvattu. Tutkia suoria vaikutuksia TGFp stimulaation modulaatio p-PTEN /PTEN suhde, soluja inkuboitiin ajoneuvon tai SB 431542 1 tunti ennen TGF hoitoa. Jotta voidaan tutkia roolia FAK fosforylaatio TGF-indusoidun EMT, soluja inkuboitiin ajoneuvon tai FAK-estäjä 14 24 tunnin ajan, ennen kuin TGF hoitoa.

Cell migraatiokokeessa

A 8-um huokoskoko Boyden kammio käytettiin in vitro migraatiokokeessa [18]. Sen jälkeen, kun on käsitelty Dox: ssa 24 tuntia, solut (3×10

4 solut) RPMI, joka sisälsi 0,5% seerumia, ja TGFp 2 ng /ml maljattiin ylempään kammioon ja 15% naudan sikiön seerumia (FCS) RPMI lisättiin alempaan kammioon kuin kemoattraktantti.

PCR-analyysi ilmentämiseen kohdennettujen geenien

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan ABI 7300 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Snail (NM_005985), kierre (twist1: NM_000474), ja glyceraldehydes-3-phophate (GAPDH) mRNA: t havaittiin, käyttämällä seosta oligonukleotidialukkeita ja koettimia Nippon EGT, Inc (Toyama, Japani). mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH mRNA-signaalin [19].

Western blot-analyysi

Koko-solu-uutteet, solut kerättiin jääkylmään lyysipuskuria ja kirkastetaan sentrifugoimalla [20,21]. Näytteet alistettiin sitten SDSPAGE ja analysoitiin immunoblottauksella. Havaitsemiseksi fosforylaation tasoja kohteena proteiinien, Phosphostop lisättiin lyysipuskuria ja voi saada Signal lisättiin myös laimennus ratkaisu primaarisen vasta-aineen ja toisen vasta-aineen. β-aktiini arvioitiin latauskontrollina.

WST-1-määritys

soluproliferaation reagenssi WST-1 käytettiin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi soluproliferaation [18]. Absorbanssi näytteiden mitattiin 450 nm: ssä käyttämällä spectrofluorophotometer (Wallac 1420 ARVO-SX; PerkinElmer, Inc., Waltham, MA). Ellei toisin mainita, pelkästään väliainetta mitattiin taustavertailuna.

Immunofluorescence ja CLSM

Immunochtochemistry suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [22]. Arvioida vaikutuksen PTEN4A transduktion on TGF-indusoidun translokaatio β-kateniinin, H358ON solut, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A inkuboitiin anti-β-kateniinin vasta-aine, jota seurasi SAV-594 konjugoitua anti-hiiri- vasta-aine. Nuclear värjäys suoritettiin Hoechst 33342. määrittämiseksi tasot β-kateniinin jakelu, CLSM (LSM 5 PASCAL; Carl Zeiss Co., Ltd, JENA, Saksa) käytettiin. Fluoresenssin β-kateniinin ja ydin arvioitiin käyttämällä kuvankäsittelyohjelma (LSM Software ZEN 2008 Carl Zeiss Co., Ltd, JENA, Saksa). Voit suorittaa silmämääräisesti fluoresenssiangiografiassa, fluoresoiva intensiteetti yli satunnainen poikkileikkaus soluja piirrettiin [23,24]. Voit selvittää tasot PTEN subsellulaarinen jakelu, CLSM myös hyödyntää. Intensiteetti tasot GFP fluoresenssin sekä sytoplasmassa ja tumassa myös määrällisesti, käyttämällä kuvankäsittelyohjelma. Vähintään 5 satunnaisesti valitun suuritehoisia alueita tarkastellaan näytettä kohti mitataan fluoresenssi-intensiteetin tumassa ja sytoplasmassa [25].

Hiiri ksenograftimallia

3×10

6 H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFPPTENWt tai GFPPTEN4A, ympättiin ihonalaisesti (sc) kylkeen 6-viikkoisen naaras-nude hiiriä ja pidettiin sitten veden kanssa Dox loppukonsentraatiolla 2 mg /ml ja autoklavoitiin rehun halun mukaan. Kasvua seurattiin ajan ottamalla mittaharppimittauksilla ilmoitettuina aikoina kuten aikaisemmin on kuvattu [26,27]. Jokainen koe käyttää 5 nude hiirille GFPPTENWT, 7 nude-hiiriin GFP, ja 7 nude hiirten GFPPTEN4A. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin.

Tilastollinen analyysi

Tulokset analysoitiin käyttäen Mann-Whitney-testi vertailu tahansa kaksi ryhmää, ja ei-parametrinen ekvivalenttia varianssianalyysi (ANOVA) useita vertailuja. Arvo p 0.05was katsotaan osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

TGF moduloi fosforylaation tasoja PTEN C-pää, kun PTEN ilmentymisen H358-soluissa, sen jälkeen EMT ja poikkeavan solun motiliteettia

arvioidaan TGFli aiheuttaman EMT keuhkojen syöpäsoluja [28,29], western blotting-analyysi fibronektiiniin [4,30] ja E-kadheriinin [4,29] tehtiin. Western blotting-analyysi osoitti, että TGFli indusoi noin 12-kertainen fibronektiinin ilmentymisen H358 naiivi soluissa verrattuna ajoneuvon, kun taas E-kadheriinin ilmentymisen soluissa käsitelty TGFβdecreased yli 20% verrattuna niihin vehikkeliä; Näin ollen, TGF stimulaatio tuotti yli 15-kertaa suurempi fibronektiinin /E-kadheriinin suhde H358 naiivi soluissa verrattuna ajoneuvon (kuvio 1A). Arvioidaan yhdistyksen välillä TGFp aiheuttaman EMT ja muuttoliike kyky, muuttoliikkeen määritys suoritettiin. H358 naiivi solut käsiteltiin TGFβat 2 ng /ml näytteillä noin 20 kertaa suurempi kyky siirtyä kohti kemoattraktantti, kuin niitä, vehikkeliä (kuvio 1 B). Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että translokaatio β-kateniinin sytoplasmaan suoraan saa

de novo

ilmentymistä mesenkymaalisten geenien epiteelisolujen [4,31]. Näin ollen, lokalisaatio β-kateniinin arvioitiin myös TGFp-käsiteltyjen keuhkosyövän solut immunofluoresenssilla. Immunofluoresenssilla saatujen kuvien konfokaalimikroskopialla ehdotti, että β-kateniinin paikallistettiin solun kalvon H358 naiivi soluissa, joita käsiteltiin ilman TGF (kuvio 1C ja 1 D), kun taas β-kateniinin translokaatio solulimaan havaittiin TGF-käsiteltyjen H358 naiivi soluja, mukana kolokalisaation β-kateniinin kanssa Hoechst33342 (kuvio 1 C ja 1 D). Arvioida TGFp aiheuttama signalointireittien, western-blottaus suoritettiin. TGF aiheuttama lisäys Smad2 fosforylaation alkaa 5 minuuttia ja nousee enintään 1 tunti, jonka jälkeen fosforyloitiin Smad2 ilme säilyi vakaalla tasolla jopa 6 tuntia (kuvio 1 E). Arvioidaan vaikutus TGFp stimulaation Smad-riippumaton polkuja, aktivointi Akt ja FAK analysoitiin myös western blottauksella. TGF indusoi yhä fosforylaatiota Akt at Thr308 ja Ser473 (Akt308 ja Akt473) alkaa 20 minuuttia ja saavuttaa maksimaalinen taso 1-3 tuntia (kuvio 1 F); Sen sijaan lisäämällä fosforylaatiota FAK at Tyr397 havaittiin 6 tuntia ja saavutti maksimaalisen tason 12 24 tuntia (kuvio 1G). Lisäksi arvioimme vaikutus TGFp sekä PTEN ekspressiotasot ja fosforylaation PTEN (p-PTEN) sen C-terminuksessa keuhkojen syöpäsoluja. Tulokset osoittivat, että TGF hoito hieman, mutta huomattavasti fosforylaatioon PTEN sen C-terminuksessa, ja myös vähentynyt yhteensä PTEN tasot H358 naiivi soluissa, jolloin saadaan kaksinkertainen lisäys p-PTEN /PTEN-suhde 24 tunnin kuluttua TGF hoidon ( Kuvio 1 H). Sen arvioimiseksi, onko TGF voi suoraan moduloida p-PTEN /PTEN-suhde, H358-soluja käsiteltiin SB 431542, voimakas estäjä TGFp tyypin I reseptori-kinaasien [32]. Käsittelemällä SB 431542 onnistuneesti esti TGF-indusoitu lisääntyminen p-PTEN /PTEN-suhde (kuvio 1 i), joka on havainto tukee tietoja, jotka osoittavat, että käsittely 10 uM SB 431542 inhiboi Smad2 aktivointi (tuloksia ei ole esitetty). Siten TGFp aiheuttama lisäys p-PTEN /PTEN-suhde voi olla mukana TGFp-indusoidun hankinta pahanlaatuisten fenotyyppejä keuhkosyövän soluja.

(A) H358-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai TGF kerättiin analysointia varten fibronektiinin ja E-kadheriinin. Suhteellinen ekspressio fibronektiinin E-kadheriinin (F /E-suhde), on esitetty verrattuna, että soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 (B) migraatiokokeessa suoritettiin varten H358 solulinjan vehikkeliä tai TGF. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoja ± SD. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 fluoresenssin β-kateniinin (punainen) käsitellyn solut arvioitiin käyttämällä CLSM: ää ja kuvantamisen ohjelmistoja. Tumavärjäystä suoritettiin Hoechst33342 (sininen). Vasemman kuvan (C) esittää solujen ilman TGF stimulaatiota. Oikeus kuva (C) esittää stimuloitu TGF. Soluja inkuboitiin isotyypin kontrolli-IgG on esitetty sisäke (C). Ylempi paneeli (D) piirtää fluoresenssin voimakkuus β-kateniinin (punainen) ja tuma (sininen) yli poikkileikkauksen soluja ilman TGF stimulaatiota. Alempi paneeli (D) piirtää fluoresenssin voimakkuus β-kateniinin (punainen) ja tuma (sininen) yli poikkileikkauksen soluja stimuloidaan TGF. Nämä luvut edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen. (E, F, ja G) Solu-uutteet otettiin talteen osoitettuina ajanjaksoina käsittelyn jälkeen TGF analyysiä varten veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun Smad2 (E), Akt473 (F), Akt308 (F), ja FAK (G). Tulokset on esitetty H358 naiivi solut 0 minuutin ajan (kaista 1), 5 minuutin kuluessa (kaista 2), 20 minuuttia (rata 3), 1 tunnin ajan (kaista 4), 3 tuntia (kaista 5), ​​6 tuntia (kaista 6), 24 tuntia (kaista 7) ja 48 tuntia (kaista 8) käsittelyn jälkeen TGF (vasemmalle E, F ja G). Suhde fosforyloidun proteiinin kokonaisproteiinin on esitetty intensiteetin taso suhteessa kuin H358 naiivi solujen 0 minuutin ajan (kaista 1) käsittelyn jälkeen TGF (oikealla E, F, ja G). Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 (H) Solut vehikkeliä tai TGFli 0 minuuttia tai 24 tuntia kerättiin analysointia varten fosforyloidun PTEN (pPTEN) ja yhteensä PTEN. Suhteellinen ilmentyminen pPTEN kokonaismäärään PTEN (pPTEN /PTEN-suhde) on esitetty verrattuna, että solut vehikkeliä 0 minuuttia. Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 N. S. osoittaa ”ei merkittävää”. (I) H358 naiivi soluja inkuboitiin ajoneuvon tai SB 431542 10 uM: ssa yksi tunti, ennen kuin TGF hoitoa. pPTEN /PTEN-suhde on esitetty verrattuna, että soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä. Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 N. S. osoittaa ”ei merkittävää”.

mutaatio fosforylaation sivustoja PTEN C-päässä tukahduttaa TGF aiheuttama EMT ja aberrance soluliikkuvuus vuonna H358-soluissa

Vahvista biologisten vaikutusten TGFp indusoima fosforylaatio PTEN C-terminaalissa keuhkojen syöpäsoluja, tutkimme onko mutaatio fosforylaatiopaikat PTEN voi vaikuttaa sekä TGFli aiheuttama EMT ja siirtyminen kyky keuhkosyöpään solujen käyttämällä Dox riippuvan geeniekspression järjestelmää, koska useat PTENWt saattamisen mallit ovat ehdottaneet, että PTENWt transduktio voi aiheuttaa hitaan kasvun suhde glioomasoluihin [15]. Ensin tarkistaa, että neljän Ala korvaaminen estää fosforylaatiota PTEN C-pää, kun

de novo

PTEN-proteiinin aiheuttama Dox, western blotting suoritettiin H358ON soluista, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP -PTEN4A puuttuessa tai läsnä Dox. Vaikka

de novo

GFP-PTEN ilmentymistä havaittiin H358ON soluissa, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A kun Dox lisättiin fosforyloitua GFP-PTEN havaittiin vain H358ON soluissa, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP- PTENWt (kuvio 2A). Koska viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että fosforyloitumaton PTEN saattavat joutua ubikitinaatiosta jolloin translokaation tumaan [21], arvioimme lokalisoinnin GFP-fluoresenssin H358ON soluissa, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt ja GFP-PTEN4A. GFP yksin oli hajanaisesti ilmaistu sekä sytoplasmassa ja tumassa (vasen kuviossa 2B ja 2C), kun taas GFP-PTENWt ja GFP-PTEN4A pääasiassa sijaitsee sytoplasmassa haaleatekstisten ydin- ilme (keskimmäinen ja oikealle kuviossa 2B, ja 2C). Ei ollut mitään eroa tumassa /sytoplasmaan suhde GFP fluoresenssin välisen GFP-PTENWt ja GFP-PTEN4A (kuvio 2C). Sen arvioimiseksi, onko TGFli aiheuttama EMT voidaan puuttua

de novo

GFP-PTEN ilme, western blotting analyysi fibronektiinin ja E-kadheriinin suoritettiin. Ei ollut väheneminen fibronektiini /E-kadheriinin suhde soluissa, jotka ilmentävät GFP yksin ja osittainen vähennys (31,8%) niissä ilmentävät GFP-PTENWt; kuitenkin,

de novo

GFP-PTEN4A proteiinin aiheuttama Dox aiheutti merkittävän laskun noin 75%, kun fibronektiini /E-kadheriinin suhde (kuvio 2D). Sen arvioimiseksi, GFP-PTEN4A voi vaikuttaa TGFli aiheuttama solun liikkuvuus, muuttoliikkeen määritys suoritettiin. Vuonna H358ON soluissa TGFp aiheuttama lisäys muuttoliikettä kohti kemoattraktantti ei inhiboinut joko GFP tai GFP-PTENWt proteiinin aiheuttama Dox, kun taas

de novo

GFP-PTEN4A proteiini tukahdutettu migraatiota aiheuttama TGF stimulaatio ( kuvio 2E). Nämä tulokset osoittavat, että estämällä fosforylaation PTEN C-päähän voidaan torjua TGFp aiheuttama EMT ja estää poikkeavan solun motiliteettia keuhkosyövän soluja, kuin vaikutus PTEN transduktion itse havaittiin soluissa, jotka ekspressoivat PTENWt.

(A) H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A inkuboitiin ajoneuvon tai Dox 24 tunnin ajan ennen TGF hoitoa. Solut käsiteltiin sitten ajoneuvon tai TGF vielä 24 tuntia poissa tai läsnä Dox. Solut kerättiin analysointia varten pPTEN (yläpaneeli), yhteensä PTEN (keskimmäinen paneeli) ja β-aktiini (alapaneeli) western-blottauksella. Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) Käyttäen CLSM, lokalisoinnin GFP-fluoresenssin H358ON soluissa, jotka ilmentävät Dox-käsiteltyjen GFP (vasen paneeli), GFP-PTENWt (keskimmäinen paneeli) ja GFP-PTEN4A (oikea paneeli) arvioitiin. (C) Intensiteetti tasot GFP fluoresenssin sekä sytoplasmassa ja tumassa myös määrällisesti, jonka kuvankäsittelyohjelma. Fluoresenssin intensiteetin ilmaistiin tuma /sytoplasma-suhde kullekin näytteelle. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *: P 0,05 N. S. osoittaa ”ei merkittävää”. (D) H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A sai vehikkeliä tai TGFp 48 tunnin ajan poissa tai läsnä Dox, ja sitten talteen analyysiä varten fibronektiinin, E-kadheriinin ja β aktiini-western blottauksella. F /E-suhde on esitetty verrattuna, että soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä ilman Dox. Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 N. S. osoittaa ”ei merkittävää”. (E) migraatiomääritys suoritettiin H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A puuttuessa tai läsnä Dox ja /tai TGFp stimulaatio. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoja ± SD. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 N. S. tarkoittaa ”ei merkittävää”.

mutaatio fosforylaation sivustoja PTEN C-päähän inhiboi TGF-indusoidun Smad-riippumaton reittejä, mutta ei Smad-riippuvaisen reitin in H358-soluissa

valaisemiseksi taustalla molekyylitason mekanismeja, vaikutus GFP-PTEN4A on TGF-indusoidun signalointireitteihin arvioitiin. Kumpikaan

de novo

GFP, GFP-PTENWt, eikä GFP-PTEN4A ilmentyminen indusoi Dox tukahdutettu kasvu Smad2 fosforylaation TGFp-käsiteltyjen H358ON soluissa (kuvio 3A). Kasvu Akt-fosforylaation TGFli saaneilla H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP-PTENWt ja GFP-PTEN4A palasi perustasolle tai pienempi, kun Dox lisättiin, kun taas vuonna TGFli hoidetuilla H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP ei muutosta kun Dox lisättiin (kuvio 3B). On huomattava, että GFP-PTEN4A tasaisesti tukahdutettu fosforyloidun Akt tasoja, verrattuna GFP-PTENWt (GFP-PTEN4A, 88%: n lasku Akt473 ja 79%: n lasku Akt308, GFP-PTENWt, 74%: n lasku Akt473 ja 68% vähennys in Akt308) (kuvio 3B). Fosforyloidun FAK in TGFp-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät joko GFP tai GFP-PTENWt ei muuttunut, kun Dox lisättiin, kun taas, että TGFp-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät GFP-PTEN4A onnistuneesti palasi perustasolle, kun Dox lisättiin (kuvio 3C).

Solun otteita H358ON soluista, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP, GFP-PTENWt tai GFP-PTEN4A puuttuessa tai läsnä Dox kerättiin analyysiä veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun ja Smad2 (A), Akt473 (B), Akt308 (B), ja FAK (C) ilmoitettu aikoja hoidon jälkeen ajoneuvo tai TGF (1h varten Smad2, 1h varten Akt473, 1h varten Akt308, ja 24hours varten FAK, vastaavasti). Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta (top A, B ja C). Suhde fosforyloidun proteiinin kokonaisproteiinin on esitetty intensiteetin taso suhteessa, että H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP vehikkeliä ilman Dox (pohja A, B ja C). Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 N. S. osoittaa ”ei merkittävää”.

FAK-estäjä kohdistaminen Tyr397 lohkot TGFli aiheuttama poikkeava solun liikkuvuus, mutta ei TGFli aiheuttama EMT in H358-soluissa

Koska PTEN4A tukahdutettu tasot fosforyloitua FAK at Tyr397 aiheuttama TGFli, päätimme onko esto TGFp aiheuttaman FAK aktivointi voi pelastaa EMT ja estää poikkeavaa solua motilit. Ensinnäkin, soluja käsiteltiin FAK-estäjä 14, kohdistaminen Tyr397 sivuston FAK [33], joka onnistuneesti esti TGF-indusoitua FAK fosforylaation Tyr397 annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 4A). Esto TGFp aiheuttaman FAK aktiivisuutta FAK-estäjä 14 tuotti tukahdutettu TGFli aiheuttama soluliikkuvuus (kuvio 4C), mutta se ei vaikuttanut hankinta EMT fenotyypit jäi pysyviä (kuva 4B). Lisäksi olemme vahvistaneet TGFli aiheuttama β-kateniinin translokaation sytoplasmaan ja tumaan ei estänyt käsittelemällä FAK-estäjä 14 (kuvio 4D-4G).

Jotta voidaan tutkia roolia FAK fosforylaation Tyr397 on TGFli aiheuttama EMT, Dox-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP inkuboitiin ajoneuvon tai FAK-estäjä 14 24 tunnin ajan ennen TGF hoitoa. (A) Solu-uutteet otettiin talteen 24 tunnin kuluttua altistuksesta ja TGF analyysiä varten veren kokonaiskolesterolia ja fosforyloidun FAK. Dox-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP sai vehikkeliä (kaista 1) tai TGF (kaista 2, 3, 4, ja 5). Soluja inkuboitiin myös ajoneuvon (kaista 1 ja 2), tai FAK-estäjä 14 0,1 nM (kaista 3), 1 nM (kaista 4), ja 5 nM (kaista 5) (alkuun A). Suhde fosforyloidun proteiinin kokonaisproteiinin on esitetty intensiteetin taso suhteessa, että Dox-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP vehikkeliä (pohja A). Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 (B) Dox-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP sai vehikkeliä tai TGFp 48 tunnin ajan poissa tai läsnä FAK-estäjä 14 5 nM, ja sitten talteen analyysiä varten fibronektiinin, E-kadheriinin , ja β-aktiini western blottauksella. F /E-luku on esitetty verrattuna, että soluissa vehikkeliä (pohja B). Edustaja blot kolmesta itsenäisestä kokeesta. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvo ± SE. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 N. S. osoittaa ”ei merkittävää”. (C) migraatiomääritys suoritettiin Dox-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP vehikkeliä tai TGFp 48 tunnin ajan poissa tai läsnä FAK-estäjä 14 5 nM. Esitetyt tulokset edustavat keskiarvoja ± SD. Koe toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. *: P 0,05 vaikutuksen arvioimiseksi FAK estäjän 14 lokalisoinnin β-kateniinin Dox-käsiteltyjen H358ON soluja, jotka ilmentävät Dox-riippuvainen GFP vehikkeliä tai TGFli, voimakkuudet fluoresenssin β-kateniinin soluissa arvioitiin. Soluja käsiteltiin vehikkelillä (D ja E) tai FAK-estäjä on 5 nM (F ja G). Vasemman kuvan (D ja F) esittää solujen ilman TGF stimulaatiota. Oikeus kuva (D ja F) esittää stimuloitu TGF. Soluja inkuboitiin isotyypin kontrolli-IgG on esitetty sisäke (D).