Krooninen sairaus

tiivistelmä

makrofagikasvutekijää (MCSF) säätelee kasvua, lisääntymistä ja erilaistumista hematopoieettisten solulinjojen. Monet syövät tiedetään erittävän korkea MCSF, joka makrofagien kasvaimeen mikro-ympäristössä, joka tukee kasvaimen kasvua. Tässä me raportoimme kloonaamista MCSF ja myöhemmän sukupolven U87MG ilmentävien MCSF vakaa solulinjasta (U87-MCSF). Sytotoksisuuden syövän huumeiden 5-fluorourasiilin (5-FU), arvioitiin sekä U87MG ja U87-MCSF soluja. Mielenkiintoista, leviämisen U87-MCSF soluja oli vähemmän (p 0,001) kuin U87MG pelkät solut, käsittelyn jälkeen 5-FU. Merkittävä lasku ekspressiotasot sykliini E ja A2 kvantitoitiin reaaliaikainen PCR-analyysi vahvistivat alennetussa leviämisen 5-FU käsiteltiin U87-MCSF soluja. Kuitenkin JC-1 värjäystä ei havaittu apoptoosin upon 5-FU hoidossa. Notch-1 säätelyä aiheuttama mahdollinen epiteelin-mesenkymaalitransitioon in U87-MCSF soluja, joiden osuus kasvusta osuuden CD24

korkea /CD44

vähemmän syövän kantasoluja U87-MCSF solujen jälkeen 5-FU hoito . Kohonnut vastus U87-MCSF soluja kohti 5-FU johtui kasvusta ilmaisuja (10,2 ja 6-kertainen) ABCB1 ja MDM2, vastaavasti. Lisäksi kasvu ilmauksia ABCG1, MDM2 ja CD24 havaittiin myös U87MG soluissa pitkitetyn inkubaation jälkeen 5-FU. Tutkimuksemme edellyttäen mekanistinen oivalluksia lääkeresistenssin U87MG solujen ja kuvasi myös keskeinen rooli MCSF kohensi vastus U87MG solujen 5-FU.

Citation: Chockalingam S, Ghosh SS (2013) Parantuminen on syöpä kantasolujen makrofagikasvutekijää ilmentävien U87MG-Human glioblastoma upon 5-fluoriurasiili Therapy. PLoS ONE 8 (12): e83877. doi: 10,1371 /journal.pone.0083877

Editor: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 syyskuu 2013; Hyväksytty: 08 marraskuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Chockalingam, Ghosh. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus by Department of Biotechnology nro BT /49 /NE /TBP /2010 ja BT /01 /NE /PS /08. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

makrofagikasvutekijää (MCSF), jota kutsutaan myös pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1 (CSF-1), on kasvutekijä, joka vastaa selviytymistä, proliferaatiota ja erilaistumista solujen hematopoieettisten linjojen [1]. Ulkopuolella hematopoieesijärjestelmän, MCSF on tärkeä rooli kehityksen ja sääntelyn istukan, rintarauhasen, aivot ja luu fysiologian [2] – [4]. MCSF koodaa ainutlaatuinen geeni, mutta vaihtoehtoisen mRNA: n silmukoinnin ja ero translaation jälkeisen modifikaation, kolme eri MCSF, kuten erittyvää glykoproteiinia, erittyvä proteoglykaani ja lyhyen kalvoon sitoutunut isoformi on havaittu [1]. MCSF toimii kautta tyypin III tyrosiinikinaasireseptorin, pesäkkeitä stimuloiva tekijä 1-reseptori (CSF1R), joka on tuote, c-fms: n proto-onkogeeni.

MCSF tiedetään tunkeutua sivustoja vahingon ja tulehdus mononukleaaristen fagosyyttien . Homotsygoottisia mutaatiota CSF-1 hiirissä näyttää köyhdytetty makrofagi väestön rintasyövän, mikä vähentää pahanlaatuisen ja etäpesäkkeiden [5]. Läsnäolo monosyytit ja makrofagit edistää angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden kasvaimen korottamalla eritystä verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF). MCSF toimii transkription sääntelijä tuotannon VEGF [6]. Kuitenkin MCSF on mahdollinen rooli herättämisessä kasvaimen vastaisen vasteen. Monosyytit ja makrofagit on raportoitu tappaa syöpäsoluja mukaan paraptosis, jossa yliekspressio kalvon muodossa MCSF [7], [8]. Lisäksi puhdistettua MCSF ihmisen munasarjan syöpäsolujen on dokumentoitu indusoivan pitoisuudesta riippuvainen kasvun estäminen in vitro [9]. Siksi tällaiset raportit osoittavat kasvaimen vastainen toiminta MCSF run käsi kädessä vaihtoehto raportit osoittavat pro-kasvaimen ominaisuuksista MCSF.

Tässä tutkimuksessa olemme selvitetty roolia MCSF lisäämään huumeiden resistiivinen ominaisuudet ihmisen glioblastoomasolulinjan, U87MG. Olemme myös löytäneet mekanismin 5-FU resistenssin U87MG soluissa. Tuloksemme osoitti, että Notch-1 ekspressio oli lisääntynyt käsittelemättömissä U87-MCSF soluja, joka indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon. Lisääntyminen CD24

korkea /CD44

pieni syövän kantasoluja ja säätelyä keskeisten ABC transporter geenejä (ABCG1 ja ABCB1) luovuttaa resistenssin 5-FU: U87-MCSF soluissa. Tuloksemme antaa näyttöä lääkeaineille fenotyyppi syntymässä muodostamalla syövän kantasolujen MCSF ilmentävät glioblastooma.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ACHN, ihmisen munuaisen karsinooma ja U87MG, ihmisen glioblastoomasolulinjoissa hankitaan National Center for Cell Science, Pune pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (50 U /ml) -Streptomycin (50 mg /ml) 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

RNA: n eristys ja RT-PCR-

RNA viljellyistä nisäkässoluista eristettiin käyttäen GenElute nisäkkään koko RNA: n eristys-kittiä ( sigma) kohti valmistajan ohjeiden mukaan. Kokonais-RNA (1 ug), tehtiin käänteistranskriptio käyttäen cDNA-synteesi kit (Fermentas). Monistus geenin ilmentyminen suoritettiin vastaavien alukkeilla (taulukko S1 File S1).

Western blotting

Soluja kasvatettiin 70-80% konfluenssiin lyysattiin RIPA-puskurilla, joka sisälsi 1 mM PMSF: . Kokonaisproteiinipitoisuus solulysaateissa kvantitoitiin Lowryn menetelmällä proteiinin arviointi käyttäen BSA: ta standardina. SDS-PAGE tehtiin lastaus yhtä suuri määrä proteiinia kussakin kuopassa. Näytteet blotattiin PVDF-kalvolle ja havaita käyttäen vasta-aineita β-aktiinin (BD Transduction Laboratories) ja MCSF (Sigma). Blotit kehitettiin käyttäen kemiluminesenssi peroksidaasisubstraattia-1 Kit (Sigma) ja kuvattiin käyttäen geeliä asiakirjat järjestelmään (Molecular Imager ChemiDoc XRS + kuvaa järjestelmän, Bio-Rad).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus mitattuna käyttäen in vitro toksikologian iinianalyysikitissä, XTT pohjainen (Sigma). Solut ympättiin 96 kuoppalevylle tiheydellä 1,5 x 10

3-soluja kuoppaa kohti annettiin kasvaa yön yli ja sitten sitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU eri aikavälein. XTT (2, 3-bis [2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli] -2H-tetratsolium-5-karboksianilidi sisäinen suola) määritys suoritettiin lopussa hoitojakson käyttämällä valmistajan protokollaa. Liukoinen oranssi formatsaanituote mitattiin monilevylukija (Tecan, Infinite M200) 450 nm: ssä ja taustan mittaus 690 nm: ssä. Solujen elinkelpoisuus (%) laskettiin suhteessa käsittelemättömän 100% eläviä soluja.

MCSF lokalisointi tutkimus

Lyhyesti, solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä liuosta (tai ilman 0,1% Triton X-100) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Kun oli pesty PBS: llä kolme kertaa, solut estettiin 1% BSA blokkausliuosta 30 min. Sitten soluja inkuboitiin anti-MCSF (Sigma) primaarisena vasta-aineena ja sen jälkeen FITC-merkitty sekundaarista vasta-ainetta (BD Transduction Laboratories). Värjäyksen jälkeen FITC merkitty sekundaarista vasta-ainetta, soluja inkuboitiin väliaineessa, joka sisälsi 300 nM DAPI 3 min, pestiin lopuksi ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon ECLIPSE T

i

-U, Japani), jossa on heräte suodattimen 480 /15 nm (FITC) ja 360/20 nm (varten DAPI).

trypaanisinivärin syrjäytymisen määritys

Solut kuudessa kuoppalevyllä hoidettiin 5-FU 120 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden 0,4% trypan blue (Invitrogen) ja ladattiin yli laskukammiossa. Terve ja elinkelpoinen solujen ehjän kalvon ulkopuolelle väriaine, kun taas heikentynyt solut värjättiin väriaineen ja laskettiin kuolleeksi. Prosenttiosuus (%) solujen elinkykyisyys laskettiin käyttämällä kreivitär automatisoitu solulaskijalla (Invitrogen).

CFSE soluproleferaatiomäärityksessä

Solut (1 x 10

6 solua /ml) PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% BSA: ta inkuboitiin 10 ui 0,5 mM CFDA-SE 37 ° C: ssa 10 minuuttia ja sitten pestiin 5 tilavuudella jääkylmää media sammuttamaan mahdollinen vapaa väriaine. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kaksi kertaa tuoreella liuoksella. Värjätään solut analysoitiin välittömästi virtaussytometrilla (nolla ajankohtana) ja loput solut siirrostettiin myöhempiä ajanjaksoja. Saadut tiedot analysoitiin Cell Quest Pro -ohjelmisto. Tuplaus aika laskettiin kaavalla T

d = T /log

2 (F

0 /F

T), missä F

0 on geometrinen keskiarvo fluoresenssin intensiteetin 0 h ja F

T on geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetti T h [10]. Meidän kokeissa T oli 72 tuntia.

Solusyklianalyysiä

Solut ympättiin kuudella kuoppalevyille tiheydessä 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Yön yli kiinnitys, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU. Lopussa hoitojakson solut trypsinoitiin, pestiin ja kiinnitettiin 70% alkoholia liuosta 15 minuuttia jäissä. Kiinnitetyt solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) värjäysliuosta (50 ug /ml PI, 0,1 mg /ml RNaasi A: ta ja 0,05% Triton X-100) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Ainakin 10000 tapahtumaa per näyte hankittiin virtaussytometrillä ja solujen prosenttiosuus jaetaan eri vaiheissa solusyklin laskettiin ModFit LT ohjelmistoa.

CD24 /CD44-analyysi virtaussytometrialla

Cells käsittelyn jälkeen hajotettiin trypsiinikäsittelyllä, pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 10% ihmisen seerumia, 20 min jäillä estää Fc-reseptoreihin. FITC hiiren anti-humaani CD24 ja PE hiiren anti-humaani CD44 (molemmat BD Pharmingen) vasta-aineita lisättiin ja inkuboitiin 20 minuuttia jäissä ja pimeässä. Solut pestiin kahdesti PBS: llä, suspendoidaan lopuksi uudelleen PBS: ään ja analysoitiin virtaussytometrillä (FACScalibur, BD Biosciences, NJ).

Geenien ilmentyminen analyysi reaaliaikaista PCR

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green kuin reportteriväriaineesta (Virta SYBR Green PCR master mix, Applied Biosystem) ja 7500 Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystem). Raaka-aineisto analysoitiin ja tehokkuus kunkin reaktion laskettiin LinRegPCR ohjelmisto. β-aktiini käytettiin endogeenisen ohjaus ja kertainen muutos geenien ekspressiota on laskettu ΔΔCt menetelmällä.

Metyleenisini värjäystä

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU eri aikaan välein, pestiin jääkylmällä PBS: llä, kiinnitettiin 50%: isella jääkylmällä etanolilla. 0,2% (W /V) metyleenisinistä värjäys liuos lisättiin levylle ja värjäys suoritettiin 30 sekunnin ajan. Liuos imettiin pois ja solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä vedellä. Näytteet ilmakuivattiin ja visualisoitiin valomikroskoopilla.

Aktiinisytoskeletonin värjäämällä

Solut siirrostettiin kuusi kuoppalevyille käsiteltiin 5-FU. Lopussa hoidon jälkeen solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä, joka sisälsi 0,1% Triton X-100, 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Kun oli pesty PBS: llä kolme kertaa, solut estettiin 1% BSA blokkausliuosta 30 min. Sitten soluja inkuboitiin anti β-aktiini primaarista vasta-ainetta (BD Transduction Laboratories) ja sen jälkeen FITC-merkitty sekundaarista vasta-ainetta (BD Transduction Laboratories). Värjäyksen jälkeen FITC merkitty sekundaarista vasta-ainetta, solut pestiin kolmesti ja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 300 nM DAPI 3 min. Solut pestiin läpikotaisin, suspendoidaan lopuksi uudelleen PBS: ään ja visualisoitiin fluoresenssin mikroskoopilla (Nikon ECLIPSE T

i

-U, Japani), jossa heräte suodattimella 480/15 nm (FITC) ja 360/20 nm (varten DAPI).

tilastollinen analyysi

arvot kaikissa kokeissa ilmaistiin keskiarvona ± sem kolme tai useampia yksittäisiä kokeita. Aineisto analysoitiin Studentin t-testiä tai ANOVA kumpi sovellettavissa käyttäen GraphPad Prism 5.01. Tilastollisesti merkitsevä arvot merkitään * (p 0,05), ** (p 0,01) ja *** (p 0,001).

Tulokset

Generation of U87-MCSF solujen ja herkkyyttä 5-FU

Kuva 1A kuvattu strategia sukupolven U87-MCSF vakaa solulinjasta. 0,771 kb PCR-monistettiin geeni vastaa kalvoon sitoutunut isomuodon MCSF kloonattiin peräkkäin osaksi pGEMT-helppoa ja pEGFP-N1 vektoreita. Kloonit tarkistettiin restriktioanalyysillä kuviossa 1B (kaista 2 ja 4). Vakaa solulinja (U87-MCSF), jotka yli-ilmentävät MCSF perustettiin transfektoimalla U87MG soluja pEGFP-N1-MCSF. Sekapopulaatioon klooneja U87-MCSF valittiin G418 (400 ug /ml) sulkea mahdollista roolia muun kompensaatioprosessilla johtuvia transfektion yhdessä klonaalinen populaatio. Ilmentyminen siirtogeenin MCSF vahvistettiin semikvantitatiivisella RT-PCR: llä (kuvio 1C). Yli-ilmentyminen MCSF proteiinin varmistettiin western blottauksella käyttäen anti-MCSF vasta-aine, joka, 1,8 kertainen lisäys MCSF ilmentyminen havaittiin U87-MCSF soluissa (kuvio 1 D). Pieneneminen ilmentymisen MCSF reseptorin, CSF1R havaittiin U87-MCSF solujen (0,16-kertainen ekspression U87-MCSF soluja verrattuna U87MG-solut) (kuvio 1C).

. Kaavamaisen sukupolven U87-MCSF solulinjassa. B. vahvistaminen kloonien restriktiodigestiolla Kaistat 1 ja 3: 1 kb DNA tikkaat, kaista 2: pGEMT-MCSF pilkottiin EcoRI, kaista 4: pEGFP-N1-MCSF pilkottiin EcoRI ja Apa IC RT-PCR-analyysi ilmentämiseen of MCSF ja CSF1R vuonna U87MG ja U87-MCSF soluissa. D. Western blot-analyysi MCSF proteiinia. 28 kD: n vyöhyke vahvisti yliekspressio kalvoon sitoutuneiden MCSF in U87-MCSF soluissa.

herkkyys U87-MCSF solut tarkistettiin XTT-määritys hoidon jälkeen eri pitoisuuksien 5-FU: n välillä 5- 100 uM, 72 h. Leviämisen U87-MCSF soluihin väheni merkittävästi 5-FU: yli 10 uM ilmenee alennettua absorbanssiarvot (kuvio 2A). Samanlainen kasvun vähenemistä ei havaittu U87-GFP solulinja 5-FU hoidossa, jossa leviämisen oli lähes samanlainen kuin käsiteltyjen U87MG soluja. Lisäksi mitään viitteitä apoptoosin nähtiin käsiteltiin U87MG tai käsitelty U87-MCSF solujen jälkeen JC-1 värjäytymistä (kuva S1 File S1). Tulokset perusteltuja kvantitatiivisia trypaanisinieksluusiolla määritys, joka näytti terveen solun populaatioiden kanssa ehjä solukalvon jälkeen 120 h hoidon (kuvio 2B). Olemme tutkineet kuvaamaan joitakin pro-apoptoottisten ja antiapoptoottisten geenien, kuten kaspaasi-3, Bax: n ja Bcl-xL. Kuten kuviossa S2 File S1, ilmentymisen pro-apoptoottisen geenin, Bax lisääntyi käsiteltyjen näytteiden sekä U87MG (1,90-kertainen) ja U87-MCSF solujen (1,29-kertainen). Ekspression anti-apoptoottisen geenin, Bcl-x L kohosi myös käsitelty U87MG ja käsiteltiin U87-MCSF soluja. Kuitenkin kasvu Bcl-xL: n ilmentyminen oli 2,11-kertaisesti käsiteltiin U87-MCSF soluja verrattuna 1,25-kertainen kasvu hoidetuissa U87MG-soluissa. Kaspaasi 3 ilmentymisen pysyi muuttumattomana hoidetuissa näytteitä U87MG ja U87-MCSF soluissa.

. Effect of 5-FU kasvuun ja kannattavuuteen U87MG, U87-MCSF ja U87-GFP solut laskettiin XTT-määritys 72 tunnin jälkeen 5-FU hoidossa. B. trypaanisinivärin syrjäytymisen testi osoitti terve väestö jälkeen 120h 5-FU hoidossa. Tilastollinen merkitys merkitään * (p 0,05), ** (p 0,01) ja *** (p 0,001).

vaikutus 5-FU solusyklin ja sykliinejä

solusykli upon 5-FU hoidossa tutkittiin propidiumjodidivärjäys käyttämällä virtaussytometria. Aluksi molemmat U87MG ja U87-MCSF solut synkronoidaan G0 /G1-vaiheessa seerumistarvaatio 48 tuntia ja sitten solusyklin malli havaittiin täydellinen seerumia sisältävässä väliaineessa säännöllisin väliajoin. Nopeus etenemistä solusyklin kahden solulinjoista oli sama (kuva S3 File S1). Tämä vahvisti myös CFSE soluproleferaatiomäärityksessä (kuvio 3A), jonka kahdentumisaika sekä solulinjojen havaittiin olevan 12 h.

. CFSE soluproleferaatiomäärityksessä osoitti, että korko leviämisen käsittelemättömän U87MG ja U87-MCSF soluihin säilyi muuttumattomana. B. Solusyklin analyysi U87MG ja U87-MCSF solujen käsittelyn jälkeen 5-FU: ssa 24 tuntia. Valtaosa soluja kertynyt G0 /G1 vaihe käsitellyissä väestöstä U87-MCSF soluissa. Tilastollinen merkitsevyys on merkitty * (p 0,05), ** (p 0,01) ja *** (p 0,001).

Seuraavaksi, ennalta synkronoitu soluja käsiteltiin 25 uM 5 -FU seerumia sisältävässä mediassa 24 tuntia. Solusyklin jakautumisen kuvio analysoitiin virtaussytometrillä osoitti huomattavasti suurempi prosenttimäärä (90%) hoidetuista U87-MCSF solut G0 /G1 vaiheeseen kuin käsitellyn U87MG (69%) soluja (kuvio 3B). Tämä liittyy vastaava lasku suhteessa solujen S ja G2 /M vaiheessa. Verraten, 75% U87-GFP solut kertynyt G0 /G1 vaihe upon 5-FU hoidossa (tuloksia ei ole esitetty).

Sykliinit mukana G1 vaiheessa ja G1-S siirtymisen tutkittiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR analyysi jälkeen hoitoon synkronoitu soluja (in G0 /G1 vaihe) 5-FU 18 tuntia. Samoin sykliinit mukana myöhään S-faasissa ja G2 /M-vaiheen kvantifioitiin 24 tunnin kuluttua 5-FU hoitoon. Sykliini D1 ilmentyminen pysyivät muuttumattomina välillä käsitelty U87MG ja käsiteltiin U87-MCSF soluissa. 18 tunnin jälkeen 5-FU: hoito, sykliini E ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt käsiteltyjen U87-MCSF soluissa, mutta ei käsitellyissä U87MG-soluissa (kuvio 4). Kuitenkin, kun 24 h 5-FU hoidossa, alas sääntely sykliini E ilmentyminen havaittiin Käsitellyt näytteet sekä U87MG ja U87-MCSF soluissa (kuvio S4 File S1). Tämä on merkitty, että vaste U87-MCSF soluja 5-FU hoito oli nopeampaa kuin U87MG-soluissa. Pientä vähenemistä ilmentymisessä sykliini A2 havaittiin myös 5-FU käsitelty U87-MCSF soluja verrattuna 5-FU käsiteltyjen U87MG soluista 24 tunnin kuluttua 5-FU hoidossa. Ilmaisut sykliini B1 ja sykliini B2 olivat vähemmän kummassakin Käsitellyt näytteet, korreloi vähemmän solujen määrän edennyt G2 /M vaiheessa. Ilmaisu p21, joka on sykliiniriippuvainen estäjä, nostettiin käsitellyissä näytteissä sekä U87MG ja U87-MCSF soluissa. Siten tasauspyörästö Sykliini ja CDK-estäjä, p21 eri vaiheissa solukierron Havaintoa solujen kasvun hidastuminen 5-FU käsitelty U87-MCSF soluissa.

pienenee merkittävästi ilmaus sykliini E ja lievää laskua ilmentyminen sykliini A2 havaittiin käsiteltiin U87-MCSF soluja, jotka korreloivat koholla G0 /G1 kertyminen solujen nähdään solusyklin analyysi. Ilmaisu p21, sykliiniriippuvaiset estäjä lisääntyi Käsitellyt näytteet sekä U87MG ja U87-MCSF soluissa. Tilastollinen merkitys merkitään * (p 0,05), ** (p 0,01) ja *** (p 0,001).

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja U87-MCSF soluissa

Lukuun ottamatta solujen kasvun hidastumista, morfologiset muutokset näkyivät metyleenisininen värjättyä U87-MCSF soluja käsiteltiin jopa pieniä annoksia 5-FU. Ulkonäkö pitkänomainen, Karan muotoinen morfologia pitkiä prosesseja nähtiin U87-MCSF solujen 25 uM 5-FU: n hoitoa varten 72 tuntia, mutta ei U87MG-soluissa (kuvio 5A). Kuitenkin pitkänomainen morfologia nähtiin molemmissa soluissa 50 uM 5-FU hoidossa. Lisäksi, solun tukirangan värjäys käsittelemättömien ja käsiteltyjen näytteiden ja U87MG ja U87-MCSF soluissa tehtiin käyttämällä anti β-aktiini-vasta-aine (kuvio 5B). Saadut tulokset vahvistivat morfologiset muutokset havaitaan metyleenisineä värjäystä. Pitkänomainen ja mesenkymaaliset solut havaittiin 25 uM 5-FU käsiteltiin U87-MCSF soluissa, mutta ei 25 uM 5-FU käsiteltyjen U87MG-soluissa 72 tunnin kuluttua hoidosta. Mutta, pitkänomainen soluja nähtiin sekä U87MG ja U87-MCSF soluja käsiteltiin 50 uM 5-FU: ssa 72 tuntia. Lisäksi mikroskooppitutkimukset DAPI värjätyistä soluista 25 ja 50 uM 5-FU hoidon jälkeen 120 h osoitti ehjä ytimet, ja calceinAM värjätään solut samoissa olosuhteissa, siirrettävä pitkänomainen karan muotoinen morfologit (kuva S5 File S1), joka oli samankaltainen että havainto metyleenisininen värjäystä. Ilmentäminen astrocytic differentiaatiomarkkeri, glial fibrillary hapan proteiini (GFAP) oli poissa ja ilmaus hTERT väheni merkittävästi sekä U87MG ja U87-MCSF solujen jälkeen 5-FU hoidossa, perustellaan solujen proliferaatio (kuvio 6C).

. Metyleenisini värjäystä havaitsemiseksi solun morfologian jälkeen 5-FU hoidossa. B. Aktiinisytoskeletonin värjäyksellä käsiteltyjen solujen anti β-aktiini-vasta-aine. Morfologiset kuvia osoitti läsnäolon pitkänomainen ja mesenkymaalisten solujen U87-MCSF soluja käsiteltiin 25 uM 5-FU, mutta ei U87MG soluissa käsiteltiin 25 uM 5-FU. Kun 50 uM 5-FU hoidossa, pitkänomainen soluja nähtiin sekä käsitellään U87MG ja käsiteltiin U87-MCSF soluissa. Mitta-asteikko: 50 um.

. Morfologia käsittelemättömän U87MG ja U87-MCSF soluissa. U87-MCSF solut osoittivat kara muotoinen, mesenkymaaliset kuten solut (merkitty nuolilla). B. Mikroskooppinen tutkimukset käyttäen anti-MCSF-vasta paljasti sytoplasmisen sijainnin MCSF. Triton X-100 käytettiin kalvon lävistävän aineena fiksausliuoksessa. Nucleus värjättiin DAPI oli myös esitetty. C. Semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi hTERT, GFAP, N-kadheriinin, vimentiinin, fibronektiinin ja Notch-1. Expression mesenkyymisolun markkereita, N-kadheriinin, vimentiinistä ja Notch-1 kasvoi U87-MCSF soluissa. Mitta-asteikko: 50 um.

Läsnäolo Karan muotoinen enemmän mesenkymaalisten esiintyy soluja käsittelemättömiä U87-MCSF soluja (kuva 6A) osoitti mahdollisesta epiteelin-mesenkymaalitransitioon. Ilmaisu epiteelisolujen merkki E-kadheriinin ja mesenkymaalisten solujen markkereita vimentiinista, N-kadheriinin, fibronektiini analysoitiin semikvantitatiivinen RT-PCR. E-kadheriinin ilmentyminen ei havaittu käsittelemättömissä ja käsitellyissä soluissa sekä U87MG ja U87-MCSF soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Oli kuitenkin huomattava kasvu ilmaus mesenkyymisolun merkkiaineiden vimentiinista (~ 2 kertainen sekä käsittelemätöntä ja käsiteltyjen näytteiden) ja N-kadheriinin (1,98 ja 3,32 taittuu käsittelemättömän ja käsiteltyjen näytteiden, vastaavasti) in U87-MCSF soluja (kuvio 6C). Ilmaisu taso fibronektiinin oli muuttumattomana molemmissa käsitelty solutyypeissä. Lisäksi ilmaus Notch-1 indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), havaittiin merkittävästi voimistunut (2,14-kertainen) in U87-MCSF soluja. Mikroskooppinen tarkastelu U87-MCSF solujen kiinnittämisen jälkeen 3,7% paraformaldehydillä, joka sisälsi Triton X-100, paljasti sytoplasmisen sijainnin MCSF (kuvio 6B). Kuitenkin ilman Triton X-100 kiinnitysliuokseen fluoresenssia ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa ilman MCSF on solukalvon.

Ulkonäkö Cancer kantasolujen populaation ja säätelyä ABC kuljettajat

vähensi lisääntymistä, muutos solujen morfologia ja merkintöjen läsnäolo EMT ehdotti mahdollista syöpäsairauden kantasolujen U87-MCSF soluja käsiteltäessä 5-FU. Analysoimme ilmentymisen markkereita syövän kantasoluja, CD24 ja CD44 virtaussytometrialla ja reaaliaikainen PCR. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että ekspressio CD24 lisättiin 6,93% ja 33,37% vuonna U87MG-soluissa ja U87-MCSF soluissa, kun käsiteltiin 25 uM 5-FU: n (kuvio 7A). Kasvua ei CD44 ilmentyminen havaittiin Käsitellyt näytteet sekä U87MG ja U87-MCSF soluissa. Kvantitatiivinen ilmaus analyysi reaaliaikaista PCR paljasti myös lisääntyminen CD24 ilmaisun noin 4 kertaisesti käsitellään U87-MCSF soluissa, kun taas vain 2 kertainen nousu CD24 ilmentymisen nähtiin käsiteltiin U87MG soluissa. CD44 ilme pysyi ennallaan käsitellyissä soluissa sekä U87MG ja U87-MCSF (kuvio 7B).

. Virtaussytometria analyysi ilmentymisen CD24 ja CD44 käsitellyissä soluissa. B. Reaaliaikainen PCR-analyysi ilmentymisen CD44, CD24, ABCB1, mdm2, ABCG1 ja ABCG2. Tiedot piirrettiin suhteessa geeni-ilmentymisen käsitellyn näytteen käsittelemätön näyte ja vastaavat solut. Tilastollinen merkitys merkitään * (p 0,05), ** (p 0,01) ja *** (p 0,001).

ABC transporter geenit on yhdistetty karkottamista huumeiden monissa syöpätyypit. Analysoimme ilmentymisen ABCG1, ABCG2 ja ABCB1 kvantitatiivisella reaaliaikainen PCR. Kuva 6B osoitti, että ilmaus ABCG1 ja ABCB1 lisääntyi sekä käsitelty U87MG ja käsiteltiin U87-MCSF soluissa. Kuitenkin ilmaus ABCB1 lisättiin 10,2-kertaisesti käsiteltiin U87-MCSF soluja verrattuna 2-kertainen kasvu hoidetuissa U87MG-soluissa. Samoin ilmaus MDM2 onkogeenin kasvattivat myös 6 kertaiseksi käsitelty U87-MCSF soluja verrattuna 3,3-kertainen kasvu löytyy käsitellyssä U87MG soluja. Tutkimme myös ilmentymistason RALBP1gene, ei-ABC transporter liittyy MDR (monilääkeresistenssin). Löysimme marginaalista lisääntymistä ilmaus RALBP1 käsittelemättömissä U87-MCSF soluja (1,29-kertainen) verrattuna käsittelemättömiin U87MG soluja (kuvio S6 File S1). Kuitenkin kun 5-FU hoidossa, ei säätelyyn ylöspäin RALBP1 nähtiin käsiteltyjen näytteiden osalta niiden vastaavien käsittelemättömiä näytteitä.

Keskustelu

Glioblastoma edelleen yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, joilla on heikko terapeuttinen vastaus [11]. Expression eri monilääkeresistenteiksi proteiinit on pääasiassa osaltaan kykyä glioomasoluihin kehittää solunsalpaajaresistentti fenotyyppiin [12], [13]. Esillä olevassa tutkimuksessa, MCSF ilmentävät U87MG glioblastoomasolut näytteillä vähentää kasvua ja merkittävää hidastumista solujen lisääntymisen ilman apoptoosin sen jälkeen, kun 5-FU: n antamisen. Tasapaino ilmaisemisessa pro-ja anti-apoptoottiset geenit päättää kohtalosta solujen päästä apoptoottisen reitin [14]. Analyysi ilmaus pro-ja anti-apoptoottiset geenit paljasti, että säätelyyn ylöspäin ilmaus proapoptoottisten geeni, Bax on vastapainona säätely ilmaisussa Antiapoptoottisten Bcl-xL sekä käsitelty U87MG ja käsiteltiin U87-MCSF soluissa . Kuitenkin, käsiteltiin U87-MCSF soluilla oli pienempi ilmentyminen pro-apoptoottisen geenin Bax ja suurempi ekspressio anti-apoptoottisten Bcl-xL verrattuna käsiteltiin U87MG-soluissa. Tulokset osoittavat, että vaikka käsiteltyjen näytteiden sekä U87MG ja U87-MCSF solut eivät apoptoosiin, 5-FU käsiteltiin U87-MCSF soluja oli enemmän vastustuskykyä apoptoosin kuin 5-FU käsiteltyjen U87MG-soluissa.

Havaitsimme, että MCSF sijaitsee sytoplasmassa eikä solukalvon. Lisäksi ilmaus reseptorin MCSF, CSF1R oli alaspäin säännelty U87-MCSF soluja, jotka oli sopimus edellisen raportin [15] noin alas säätely mRNA CSF1R mukaan MCSF perusterveydenhuollossa makrofageissa. CSF1R ajateltiin toimimaan solukalvon mutta viimeaikaiset todisteet osoitti, että läsnä toiminnallisen reseptorin MCSF on ydin- kirjekuoren erilaisten syöpäsolujen ja makrofagit [16]. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että havaitut vaikutukset ja MCSF in U87-MCSF soluissa, kun 5-FU hoitoa voitaisiin välittää reseptorin kautta, joka sijaitsee ydin- kuori.

EMT on konservoitunut transdifferentiation soluprosessi annetaan ominaisuudet mesenkymaalisten solut yli pohjapinta epiteelisolujen, lisätä niiden invasiivisia ominaisuudet ja etäpesäkkeiden [17], [18]. MCSF ilmentyminen U87MG soluissa johti ulkonäkö karan muotoinen, enemmän mesenkymaaliset tyypin solujen osoittaa esiintyminen EMT. Vastaava säätelyyn ylöspäin ilmaus mesenkymaalisten merkkiaineiden, kuten N-kadheriinin ja vimentiinista (1,98 ja 2,18 kertaiseksi) havaittiin myös U87-MCSF soluissa. E-kadheriinin ilmentyminen havaittiin puuttuvan kaikki näytteet analysoitiin (tuloksia ei ole esitetty), joka korreloi aiemmin raportoitu, jotka osoittavat puute E-kadheriinin ilmentymisen glioblastoma [19]. Lisäksi kasvu ekspression lovi-1 havaittiin U87-MCSF soluja. Ylössäätely Notch-1 on osallisena indusoimaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on aiemmin raportoitu lisäävän invasiivisia ominaisuuksia haimasyövän soluja [20].

5-FU hoitoa, ilmaus mesenkymaaliset merkki, N-kadheriinin lisättiin edelleen käsitellyissä U87-MCSF soluissa 3.32 kertaiseksi, kun taas ilmaus vimentiinista pysyi ennallaan. Käsitellyissä U87MG soluissa, vain marginaalinen kasvu ilmentymisen N-kadheriinin ja vimentiinista (1,26 ja 1,41-kertainen vastaavasti) todettiin. 5-FU indusoi mesenkymaalisten ominaisuudet sekä U87MG ja U87-MCSF soluja, kuten nähdään kuviosta 5 ja kuviossa 6. Kuitenkin pitoisuus on 5-FU tarvitaan aiheuttamaan muutokset vaihtelivat välillä U87MG ja U87-MCSF soluja. Vaikka pitkänomainen ja karan muotoinen mesenkymaaliset solut havaittiin käsiteltiin U87-MCSF, kun käsiteltiin 25 uM 5-FU: ssa 72 tuntia, mesenkymaaliset morfologia voidaan nähdä käsitellään U87MG-soluissa vain silloin, kun on käsitelty 50 uM 5-FU: ssa 72 tuntia. Mutta kun hoito 25 uM 5-FU pidentyi 120 tuntia, pitkänomainen mesenkymaaliset tyypin solujen nähtiin käsitellyissä näytteissä sekä U87MG ja U87-MCSF soluissa (kuvio S5 File S1).

Viimeaikaiset raportit vahvistettu, että EMT voisi laukaista hankintaan varren kaltaisia ​​ominaisuuksia kasvainsoluissa [21]. Sub solupopulaatio muutamassa kasvaimia esiintyy syövän kantasoluja (CSC) kiinteistöstä äärimmäisen hidasta leviämisen, lisääntynyt ilmentyminen monilääkeaineresistenssin geenien ja pidetään ensisijainen syy uusiutumisen kasvain käsittelyn jälkeen [22], [ ,,,0],23]. Hidastuminen leviämisen, esiintyminen EMT ja kestävyys lääkehoitoa ehdotti läsnäoloa CSCS tai niiden esiasteita käsitellyissä solupopulaatioiden. Analyysi stemness liittyvän pinnan markkereita, CD24 ja CD44 käsitellyssä soluissa virtaussytometrillä kuvattu lisääntyminen CD24

korkea /CD44

harvaan solujen sekä käsiteltyjen U87MG ja käsiteltiin U87-MCSF soluissa. Kuitenkin käsitelty U87-MCSF solut osoittivat suurempaa prosenttiosuutta (33.37%) ja CD24

korkea /CD44

alhainen solujen verrattuna 6,93% käsitellyissä U87MG soluissa. Lisäksi kvantitatiivinen ilmaisun analyysi reaaliaikaista PCR osoitti, että CD44: n ilmentyminen oli tasainen 5-FU käsiteltyjen näytteiden molempien solujen, mutta CD24: n ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi käsitelty U87-MCSF soluissa. Aiemmat raportit osoittivat, että CSCS eristetty rintasyöpään olivat pääasiassa CD44

korkea /CD24

alhainen solujen [21]. Vastakohtana tälle, rintasyövän solujen CD44

pieni /CD24

korkea fenotyyppi on myös raportoitu olevan huonon ennusteen kanssa hoidon [24].