Krooninen sairaus

tiivistelmä

haimatiehyen adenokarsinoomia ovat desmoplastic ja hypoksinen, jotka molemmat ovat yhteydessä huonoon ennusteeseen. Hypoksia-aihiolääkkeiden (HAPS) on nimenomaan aktivoidaan hypoksinen ympäristöissä vapauttamaan sytotoksisia tai sytostaattinen efektoreita. TH-302 on HAP joka arvioidaan parhaillaan faasin III kliinisessä tutkimuksessa haimasyövän. Käyttämällä eläinmalleissa, osoitamme, että kasvain hypoksia voi pahentaa käyttämällä verisuonia laajentava, hydralazine, parantamalla TH-302 tehoa. Hydralazine vähentää kasvain veren virtausta ”varastaa” ilmiö, jossa atonaalista kehittymättömät kasvaimen verisuoniston ei laajeta koordinoidusti normaalissa verisuonistossa. Osoitamme, että MIA PaCa-2 kasvaimia näytteille ”varastaa” ja vastauksena hydralazine, mikä laski kasvaimen verenvirtauksen ja myöhemmin kasvain pH vähentäminen. Vaikutus ei havaita SU.86.86 kasvaimissa kypsä verisuonien mitattuna CD31 ja sileän lihaksen aktiini (SMA) immunohistokemia värjäystä. Yhdistelmähoito hydralatsiinilla ja TH-302 johti vähenemiseen MIA PaCa-2 kasvaimen kasvua 18 päivän kuluttua hoidon. Nämä tutkimukset tukevat yhdistelmän vaikutusmekanismi TH-302 vasodilataattorihoidon joka ohimenevän nousun kasvaimen hypoksia.

Citation: Bailey KM, Cornnell HH, Ibrahim-Hashim A, Wojtkowiak JW, Hart CP, Zhang X, et al. (2014) arviointi ”varastaa” ilmiö tehosta Hypoksia Aktivoitu Aihiolääke TH-302 Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (12): e113586. doi: 10,1371 /journal.pone.0113586

Toimittaja: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 26 lokakuu 2014; Julkaistu: 22 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Bailey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia R01CA125627-02; R01CA077575-10; P30CA076292-16 (Robert J. Gillies) ja P30CA023074-35 (Amanda F. Baker). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja laatijat käsikirjoituksen ovat seuraavat kilpailevia edut: Charles P. Hart on työntekijä Threshold Pharmaceuticals. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

haimatiehyen adenokarsinoomat (PDAC) potilailla on erittäin huono ennusteita, joissa on 5 vuoden pysyvyys noin 6%. Survival pysyy alhaisena johtuen sekä puutteen varhaista havaitsemista lokalisoitu PDAC ja tehottomuus perinteisten kemoterapian hallita PDAC etenemistä. Nämä alhainen eloonjäämisluvut osoittavat tarvetta kehittää uusia hoitostrategioita. Patologisesti, PDAC kasvaimet ovat erittäin heterogeeninen ja sisältää dynaamisen desmoplastic strooman osastoon, jotka molemmat edistävät kasvaimen etenemiseen ja kemoterapian resistenssin [1], [2]. Sen lisäksi, että mekaanisena esteenä huumeiden levinneisyys, desmoplastic stroman edistää kasvaimen hypoksia; yhteinen fysiologinen piirre PDAC kasvaimia, jotka liittyy myös vastustuskykyä kemoterapiaa ja sädehoitoa [3] – [5]. Hypoksia liittyvä kemoterapia kestävyys voidaan välittämä: puute lääkeaineen kasvaimeen huonon perfuusio [4]; hypoksian aiheuttama vastus apoptoosin [6]; ja laski soluproliferaatiota hypoksia solufraktioiden [7]. Lisäksi hypoksinen kasvaimen kudokset on osoitettu kasvaneen metastaattista potentiaalia [8] ja suurin osa PDAC kasvaimista läsnä metastaattinen myöhäisvaiheen tauti [9].

Viime aikoina pyrkimykset terapeuttisesti kohdistaa hypoksinen osastojen kasvainten on jatkettu käyttämällä hypoksia-aihiolääkkeiden (HAPS). HAPS ovat suhteellisen inerttejä kudoksissa normaalin hapetuksen (PO

2), mutta vähennetään valita yhden elektronin oksidoreduktaaseihin hypoksisissa olosuhteissa vapauttamaan sytotoksisia taistelukärkiä. Ensimmäinen sukupolvi HAP, tirapatsamiini, osoitti mahdollista terapeuttista hyötyä yhdessä asiaankuuluvien hoitojen [10] – [12], ja osoittivat kohtalainen menestys vaiheen I – II kliinisissä kokeissa [13], [14]. Puutteellinen kasvain levinneisyys ja lyhyt puoliintumisaika on kannustanut pyrkimyksiä suunnitella parannettu tirapatsamiinin analogien parempi liukoisuus, sytotoksisuus, selektiivisyys ja kudospenetraatio [15] – [17]. Toisen sukupolven HAP, TH-302, kootaan 2-nitroimidatsoli hypoksia-herkkä laukaisinväline, ja aktivoidaan selektiivisesti äärimmäisen hypoksian ( 0,5% O

2) vapauttaen bromi-isophosphoramide, DNA ristisilloitukseen sytotoksisten efektorisolujen [18]. TH-302 on erittäin tehokas prekliinisissä ksenografti- kasvainmuodoista [19], ja tutkitaan kliinisesti useiden syöpien, kuten PDAC. Vaiheen I /II tutkimus osoitti, että TH-302, yhdessä gemsitabiinin, lisääntynyt ilman taudin etenemistä 2 kuukautta PDAC potilaille [20], ja tämä yhdistelmä on nyt edennyt vaiheeseen III (NCT01746979, EMD Serono).

Prekliiniset TH-302

in vitro

ja

in vitro

monoterapiatutkimuksissa tunnistettu herkkiä ja resistenttejä haimasyövän linjat muistuttavat läheisesti kliinisen vasteen PDAC potilailla [21], [22]. Kuten kasvaimen hypoksia vaaditaan TH-302 aktiivisuus, ja koska TH-302 näyttelyesineet sivustakatsojavaikutus tappamalla soluja viereisten normoxic kudoksissa [22], me arveltu, että TH-302 tehoa voitaisiin parantaa ohimenevästi lisäämällä hypoksinen jae kiinteissä kasvaimissa . In silico malleissa ja kokeellista näyttöä osoittavat, että tehokkain tapa vähentää kasvaimen pO

2 on lisätä soluhengityksessä [23]. Tämä on aiemmin osoitettu koolonkarsinoomasolulinja, RKO, jossa farmakologinen esto HIF-1α, jossa echinomycin lisääntynyt hapen kulutusta, vähentynyt tuumorin pO

2 ja lisääntynyt aktiivisuus HAP, tirapatsamiinin [24]. Tämä käsittely johti kroonisesti hypoksinen ympäristön, joka voi johtaa edelleen hypoksinen mukauttaminen kasvainsolujen ja HAP sivuvaikutuksia. Sen sijaan ehdotamme, että ohimenevää ja akuutin hypoksian, yhdistettynä TH-302, olisi tehokkaampaa, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia. Ennen työ on myös havaittu, että eksogeeninen pyruvaatti kasvattaa hypoksinen jae levyepiteelisyöpä (SCC) kasvaimia [25] kautta ohimenevää hapenkulutuksen [26]. Olemme myös havainneet, että eksogeeninen pyruvaatti lisääntynyt teho TH-302 prekliinisissä SCC ja PDAC mallit [26], [27]. Tutkia vaihtoehtoisia farmakologinen menetelmiä tilapäisesti pahentaa hypoksia ja siten parantaa anti-kasvain ominaisuuksia TH-302, olemme tässä tutkia ”varastaa” ilmiö. ”Varastaa” ilmiö tapahtuu, kun vasodilataattorit, kuten hydralatsiini, aiheuttaa terve verisuonten laajeta mikä alentaa systeemistä verenpainetta. Verisuonien on usein kehittymätön ja atonaalista, puuttuu kyky kuristaa tai laajeta. Siksi aikana systeemistä verisuonten laajenemista, on fysiologinen verenpaineen lasku, jota ei voida sovitettava kasvaimen mikroympäristön ja verisuoniston. Tuloksena paine-ero aiheuttaa ohimenevää laskua kasvaimen perfuusio, jotka vaikuttavat kasvaimen fysiologian ja johtaa kasvaneisiin hypoksia ja asidoosi [28] – [33].

Tässä tutkimuksessa arveltu, että hydralazine voitaisiin käyttää akuutisti vähentämiseen perfuusio ja lisätä hypoksia sisällä kasvain microenvironment, mikä parantaa tehoa TH-302. Valitsimme kolme ihmisen haimasyövän solulinja ksenograftimalleissa, joka oli aikaisemmin osoitettu olevan vaihtelevasti herkkä TH-302 monoterapiana [18], [21], [22]. Kasvaimen pH mitattiin ennen ja annon jälkeen hydralatsiinin biomarkkerina lyhennettyjen perfuusion. Muutokset verenkierron seuraavissa hydralazine hoidon kvantitatiivisesti mitattiin käyttämällä Doppler ultraääni vahvistaa vähenemiseen kasvaimen perfuusio ja suunnitella annosten maksimoimiseksi vaikutus ”varastaa” ilmiö. Yhdistelmähoito hydralatsiinilla ja TH-302 arvioitiin hypoteesia, että hydralazine hoito lisäisi TH-302 tehoa ”varastaa” -sensitive linjat. Tulokset osoittivat, että hydralazine parannettu TH-302 tehoa, vaikkakin vaikutus oli hyvin pieni ja oli vain kohtalaisesti merkittävä kasvaimia (MIA PaCa-2), joilla on keskitason herkkyys TH-302 monoterapiana.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

SU.86.86 ja Hs766t solut saatiin Threshold Pharmaceuticals (South San Francisco, CA) ja MIA PaCa-2-solut saatiin American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja ylläpidetään mukaisesti ATCC ohjeita. Soluja inkuboitiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää (Hs766t ja SU.86.86) tai DMEM 10% FBS: ää (MIA PaCa-2), ja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Mycoplasma ja solulinjaa aitous (karyotype) suoritettiin.

Animal Studies

Kaikki menettelyt olivat noudattaen Guide for Care ja käyttö laboratorion Animal Resources (1996), National Research Council, ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitea, University of South Florida hyväksyttyyn protokollan R4033. Immuunipuutteiset hiiriä pidettiin puhtaassa laitos Erityisehdoin jotka sisältävät HEPA suodatettu ilmanvaihto häkkikanaloissa, autoklavoidaan vuodevaatteet, autoklavoidaan kotelo, autoklavoidaan vesi, säteilytettyä ruokaa ja erityinen häkki muuttuvat menettelyjä. Hiiret lopetettiin CO

2 hengitettynä jos kasvaimet osaltaan voitto 20% painon kontrolleihin verrattuna samaan aikaan piste, tai hiirillä kokenut 10% menetys paino, kasvain mitataan suuremman yli 2000 mm

3, tai hiirillä merkkejä levittää taudin kuten keuhkojen etäpesäkkeiden osoitetaan vaivalloinen hengitys. Kaikki eläimet asutettiin joko USF Vivarium kuluessa Moffitt Cancer Center tai sisällä Arizona Cancer Center laitokseen.

SCID-beige naaras hiiret (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) ympättiin 5 – 10 x 10

6 solua 1: 1 matrigeelin (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ): PBS-liuosta ihonalaisesti oikeaan kylkeen. Kasvaimen kasvua seurattiin joka toinen viikko elektronisella jarrusatulat koko keston kokeissa. Kasvaintilavuudet laskettiin käyttäen: tilavuus = (

l

×

w

2) /2, jossa

l

= pisin pituus ja

w

= lyhin. Orthotopic Haiman kasvain malli: Nude uroshiiriä (n = 3) injektoitiin 1 x 10

6/20 ui MIA PaCa-2-soluja PBS: ssä. Hiiret nukutettiin 3% isofluraania ja ylläpidetään 1,5% isofluraania koko menettelyn. Seuraavat sivusuunnassa viilto, perna ja distaalinen haima mobilisoitiin ja soluja injektoitiin suoraan haimaan. Vatsan sisäseinä ommeltiin ja ulkokuori viilto suljettiin niiteillä. Kivunlievitystä annettiin leikkauskohtaan kivunlievitykseen. Hiiriä seurattiin päivittäin, kunnes niitit poistettiin, noin viikon. Kasvaimen tilavuus seurattiin viikoittain Ultraääni.

pH elektrodi

pH mittaukset saatiin käyttämällä FE20 Five Easy pH-mittari (Mettler-Toledo, Columbus, OH). Kaikki eläimet nukutettiin isofluraanilla (3,5%), ja pysyi nukutuksessa (1,5-3,5% isofluraani) ajaksi kokeen. Viittaus ja pH-elektrodi (MI-401F ja MI-408B vastaavasti mikroelektrodeilla Inc., Bedford, NH) käytettiin pH: n mittaamiseen liittämällä ensin viite elektrodi (OD 1 mm) ihon alle hiiren lähellä kasvain (kylki). PH-elektrodi (OD 0,8 mm) liitettiin sitten jopa 1,3 cm keskelle kunkin ihonalainen kasvain. Elektrodit kalibroitiin ennen ja jälkeen jokaisen sarjan mittauksia. Kaksi mittaukset tehtiin kunakin ajankohtana ja keskiarvo. Alkuvaiheen jälkeen pH mittauksiin, eläimille annettiin 100 ui intraperitoneaalisesti (ip) injektion 10 mg /kg hydralatsiini (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). PH mitattiin 30 minuutin välein jopa kolmen tunnin kuluttua ip injektion, ja huolehdittiin mitata pH suunnilleen samassa paikassa kasvaimen kunakin ajankohtana. Kun lopullinen pH: n mittausta, eläimet tapettiin ja kasvaimet kerättiin histologiaa varten.

Tiedot käsiteltiin ottamalla keskiarvo kahdesta pH-arvot mitataan kunakin ajankohtana. PH: n muutos tai delta (Δ (

t

), jossa

t

on injektion jälkeen hydralatsiinin tai suolaliuosta, minuutteina) mitattiin ero ensimmäisen aikapisteen pH ja kussakin myöhemmässä vaiheessa pH. Kunkin kasvaimen tyyppi, keskimääräinen delta (

Avg

Δ) tarkoittaa keskimääräistä delta kaikista eläimistä, että kasvaimen tyyppi:

Missä

t

on aika, joka vaihtelee 30-180 minuuttia injektion jälkeen,

on eläin,

n

t

on määrä mittausajankohtina ja

n

on eläinten lukumäärä kanssa, että kasvaimen tyyppi. Suurin muutos pH milloin tahansa injektion jälkeen havaittiin kunkin yksittäisen eläimen. Keskimääräinen enimmäismäärä jokaisen eri kasvaintyypistä laskettiin, ja suurin muutos minkä tahansa eläintä kussakin ryhmässä tunnistettiin myös. Eläinten lukumäärän mitatun vaihteli per kasvain tyyppi: Hs766T, n = 3; MIA PaCa-2 n = 4; ja SU.86.86, n = 7

OxyLite

Kasvaimen hapetuksen tasot seurattiin OxyLab (Oxford Optronics, Oxford, UK) triple parametri E-sarjan kuituoptista antureista, jotka työnnetään kaikki kasvaimet. Nämä ennalta kalibroitu hypoksia mikropilarit perustuvat luminesenssi sammutusta ja mittaus pO2 perustuu happea sammutettiin eliniän luminescent väriainetta. Signaalit OxyLab koetin hankittiin käyttäen OxyLab pO2 E ja OxyLab LDF seurantajärjestelmät liitetty tietokoneeseen. Lähtötiedot signaaleja näistä näytöt muutettiin pO2 (mmHg) arvot ja tallennetaan reaaliaikaisesti monikanavainen tiedonkeruujärjestelmä (Powerlab 8SP, ADInstruments, Australia) running Chart for Windows (Ver.5.02, ADInstruments, Australia) . Nukutetuista hiiriä (Isofluraania, 100% O

2) on hillitty mukautetun liikkumattomuus alustan liikkeen estämiseksi ja jälkiasentaa lämpötyyny ylläpitää kehon lämpötilaa. Extra varotoimista estämiseksi liikkuneet hypoksia koettimet sekä rajoittamalla häiriöitä ulkoisista valonlähteistä poistaa näin artefakti. Mikropilarit (OD ~450 um) insertoitiin kasvain ja kiinnitetty paikalleen käyttämällä stereotaktiseen menetelmiä. Entry kuhunkin kasvainten tehtiin 19 g injektioneulalla ja mikropilarit syötettiin kasvaimeen ~ 3 mm kasvaimen pinta ja neula vedettiin pois. Mikropilarit huolellisesti merkitty gradations päästäkseen samaan syvyyteen kaikissa kasvaimia. Kasvaimen pO2 tasot tarkkailtiin kunnes vakaa perustaso havaittiin. Reaaliaikainen mittaukset tehtiin 10 minuuttia lähtötilanteessa yhtäjaksoisesti 60 minuutin kuluttua 100 ui vatsaonteloon (ip) injektion 10 mg /kg hydralatsiini. Kasvaimen hapettuminen tasoa ennen ja jälkeen hydralazine injektiot verrattiin. Eläinten lukumäärän mitattuna: MIA PaCa-2 n = 4.

kaikukuvaukseen

Ultraääni kuvantaminen suoritettiin Vevo2100 kanssa 22-55 MHz anturi MS550D (VisualSonics, Toronto, Ontario, Kanada). Hiirillä, joilla MIA PaCa-2 kasvain (n = 4) nukutettiin (kuten edellä on kuvattu) kautta kuvantamisen ajaksi. Color Doppler Kuvat on otettu luomaan sijainnin suuren verisuonen sisällä kasvain. Kun riittävän suuri verisuoni sijaitsi, pulssi aalto (PW) Doppler otettiin kvantifiointiin virtauksen. Eläin sai 100 ui injektio 10 mg /kg hydralatsiini, ja virtaus samassa verisuonen mitattiin 5 minuutin välein 30 minuutin ajan. Mia PaCa-2 potilaalle tehdä kasvaimet, verenvirtaus mitattiin 180 minuutin.

Drug Hoito ja kasvaimen kasvu Kinetics Monitoring

Eläimet parin rinnalle kasvaimen tilavuus (laskettuna sähköisessä jarrusatulat), kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 200 mm

3. Eläimet jaettiin neljään huumeiden hoitoryhmään (n = 9 eläintä per hoito ryhmä Hs766T ja SU.86.86, numerot listattu MIA PaCa-2): i) TH-302 (n = 9), ii) hydralatsiini (n = 7 ), iii) TH-302 + Hydralazine (n = 7) ja iv) Saline (kontrolli, n = 10). Käsittelyt annettiin ip injektiot un-nukutettiin eläimiä. Annokset olivat 50 mg /kg TH-302 200 ui suolaliuosta kunkin eläimen ryhmissä I ja III, 10 mg /kg hydralazine 100 ui suolaliuosta eläintä kohti [29] ryhmissä II ja III, ja 200 ui suolaliuosta ryhmä iv . Ryhmä iii sai hydralazine 30 minuuttia ennen antoa TH-302. Aikana samanaikainen annostelu hydralatsiinilla ja TH-302, hydralazine injektoitiin ip välittömästi ennen TH-302. Kaikki hoito suunnitelmat annettiin QDx5 kaksi samanaikaista viikkoa. Kasvain tilavuudet mitattiin kahdesti viikossa käyttäen sähköistä jarrusatulat ajaksi kokeen.

Kudoskäsittely ja immunohistokemia

Vuoden loppuun

in vivo

tutkimuksissa eläimet tapettiin ja kasvaimet irrotettiin. Kasvaimet kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin jatkokäsittelyä varten. Värjäystä varten hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 20% painon kontrolleihin verrattuna samaan aikaan piste, tai hiirillä kokenut 10% menetys paino, kasvain mitataan suuremman yli 2000 mm

3, tai hiirillä merkkejä levittää taudin kuten keuhkojen etäpesäkkeiden osoitetaan vaikea vaivalloinen hengitys.

tulokset

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, vaihteleva vaste kolmen PDAC solulinjojen , Hs766t, MIA PaCa-2 ja SU.86.86, että TH-302 monoterapia sekä

in vitro

ja

in vivo

. Solujen käsittely viljelty hapettomissa olosuhteissa TH-302 osoittavat, että MIA PaCa-2-solut ovat herkin (IC

50 = 2,1 ± 0,7 umol /l); SU.86.86 vastaa kohtalaisen (IC

50 = 12 ± 1,2 umol /l); ja Hs766t vähiten herkkä (IC

50 = 60 ± 7,5 umol /l) [21]. Mielenkiintoista

in vivo

, -tuumoriksenografti malleja käyttäen samoja solulinjoja näyttää eri vastauksia TH-302 monoterapiana. Hs766t vastasi kaikkein suotuisasti TH-302 käsittely [22], jossa on täydellinen tuumorin kasvun estäminen, kun taas MIA PaCa-2 kasvaimet olivat kohtalaisen reagoivat [34] ja SU.86.86 kasvaimet resistenttejä TH-302 monoterapiana [33]. Differentiaalinen vaste PDAC solujen

in vitro

ja

in vivo

korostaa hypoksia fraktion sisällä kasvain maksimaalisen TH-302 teho

in vivo

, koska SU .86.86 kasvaimet ovat erittäin vascularized ja hyvin happipitoista, kun taas Hs766t kasvaimet ovat suuria hypoksinen jakeet [19] ja mutaatio homologia-riippuvaisen DNA korjaus (HDR) geeni FANCG mikä tekee niistä herkempiä Br-IPM efektori [35].

Hydralazine ja ”varastaa” vaikutus

Koska hydralatsiini hoidon on aiemmin osoitettu vähentävän kasvaimen verenvirtauksen

in vivo

[28], me arveltu, että hydralatsiini voitaisiin käyttää ohimenevästi lisätä hypoksinen jae kasvaimia ja lisätä TH-302 tehoa. Hydralazine on myös todettu lisäävän kasvainten asidoosi [29], joka voi olla tehokas tapa tunnistaa kasvaimia osoittaen ”varastaa” vaikutus, joka olisi paremmin vastata yhdistelmähoitoa. Testata hypoteesia, hiirillä, joilla on ihonalainen SU.86.86, MIA PaCa-2 tai Hs766t kasvaimia nukutettiin ja kasvaimen pH mitattiin käyttäen pH-mikroelektrodin. Mitata pH-muutokset, jotka johtuvat veren virtauksen muutoksia, hiirille annettiin 10 mg /kg hydralatsiini intraperitoneaalisesti (ip) injektiolla. Kasvaimen pH mittaukset saatiin 30 minuutin välein seuraavien hydralatsiini hoidon kolmen tunnin ajan. Oletimme, että kasvaimia näytteille ”varastaa” vaikutus kokevat kasvain happamoituminen seuraavat hydralatsiini hoitoa. TH-302 herkkä Hs766t kasvain (n = 3), ei esiintynyt muutosta keskimääräinen pH-hoidon jälkeen hydralatsiini (Fig. 1). TH-302 kestävä SU.86.86 kasvain (n = 7), mutta kokemus paradoksaalinen pieni lisäys pH (0,05 pH-yksikköä) minkä hydralatsiini (Fig. 1). MIA PaCa-2 kasvain (n = 4), jotka ovat kohtalaisen herkkiä TH-302, jatkuvasti esillä todellinen ”varastaa” vaikutus seuraavat hydralatsiini hoitoa, ilmenee merkittävästi pH-arvon laskua (- 0,12 pH-yksikköä) suhteessa SU.86.86 (

p

0,007) ja Hs766t (

p

0,05) (Fig. 1). Vaikka heterogeenisyys välillä oli kasvain näytteet, kukin näyte testataan reagoivat samalla toiselle kasvaimia niiden ikäluokat, osoituksena tarkkailemalla yksittäisen eläimen suurin muutos, keskiarvo maksimaalisen vasteen kunkin eläimen kokeen aikana ja keskimääräinen muutos pH kunkin eläinten kunakin ajankohtana mitattu (Fig. 1). Nämä tulokset osoittavat, että antaminen hydralatsiinin vähensivät perfuusiota MIA PaCa-2 kasvaimia, mutta ei vaikuttanut perfuusio joko Hs766t tai SU.86.86 kasvaimia.

Hiiret, ihonalainen SU.86.86 (n = 7), Hs766t (n = 3) tai MIA PaCa-2 (n = 4) kyljen kasvaimia nukutettiin ja kasvaimen pH mittaukset saatiin. Viittaus elektrodi lisättiin ihon alle hiiren ei-kasvaimen, kun taas pH-elektrodi on lisätty enintään 1,3 cm keskelle kunkin kasvaimen. Kaksi mittaukset tehtiin kunakin ajankohtana ja keskiarvo. Seuraavat alku-pH mittaukset, hiirille annettiin 10 mg /kg hydralatsiini kautta ip injektiona. Kasvaimen pH mitattiin 3 tuntia hoidon jälkeen. Tiedot ilmoitetaan edustaa keskimääräinen ylin muutos kunkin kohortin keskimääräinen pH muutoksen kunkin kohortin ja yhden eläimen suurin pH-muutokset kunkin kohortin. Tiedot ilmoitetaan keskimääräinen muutos pH ± SEM. *

P

0,05; **

P

0,007.

edelleen tutkia vaikutuksia hydralatsiinin kasvaimiin, joilla todettiin ”varastaa” vaikutus, käytimme Doppler ultraääni mitata kasvaimen verenvirtauksen seuraavia hydralazine hoito MIA PaCa-2 kasvaimia. Ennen hydralatsiini hoitoon, väri-Doppler kuvat saatiin esille MIA PaCa-2 kasvaimet (n = 4) tunnistaa suuren kasvaimen verisuonistossa (Fig. 2A, vasen paneeli). Käyttämällä pulssi aalto (PW) Doppler, verenvirtausta kasvaimen verisuoniston mitattiin 30 minuutin kuluessa hydralazine ip annon (Fig. 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Havaitsimme väheneminen veren virtausta 15 minuutin hydralatsiinilla injektion (Fig. 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Kvantifiointi nämä tiedot vahvistivat väheneminen kasvaimen verenvirtauksen alkaa 15 minuutin kuluttua hydralatsiini injektion jatkuvaa laskua läpi 30 minuuttia (Fig. 2B). Vaikutus hydralatsiinin veren virtaus voi kestää yli 30 minuuttia. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi, veren virtaus Mia PaCa-2 potilaalle tehdä haiman kasvaimet (N = 3), kasvain malli, joka on enemmän fysiologisesti merkityksellistä, seurattiin Doppler-ultraää- 180 minuuttia. Veren virtaus vähennetään vähimmäistason 30 minuuttia, tukemalla ihonalainen kasvain havaintoja, mutta potilaalle tehdä kasvaimet, verenkierron pysyi tällä tasolla 90 minuuttia elpymisen välillä tapahtuvat 90 ja 120 minuuttia. Koska yhtäläisyyksiä verenkiertoa välillä ihonalainen ja potilaalle tehdä Mia PaCa-2 kasvaimet, olimme varmoja, että seuranta kasvaimen hapettuminen (70 minuuttia) käyttämällä hapen elektrodien ihonalainen kasvain (n = 5) olisi tarkka esitys. Samanlainen pH-elektrodi tietojen kasvain happipitoisuus laski 5 minuutin kuluttua hydralazine mutta ei palannut lähtötasolle ajassa tämän tutkimuksen. Heterogeenisuus havaittiin aste hapen vähentynyt vaihteli (Fig. 2D).

Hiiret, joissa MIA PaCa-2 kasvaimet analysoitiin Doppler-ultraää- mitata kasvaimen verenvirtauksen. A)

Vasen paneeli:

Kasvaimet skannata väri Doppler kuvantamisen tunnistaa merkittävä kasvaimen verisuoniston ennen hoitoa. Punainen edustaa veren virtausta kasvaimen verisuoniston. Valkoinen nuolimerkit verisuoniston analysointiin valittu.

Right Panel:

jälkeen hydralazine annon, pulssi aalto (PW) Doppler käytettiin 5 minuutin välein 30 minuutin määrällisesti veren virtausta kasvaimen verisuoniston. Edustavia kaavioita, joissa lasku kasvaimen verenvirtauksen seuraavat hydralatsiini hoitoa. B) kvantifiointi kasvaimen verenvirtauksen muutoksia MIA PaCa-2 ihonalainen kasvain (n = 4) sen jälkeen, hydralatsiini hoitoon. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona nopeus (mm /s) ± SEM. C) kvantifiointi kasvaimen verenvirtauksen muutoksia Mia PaCa-2 potilaalle tehdä haiman kasvain (n = 3) seuraavat hydralatsiini hoitoa. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona nopeus (mm /s) ± SEM. D) Kasvaimen hapetuksen mitattiin ennen ja jälkeen hydralazine käyttäen OxyLite (happi) neulaelektrodien in ihonalaisen Mia PaCa-2 kasvaimet (N = 5). Mittauksia kerätään ajan myötä yhdellä sivustolla sisällä kasvain. Täydellinen kokeellisia yksityiskohtia löytyy menetelmien osassa. Tiedot esitetään pO2 (mmHg). Nuoli t = 10 minuuttia tarkoittaa i.p. injektio hydralatsiinilla.

histologinen arviointi PDAC verisuoniston

kasvain näytteet jokaisesta solulinjasta analysoitiin histologisesti luonnehtia verisuonistoon. CD31 ja sileän lihaksen aktiini (SMA) on kaksi yhteistä verisuonien immunohistokemia (IHC) merkkiaineiden määritysten (CD31), ja kypsyyden ja sävy (SMA) verisuoniston. Kasvaimet merkittäviä verisuoniston jotka eivät tonaalinen ei odoteta näytteille ”varastaa” ilmiö, koska kasvaimen verisuonistoon olisi laajeta koordinoidusti systeemisiä vaikutuksia hydralatsiinilla hoidon. Käyttämällä positiivista pikselin analyysissa määrällisesti prosenttiosuus Hs766t, SU.86.86 ja MIA PaCa-2 kasvaimia, jotka sisälsivät CD31 ja SMA värjäystä. Yhdenmukainen ennen tulosten SU.86.86 kasvaimia oli merkitsevästi enemmän CD31 (

p

0,05) värjäystä kuin joko Hs766t tai MIA PaCa-2 (Fig. 3A-B), ja huomattavasti enemmän SMA (

p

0,005) kuin MIA PaCa-2 kasvain näytteissä (kuvio. 3A, C). Nämä tiedot osoittavat, että SU.86.86 kasvaimet ovat hyvin vascularized kypsä aluksista, jotka voisi odottaa laajeta vastauksena hydralatsiini hoitoon. MIA PaCa-2, ja Hs766t kasvaimia oli samanlaiset määrät CD31-värjäys (Fig. 3A-B). MIA PaCa-2 kasvaimia oli vähiten SMA värjäys kolmesta kasvaimia testattiin (Fig. 3A, C). Nämä tulokset osoittavat, että MIA PaCa-2 verisuoniston on kehittymätön ja atonaalinen. Kuten MIA PaCa-2 kasvaimia näkyy vähentynyt kasvaimen verenvirtauksen (Fig. 2) ja myöhemmin lasku kasvaimen pH (Fig. 1), voimme päätellä, että MIA PaCa-2 kasvaimia havaittu ”varastaa” vaikutus johtuu epäkypsä kasvaimen verisuonistoon.

Hs766t, MIA PaCa-2 ja SU.86.86 kasvaimet kiinnitettiin ja upotettiin parafiiniin valmisteltaessa IHC värjäyksen verisuonien markkereita, CD31 ja SMA. A) edustaja kuviin kasvaimista värjättiin CD31 ja SMA. Mittaviivat edustaa 100 um. Positiivinen pikseli analyysi B) CD31 ja C) SMA värjäys koko alueella kasvain. Aineisto esitetään% Positivity [(Positive pikseliä /yhteensä pikseliä) x 100] ± SEM. *

P

0,05; **

P

0,005.

Hydralazine parantaa TH-302 aktiivisuus in vivo

Voit testata TH-302 yksinään yhdistelmähoito hydralazine jokaisen solun line ksenografti, hiiriä istutettiin ihon alle Hs766t, SU.86.86 tai MIA PaCa-2 kylki kasvaimia, ja pari-sovitettu neljään kohortteja: käsittelemätön (suolaliuos), TH-302 yksin (50 mg /kg ip), hydralazine yksin (10 mg /kg ip) ja TH-302 /hydralatsiini yhdistelmähoitoa. Yhdistelmähoidossa, TH-302 annettiin 30 minuutin kuluessa hydralazine annon koska tämä näytti olevan aika maksimaalinen vaikutus perfuusio jälkeisestä hydralatsiini. Kaikki ikäluokat hoidettiin kaksi sykliä 5 peräkkäistä hoitojen jälkeen 2 vapaapäiviä, ja kasvainten tilavuudet seurattiin elektronisella jarrusatulat aikana tutkimuksen. Kasvain äänenvoimakkuuden säätimen TH-302 yksinään tai yhdistelmähoidossa pidettiin kadonnut, kun kasvaimet saavuttivat 1000 mm

3, joka on esitetty yksityiskohtaisesti Kaplan Meier käyrät. Kuten odotettua, Hs766t kasvaimen kasvu inhiboitui täydellisesti TH-302 monoterapiana (Fig. 4A-B), SU.86.86 kasvaimen kasvua ei vaikuttanut TH-302 monoterapiana (Fig. 4C-D) ja MIA PaCa-2 kasvainten vastasi kohtalaisen hoidon (Fig. 4E-F). Yhdistelmähoito hydralatsiinilla jälkeen annetaan TH-302 ei ollut suotuisa vaikutus kasvaimen äänenvoimakkuudensäädin hiirillä Hs766t tai SU.86.86 kasvaimet suhteessa ikäluokat käsitelty TH-302 monoterapiana. Tärkeää on, kumpikaan näistä kasvainmuodossa osoitti ”varastaa” vaikutus seuraavat hydralatsiini annon (Fig. 1). MIA PaCa-2 kasvaimet reagoivat kohtalaisen TH-302 monoterapiana (Kuva. 4E-F) ja heillä esiintyi kasvaimen asidoosi vuoksi alentunut kasvaimen verenvirtauksen seuraavat hydralazine hoidon (Fig. 1). Hiirillä MIA PaCa-2 kasvaimia kokenut vaatimaton edelleen vähentää kasvaimen tilavuuden kasvua hoidetuilla TH-302 /hydralazine yhdistelmähoito verrattuna TH-302 monoterapiana (Kuva. 4E-F). Vaikka suuntaus väheneminen kasvaimen kasvua väliin TH-302 /hydralatsiinilla yhdistelmähoitoa sekä TH-302 monoterapia, tilastotiedot kasvukäyrät osoittavat, että erot eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä (

p

0,08). Tämä koe toistettiin kaksi kertaa samankaltaisilla tuloksilla (tuloksia ei ole esitetty). Kaikissa tapauksissa, MIA PaCa-2 kasvaimia hoidettiin yhdistelmähoidolla oli vähentänyt kasvua, mutta se ei ollut merkitsevästi pienempi (p = 0,08) kuin TH-302 monoterapiaryhmässä.