PLoS ONE: Vähentynyt ilmentyminen ARID1A Gene liittyy huonon ennusteen Ensisijainen Mahalaukun Cancer
tiivistelmä
Background
ARID1A
geeni koodaa adeniini-tymiini (AT ) rikas interaktiivinen domain sisältävä proteiini 1A, joka osallistuu chromatin remodeling.
ARID1A
on osoitti toimia tuumorisuppressori eri syöpätyypeissä. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme ilmaisun ja ennusteen arvo
ARID1A
perusterveydenhuollossa mahasyövässä. Samaan aikaan biologisen roolin
ARID1A
tutkittiin tarkemmin käyttäen solumallin in vitro.
Menetelmät /Principal Havainnot
roolin tutkimiseksi
ARID1A
geeni ensisijainen mahasyövän synnyssä, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR ja western blotting käytettiin tutkimaan
ARID1A
ilmaisun pariksi syöpä- ja noncancerous kudoksiin. Tulokset paljastivat laski
ARID1A
mRNA (
P
= 0,0029) ja proteiini (
P
= 0,0015) ilmentyminen useimmissa kasvain kudosten verrattuna sovitetun viereisen ei-kasvain kudoksia ja mahasyövän solulinjoissa. Jotta voitaisiin edelleen tutkia kliinis ja prognostiset roolit
ARID1A
ilmaisu, teimme immunohistokemiallinen analyysit 224 parafinoidut mahasyövän kudospaloista. Paljastivat, että menetys
ARID1A
ilmentyminen korreloi merkitsevästi T vaiheessa (
P
= 0,001) ja laatu (
P
= 0,006). Yhdenmukaisesti näiden tulosten, huomasimme, että menetys
ARID1A
ilmentyminen korreloi merkitsevästi huono hengissä mahalaukun syöpäpotilailla (
P
= 0,003). Coxin regressio analyysit osoittivat, että
ARID1A
ilme oli itsenäinen ennustaja kokonaiselinaika (
P
= 0,029). Lisäksi toiminnot
ARID1A
in leviämisen ja pesäkkeiden muodostumista mahalaukun solulinjojen analysoitiin transfektoimalla soluja täyspitkän
ARID1A
ilmentämisvektoriin tai siRNA kohdistaminen
ARID1A
. Palauttaminen
ARID1A
ilmentymistä mahasyövässä soluissa esti merkitsevästi solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumista. Hiljentäminen
ARID1A
ilmentymistä mahalaukun epiteelisolujen linja tehostaa merkittävästi solujen kasvua.
Johtopäätökset /merkitys
Tuloksemme viittaavat siihen, että
ARID1A
voi olla tärkeä rooli mahasyövän ja voi toimia arvokkaana prognostinen markkeri ja potentiaalinen kohde geeniterapiaan hoidossa mahasyövän.
Citation: Wang Dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen Jg , et ai. (2012) Vähentynyt ilmentyminen
ARID1A
Gene liittyy huonon ennusteen Ensisijainen syöpään. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10,1371 /journal.pone.0040364
Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore
vastaanotettu: 19 tammikuu 2012; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2012; Julkaistu: 13 heinäkuu 2012
Copyright: © 2012 Dandan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (30973398) ja Guangdong Natural Science Foundation (925100890). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Mahasyöpä on neljänneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien vuosittain (10,4% syöpäkuolemista) [1]. Hoito mahasyöpä sisältää yhdistelmän leikkaus, kemoterapia tai sädehoito. Kuitenkin lähes 60% potilaista vaikuttaa periksi mahasyövän jälkeenkin parantavaa resektiota yksin tai jälkeen adjuvanttihoito [2]. Jo kauan on tiedetty, että mahasyövän tulokset yhdistelmästä ympäristötekijöiden ja kertymistä yleistynyt ja erityisiä geneettisiä muutoksia. Monet geneettiset tai epigeneettiset muutokset liittyvät mahasyöpä, mukaan lukien Heterotsygotian menetys, mikrosatelliittien ja kromosomi epävakautta ja hypermetylaation, on raportoitu [3]. Ymmärtäminen muutokset ja molekyylitason mekanismit mahasyövän tulee olemaan kriittinen parantamiseen diagnoosin, hoidon ja ennusteen ennustaminen tämän taudin.
eukaryoottisesti säilyneet SWI /SNF kromatiiniin remontin kompleksi on olennaisia rooleja erilaisissa solun prosesseja, mukaan lukien erilaistuminen, proliferaatio ja DNA korjaukseen [4]. Menetys SWI /SNF-alayksiköitä on raportoitu suurimmassa osassa kasvaimia, ja suuri määrä kokeellisia havainnot viittaavat siihen, että tämä kompleksi on kriittinen tuumorisuppressiogeeneksi [5]. Kompleksit sisältävät vähintään seitsemän katalyytittö- män alayksikköä, jotka oletettavasti auttaa moduloida kohdentamiseen ja toiminnan ATPaasi [6]. Yksi alayksikön tämän monimutkaisen, hSNF5 /Ini1 /BAF47, on tunnistettu tuumorisuppressori [7], [8]. Toinen katalyytittö- män alayksikkö, P270 /ARID1A /BAF250a (adeniini-tymiini AT-rikas interaktiivinen domain sisältävä proteiini 1A), on osoitettu olevan välttämätön normaalille solusyklin pysähtymiseen [9]. Knockdovvn
ARID1A
on leukemiasolulinja resistenssin Fas-välitteisen apoptoosin [10].
Äskettäin
ARID1A
mutaatioita ja menetys BAF250a-proteiinin on todettu korreloivat vahvasti munasarjojen kirkas-cell carcinoma ja kohdun heikompilaatuisen endomet- karsinooma [11] – [13]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että
ARID1A
on potentiaalinen ehdokas tuumorisuppressorigeeniä. Kuitenkin kliininen merkitys tällaisten differentiaalikaavojen ja toiminta ARID1A proteiinin jäävät määrittämättä puutteen vuoksi tutkimusten tuoreista ihmisen kasvainnäytteestä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme analysoineet
ARID1A
ekspressiotaso mahasyövässä käyttäen reaaliaikaista kvantitatiivinen RT-PCR, western blottaus ja immunohistokemia. Samalla olemme tunnistaneet suhdetta
ARID1A
ilmaisun ja kliinis-ja arvioidaan sen ennusteen arvioinnissa jälkeiseen resektio selviytymisen mahasyöpäpotilaista. Lisäksi arvioimme toiminnallista roolia
ARID1A
että kasvainten synnyssä ensisijaisen mahasyövän tutkimalla in vitro leviämisen ja pesäkkeiden muodostumista mahalaukun solulinjoissa.
Tulokset
ARID1A
mRNA Expression Analyzed by reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR
mRNA taso
ARID1A
määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR-määrityksissä 66 pariksi syöpä- ja sovitetun viereiseen normaaliin mahalaukun limakalvon kudoksissa.
ARID1A
ilmentymisen taso oli merkitsevästi alhaisempi 43 (65.15%) kasvain kudosten verrattuna viereisen ei-tuumorikudoksista (
P
= 0,0029, kuva 1).
suhteellinen mRNA: n ilmentymisen on
ARID1A
on merkittävästi vähentynyt mahalaukun syövän kudoksissa verrattuna sovitetun viereisen nontumorous kudoksissa (n = 66,
P
= 0,0029). Vaakasuorat viivat edustavat keskiarvoa.
ARID1A Protein Expression analysoitiin Western blot -menetelmällä
Western blottaus suoritettiin 25 mahasyövän näytteet ja vastaavat viereisen ei-syöpä mahan limakalvon kudokset 66 pariksi näytteet. Tulokset osoittivat ARID1A vyöhyke odotetun kokoinen 242 kDa ja määrä ARID1A olevan proteiinin edelleen mitattiin densitometrisesti. Yhdenmukainen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-tuloksiin, väheneminen ARID1A ilmentyminen havaittiin 13 (52%) on mahakasvaimen kudoksiin verrattuna sovitetun viereisen ei-tuumorikudoksista (
P
= 0,0015, kuva 2A ja Kuvio 2B). Samoin ARID1A proteiinin ilmentyminen oli huomattavasti vähentynyt mahalaukun syövän solulinjoissa, SGC7901, AGS, erityisesti MGC803, verrattuna normaaliin mahalaukun solulinjan GES1 (kuvio 2C).
(A) Suhteellinen ARID1A proteiinin ekspressiotasot mahasyövän kudoksia ja noncancerous kudokset (ARID1A /GAPDH, n = 25,
P
= 0,0015). Vaakaviivat edustavat keskiarvoa. (B) edustaja tulos ARID1A proteiinin ilmentymisen 4 pariksi mahalaukun tumorous ja vastaavan viereisen nontumorous kudoksiin (C, mahasyöpä kudokset, N sovitettu noncancerous mahan limakalvon). (C) ARID1A proteiinin taso oli huomattavasti vähentynyt mahalaukun syövän solulinjoissa, SGC7901, AGS, erityisesti MGC803, verrattuna normaaliin mahalaukun solulinjan GES1.
immunohistokemiallinen analyysi ARID1A Expression mahasyövän Tissue näytteet ja sen Suhde kliinis parametrit
Jotta voitaisiin edelleen tutkia kliinis sekä varoituksia roolit ARID1A ilmaisun, suoritimme immunohistokemiallinen analyysit 224 parafinoidut mahasyövässä kudosblokeista. Kaiken kaikkiaan 115 224 (51,3%) tapauksista oli negatiivinen ARID1A ilmentymistä syöpäkudokset (kuvio 3B), kun taas 109 (48,7%) tapauksista positiivisesti immuunivärjäysmenetelmällä (kuvio 3C 0,05 verrattuna mock-ohjaus; **,
P
0,01 verrattuna mock-ohjaus.
Keskustelu
Huolimatta suurista edistysaskelista diagnosoinnissa ja hoidossa, mahasyöpä edelleen yksi kaikkein tuhoisimpia kasvainten, joiden synkkä ennuste jälkeen radikaali gastrectomy [14], [15]. Kliininen tulos mahalaukun syövän määritetään joukko kasvainten ominaisuuksiin, kuten Paikallista kasvaimen kasvun ja invaasion, erilaistumista luokka, angiogeneesi, etäpesäkkeiden ja solusyklin etenemisen, jotka säätelevät erilaiset liittyvien geenien, mukaan lukien onkogeenit ja tuumorisuppressorigeenit geenejä. Siksi tunnistaminen mahasyöpä-erityinen biomarkkereita osallistuvat näihin menettelyihin on erittäin tärkeää diagnoosin, hoidon ja ennusteen ennustuksen klinikalla.
ARID1A
, vastatunnistetun tuumorisuppressorigeeniä joka koodaa jäsen että SWI /SNF monimutkainen, on suuri mutaatio taajuus virtsarakon syövän, kohdun endomet-, munasarjasyöpä endomet- ja selkeä cell carcinoma [11] – [13], [16], [17]. Munasarjasyöpää selkeät cell carcinoma, on raportoitu, että
ARID1A
mutaatio liittyy merkittävästi ARID1A immunoreaktiivisuus [18]. Äskettäin exome sekvensointi tutkimus paljasti, että
ARID1A
on myös usein mutatoitunut mahasyövässä [19], [23]. Kuitenkin toistaiseksi ilmaisua, kliininen merkitys ja biologisia toimintoja on
ARID1A
mahasyövän ei ole tutkittu. Siksi arvioimme ilmaus
ARID1A
mahasyövän reaaliaikaisella PCR, Western blotting ja immunohistokemia, lisäksi sen kliinis sekä varoituksia merkitys on suuri ihmisen näyte. Lisäksi käyttämällä in vitro solujen mallissa, tutkimme myös tuumorisuppressorigeenin rooli
ARID1A
mahalaukun soluissa yksityiskohtaisesti.
Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että
ARID1A
ilmentyi sekä alemman mRNA ja proteiini tasolla mahasyövässä kudoksissa kuin vastaava ei-syöpä limakalvon. Suostumuksella nämä molekyylibiologisia havaintojen immunohisto- kemiaa, jossa on anti-ARID1A-vasta osoittivat, että
ARID1A
oli täysin vaiennettu 115 ulos 224 potilaan mahasyövän näytteitä, joiden positiivinen ilme toisessa 109 potilasta. Havaintomme on yhtä mieltä joukon selvityksiä paljastavaa, että
ARID1A
ilmaisun usein katoaa tai vähennetään useita syövän kudoksissa ja solulinjoissa, kuten rintasyövän, kohdun endomet-, munasarjasyöpä selkeä solu ja endomet- karsinooma [13,18,20 ja 21].
Toistaiseksi syyt
ARID1A
hiljentäminen ei ole täysin selvitetty. Olemassa tutkimukset keskittyvät mutaatioita
ARID1A
erityisesti gynekologiset syövät. On todettu, että nonsense tai Indel mutaatio
ARID1A
korreloi menetys tai vähentäminen proteiinin ilmentymisen kohdun endomet-, munasarjasyöpä endomet- karsinooma ja selkeä cell carcinoma [11] – [13], [18]. Integroidussa genomista tutkimuksen, Mamo
et al
. löysivät vain yksi typistettyjä mutaatio
ARID1A
että T47D rintasyövän solulinjaa, ilman mutaatio 11 rintasyövän näytteistä, joka osoitti DNA kopiomäärä tappio klo 1p36.11 lokuksen vieressä
ARID1A
[22]. Kahdeksan yhdeksästä näytteiden DNA kopiomäärä tappio 1p36.11 myös alhainen ARID1A proteiinin ilmentymisen, mikä viittaa välistä yhdenmukaisuutta DNA kopiomäärä menetys ja
ARID1A
inaktivoitumista. Vuonna exome sekvensointi tutkimuksen Wang
et al
., Yhteensä 46 mutaatioiden todettiin 32 ulos 109 (29%) mahasyövän näytteitä, 39 (85%) katkaistu mutaatioita [19]. Kaksikymmentäneljä (75%) 32 mahasyövän näytteitä
ARID1A
mutaatiot osoittavat, joko menetys tai oleellisesti vähentää proteiinin ilmentymisen verrattuna ilman
ARID1A
mutaatio. Sen sijaan on olemassa vain 6 mahasyövän näytteet osoittavat poissa tai heikko proteiinin ilmentymisen puuttuessa havaittavan
ARID1A
mutaation, joka viittaa siihen, että muut mekanismit voivat myötävaikuttaa
ARID1A
inaktivoitumista. Äskettäin toinen exome sekvensointi tutkimuksen Zang
et al
. osoittivat myös
ARID1A
mutaatioiden 8% mahalaukun näytteistä, joista 75%: kadonnut tai vähentänyt proteiinin ilmentyminen [23]. Enemmän kiinnostavaa, molemmat tutkimukset osoittivat korkeampia
ARID1A
muutokset mahasyövän näytteitä mikrosatelliittien epävakaus (MSI) kuin ne, joilla microsatellite vakauden (MSS). Lisäksi mutaatio kirjo
ARID1A
on selvä kahden geneettistä tyyppiä mahasyövän, useimmat indeleitä MSI tyyppi ja yhden neucliotide vaihtelut MSS tyyppi. MSI on määritelty Indel mutaatiot nukleotidin toistoja (tunnetaan mikrosatelliittimerkkien alueet) johtui DNA mismatch korjaus geenin toiminnan aiheuttamaa replikointi virheitä [24]. Ehdotetaan aloittava genomista tapahtumia mahalaukun syövän, MSI johtaa usein kertyminen lisää syöpään liittyvien geneettisten epävakauteen, kuten alleelinen tappiot ja lukukehysmutaatioita geeneissä osallisena solujen lisääntymisen sääntelyn, apoptoosin ja DNA: n korjaukseen. On raportoitu, että MSI esiintyy 25%: sta 50% satunnaista mahasyövän, joka määrittää ainutlaatuinen geneettinen tyyppi tauti eri kliinis-[24]. Tutkimuksessa Wang
et al
., The Indel mutaatiovauhtia (78%)
ARID1A
MSI mahasyövän on verrattavissa
TGFBR2
MSI paksusuolessa syöpä, vakiintunut ja toiminnallisesti validoituja kuljettajan geeni inaktivoidaan MSI [25]. Nämä tiedot osoittavat, että mutaatio
ARID1A
yhdessä MSI voi olla tärkeä rooli mahasyövän. Siksi suhde
ARID1A
muutoksia ja MSI asema mahasyövän sekä sen kliinis merkitys, tarvitsee lisätutkimuksia tulevaisuudessa tutkimukseen.
Tutkimuksessa Wang
et al.
, ilmaus
ARID1A
havaittiin vain pienen koon näyte (32 tapausta), ja ei ollut tutkia tarkemmin sen kliinistä merkitystä [19]. Tässä suuremmassa mahasyövän väestöstä (224 tapausta), huomasimme, että menetys
ARID1A
ilmentyminen korreloi merkitsevästi korkeampi T vaiheessa mahasyövän, mikä tarkoittaa, että puuttuminen
ARID1A
ilmentyminen voi edistää kasvaimen kasvua ja invaasiota. Lisäksi olemme havainneet alempi ARID1A immuunivaste heikosti eriytetty mahasyövän kudoksiin kuin hyvin erilaistuneet, mikä viittaa siihen, että vähentynyt
ARID1A
ilmaisu voisi olla rooli kasvaimen de-erilaistumista. Vastaa meidän havaintoja, muut tutkijat havaitsivat myös, että vähentynyt
ARID1A
ilmentyminen liittyy merkittävästi laadukkaampaa rintasyövän [22], sekä korkeampi levinneisyysaste munasarjasyöpää selkeät cell carcinoma [21]. ARID1A edistää muodostumista BRG1 tai BRM-sisälsivät SWI /SNF kromatiinin remodeling komplekseja, jotka ovat välttämättömiä normaalille solusyklin pysähtymiseen [9], [26].
Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti merkittävää korrelaatiota menetys
ARID1A
ilmaisun ja huonompi kliininen tulos mahasyöpäpotilaista jälkeen radikaali käytön. Coxin riskisuhde regressioanalyyseissä osoitti lisäksi, että
ARID1A
ilmentymisen taso oli itsenäinen riskitekijä selviytymisen, mikä viittaa siihen, että se voi toimia arvokkaana ennustetekijöitä biomarkkeri mahasyöpäpotilaista leikkauksen jälkeen ja potentiaalinen kohde geeniterapiaan hoito syöpään. Munasarjasyöpää selkeät cell carcinoma, se on myös raportoitu, että potilailla, joilla on positiivinen
ARID1A
ilme oli pitempi aika ilman taudin etenemistä kuin ne, joilla on negatiivinen
ARID1A
ilmaisun [21]. Lisäksi menetys
ARID1A
ekspressio korreloi merkitsevästi chemoresistance munasarjojen kirkas cell carcinoma, joka on myös liitetty huonoon ennusteeseen syövän. Nämä tiedot viittaavat siihen, että
ARID1A
ilmaisun ja mutaatio tarkastelu voisi olla hyödyllistä ohjata kliinisen hoidon. Yhdessä havaintojemme että menetys
ARID1A
ilmentymistä mahasyövän liittyy enemmän pahanlaatuisia fenotyyppien ja huonompi ennuste merkitse, että se voi olla tuumorisuppressorina rooli mahasyövän.
tutki tarkemmin toiminnallista roolia
ARID1A
mahalaukun solulinjoissa. Palauttaminen
ARID1A
ilmentymistä mahasyövässä soluissa esti merkitsevästi solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumista. Hiljentäminen ilmaus
ARID1A
mahalaukun epiteelisolujen tehostaa merkittävästi solujen kasvua. Nämä tulokset osoittivat, että
ARID1A
voi olla tuonnin rooli tuumorin solujen kasvua. Äskettäin toiminnalliset analyysit on
ARID1A
mahasyövän solulinjoissa Zang
et al
. ehdotti, että
ARID1A
käyttää kasvaimen suppressoriaktiivisuutta [23]. Guan
et al
. osoittivat, että palauttaminen ilmentymistä villityypin
ARID1A
on riittävä tukahduttaa leviämisen ja tumorigenecity ksenograftien ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa kätkeminen
ARID1A
mutaatioita, kun taas RNA-interferenssi-välitteisen
ARID1A
hiljentäminen parantaa solujen lisääntymistä ja tuumorigeenisyystesti kahden ei-transformoidut ihmisen munasarjan epiteelin solulinjoissa, menettää tavallisesti-80PC ja OSE4 [27]. Nämä tiedot yhdessä meidän, viittaavat siihen, että menetys
ARID1A
voi olla tärkeä rooli prosessissa syövän.
Yhteenvetona olemme osoittaneet menetys
ARID1A
ilmentymisen mahasyövän ja sen korrelaatioon enemmän pahanlaatuisen fenotyypin, ja huonompi ennuste on suuri määrä kliinisiä näytteitä. Lisäksi olemme osoittaneet, että
ARID1A
voi estää kasvainsolujen kasvua ja pesäkkeiden muodostumista in vitro. Parhaan tietomme mukaan tuotetut tiedot nykyisessä tutkimuksessa edustavat ensimmäisen raportin korreloivat läsnäollessa
ARID1A
kanssa kliinis ominaisuudet ja eloonjäämisaste mahasyöpäpotilaista. Yhdessä tulosten kanssa Wang
et al.
Ja Zang
et al
. [19], [23], me edelleen vahvisti, että
ARID1A
voisi toimia ehdokkaaksi tuumorisuppressoriproteiinia sekä varoituksia biomarkkereiden in mahasyövän.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics Statement
tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean Sun Yat-sen University Cancer Center, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan mukana tutkimuksessa.
Solulinjat ja viljelyolosuhteet
mahasyöpä solulinjat, SGC7901, AGS, MGC803, ja mahalaukun epiteelin limakalvoon solulinja GES1 saatiin komitean Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 media mukana 10% lämmöllä-aktiivinen naudan sikiön seerumia (FBS). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, joka sisälsi 5% CO
2.
ihmiskudosnäytekokoelmien
s
Yhteensä 66 pariksi syöpä- ja Hyväksytty vieressä noncancerous mahan limakalvon kudokset kerättiin mahalaukun syöpäpotilailla gastrectomy Sun Yat-sen University Cancer Center vuosien 2009 ja 2011, ja diagnoosi varmistettiin patologinen tutkimus. 25 pariksi syöpä- ja vastaavat viereisen noncancerous mahalaukun limakalvon kudoksissa käytetään havaitsemaan ARID1A proteiinin ilmentyminen western blot -analyysissä valitaan 66 pariksi näytteitä. Sen jälkeen, kun kirurginen resektio, tuoreet kudokset välittömästi immerged RNAlater (Ambion, Inc., USA), jotta vältetään RNA: n hajoamisen, säilytettiin 4 ° C: ssa yön yli, jotta perusteellisen tunkeutumisen RNAlater kudokseen ja jäädytettiin sitten -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n ja proteiinin uutto suoritettiin. Toinen 224 parafinoidut ensisijainen mahakarsinoo- näytteitä, jotka oli kerätty vuosina 2003 ja 2005, saatiin Sun Yat-sen University Cancer Center. Kukaan näistä potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Seuranta-datan mahasyövän tutkimuspotilaat ovat saatavilla ja täydellisiä. Leikkauksen jälkeinen seuranta-tapahtui meidän poliklinikalla ja mukana kliiniset ja laboratoriotutkimukset 3 kuukauden välein 2 ensimmäisen vuoden aikana 6 kuukauden välein aikana kolmannesta viidenteen vuotta, vuosittain vielä 5 vuoden ajan tai kunnes potilas kuolemaan, kumpi tapahtui ensin. Histopatologisen tyyppi ja vaihe mahasyövän määritettiin kriteerien mukaan Maailman terveysjärjestön luokitus ja TNM esitetyt unionin kansainvälisen Cancer Ohjaus.
uutto Kokonais-RNA ja Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR
Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) valmistajan protokollan. Yhteensä RNA-pitoisuus arvioitiin mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä käyttäen NANO DROP spektrofotometriä (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Käänteistranskriptio (RT) syntetisoimiseksi ensimmäisen juosteen cDNA suoritettiin 2 ug kokonais-RNA: ta käsiteltiin M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, USA) valmistajan suositusten mukaisesti. Saatu cDNA altistettiin sitten reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää varten arvioinnin suhteellinen mRNA tasot
ARID1A
ja
GAPDH
(glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, kuin sisäinen kontrolli) kanssa seuraavia alukkeita:
ARID1A
eteenpäin: 5′-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ’, ja reverse: 5′-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3’;
GAPDH
eteenpäin: 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ’, ja reverse: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. Gene-spesifinen amplifikaatio suoritettiin käyttäen ABI 7900HT reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA), jossa on 15 ui PCR-seosta, joka sisälsi 0,5 ui cDNA: ta, 7,5 ui 2 x SYBR Green master mix (Invitrogen, Carlsbad , California, USA) ja 200 nM sopivia oligonukleotidialukkeita. Seos esikuumennettiin 95 ° C (10 min) ja monistettiin sitten 95 ° C: ssa (30 sekuntia) ja 60 ° C (1 min), 45 sykliä. Resoluutio käyrä mitattiin 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 15 sekuntia ja 95 ° C 15 sekuntia. Ct (raja-sykli) arvo kunkin näytteen laskettiin kynnyksen syklien laitteen ohjelmisto (SDS 2,3), ja suhteellinen ilmentyminen
ARID1A
mRNA normalisoitiin
GAPDH
arvo . Tiedot analysoitiin käyttämällä vertailevan kynnyssykli (2
-ΔCT) menetelmällä.
Western-blottaus-analyysi
homogenoidut mahasyöpä näytteitä, kuten kasvain- ja ei kudoksia sekä solu- linjojen , lyysattiin RIPA-lyysipuskuria, ja lysaatit kerättiin sentrifugoimalla (12000 rpm) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Noin 50 ug proteiinia jälkeen näytteet erotettiin elektroforeesilla 12% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvo. Sen jälkeen, kun esto ei-spesifisiä sitoutumiskohtia 60 min 5% rasvatonta maitoa, kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren monoklonaalisella vasta-aine ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, USA, klo 1:1000 laimennus) . Kalvot pestiin sitten kolme kertaa TBST: llä (Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa Tween-20) 10 minuutin ajan, ja koettimena piparjuuren peroksidaasiin (HRP) konjugoitua kanin anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Immunology Consultants Laboratory, USA, klo 1: 2000-laimennos) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Kolmen pesun jälkeen membraanit kehitettiin parannetun kemiluminesenssi-järjestelmän (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Bändi intensiteetti mitattiin densitometrian käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Proteiini tasot normalisoitiin että GAPDH havaittiin käyttämällä hiiren anti-ihmisen GAPDH monoklonaalinen vasta-aine (Shanghai Kangchen, Kiina, klo 1:10000 laimennus).
immunohistokemia Analyysi
kudosleikkeiden olivat parafiini kanssa dimetyylibentseenin ja nesteytyksestä kautta 100%, 95%, 90%, 80% ja 70% etanolia. Kolmen pesun jälkeen PBS: ssä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos), levyt keitettiin antigeenin haku, joka sisälsi 0,01 M natriumsitraatti-suolahappoa (pH = 6,0) 15 minuutin ajan mikroaaltouunissa. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, kudos leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen ja objektilasit huuhdeltiin sitten 3% peroksidaasia sammutusta liuos (Invitrogen) endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi. Sitten leikkeitä inkuboitiin hiiren monoklonaalinen vasta-aine ARID1A (Abgent Primary Antibody Company, USA, klo 1:300 laimennus) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Pesun jälkeen PBS: ssä, visualisointi signaali kehitettiin 3, 3′-diaminobentsidiini (DAB) liuos, ja kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivisina kontrolleina vierekkäisten osioiden käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, paitsi että niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa blokkausliuoksessa ilman primaarista vasta-ainetta.
Yhteensä ARID1A immunovärjäyksellä pisteet laskettiin summana prosenttia positiivisesti värjätään kasvainsoluja ja värjäytymisen intensiteettiä. Lyhyesti, prosenttiosuus positiivista värjäytymistä pisteytettiin 0 (0-9%, negatiivinen), 1 (10% -25%, satunnaisesti), 2 (26% -50%, polttoväli) ja 3 (51% -100%, diffuusi), ja intensiteetin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (kohtalainen värjäytyminen) ja 3 (tumma värjäys). Yhteenlaskettu immunovärjäyksellä pisteet laskettiin arvoon prosentin positiivisuuden pisteet × värjäytymisen intensiteetti pisteet, jotka vaihtelivat 0 9. Ilmaisu taso ARID1A määriteltiin seuraavasti: ”-” (negatiivinen, pisteet 0), ”+” (heikosti positiivinen, pisteet 1-3), ”++” (positiivinen, pisteet 4-6), ”+++” (voimakkaasti positiivinen, pisteet 7-9). Perustuu ARID1A ekspressiotasoja, mahalaukun syöpäpotilaiden jaettiin kahteen ryhmään: negatiivinen ARID1A lauseke ryhmä (ARID1A-) ja positiivinen ARID1A ilmaisun ryhmä (ARID1A +, ARID1A ++ tai ARID1A +++).
ekspressioplasmidin ja ohimenevä transfektoinneilla
eukaryoottinen ekspressioplasmidin pCMV6-Entry, joka sisältää täyspitkän ihmisen
ARID1A
cDNA saatiin Asbio Technology (Guangzhou, Kiina). Tyhjää vektoria käytettiin negatiivisena kontrollina. MGC803 soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä, kunnes ne saavuttivat 85-90% konfluenssin, ja sitten ohimenevä transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, geenin ilmentyminen tutkittiin Western blot-analyysi. Ja sitten, solujen lisääntymisen ja pesäkkeiden muodostumisen tehtiin.
RNA Oligonukleotidit ja Solutransfektiot
knockdovvn
ARID1A
ilmaisu, siRNA: t syntetisoitiin GenePharma Company (Shanghai, Kiina). SiRNA-sekvenssit olivat seuraavat: siRNA-
ARID1A
, sense: 5’GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ’, antisense: 5’AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3 ”. Negatiivinen kontrolli (NC), sense: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ’, antisense: 5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3 ”. 400 pmol siRNA-
ARID1A
tai NC transfektoitiin 2 x 10
5 GES1-soluihin käyttäen Lipofectamine-RNAi MAX-reagenssia (Invitrogen, USA) valmistajan protokollan.