Krooninen sairaus

tiivistelmä

Co-kulttuuri mallit ovat tällä hetkellä välisen kuilun kaventamiseen klassisen kulttuurien ja

in vivo

eläinmalleissa. Exploring tämä uusi lähestymistapa avaa mahdollisuuden matkia kasvain microenvironment

in vitro

, luomalla syövän strooman synergistiset vaikutukset. Erityisesti nämä organotypic mallit tarjoavat täydellisen alustan kehittäminen ja prekliininen arviointi ehdokas nanocarriers täynnä kasvaimia torjuvaa lääkkeiden suurikapasiteettisten seulonta tilassa alhaisemmilla kustannuksilla ja ilman eettisiä kysymyksiä. Tämä arviointi oli tähän asti rajoitettu yhdessä viljelemisen perustettujen tarkat solusuhteilla, ei puututa luonnollista solun heterogeenisyys esiintyy yleisesti eri kasvaimissa. Siksi tässä monitoiminen nanocarriers tehokkuutta leimasi eri fibroblasti-MCF-7 yhdessä viljelemisen, jotka sisältävät eri solujen suhde, jotta selvittää keskeiset suunnitteluparametrit, jotka vaikuttavat nanocarrier suorituskyky ja hoitotulokseen. Perustamisen onnistuminen yhdessä viljelemisen mallien varmistettiin kudoksen kaltaisia ​​jakautuminen eri solujen viljelmässä. Nanohiukkasten inkubaatio eri yhteistyössä viljelysysteemejä paljastaa, että nämä nanocarriers hallussaan suunnattu spesifisyys syöpäsoluja, mikä osoittaa niiden sopivuutta käytetään tämän sairauden hoidossa. Lisäksi, käyttämällä erilaisia ​​yhteisviljelmässä suhteet eri nanohiukkasten otto profiilit saatiin. Nämä havainnot ovat ratkaisevan tärkeitä tulevaisuuden suunnitteluun ja optimointiin uuden lääkkeen jakelujärjestelmiä, koska niiden todellinen kohdentamisen kapasiteetti on käsiteltävä heterogeeninen solupopulaatioiden, kuten todettu kasvaimissa.

Citation: Costa EY, Gaspar VM, Marques JG, Coutinho P, Correia IJ (2013) arviointi Nanoparticle otto Yhdessä viljeleminen Cancer Models. PLoS ONE 8 (7): e70072. doi: 10,1371 /journal.pone.0070072

Editor: Michiya Matsusaki, Osakan yliopisto, Japani

vastaanotettu: 25 tammikuu 2013; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 26 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Costa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Portugalin Foundation for Science and Technology (FCT), SFRH /BD /80402/2011, PTDC /EME-TME /103375/2008, PTDC /EBB-BIO /114320/2009 ja tuhoeläinten OE /EGE /UI4056 /2011. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosikymmenellä kehittyvien kehitys nanolääketieteen on kannustanut sen nopea soveltaminen kehittämiseen lukuisia strategioita hoitoon haittaavaa sairauksia, jotka ovat edelleen parantumaton [1]. Tällä hetkellä valtava teknologinen kehitys toteuttaa suunnittelussa ja tuotannossa nanoparticulated järjestelmien syövän hoito on peräisin tuloksista ikuisesti taitavia ja kohde-erityisiä nanocarriers, jotka vähentävät sivuvaikutuksia, jotka liittyvät klassisen syöpälääkkeiden ja myös lisätä potilaiden eloonjäämisaste [ ,,,0],2]. Usein sisällytetä bioyhteensopivaa epäorgaanisia tai orgaanisia materiaaleja, nanocarriers kykenevät myös parantaa biojakautumista ja hyötyosuus lääkkeitä, jotka muuten olisivat huonosti saatavilla kohdealuei- [3]. Joustava luonne nanohiukkasia läheisesti korreloi eri materiaaleja, joita käytetään niiden synteesissä, kuten metallit (kulta ja hopea), keramiikka (hydroksiapatiitti), lipidien (kolesterolin ja myrkyttömiä fosfolipidit) ja polymeerien (alginaatti, kitosaani, PEG,) [4]. Näistä, kitosaani on ollut yksi laajimmin käytetty synteesiin eri nanoparticulated lääkkeen jakelujärjestelmiä, koska sen ainutlaatuiset ominaisuudet, kuten biologinen yhteensopivuus, vakaus, helposti modifioida kemiallisesti ja immunogeenisyys on alhainen [5]. Näitä ainutlaatuisia ominaisuuksia voidaan edelleen räätälöidä funktionalisoimiseksi hiukkasen pinta cell-molekyylejä, kuten vasta-aineita, foolihappo, biotiini, tai aptameerit [6], [7], jotka parantavat huomattavasti nanocarrier spesifisyys kohti kohdesoluja, suojata normaaleja soluja vastaan ​​huumeiden -johdannainen myrkyllisiä haittavaikutuksia [8].

kuitenkin, ennen kuin lukuisat nanodevices parhaillaan tutkittavana tulla sopivia kliiniseen käyttöön, niiden on ylittämään tiukat testit esitetään sääntelyvirastoja kuten Food and Drug Administration (FDA ) ja Euroopan lääkevirasto (EMEA). Mukana eri arviointivaiheessa että nanocarriers on voitettava, biologinen turvallisuus ja aktiivisuusmääritysten olettaa kriittinen merkitystä nanohiukkasten valmisteilla kehittämiseen [9], [10].

Erityisesti näihin testausta varten, soluviljelmissä syntyy kuin poikkeuksellisen tehokas ja taloudellinen väline, verrattuna

in vivo

malleissa. Itse asiassa ne tarjoavat ainutlaatuisen koelaitteisto tutkia vaikutuksia eri lääkeainesekoituk- ja nanohiukkasten malleja, alle erittäin valvotuissa ja toistettavissa olosuhteissa [11]. Lisäksi soluviljelmissä tarjoavat helpon tavan käsitellä useita kokeellisia muuttujia, jotta jäljentää joitakin

in vivo

olosuhteissa, välttäen kuitenkin eettisiä ja oikeudellisia kysymyksiä, jotka liittyvät eläinten käsittelyyn [12]. Kuitenkin tähän asti alueellista organisaatiota kudosten ja solu-vuorovaikutuksiin olivat yleisesti oteta huomioon suurin osa käytettävissä

in vitro

malleissa [12]. Voittamiseksi tällaiset rajoitukset uusi luokka soluviljelmissä, kutsutaan co-kulttuureissa, kehitetään parhaillaan [13]. Tämä uusi konsepti on suunniteltu tarkoitus kattaa välisen korrelaation puuttuminen klassisen soluviljelmissä ja

in vivo

järjestelmissä (kuvio 1) [12]. Käyttämällä yhteistyö kulttuureissa on mahdollista luoda uudelleen joitakin

in vivo

kudoksessa kapeampiin [14], koska solu-solu-vuorovaikutuksia perustetaan tiiviissä yhteydessä. Tämä kriittinen parametri on välttämätöntä perustaa solun morfologia, fenotyyppi, aineenvaihduntaa ja leviämisen, ominaisuuksia, jotka ovat läsnä

in vivo

[15], [16], [17], [18]. Lisäksi yhteistyössä kulttuurit ovat myös erinomainen väline analysoida kohdistaminen spesifisyys lääkeainekuljetussysteemeihin varten kasvainsolujen [19].

soluviljelmissä pystyvät jäljittelemään

in vivo

kudoksissa ilman eettisiä ja kustannukset liittyvät kysymykset eläinkokeiden.

Nykyään rintasyöpä on yksi tutkittu maligniteetti [13]. Tämä sairaus on yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien naisilla maailmanlaajuisesti [20], [21]. Rintasyöpä microenvironment koostuu paitsi syöpäsolujen lisäksi myös fibroblastien, rasvasolut, veren kapillaareja, endoteelisolujen, immuunijärjestelmän solut ja soluväliaineen (ECM) proteiineja [13], kuten kollageenin ja elastiinin. Huolimatta hyväksytty, että syöpä voi yleensä syntyä geneettisiä mutaatioita [22], kasvu, invaasio ja metastaasi eivät ole vain riippuvainen näistä mutageenisia tapahtumista. Oikeastaan ​​se on tunnustettu, että kaikkien solujen läsnä kasvaimen mikroympäristössä toimivat synergistisesti edistää kasvainten lisääntymistä ja leviämistä [23], [24]. Lisäksi on äskettäin raportoineet Straussman et al., 2012, että stroomasolut otetaan palvelukseen syöpäsolut kysymään kasvain lääkeresistenssideterminantit ja leviämisen [25].

Viime aikoina useat syövän hoitomuotoja, jotka kohdistuvat myös fibroblastit ovat osoittaneet, estää tämän sairauden etenemistä [26]. Nämä tietyt solut kuvattu olevan keskeinen rooli kasvaimen kapealla [27], jossa on heterogeeninen väestö ja erilaiset suhteelliset koostumus nykyisten lukuisissa kasvaimissa [26]. Nämä solut ovat mukana aineenvaihdunnassa ECM, edistämällä integriini signalointi [28], [29]. Fibroblastit erittävät myös ja vuorovaikutuksessa useiden kasvutekijöiden [25], [29], kuten hepatosyyttikasvutekijän (HGF), fibroblastien kasvutekijä (FGF), insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) ja epiteelin kasvutekijä (EGF), jotka ovat vastuussa aktivointi mekanismeja, jotka edistävät apoptoosia vastus [30], [31], ja edistää pahanlaatuisten solujen uudiskasvun [32]. Kaikki nämä vahingollisia ominaisuuksia, ovat herättäneet tutkijoiden huomiota yhteistyön kehittämiseksi kulttuureissa, jotka sisältävät nämä solutyypit yrittää jäljitellä todellinen kasvain microenvironment [19], [33].

Tästä stand vaiheessa, tämän tutkimuksen luonnehtii solun oton funktionalisoidun nanocarriers yhteistyössä kulttuurin malleja, jotta voidaan puuttua niiden selektiivisyyden ja biologinen aktiivisuus syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

estrogeeni riippuvainen ihmisen rinta- adenokarsinooma (MCF-7) saatiin ATCC (Middlesex, UK) ja ensisijaisen normaalin ihmisen ihon fibroblasteista (hFIB) peräisin Promocell (Heidelberg, Saksa). Soluviljelmästä T-pulloissa saatiin Orange Scientific (Braine-l’Alleud, Belgia). Cell kuvalevyille hankittiin Ibidi GmbH (Ibidi, Munich, Saksa). Rodamiini B isothiocianate (RITC), trypsiini, soluviljelmä Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine F-12 (DMEM-F12), Kollageeni tyyppi I, L-histidiini, L-arginiini,

N

– hydroksisukkinimidi (NHS),

N

– (3-dimetyyliaminopropyyli) –

N

-ethylcarbodiimide hydrokloridi (EDC) ostettiin Sigma-Aldrich (Sintra, Portugali). Hoescht 33342® ja CellLight 2.0® BacMam toimitti Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Ultrapuhdasta kitosaanihydrokloridi (CH) (Protasan UP CL 113) saatiin Novamatrix (Sandvika, Norja). Naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Biochrom AG (Berliini, Saksa). (4- (2-hydroksietyyli) -1-piperatsiinietaanisulfonihappo) ostettiin Tokio Chemical Industry (TCI) (Tokio, Japani). Kaikki muut reagenssit käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

Co-kulttuuri mallit

määrätä erilaiset yhdessä viljelemisen mallit MCF-7 ja hFIB soluja kasvatettiin 75 cm

2 solun T- pulloihin DMEM-F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää, ja 1% streptomysiiniä ja gentamysiiniä. Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa, kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Kun saavuttaa yhtymäkohdassa, sekä solut kerättiin käyttämällä 0,18% trypsiiniä ja 5 mM EDTA: ta, jolloin saatiin kaksi yhden solun suspensiot. Solut värjättiin trypaanisinisellä 4% ja laskettiin käyttämällä hemosytometriä. Sen jälkeen, co-viljelmiä ympättiin 01:01, 01:03, 01:05 ja 03:01 MCF-7 hFIB suhteet, päälle 6-kuoppaisille levyille, joissa on yhteensä 2 x 10

4 solut kuoppaa kohti. Ohjaus homotyyppisessä viljelmiä hFIB ja MCF-7-solut ympättiin käyttäen samaa kokonaismäärä solua kuoppaa kohti erillisissä kuopissa. Co-kulttuureissa ja homotyyppisessä viljelmiä pidettiin DMEM-F12 täydellistä alustaa kaikissa kokeissa. Kehitys yhteisviljelyt suhteen solujen jakelun ja morfologia analysoitiin käyttäen Olympus CX41 optisella mikroskoopilla varustettu Olympus SP-500 UZ digitaalikamera.

synteesi ja karakterisointi kitosaani-histidiini-arginiini

synteesiä monitoimisen polymeeri, CH kemiallisesti muunnettu arginiini (R) ja histidiini (H) kautta EDC /NHS kytkin [34], [35]. Tätä tarkoitusta varten, kitosaania liuotettiin (10 mM TEMED /HCl-puskuriin, pH 6,0) pitoisuuteen 1% (w /v). Sen jälkeen, NHS, EDC: tä (0,6 mol: 1,5 mol) ja L-histidiini (0,7 mol: 1,0 mol glukosamiini) lisättiin myöhemmin kitosaaniliuokseen. Reaktio suoritettiin aikana 24 h, huoneen lämpötilassa. Funktionalisoitu polymeeri dialysoitiin sitten deionisoidulla vedellä (MWCO 12 000-14 000 Da). Puhdistettu kitosaani-H polymeeri sitten talteen kylmäkuivaamalla. CH-H polymeerirunko on jälkikäteen muunnettu L-arginiini kuten edellä on mainittu, jolloin saadaan CH-HR.

sisällyttäminen aminohappojen kitosaanin selkäranka analysoitiin läpi protoniydinmagneettiresonanssispektrin (

1H-NMR spektroskopiaa) käyttäen Bruker Avance III 400 MHz-spektrometrillä (Bruker Scientific Inc., NY, USA). Kaikki näytteet liuotettiin 1 ml: aan DMSO-d

6 laajoin sonikoimalla ja

1 H spektrit kerättiin gradientilla perustuva pulssin ohjelma (zgesgp, Bruker), 298 K käyttäen spektrin ikkuna 9 kHz . NMR-spektrit käsiteltiin ja analysoitiin TOPSPIN 3.1 ohjelmistoa (Bruker Scientific Inc., N.Y., USA). Lisäksi aminohappokytkennän varmistettiin myös Heikennettyä Yhteensä heijastuskyky-Fourier-muunnos infrapunaspektroskopia (ATR-FTIR) (pöytäkirja S1 File S1 ja kuvio S1). Yleinen substituutioaste alkuperäisen CH polymeerirungon määritettiin ATR-FTIR, kuten aiemmin on kuvattu elsewere [36] (keskiarvo ± S.D .: 43,84 ± 6,67%;

n

= 3). Lisäksi substituutioaste oli myös määritettiin NMR-analyysillä integroimalla histidiini (δ = 8,1 ppm), arginiini (δ = 7,41 ppm) ja kitosaani (δ = 1,3 ppm) karakteristiset piikit (Histidiini suhde = 1,14; arginiini ratio = 0,39).

nanopartikkeliformulaatiossa ja fysikaalis-kemialliset karakterisointi

Jotta olemassa geneettisen materiaalin kapseloitavaksi nanocarriers The pVAX1-LacZ plasmidia perin monistettiin rekombinanttibakteerien ja talteen aiemmin raportoitu [37]. Lyhyesti, formulointiin kitosaani-histidiini-arginiini /pDNA (CH-H-R /pDNA) nanohiukkasia, polymeeri liuotettiin asetaattipuskurissa (pH 4,5), halutussa konsentraatiossa. Kaikki amino CH-H-R nanohiukkasten formuloidaan aiemmin optimoitu amiinin fosfaatti-suhde (N: P-suhde = 60). Nanohiukkasten syntetisoitiin lisäämällä pDNA polymeerin liuokseen 01:04 (v /v). Seosta sekoitetaan sitten voimakkaasti 1 min. Jälkeenpäin kompleksit vakiintui huoneenlämpötilassa ja talteen sentrifugoimalla 18 000 g, 30 min.

nanopartikkelikoko ja zeta-potentiaali määritettiin käyttämällä Zetasizer Nano Zs väline (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) kuten ryhmämme aiemmin kuvattu [37]. Kaikki kokeet suoritettiin 25 ° C: ssa, jossa on kertakäyttöinen taitettu kapillaari soluja, automaattitilassa. Aineisto käsitellään Zetasizer ohjelmisto (v 6.2). Lisäksi nanohiukkasten zeta-potentiaali oli myös seuloa erilaisia ​​pH: n (5,0-7,4), jotta edelleen käsitellä pH reagoiva toiminta tämän järjestelmän eri olosuhteissa. PH seulonta suoritettiin suspendoimalla nanohiukkasten puskureissa sopivalla puskurikapasiteetti (asetaattipuskuri, 10 mM, pH 5,0; sitraattipuskurissa 10 mM, pH 6,0 ja pH 6,5; HEPES-puskuria 10 mM, pH 7,0 ja pH 7,4). Kaikki puskurit aiemmin suodatettiin 0,22 um: n suodattimen läpi.

valmistaa nanopartikkelien analysoitiin myös pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM). Ennen SEM-analyysi, nanohiukkasten näytteet värjättiin 0,1% fosfovolframihappoa ja sonikoitiin. Jälkeenpäin nanohiukkasten suspensio dispergoitiin alumiini kantojen, ja sputteroitiin kulta kuivaamisen jälkeen huoneenlämpötilassa. Nanohiukkasten jälkeen näytteet visualisoitiin Hitachi S-2700 (Tokio, Japani) elektronimikroskoopilla konfiguroida optimaaliset asetukset kuvantamiseen nanokokoluokan materiaaleja.

In vitro

nanohiukkasten Cell otto

in vitro

nanohiukkasten otto eri yhteistyössä kulttuuri järjestelmät (01:01, 01:03, 01:05, 03:01) analysoitiin CLSM (CLSM). Erottaa hFIB solujen MCF-7, jälkimmäinen leimattiin CellLight 2.0® BacMam Actin-vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) koetin noudattamalla valmistajan protokollaa. Ennen solujen kylvö, kuvantamisen levyt olivat pinta päällystetty kollageenia I, 30 minuuttia, suosittelemia valmistajat. Alkamisen jälkeen GFP: n ilmentymisen erilaisia ​​MCF-7 /GFP hFIB suhde oli sub-viljeltiin 8 hyvin μ-Slide Ibidi levyille tiheytenä 2 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Soluja viljeltiin DMEM-F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää, 37 ° C: ssa humified ilmakehässä 5% CO

2. Ensimmäisen päivän jälkeen yhteistyön viljelyn jälkeen soluja inkuboitiin CH-H-R nanohiukkasten ladattu RITC-leimatun pDNA (1 ug /cm

2) 4 h [38]. Nanopartikkelit inkuboitiin myös monokulttuurien on hFIB, MCF-7 ja Actin-GFP MCF-7-soluissa. Lisäksi MCF-7-solut värjättiin GFP ja inkuboitiin paljain RITC-pDNA käytettiin kontrolleina (kuvio S2). Sen jälkeen 4 tunnin inkubointijakson jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA) 15 minuutin ajan, pestiin perusteellisesti PBS: llä ja värjättiin Hoechst 33342® ydin- koettimella huoneenlämpötilassa. Solujen kuvantaminen suoritettiin Zeiss LSM 710 laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss SMT Inc., USA) käyttämällä Plan-Apochromat 40 × /1,4 Oil DIC tavoite. Kuvat näytteistä hankittu z-stack tilassa siivu paksuus on 0,23 um. Orthogonal leikkuu ja 3D jälleenrakentamiseen eri z-pinot tehtiin Zeiss LSM Zen ohjelmisto (2010).

virtaussytometria analyysi Nanoparticle otto

vaikutus erilaisten yhteistyön kulttuuri tunnusluvut laajuutta ja spesifisyyttä nanohiukkasten sisäänotto analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen BD FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson Inc., USA). Lyhyesti, sillä säänottokokeista, co-viljelmiä ympättiin 6 kuoppaviljelylevyillä yhteensä 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Soluja kasvatettiin 24 h DMEM-F12-10% FBS ennen kaikissa kokeissa. Lisäksi yhteistyössä kulttuureissa ja monokulttuurien hFIB ja MCF-7 käytettiin verrokkeina perustaa oikeat gating ja hankinta parametreja FL-1 (530/30 nm (GFP)) ja FL-2 (585/42 nm ( RITC)) kanavat (kuva S3). Analysoimiseksi nanohiukkasten oton eri yhteisviljelmissä CH-H-R nanohiukkasten valmistettiin tuoreeltaan leimatun RITC-pDNA (1 ug /cm

2) ja inkuboitiin solujen kanssa 4 tuntia. Sen jälkeen solut laajasti huuhdeltiin jääkylmällä PBS: llä ja kerättiin 0,18% trypsiiniä /5 mM EDTA (etyleenidiamiinitetraetikkahappo). Virtaussytometriaa analyysiä, solut resuspendend 600 ui tuoretta PBS: ää. Tietojen hankinta suoritettiin CellQuest- ™ Pro -ohjelmiston jossa 8 x 10

3 tapahtumia kirjattiin aidatulla kiinnostavilla alueilla määrätty hFIB ja MCF-7-soluissa. Virtaussytometria data analysoitiin kokeiluversion FCS ilmaista V.4 tutkimusta painos ohjelmisto (De Novo Software, Ontario, Canada). Laskemiseksi solun prosenttiosuutta aidatulla alueella vaihtelee 10

1 ja 10

4 käytettiin. Tämä alue rajautuu merkkiaine histogrammit ja vastaa R2 neljännekseen piste tontteja. Kaikki histogrammit ei-käsiteltyihin kontrolleihin vähennettiin, että histogrammeja, jotka on saatu eri suhteita.

Tulokset

Co-viljelmistä MCF-7 ja hFIB

Aluksi eri rintasyöpä yhdessä viljelemisen mallit luotiin käyttäen erilaisia ​​solujen suhdeluvut aiemmin kuvattu kirjallisuudessa olevan kuvailevan

in vivo

-mimicking olosuhteissa, nimittäin, 01:01; 01:03; 01:05; 03:01, MCF-7 hFIB soluihin [19], [39], [40], [41], [42]. Kehitys aloittanut yhteistyön kulttuuri malleja on esitetty kuvassa 2.

Co-viljelmistä MCF-7 hFIB of suhde: 01:01 (A1-A5), 1:03 (B1-B5) , 01:05 (C1-C5), ja 03:01 (D1-D5). Monokulttuurien MCF-7 (E1-E5) ja hFIB (F1-F5), käytettiin kontrolleina. Alkuperäinen suurennus 100 ×.

Kautta analyysi Kuvion 2 on selvästi nähtävissä, että solut ovat kiinnittyneet ja kykenevät jäljellä yhdessä viljelemisen useita päiviä ilman irtoaminen tai epänormaalia solujen kuolemaan. Mielenkiintoista on, että co-viljelmissä, jotka oli perustettu enemmän fibroblasteja kuin rinta- syöpäsolujen (kuvio 2 B1-B5 ja C1-C5), MCF-7-soluissa on kehitetty hieman taipumus muodostaa agglomeraatteja ympäröivät fibroblasteissa. Tämä taajamassa on erityisen selvää 8 päivän kuluttua yhteistyön kulttuuri (kuva 3) ja se liittyy ilmiasun rintasyövän soluja, jotka järjestetään acinar rakenteisiin [43].

Co-viljelmistä MCF- 7 ja hFIB 01:01 (A, B) ja 1:05 (C, D). Alkuperäinen suurennos 100 x.

synteesi ja karakterisointi CH-H-R Monitoiminen Polymers

lisäys aminohappotähteiden kitosaanin selkärangan vahvistettiin

1H-NMR-spektroskopialla. Tulokset kuviossa 4 A ja B osoittavat, että läsnä on lisäksi protonin piikit δ≈1.5 ppm (-CH

2-, L-arginiini ja L-histidiini, numero 1) ja δ≈2.8-3.0 ppm (-CH

2NH-, L-arginiini, numero 2) verrattuna spektrien kitosaanin yksin. Signaalit, jotka vastaavat C

3-C

6 hiiltä kitosaanin naamioi liuotin huiput. Kitosaani anomeerinen hiilisignaalit välille saadaan δ≈4.6-4.9 (numero 7 ja 7 *) [44]. Protoni signaali δ≈1.9 ppm (numero 6) vastaa -CH

3 ryhmää, jotka liittyvät asetamido ryhmät kitosaanin [44]. Olemassaolo tunnusmerkit protoni piikin δ≈7.41 ppm (NHCH = NHNH

2, numero 3) määritetty guanidiinin funktionaalisen ryhmän [45] läsnä L-arginiini ehdottaa onnistunut sisällyttäminen tämän aminohapon. Lisäksi ulkonäkö tunnusmerkit protoni huiput L-histidiini imidatsolirenkaan δ≈8.0-8.5 ppm (N = CH-NH-, numero 5) osoittavat myös sen sisällyttämistä kitosaanipolymeerin. Histidiini esitellään myös protoni piikit δ≈7.1-7.2 ppm, jotka vastaavat H2 vety (HN-CH-C, numero 4) on imidatsolirenkaan. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä saatu ATR-FTIR-analyysi (kuva S2).

1H NMR -spektrit modifioimattoman CH (A) ja CH-H-R (B ja D). Zeta potentiaali (C) ja SEM-analyysi (D) CH-HR /pDNA nanohiukkasia, vastaavasti.

nanopartikkeliformulaatiossa ja fysikaalis-kemialliset karakterisointi

synteesi CH-HR /pDNA nanohiukkasten edistettiin perustamalla houkutteleva sähköstaattisten voimien välillä positiivisesti varautunut polymeerirungon ja negatiivisesti varautuneet pDNA biomolekyylien. Nanopartikkelikoko luonnehdinta dynaamisella valonsironta (DLS) paljasti, että nanodevices valmistetut tässä prosessissa on solukomponenttien koko nanomittakaavan alueella (kuvio 4C), arvokas ominaisuus, jos terapeuttiset sovellukset kuvitteli. SEM-analyysi osoitti myös, että hiukkaset aiheuttavat pallomainen kaltainen morfologia (kuvio 4D). Lisäksi analyysi zeta-potentiaali paljasti, että pintavarauksen nanohiukkasten on erittäin positiivinen ja alueella hiukkasen vakautta,

so.

Ei partikkelien aggregoitumista ei havaittu (kuvio 4 C ja D). Muuttaminen zeta-potentiaali nanohiukkasten ympäristön pH tutkittiin myös, jotta voidaan edelleen tukea hankintaan pH reagoiva toiminta, kun aminohappo-osien oksastettu omaksi kitosaani (kuva 5). Saadut tulokset osoittavat, että nanopartikkelit joilla on hyvä positiivinen varaus alueella lysosomaalisen pH (pH 5,0-6,0). Mielenkiintoista on, että korkeammissa pH, pinta vastaa nanohiukkasten pienenee, joka havainnollistaa deprotonoinnin primäärisiä kitosaanin ja positiivisesti varautuneet imidatsoli ryhmä histidiinin (kuvio 5).

Kaavioesitys zeta-potentiaalin lasku, kuten pH: n funktio. Tiedot esitetään keskiarvona ± sd

Effect of Cell Ratio tehokkuuteen Nanoparticle otto solun sisään

Kun olet vahvistanut onnistuneen synteesin nanoparticulated järjestelmiä ja että MCF-7-hFIB solut pysyi vakaana yhdessä viljelemisen, eri solusuhteilla sitten perustettu yhteistyössä kulttuuri, jonka tarkoituksena on tarjota alustan arvioida soluun oton tapahtumia monimuotoisen nanohiukkasten järjestelmä koostuu CH-HR ja pDNA. Soluunottoa nanohiukkasten alun perin tunnettu konfokaalimikroskopialla arvioida niiden solujen sisäistämisen kapasiteettia. Analyysi 3D jälleenrakentamiseen yhdessä viljelemisen mallit osoittavat, että nanocarriers ovat laajalti läsnä sytoplasmassa (kuvio 6). PDNA ladattu nanohiukkasia myös lokalisoitu solun tumassa kuin näyttelyssä kohtisuorassa viipaleiksi (kuvio 6 B, B1, B2, valkoiset nuolet) ja ydin- kohdat (kuva 6 C, valkoiset nuolet). Lisäksi rinnakkais- analyysi suoritettiin myös edelleen vahvistaa nämä havainnot. Kuten kuviossa 6 D (rinnakkais- kanavan – harmaa väri) on näkyvä rinnakkaispaikantumisen välillä RITC-leimatun nanocarriers ja solunsisäisen osaston (violetti nuoli). Lisäksi ydin- rinnakkaispaikantumisen kuvaa myös, että on olemassa nanocarriers ydinvoiman osastoon.

Konfokaalimikroskopia kuvia MCF-7-rintasyöpäsolujen 4 h inkubaation nanocarriers (A, B), ortogonaaliset leikkuu xy akselin (B1, B2), 3D jälleenrakentamiseen solun tumassa (C). Rinnakkaispaikantumisen Punaisen ja vihreän kanavat (D). Rinnakkaispaikantumisen Punaisen ja sinisen kanavan. Punainen kanava – RITC merkitty pDNA /CH-H-R; Vihreä kanava – Actin-GFP värjäys MCF-7 Blue Channel – Hoechst 33342® tumavärjäystä. Harmaa kanavat: rinnakkaispaikantumisen analyysi.

Nanolaitteen kohdistaminen kapasiteettia arvioitiin myös eri Yhdessä viljelemisen mallien konfokaalimikroskopiaa ja virtaussytometrialla leimaamalla pDNA läsnä nanopartikkelien RITC ja myös syöpäsolujen kanssa GFP aktiini-anturi. Tämän lähestymistavan kautta pystyimme erottamaan nanohiukkasten kertymä molemmissa solutyypeissä (kuvio 7). Analysoidaan eri CLSM kuvia, huomaamme että eri Yhdessä viljelemisen suhteet, nanohiukkasten sisäistäminen on selvästi suurempi MCF-7-solujen verrattuna hFIB (kuva 7). Itse asiassa, virtaussytometria analyysi vahvistaa havainnot CLSM kuvia. Kuvio 8 osoittaa, että CH-R-H /pDNA nanohiukkasten tulla ensisijaisesti MCF-7 syöpäsoluja, vuonna kustannuksella hFIB, kaikkien yhteistyössä kulttuurin suhde. Tämä havainto korostaa mahdollisen selektiivisyyden tämän järjestelmän kohti pahanlaatuisia soluja heterogeenisessä mikroympäristöihin. Lisäksi nanohiukkasten säänottokokeista in monocultured MCF-7-solut ja hFIB osoittavat, että nanocarriers ovat enemmän sisäistettyjä pahanlaatuisia soluja kuin normaaleissa soluissa (kuvio S4), korostaa entisestään saadut tulokset yhdessä viljelemisen kokeita.

Co-viljelmiä MCF-7 hFIB suhteissa ovat: 01:01 (A-C), 1:03 (D-F), 01:05 (G-I) ja 03:07 (J-L) 4 h inkubaation nanohiukkasia. Punainen kanava – RITC-leimattu pDNA /CH-H-R nanopartikkelit Vihreä kanava – Actin-GFP värjäys MCF-7; Blue Channel – Hoechst 33342® tumavärjäystä; Harmaa Channel: DIC; Fuusioitiin – päällekkäin kaikilla kanavilla.

edustaja dot tontit nanohiukkasten oton eri yhteistyössä kulttuuri suhteet (A-D). R2 kvadrantin käytettiin portti histogrammin analyysiä. Edustavia histogrammit nanohiukkasten oton MCF-7-solut (E-H) ja hFIB (I-L) populaatioissa eri yhdessä viljelemisen suhteet 4 h inkubaation RITC-leimatun pDNA /CH-HR nanohiukkasia.

keskustelu

tällä hetkellä tarvetta parantaa tehokkuutta syövän hoitomuotoja on kannustanut kehittämään taitavia nanokokoluokan jakelujärjestelmiä, jotka pystyvät vähentämään paikallista ja systeemisiä sivuvaikutuksia tavanomaisten kemoterapeuttisten [8]. Nämä nanodevices hallussaan joukon ainutlaatuisia ominaisuuksia, jotka parantavat ja farmakodynaamisen profiilin bioaktiivisten molekyylien, kasvaa niiden biologinen kohteisiinsa [6]. Oikeastaan ​​koska niiden monipuolisuus, nanocarriers voidaan muokata selektiivisesti tunnistamaan kohdistaa kasvainsoluja ja kiertää alkureitin metabolia, fagosytoosin tai nopea verestä, vähentäen todennäköisyyttä off-tavoite tapahtumat [3]. Lisäksi kun sijaittava soluosastoon, nanocarriers suojella lastia luonnon lääkeresistenssideterminantit mekanismeja kasvainsolujen, kuten riippuvaisia ​​ABC kuljettajat, ja myös ohjata terapeuttisia molekyylejä niiden solunsisäisen tavoitteita [46]. Kaikki nämä keskeiset ominaisuudet riippuvat suuresti eri vaiheissa nanocarrier suunnittelu ja kokoonpano. Siksi sopiva arvioinnin aikana nanohiukkasten kehitysprosessi on ratkaisevan tärkeää sen onnistunut soveltaminen

in vivo.

Itse arviointi romaani jakelujärjestelmiä on perusteellisesti suoritettava estämiseksi mahdollisten terveysriskien riskit ja tunnistaa optimaaliset ominaisuudet [9]. Yleensä prekliininen arviointi biologisen suorituskyvyn nanolaitteen suoritetaan sekä

in vitro

käyttäen soluviljelmissä, ja

in vivo,

kanssa eläinmalleissa. Kuitenkin nykyinen kysyntä vähentää eläinkokeita johtuen niihin liittyviä eettisiä ja taloudellisia kysymyksiä on kannustanut kehittämään vaihtoehtoisia lähestymistapoja, kuten soluviljelmissä. Kuitenkin päästäkseen koko potentiaalin soluviljelymalleissa ja saada enemmän realistisia tuloksia, ero yksinkertaisen soluviljelmissä ja

in vivo

kudoksissa on vähennettävä. Siksi kehittää uusia malleja, jotka perustuvat yhteistyöhön kulttuureissa on tuonut esiin mahdollisuuden matkia tuumorikudoksista siten, että fysiologinen ympäristö löytyy

in vivo

voidaan monistaa

in vitro

. Testaus nanocarrier ehdokkaita näiden samanaikaisesti kulttuureissa järjestelmät, antaa tarkempia tuloksia, koska nämä jäljentää syövän etenemiseen, lääkeresistenssin ja myös solu-solu viestintä [47]. Kaikki nämä tapahtumat lopulta vaikuttaa biologiseen suorituskykyyn tietyn nanocarrier ja sen ladattu bioaktiivisten molekyylien.

Näin ollen se tulee arvokasta luonnehtia nanohiukkasten soluunottoa yhteistyössä kulttuuri malleja arvioida niiden kohdistaminen spesifisyys. Siitä huolimatta, koska toiminta nanohiukkasten voisi muuttaa ominaisuuksien mukaan kasvaimen mikroympäristöihin, arvioimalla eri olosuhteissa on ratkaiseva vaatimus prekliinisen kehityksen. Tämän analyysin toimintaa funktionalisoidun nanohiukkasia vastaan ​​pahanlaatuisia soluja voidaan sitten virittää riippuen kasvaimen kapealla ja sen ympärillä normaalit solut. Sillä, että siitä tulee tärkeää kehittää erilaisia ​​yhdessä viljelemisen malleja, jotka toistavat dynaamisissa ympäristöissä. Siten tässä kitosaani funktionalisoidun nanohiukkasten testattiin yhteistyössä kulttuureissa eri pahanlaatuinen-to-normaalin solun suhteet. Suorittaa nämä määritykset, eri suhteissa hFIB ja rintasyöpäsolujen (MCF-7) käytettiin. Nämä mallit olivat määritettiin ottamalla huomioon aikaisempien raporttien missä nämä erityisesti solujen suhdeluvut käytettiin jäljittelemällä syövän ympäristöissä [19], [39], [40], [41], [42]. Kuvio 2 esittää korkean lisääntymisnopeus molempien solutyyppien, jossa ei ole epänormaalia solujen kuoleman, kun niiden monokulttuuriin kanssa. Lisäksi, tulokset on esitetty kuviossa 2 vahvistavat hyvän vuorovaikutukset MCF-7 rintasyöpäsolujen ja hFIB, ja näin ollen onnistunut Näiden sekä yhdessä viljelemisen malleja.

osalta solun morfologiaa, optinen kuvat (kuvio 2 ) osoittavat, että molemmat solutyypit säilyttävät fenotyyppisen ominaisuuden. Syöpäsolut säilyttivät epiteelin morfologian, jossa monikulmion [48], [49].