Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

transkriptiotekijä Snail1 indusoi epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), prosessi vastuullinen hankintaan invasiivisuus aikana tuumorigeneesin. Useat transcriptomic tutkimuksissa on raportoitu Snail1-geenien eri solutyypeissä, ja monet niistä liittyi solun tarttumiseen. Kuitenkin vain harvat tutkimukset ovat käyttäneet proteomiikka välineenä luonnehdinta proteiinien välittävien EMT.

Menetelmät /Principal Havainnot

tunnistetaan proteomiikka-analyysi käyttämällä 2D-DIGE elektroforeesi yhdistettynä MALDI- TOF-TOF ja ESI-lineaariset ioniloukku massaspektrometria useita proteiinien useita toimintoja, joiden ilmentymistä moduloidaan Snail1 in SW480-ADH ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Validointi suoritettiin Western blot ja immunofluoresenssimenetelmällä analyysejä. Snail1 tukahdutettu useat jäsenet 14-3-3 perheen fosfoseriini /fosfotreoniini sitovia proteiineja ja myös ilmaus leviämisen liittyvä proteiini 2G4 (PA2G4), joka oli pääasiassa paikallistaa ydin- Cajal elimissä. Sitä vastoin ilmaisu kahden proteiineja, jotka liittyvät RNA: n käsittelyyn, lohkaisu ja polyadenylaation spesifisyys tekijä alayksikön 6 (CPSF6) ja jatkaminen tekijä proliini /glutamiini-rikas (SFPQ), oli suurempi Snail1 ilmentäviä soluja kuin kontrolleilla. Sääntely 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ ja PA2G4 mukaan Snail1 toistettiin HT29 koolonkarsinoomasoluissa. Lisäksi löysimme käänteinen korrelaatio 14-3-3σ ja Snail1 ilmentymistä ihmisen Kolorektaalituumorien.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme tunnistaneet joukon uusia Snail1 kohde- proteiinien paksusuolensyöpä jotka laajentavat soluprosesseihin vaikuttavat Snail1 ja siten sen merkitys solujen toimintaa ja fenotyypin.

Citation: Larriba MJ, Casado-Vela J, Pendás-Franco N, Peña R, García de Herreros A, Berciano MT, et ai. (2010) Novel Snail1 Target proteiinit Human Colon Cancer Merkitty proteomiikan Analysis. PLoS ONE 5 (4): e10221. doi: 10,1371 /journal.pone.0010221

Editor: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Espanja

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2010 Hyväksytty: 26 maaliskuu 2010; Julkaistu: 20 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Larriba et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ministerio de Ciencia e Innovación Espanjan (SAF2007-60341, BIO2006-07689, ISCIII-retic RD06 /0020/0009 ja RD06 /0020/0040), Comunidad de Madrid (S-GEN-0266/2006) ja Euroopan unioni (MRTN-CT-2005-019496, NucSys). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

transkriptiotekijä Snail1 säätelee biologian fibroblastien ja sen säätelyyn ylöspäin epiteelisolujen aiheuttaa muutoksen mesenchymatic fenotyyppi, prosessi tunnetaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT). Tämä on transdifferentiation muutos, joka epiteelisoluissa menettää tarttuvuuden ja polariteetin ja hankkia karan morfologia ja muuttavat kykyä ominaisuus fibroblastien seurauksena jyrkästi muutoksen geenin ilmentymisen profiili [1], [2]. EMT pelaa tärkeitä fysiologisia rooleja alkionkehityksen aikana ja haavan paranemista, ja on erittäin tärkeää myös hankintaan kasvainten invasiivisuus, ensimmäinen vaihe metastaattisen kaskadin syövän [1], [2].

Snail1 näyttää olevan master rooli EMT, vaikka useat muut tekijät, kuten Snail2 (Slug), Zeb1 (δEF1), Zeb2 (Sip1), Twist1, E47 ja E2-2 tiedetään myös aiheuttaa tai edistää EMT erityyppisissä soluissa [2 ], [3]. Nämä tekijät edistävät osittain erilaiset geeniekspressioprofiilien että on yhteistä tukahduttaminen geenejä, jotka koodaavat adheesioproteiineja (E-kadheriinin, Occludin ja useat claudins) ja induktion mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinista, fibronektiinin, ja proteaasien ja tekijöitä, jotka edistävät solujen liikkumista [ ,,,0],3], [4]. Snail1 oli ensimmäinen tunnettu repressori hyökkäyksen estävä geeni

CDH1

joka koodaa ratkaisevaa tarttuvuus proteiinin E-kadheriinin [5], [6]. Lisäksi, Snail1 on hiljattain osoitettu aktivoivan Wnt /β-kateniinin signalointi ja Nuclear tekijä

kappa

B aktiivisuus [7], [8], ja se kumoaa eston Wnt /β-kateniinin reitin aiheuttamien Kasvaimien yhdiste 1α, 25-dihydroksi-D

3 [9].

Snail1 ylössäädellään useissa ihmisen syövissä ja liittyy usein invasiivisuus, etäpesäkkeitä ja huono ennuste [3]. Snail1 RNA ei ole havaittavissa normaalissa paksusuolen limakalvossa, mutta se tulee säädellään ylöspäin 60-70% paksusuolen syövistä [10] – [12]. Tuore tutkimus on osoittanut, että Snail1 proteiini ilmentyy 79% paksusuolen kasvaimista, yleensä kasvain-strooman interphase. Snail1 löytyy sekä epiteelin kasvainkudoksen ja viereisen strooman 56% paksusuolen kasvaimista, kun taas 21%: ssa tapauksista se on läsnä vain stroomasoluissa kanssa fibroblastisella fenotyyppi [13].

Useat tutkimukset ovat keskittyneet transcriptomic analyysi EMT edistetään Snail1 ja muiden transkriptiotekijöiden, tai geenien tai aineita, kuten onkogeenisia Ras tai transformoiva kasvutekijä β, joka indusoi niitä [4], [14] – [17]. Kuitenkin vain harvat tutkimukset ovat käyttäneet proteomiikka välineenä luonnehdinta proteiinien välittämisessä EMT [18]. Suurin osa näistä tutkimuksista on käyttää 2D-PAGE: MALDI-TOF-massaspektrometrialla proteiinien tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmaistut kasvainkudoksissa ja /tai solulinjat [18] – [20]. Muutamat tutkimukset ovat käyttäneet iTRAQ tekniikka seurasi 2D-LC peptidien erotteluun ja massaspektrometriaa [18], [21], [22]. Tässä olemme käyttäneet 2D-DIGE tekniikka seuraa MALDI-TOF-TOF ja ESI-lineaariset ioni ansa massaspektrometrialla. Näiden tekniikoiden on herkempi ja luotettava lähestymistapa tunnistamiseksi pienistä eroista proteiinin ilmentymisen välillä ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, joilla on alhainen tai korkea Snail1. Nämä tekniikat ovat antaneet meille mahdollisuuden ottaa syvällisemmin proteomic muutokset liittyvät Snail1 yli-ilmentymisen. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet useita proteiineja aiemmin tuntemattomia Snail1 tavoitteet ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Jotkut heistä ovat mukana valvontaan solun geenien ilmentyminen ja fenotyypin, ja on todennäköistä välittäjiä kasvaimia toiminnan Snail1.

Tulokset

Useimmat geenejä aikaisemmin luonnehdittu säädellään Snail1 koodata solukalvon proteiinit, jotka osallistuvat solun tarttumiseen tai solun tukirangan komponentteja. Laajentaa tietämystä Snail1 vaikutuksia ihmisen paksusuolen syöpä, käytimme integroiva strategia tunnistaa tumaproteiinien säätelee Snail1 tässä neoplasia (kuvio 1A). Käytimme 2D-DIGE elektroforeesi yhdessä MALDI-TOF-TOF ja ESI-lineaarinen ioniloukku massaspektrometria vertaamaan mallia olevien proteiinien tumauutteista ihmisen paksusuolen syövän SW480-ADH-solut ekspressoivat retroviruksella transdusoitujen Snail1 cDNA (Snail1 solut) kanssa, mock-tartunnan saaneiden solujen (Mock-solut). Osajoukko tunnistetuista proteiineista validoitiin Western blot ja immunofluoresenssimenetelmällä analyysit ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, ja immunohistokemiallisesti ihmisen paksusuolen syövän koepaloja. Olemme aiemmin tunnettu matkapuhelinverkon mallia käytettiin tässä tutkimuksessa [7], [10] ja totesi, että Snail1 yli-ilmentyminen edisti hankinta enemmän stellate solumorfologiaan (kuvio 1 B), tukahduttaminen epiteelin merkkiaineiden E-kadheriinin, Occludin ja Claudin -7, ja induktio mesenkymaalisten proteiinin Lef-1 (kuvio 1C).

(A) Kaavio työnkulun myös tässä tutkimuksessa. (B) edustaja faasikontrasti- micrographs (ylempi paneeli) ja konfokaali laser immunofluoresenssilla kuvat osoittavat F-aktiinivärjäyksen (alempi paneelit) ja SW480-ADH Mock ja Snail1 soluja. Mittakaava, 20 um (ylempi paneeli) ja 10 um (alempi paneeli). (C) Western blot -analyysi kokosolu-uutteet SW480-ADH Mock ja Snail1 solut osoittavat Snail1 yli-ilmentymisen ja sen vaikutus ekspressioon epiteelin (E-kadheriinin, Occludin ja Claudin-7) ja mesenkymaaliset (Lef-1) markkerit. β-Tubulin käytettiin latauskontrollina.

Differential proteiinin ilmentymisen analyysi ydinvoiman fraktioiden ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa suuri tai pieni Snail1 ilmaisu

Nuclear otteita SW480-ADH Mock ja Snail1 solut analysoitiin 2D-DIGE, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Proteiini kuvio muuttuu kvantitatiivisesti ja tilastollisesti analysoitiin käyttämällä DeCyder ohjelmiston v.6.5 harkitsee 12 paikalla karttoja mukana tutkimuksessa. Kuviossa 2 on esitetty tyypillinen 2D-kartta ydin- SW480-ADH-proteiinien. Kukin geeli analysoitiin erikseen laskea määrän suhdelukua yksittäisten näytteiden ja sisäisen allas, jota käytettiin standardireferenssiliuos. Sitten kaikki kuvat yhdistettiin ja analysoitiin toisiinsa käyttämällä BVA moduulia. Harvat vaihtelut proteiinia runsaasti ei havaittu Mock ja Snail1 soluja. Laitepari

t

-testi käytettiin valita 22 täplät, joiden ilmentymistä vaihtelu molempien solutyyppien oli tilastollisesti merkitsevä (Opiskelijan

t

-testi,

p

0,05) . Nämä paikat valittiin paikkoja kiinnostusta ja selityksin master geelillä (kuva 2). Proteiini tunnistus suoritettiin kahdella menetelmällä: (1) peptidi massa sormenjälkien avulla MALDI-TOF-TOF ja (2) ESI-lineaarinen ioniloukku ja MS /MS peptidisekvensoinnilla (soveltamalla rajoittavaa väärä positiivinen löytö määrä (FDR) cut-off, FDR≤1%). Molemmissa tapauksissa tunnistaminen on enemmän kuin yksi peptidi oli vaadittu. Käyttämällä tätä kaksinkertaista lähestymistapaa, 19 proteiinit tunnistettiin 17 ulos 22 paikkoja (taulukko 1). Vain viisi proteiinit tunnistettiin MALDI-TOF-TOF johtuen alhainen ilmaisun. Kahdeksantoista proteiinit tunnistettiin ESI-lineaarinen ioniloukku, jossa kaksi täplää, jotka sisältävät useamman kuin yhden proteiinin. Näissä tapauksissa proteiinit luetellaan lukumäärän mukaan tunnistettujen peptidien. Neljä proteiinit tunnistettiin molemmat tekniikoilla (taulukko 1).

Nuclear otteita SW480-ADH Mock ja Snail1 solut differentiaalisesti leimattu Cy3 ja Cy5 väriaineita. Sisäistä standardia yhdistämällä proteiinien sekä otteet oli kaikissa geelit jälkeen leimaamalla kanssa Cy 2 väriainetta. 3-10 NL IPG liuskoja käytettiin IEF ja standardi SDS-PAGE toisessa ulottuvuudessa. Edustavia 2D kuvassa kohdekartalle vastaa sisäistä standardia, joka on yhteinen kaikille geelit analysoitiin. Täplät nuolilla olivat informatiivisia proteiinin tunnistamiseen massaspektrometrialla (katso taulukko 1 koodimääritysten). Valitut kohteet osoitti tilastollista vaihtelua tilavuussuhteista sisällä 95. luotettavuustasolla (Opiskelijan

t

-testi,

p

0,05).

proteiini ontologian analyysi tunnistettu proteiinien

Niiden proteiinien muuttaa Snail1 yli-ilmentyminen tunnistimme α-kateniinin (CTNNA1), PI3K sääntelyn alayksikköä α (PIK3R1), Caldesmon (CALD1), katkaisukohdassa ja polyadenylaation spesifisyys tekijä alayksikön 6 (CPSF6), ja vimentiinistä (VIM) kuin voimistunut proteiinit; ja leviämisen liittyvä proteiini 2G4 (PA2G4, joka tunnetaan myös nimellä ErbB3-proteiiniin sitoutuvan proteiinin 1 tai EBP1), Ran-specific GTPaasi-aktivoitua proteiini (RANBP1), ja useat jäsenet 14-3-3-proteiinin perheen (YWHAE, YWHAH ja YWHAQ ) joukossa vaimentua proteiineja (Taulukko 1). Huolimatta kanssa tumaekstrakteilla, vain 7 ulos 19 proteiinien osoitettiin ydinvoiman osastoon (CPSF6, WTAP, ENO1, PA2G4, HNRNPH3, RANBP1 ja PPIA), loput olivat ensisijaisesti soluliman tai liittyvät solun tukirangan. Emme kuitenkaan voi hävitä, että jälkimmäinen proteiinit olivat osittain tai tilapäisesti läsnä ydin- osastoon. Mitä biologinen toiminta, useat proteiinit liittyi solun tarttumiseen (CTNNA1) tai komponentteja solun tukirangan (CALD1, VIM ja LASP1). Kuitenkin suurin osa proteiinit osallisena signaalitransduktiossa (PI3KR1, RANBP1 ja 14-3-3-perheen jäseniä) ja RNA: n käsittely (CPSF6, WTAP ja HNRNPH3) (taulukko 1). Jotkut näistä proteiineista valittiin validointi. Ottaen huomioon korkea homologia nykyisten joukossa 14-3-3-proteiinien välillä joidenkin tunnistettujen peptidien (eli -VISSIEQK- varten 14-3-3τ ja -VLSSIEQK- varten 14-3-3σ, mikä tekee niistä lähes mahdoton), me päätti sisällyttää kaikki perheenjäsenet validoinnissa analysoidaan.

validointi ehdokas kohdeproteiinien

kvantitatiivinen arvio ilmaus ehdokas kohde proteiinit SW480-ADH Mock ja Snail1 solut, analysoitiin Western blot kolmen valmistettiin tumauutteet itsenäisesti (N1, N2, N3). Lisäksi, sytosolin otteita yksi kokeissa (C1) sisällytettiin analyysiin (kuvio 3A). Variable downregulation (20%: sta 70%) 14-3-3 β, ε, σ, τ ja ζ proteiinit havaittiin tumassa Snail1 soluja. Niille kaikille paitsi 14-3-3σ vaimennussäätely oli heikompi sytosoliin kuin tumassa (kuvio 3A). Olemme pystyneet havaitsemaan 14-3-3η ilmentymistä ei tumassa eikä sytosoliin, kun taas on 14-3-3γ ei vaikuttanut Snail1 yli-ilmentyminen (dataa ei esitetty). PA2G4 ilmentyminen oli myös pienempi sekä tumassa ja sytosoliin SW480-ADH Snail1 kuin Mock-soluissa (kuvio 3A).

(A) Western blot -analyysi ilmentymisen valittujen proteiinien sytosolinen (C) ja ydin- ( N) uutteita SW480-ADH Mock ja Snail1 soluja. HNRNPH3 isoformit (1-4) on merkitty. Numerot alla geelit osoittavat määrällisen muutoksen ilmaisun välillä Snail1 ja Mock solujen jälkeen normalisoinnin p-Tubulin tai Lamin B (soluliman ja ydinvalvonnasta, vastaavasti). Tilastollinen merkitys ydin- ilmentyminen muuttuu edistetään Snail1 arvioitiin kaksisuuntaisella parittomalla Studentin

t

-testi. Se oli

p

0,001 14-3-3ε, 14-3-3σ, 14-3-3ζ, CPSF6 ja isoformit 3 ja 4 HNRNPH3;

p

0,01 14-3-3τ; ja

p

0,05 14-3-3β ja PA2G4. Sääntely SFPQ (

p

= 0,057), ja että isoformien 1 + 2 HNRNPH3 (

p

= 0,058) eivät saavuttaneet tilastollista merkitsevyyttä, mutta selvä suuntaus havaittiin. (B) Western blot analyysi ilmentymisen valittujen proteiinien sytosolinen (C) ja ydin (N) murto-HT29 Mock ja Snail1 soluja. Numerot alla geelit osoittavat määrällisen muutoksen ilmaisun välillä Snail1 ja Mock solujen jälkeen normalisoinnin p-Tubulin tai Lamin B (soluliman ja ydinvalvonnasta, vastaavasti). (C) Kvantitatiivinen RT-PCR tutkimus PA2G4 ilmentymisen SW480-ADH ja HT29 Mock ja Snail1 soluja. 18S rRNA ilmaisua käytettiin normalisointia. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin kaksisuuntaisella parittomalla Studentin

t

-testi, yksi tähti osoittaa

p

0,05.

Sen sijaan taso CPSF6 oli suurempi Snail1 soluissa kuin Mock-soluissa (kuvio 3A). Olemme myös analysoineet ilmaus Jatkaminen tekijä proliini /glutamiini-rikas (SFPQ), proteiini 1,59-kertainen voimistussäädellään Proteomiikan analyysiin, mutta puuttuu taulukosta 1, koska se tunnistettiin vain yksi peptidi spot 609. Teimme niin koska molemmat SFPQ ja CPSF6 osallistuvat pre-mRNA: n prosessointi ja lokalisoitu ydin- paraspeckles [23], mikä viittaa mahdolliseen koordinoitu vaikutus Snail1. Todellakin, huomasimme, että Snail1 lisääntynyt ydinvoiman SFPQ ilmaisun ja myös alhainen SFPQ havaittu sytosoliin (kuvio 3A).

sääntelyä Snail1 oli monimutkainen tapauksessa heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiinin H3 (HNRNPH3) , joka esittelee useita isoformeja vaihtoehtoisista silmukointi [24]. Käytetyt peptidit Proteomiikan tutkimuksessa tunnistaa HNRNPH3 osoittaa, että vaimentua paikalla voi vain vastata isoformit 1, 2 tai 3. analyysi Western blot osoitti, että ilmentyminen isoformien 1 ja 2 (ennustettu MW 36,9 ja 35,2 kDa, vastaavasti) oli voimistuvan Snail1, kun taas isoformien 3 ja 4 (ennustettu MW 31,5 ja 22,3 kDa, vastaavasti) oli voimakkaasti vaimentua sekä tumassa ja sytosoliin Snail1 soluja (kuvio 3A). Siksi proteiinin yksilöity proteomiikka analyysin on oltava isoformin 3 HNRNPH3.

tukahduttaminen 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ ja PA2G4 mukaan Snail1 vuonna tumaekstrakteilla oli toistetaan kahdessa riippumattomassa kokeessa toisen ihmisen paksusuolen syövän solulinja, HT29 (kuvio 3B). Lisäksi, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti alentunut taso PA2G4 RNA sekä SW480-ADH ja HT29-soluja, jotka ilmentävät Snail1 verrattuna niiden Mock-solut (kuvio 3C).

Subsellulaariset jakelu Snail1 kohdeproteiinien

ilmentymistä joidenkin Snail1 kohdeproteiinien validoitu Western blot tutkittiin edelleen immunofluoresenssimenetelmällä ja konfokaalimikroskopialla analyysejä. Kuten kuviossa 4 on esitetty, taso 14-3-3 β, ε ja σ oli paljon pienempi sekä tumassa ja sytosoliin SW480-ADH Snail1 soluissa kuin Mock-soluissa. Kaikissa kolmessa tapauksessa ilmaisu oli korkeampi sytosoliin kuin tumassa, jossa on muuttuva suhde: β σ ε. Immunofluoresenssianalyysi myös vähensi sekä ydin- ja soluliman ilmentyminen PA2G4 in Snail1 soluissa verrattuna Mock-solut (kuvio 5A). Ilmentyminen PA2G4 oli hieno pistemäinen kuvio sekä tumassa ja sytosoliin, ja oli erityisen voimakasta muutama kierros ja terävät ydin- pesäkkeitä noin 0,5 um (kuvio 5). Kaksoisvärjäys käyttäen vasta-aineita Coilin (merkkiaine Cajal elimet), TMG-korkki spliceosomal snRNAs (markkeri Cajal elinten ja ydinvoiman pilkut liitos tekijät), Fibrillarin (markkeri nucleolus) ja PML (markkeri PML elimet) osoitti, että PA2G4-positiivisia ydin- pesäkkeitä vastaavat Cajalin elimet (kuvio 5B). Tämä tulos vahvistettiin neuronien (tuloksia ei ole esitetty), solutyyppi, jossa Cajalin elimet ovat merkittävimpiä [25]. Paras ymmärretty tehtävänä Cajal elinten on biogeneesin pienten ydin- ja nucleolar RNP (snRNP: eille, snoRNPs) osallistuu pre-mRNA ja pre-rRNA käsittely, vastaavasti [25], [26]. Kaksinkertainen värjäys osoittivat myös heikko värjäytyminen PA2G4 on nucleolus (katso kuvio 5B, PA2G4 ja Fibrillarin co-värjäys), sellaisena kuin se on kuvattu aiemmin [27].

edustajan konfokaalimikroskopialla kuvia, joissa esitetään ja lokalisointi 14-3-3 β, ε ja σ (punainen) in SW480-ADH Mock ja Snail1 soluja. GFP: n ilmentymisen (vihreä) oli muuttamattomana Snail1, ja sitä käytettiin kontrollina. Asteikko bar, 10 pm.

(A) edustaja konfokaalimikroskopia kuvat osoittavat ilmentymisen ja lokalisaation PA2G4 (punainen) in SW480-ADH Mock ja Snail1 soluja. GFP: n ilmentymisen (vihreä) oli muuttamattomana Snail1, ja sitä käytettiin kontrollina. Mittakaava, 5 um. (B) edustaja konfokaalimikroskopia kuvat osoittavat kaksinkertainen immunoleimaus varten PA2G4 (punainen) ja molekyylimarkkereina (sininen) of Cajal elimet (Coilin), Cajal elimet ja ydinvoiman pilkut liitos tekijöiden (TMG-cap), nucleolus (Fibrillarin), ja PML elimet (PML) in SW480-ADH Mock soluissa. Vaaleanpunainen väri yhdistämisen kuvat voidaan päätellä, että rinnakkaispaikantumisen. Mittakaava, 5 um.

analyysi ihmisen paksusuolen kasvaimista

tukahduttaminen useita 14-3-3 perheenjäsenten kasvaimeen liittyvää transkriptiotekijä kuin Snail1 sai meidät tutkimaan ekspression näiden proteiinien ihmisen paksusuolen syöpä. Koska 14-3-3σ oli jäsen, joka ilmentyminen voimakkaammin tukahdutettu Snail1 sekä tumassa ja sytosoliin, valitsimme sen tutkimus ihmisnäytteillä. Ensin analysoimme 14-3-3σ ilmentymistä immunohistokemiallisesti kudoksessa array sisältävät pariksi normaalin ja kasvaimen näytteitä 46 peräsuolen syöpäpotilaiden ja totesi, että 14-3-3σ oli erittäin ilmaisseet sekä normaali- ja kasvaimen epiteelisolujen muttei strooman solut (kuvio 6A). Koska tämä ilmaus mallia 14-3-3σ oli johdonmukaista sen tukahduttamisen indusoi EMT kuten meille Snail1, päätimme tehdä tarkempi tutkimus 14-3-3σ ja Snail1 ilmaisun peräkkäisen viipaletta viisi paksusuolen kasvainbiopsioissa. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [13], me lähinnä löytyy Snail1 immunoreaktiivisuus tumassa solujen mesenkymaalisten fenotyypin sisällä kasvain (kuvio 6B). Nämä solut voivat vastata kasvaimen epiteelisolujen, jotka ovat läpikäyneet EMT ja /tai fibroblastit, jotka on aktivoitu kasvaimen mikroympäris- [13]. Näin saatujen tulosten kanssa kudoksesta array, 14-3-3σ on ilmaistu sekä tumassa ja sytosoliin kasvaimen epiteelisolujen, mutta se oli poissa stroomasoluissa (kuvio 6B). Siksi 14-3-3σ ja Snail1 on vastakkainen ekspressiokuvioiden (epiteelin ja strooman, vastaavasti) paksusuolen syöpä. Lisäksi, 14-3-3σ ilmaisu muistuttaa läheisesti kuin Snail1 kohdegeenin

CDH1

/E-kadheriinin ja, kuten on ehdotettu tämän geenin, on mahdollista, että Snail1 tukahduttaa 14-3-3σ ilmentymisen mesenkymaaliset soluja.

(A) immunohistokemia kuvat osoittavat 14-3-3σ ilmentymistä edustava normaalin ja kasvaimen paksusuolen näytteitä 46 analysoidaan kudoksen array. Palkit osoittavat suurennus. Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä. (B) immunohistokemia kuvat osoittavat 14-3-3σ ja Snail1 ilmaisun kahtena peräkkäisenä viipaletta edustavan paksusuolensyöpä kasvain viiden analysoitu. Palkit osoittavat suurennus. Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä. Oikea paneelit ovat 3X-suurennos alueen ilmoitettu vasemmassa paneelit.

Keskustelu

tunnistaminen proteiinien säätelee Snail1 laajentaa nykyisten tietojen biologiaa tämän transkriptiotekijän ja tuo uutta valo mekanismeja EMT ja syövän etenemistä. Valitsimme paksusuolensyöpä kuin toimiva järjestelmä, koska Snail1 ylössäädellään sekä RNA ja proteiini tasolla tällä neoplasian ja edistää sen malignization [10] – [13]. Aiemmin geeniekspressioprofiilien aiheuttama Snail1 eri järjestelmissä oli tutkittu transcriptomic analyysit, ja useimmat Snail1 kohdegeenien tunnistettujen koodattu osallistuvien proteiinien soluadheesiota, soluväliaineen ja solun tukirangan [4], [15], [28] . Tässä tutkimuksessa, teimme proteomiikka analyysi tumauutteiden tavoitteena oli tunnistaa uusia proteiineja säätelee Snail1 että voisi välittää sen laaja vaikutukset solujen fysiologiaa ja fenotyypin.

Tutkimuksemme osoittaa huomattavaa säilyttäminen globaalissa rakenteessa ydin- -proteiinin ilmentymistä ihmisen paksusuolen syövän soluja, jotka ilmentävät korkeita tai matalia tasoja Snail1. Silti sarja aiemmin tuntemattomia Snail1 säädelty sekaantuneita proteiineja erilaisissa solujen toiminnalle on tunnistettu. Kaksikymmentäkaksi täplät löydettiin merkittävästi vapautettu kummankin solutyyppien kanssa

p

0,05 (Opiskelijan

t

-testi). Yhdeksäntoista eri proteiineja tunnistettiin, useimmat käyttämällä ESI-lineaarinen ioni ansa väline yhdessä nano-HPLC. Vain viisi proteiinit tunnistettiin MALDI-TOF-TOF, luultavasti johtuen matalan proteiinien ekspression läsnä paikkoja. Kaksi täplät (1419 ja 1926) sisälsi useampia proteiinia. Kuitenkin spot 1419, vimentiinistä oli huomattavasti runsaampaa (määrän perusteella tunnistettujen peptidien) kuin muut proteiinit ja me sille eroja ilmaisua. Spot 1926 tunnistautuneena peptidien oli melko samanlainen LASP1 ja HNRNPH3, mikä vaikeuttaa luovuttamista tasauspyörästön ilmaisun.

tulokset yhtyä transkription repressori rooli Snail1, kuten 12 ulos 17 täplien tunnistettu proteiinien ilmentymistä oli alhaisempi Snail1 ilmentäviä soluja kuin Mock soluissa, kun taas vain viidessä niistä ilmaisun oli korkeampi Snail1 soluissa. Tukahduttaminen on vaimentua proteiineista voisi olla välitön vaikutus Snail1, varsinkin kun on kyse PA2G4 jonka RNA taso vähensi myös Snail1. Sitä vastoin, induktio-proteiinin ilmentymisen Snail1 on epäsuora, välittävät muut transkriptiotekijät, kuten se on raportoitu matriksimetalloproteaaseja 2 ja 9 [29], [30]. Lisäksi olemme havainneet, että Snail1 muuttaa silmukoinnin HNRNPH3 in SW480-ADH soluissa. Tämä on linjassa tutkimuksissa kuvataan, että Snail1 muuttaa rakenteessa silmukoinnin p120-kateniinin ja

Zonula occludens

-1 by tuntemattomia mekanismeja [31], [32].

suostumuksella edellinen transcriptomic tutkimukset, me osoitamme tässä, että Snail1 muuttaa proteiinien ilmentymisen liittyi solun tarttumiseen ja solun tukirangan (CTNNA1, CALD1, VIM ja LASP1). Lisäksi ja tietojemme ensimmäistä kertaa, me raportoimme että Snail1 säätelee proteiinien mukana muissa solutoiminnoille RNA kypsymisen (CPSF6, HNRNPH3 ja SFPQ) ja solunsisäinen signalointi (PI3KR1, RANBP1 ja 14-3-3-proteiinin perhe). Lähes yleinen tukahduttava vaikutus Snail1 ilmentymistä koskevat 14-3-3 perheenjäsenten on yllättävä ja yhtyy äskettäin ehdottanut syöpää suojaava rooli tiettyjen näiden proteiinien [33], [34]. 14-3-3 proteiinit ovat jo pitkään tunnettu fosfoseriini /fosfotreoniini sitovia proteiineja kykenee sitomaan ja moduloivat vuorovaikutusta proteiinien ja osallistuvat solujen prosesseissa signalointi, solusyklikontrollin, apoptoosin, solunsisäistä kuljetusta, solun tukirangan rakennetta ja transkriptio [34 ], [35]. Vasta viime vuosina useita 14-3-3 perheenjäseniä on yhdistetty erilaisia ​​syövän prosesseja. Vaikka 14-3-3σ on ehdotettu kasvainsuppressorigeenin, joka on vaimennettu tai inaktivoidaan aikana etenemisen melanooma ja rintasyöpä, mahalaukun, hepatosellulaarinen, munasarja- ja levyepiteelikarsinoomien [33], [36] – [40]; on havaittu yli-ilmentynyt haimasyövän [41]. Lisäksi proteomiikka-analyysi osoitti, että 14-3-3σ ilmentyminen säädeltiin invasiivisten siirtymäkauden solukarsinoomat virtsarakon olevien EMT [19]. Tämä on yhtäpitävä tietomme ihmisen paksusuolen syövän koepaloja, jotka osoittavat vastakkaiseen ekspressiokuviota 14-3-3σ ja Snail1. Erityisesti 14-3-3 ε, ζ ja η voivat muodostaa kolmen komponentin kompleksin Chibby ja β-kateniinin helpottaa tumasta β-kateniinin, siten antagonisoivaa skription toimintaa, joka on tärkeä tekijä paksusuolen syöpä [42]. Päinvastoin, 14-3-3ζ yhteistyötä ErbB2 edistää EMT ja etenemisen ductal rintakarsinoomista on kohdunkaulan syöpä [43], ja sen yliekspressio kumppaniaan rintasyövän uusiutumisen [44]. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet 14-3-3 β, ε, σ, τ ja ζ kuin vaimentua jälkeen Snail1 ilmentymistä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Toiminnan 14-3-3 proteiineja voidaan moduloida vuorovaikutusta eri kumppaneiden paikallisesti ja ajallisesti muodin ja myös kohdistetaan sääntelyä fosforylaation. Siksi sama 14-3-3 perheenjäsen voi olla useita ja jopa vastakkaisia ​​rooleja tehdä vaikutusten analysointi yksittäisten 14-3-3 proteiinien hyvin monimutkainen ja riippuu integrointi ylimääräisiä signaaleja [45]. Näin ollen on vaikea ennustaa rooli näiden proteiinien Snail1 toimia paksusuolen syöpä, joka voi liittyä mutaatiot tyypillisesti läsnä tässä neoplasia.

Huomasimme, että Snail1 tukahduttaa myös PA2G4 ilmentymistä ihmisen paksusuolen syöpä solut. Tämä proteiini on vuorovaikutuksessa sytoplasmadomeenissa ErbB3-reseptorin vähen- tämisessä ErB signaalitransduktion ja lieventävät hereguliinin kasvuun rintasyövän solujen [46], [47]. PA2G4 sijaitsee ei vain sytosolissa, mutta myös tumaan, jossa se käyttäytyy kuin pleiotrooppinen proteiinia, joka on vuorovaikutuksessa useiden proteiinien ja RNA: t osallistuvat transkription säätelyyn ja translaation säätelysekvenssit [48], [49]. Siten PA2G4 estää E2F1- ja androgeenireseptorin välittämän transkription kautta vuorovaikutuksessa retinoblastoomaproteiiniin, androgeenireseptorin, useita histonien deasetylaaseja ja Sin3A [50] – [53]. Lokalisoinnin PA2G4 vuonna Cajal elimissä, että olemme nyt raportoitu viittaa siihen, että tämä monimuotoinen proteiini osallistuu myös kypsymisen snRNA ja snoRNA. Lisäksi PA2G4 yliekspressio indusoi erilaistumista ihmisen rinta- syöpäsolujen [54], inhiboi proliferaatiota ihmisen fibroblastien, ja tukahduttaa kasvua ja etäpesäkkeiden syljen rauhasmainen kystinen karsinoomasolut [55]. Kaikista näistä tutkimuksista on ymmärrettävää, että PA2G4 tukahduttaminen voi edistää kasvaimia toiminnan Snail1.

Mielenkiintoista, Snail1 ylössäätelee ilmaus CPSF6 ja SFPQ osallistuvien proteiinien RNA: n polyadenylaatiota ja silmukoinnin, vastaavasti [56], [57 ]. Molemmat proteiinit ovat vastikään todettu olevan läsnä paraspeckles, joka on subnuclear lokero ehdotetaan olevan sivuston pre-mRNA: n prosessointi ja säilyttäminen [23]. Huomattavaa on, että sekä CPSF6 ja SFPQ ovat fuusiopartnereita tyrosiini- kinaasien hematologisia syöpäsairauksia [58]. Snail1 muuttaa myös silmukoinnin HNRNPH3, toisen proteiinin mukana silmukoinnin prosessi [24]. Kiehtovan, The HNRNPH3 isoformien aiheuttama Snail1 sisältävät kaksi kopiota RNA-sitovan domeenin (RNA tunnustamista motiivi) esiintyy yleisesti proteiineja, jotka sitoutuvat yksijuosteista RNA: ta, kun taas isoformien tukahdutettu Snail1 olla vain yksi [24]. Kuitenkin toiminnallinen seurauksena tämä ero on tuntematon. Siksi meidän tutkimus osoittaa, että Snail1 voivat muuttaa useita vaiheita RNA kypsymisen, kuten polyadenylaatio- ja liitos, joten mRNA vakautta ja kääntäminen. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että sen lisäksi tunnustettu transkription repressioaktiivisuuteen, Snail1 voi säädellä geeniekspressiota transkription jälkeen moduloimalla tasoon liittyvien proteiinien pre-mRNA: n prosessointi ja sijainti.

Johtopäätöksenä meidän Pääteltiin Snail1 säätelijänä aiemmin arvaamaton solutoiminnoille lisäksi välistä adheesiota ja solun morfologia. Perusteellinen tutkimus vaikutusmekanismia äskettäin tunnistettu Snail1 kohdeproteiinit auttaa määrittämään tarkka monimutkainen biologista aktiivisuutta Snail1 ja niin oivalluksia prosessin EMT sikiönkehityksen aikana ja kasvaimen kehittymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Instituto de Salud Carlos III (Madrid, Espanja) ja eettisen komitean Clinical Research Institut Municipal d’assistência Sanitaria (Barcelona, ​​Espanja). Kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa varten otetaan näytteitä ja myöhempää analysointia.

Soluviljely

SW480-ADH ja HT29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, jotka ilmentävät stabiilisti Snail1 (Snail1 solut) tai tyhjän vektorin ( Mock-solut) tuotettiin retroviruksen transduktion avulla PRV-Snail1-IRES-GFP (Snail1 solut) tai PRV-IRES-GFP (mock-solut) vektoreita, kuten olemme aiemmin raportoitu [10].