Krooninen sairaus

tiivistelmä

E7 onkoproteiinia ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on ihanteellinen kohde kehittämällä immuuniterapeuttista strategioita HPV-liittyvä kasvaimia. Kuitenkin, koska proteiini-pohjainen immunogeenejä yksin ovat heikkoja elisiittorit että sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) vasteita, ne ovat olleet vaikea hyödyntää terapeuttisiin tarkoituksiin. Tässä tutkimuksessa me raportoimme, että yhdistelmä-DNA-lipoproteiini, joka koostuu ei-aktiivinen E7 (E7m) biologisesti liittyy bakteeri lipidiosan (rlipo-E7m) indusoi kypsymisen hiiren luuytimestä peräisin olevien dendriittisolujen kautta Toll-kaltainen reseptori 2 (TLR2), vääristää immuunivasteet kohti Th1 vastauksista ja indusoi E7-spesifisiä CTL-vasteita. Olemme edelleen tutki kykyä rlipo-E7m antamaan suojan TC-1 kasvainsolualtistuksen eläinmallissa. Hiiret, profylaktisesti immunisoitiin kahdella 10 ug annosta rlipo-E7m havaittiin olevan vapaa TC-1 kasvaimen kasvua. Kokeiden terapeuttisessa immunisointi malli osoitti, että kasvaimen tilavuus hiirillä, jotka saivat yhden annoksen rlipo-E7m oli alle 0,01 cm

3 päivänä 40, kun taas tuumorin tilavuus käsitellyillä hiirillä rE7m oli 2,28 ± 1,21 cm

3. Kasvaimen tilavuus koko kontrolliryhmässä oli yli 3 cm

3. Lisäksi olemme osoittaneet, että CD8 + T-solut on tärkeä rooli antituumoriselta immuniteetin kun anto rlipo-E7m. Nämä tulokset osoittavat, että rlipo-E7m voisi olla lupaava ehdokas hoitamiseksi HPV: hen liittyvän kasvaimia.

Citation: Huang C-Y, Chen JJW, Shen K-Y, Chang L-S, Yeh Y-C, Chen I-H, et al. (2012) Rekombinantti lipidoitujen HPV E7 indusoi Th-1-Biased immuunivasteen ja suojaavan immuniteetin kohdunkaulasyövän hiirimallissa. PLoS ONE 7 (7): e40970. doi: 10,1371 /journal.pone.0040970

Editor: Silke Appel, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 23 marraskuu 2011; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 18 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Research tutkija palkinnon National Health Research Institutes (VC-098-PP-04-S-JL) ja (VC-098-PP-06-C-HL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen papilloomaviruksen (HPV) infektioiden voi selittää kehittämiseksi useiden syöpien; erityisesti HPV-infektio voi aiheuttaa kohdunkaulan syöpää. Kohdunkaulan syöpä on toiseksi yleisin syy syöpäkuolemista naisten maailmanlaajuisesti [1]. Siksi Uusien hoitomuotojen tarvitaan kiireesti ohjaamaan kohdunkaulan syövän kuolleisuus. Tähän mennessä HPV E6 ja E7 onkoproteiineja on tunnistettu tärkeimmät kehityskohteet terapeuttisten rokotteiden HPV-liittyvä kasvaimia. Kuten solunsisäinen (ydin-) proteiinit, E6 ja E7-geenin tuotteita voidaan piilossa humoraalisen immuunivasteen. Huomio on siis keskittynyt sukupolven rokote, joka kykenee indusoimaan tai stimuloimaan soluvälitteisen immuunivasteen HPV E6- ja E7-onkoproteiineja [2]. Useita lähestymistapoja on ryhdytty kehittämään HPV terapeuttisia rokotteita, kuten live vektorivälitteisten, peptidi /proteiini-, nukleiini- happo- ja kokonaisten solujen lähestymistapoja. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että on tärkeää T-soluvasteita suojaavat kasvaimia ihmisillä ja eläinmalleissa [3]. Näistä lähestymistavoista, synteettisen peptidin ja proteiinin lähestymistavat ovat houkuttelevin ehdokkaat; kuitenkin, yleisesti, peptidi ja proteiini yksinään ei-immunogeenisiä. Ilman ylimääräistä adjuvantti, on vaikea saada aikaan voimakasta ja tehokasta immuunivastetta, tunnettu siitä, että tuotanto Th1 sytokiinien ja viruksen onkoproteiini-spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) [3].

TLR-agonistit ovat luonnollisesti immunostimulatiivisen indusoijat luontaisen immuniteetin. TLR2 ilmentyy monissa eri solutyypeissä, mukaan lukien dendriittisolut, makrofagit ja lymfosyytit,. Siksi TLR2 agonistit kuten bakteerien lipoproteiinit ovat lupaavia ehdokkaita käytettäväksi uuden sukupolven adjuvanttia immunoterapiassa.

Olemme hiljattain perustettu alustan korkean tuoton rekombinanttien lipoproteiinien [4]. Lipidiosa on lipo-immunogeeni on samanlainen kuin bakteerien lipoproteiinien, joita pidetään vaarasignaalit immuunijärjestelmän. Näin ollen sekä synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen voidaan indusoida lipoproteiinit [5], [6]. Lipidi rakenne rekombinantin lipoproteiini on erilainen kuin synteettisten tri-asyloitu lipopeptidin [7]. Tämä ero tekee yhdistelmä-lipoproteiini esiin eri immuunivasteiden synteettisistä lipopeptidin indusoimalla eri biologisten sytokiinien ja kemokiinien [8]. Olemme aiemmin osoittaneet, että virus-neutraloivien vasta-aineiden aikaansaamia vasteita lipidi muodossa immunogeeni oli vahvempi kuin aikaansaamat ei-lipidi muodossa immunogeenin [4], [9]. Tässä raportissa, osoitamme, että vaikeudet käyttää proteiinien yksinään indusoimaan CTL-vasteita voidaan voittaa käyttämällä lipo-immunogeeni strategiaa. Lipidi muoto E7-mutantin (rlipo-E7m) ja ei-lipidi-muodossa rE7m HPV tyyppi 16 (HPV16) tuotettiin, ja kyky näiden immunogeenien aktivoida hiiren luuytimestä peräisin olevien DC: iden (BM-DC) oli arvioitu. Immuunivasteita B- ja T-soluja tutkittiin myös. Lopuksi tutkimme, onko immuunivasteiden aiheuttama rlipo-E7m pystyivät suojaamaan hiiriä kasvaimen haaste. Nämä tutkimukset eivät vain antaa tietoa rlipo-E7m on lupaava lähestymistapa kehittämiseen terapeuttista rokotetta HPV: hen liittyvän kasvaimiin vaan myös esittämään strategian kehittämiselle onnistuneen immunoterapioiden käyttäen proteiini-pohjainen ehdokkaita.

Tulokset

rekombinantin Immunogeenit

rekombinantti E7m (rE7m), joka on muokattu sisältämään heksahistidiiniliiteleiman (HisTag) sen C-terminaaliseen päähän, on tuotettu verrata vaikutuksia rE7m että lipidimuodossa tavoite. rE7m puhdistettiin käyttäen immobilisoitua metalli-affiniteettikromatografiaa (IMAC) -kolonnia (kuvio 1b, kaistat 1-4). rE7m havaittiin anti-HisTag vasta-aineita (kuvio 1 b, kaistat 5-8). Olemme aiemmin tunnistettu fuusio-sekvenssin (D1), joka voidaan fuusioida ei-lipidoitu immunogeeninä saavuttaa korkea ilmentymisen tasoja rekombinantti-lipo-immunogeeni [4]. Käyttäen tätä strategiaa E7m geeni fuusioitiin D1 sen N-päässä ja kehitimme HisTag sen C-terminuksessa. Tämä yhdistelmä-DNA-lipidoitu E7m (rlipo-E7m) puhdistettiin käyttäen IMAC-pylvääseen (kuvio 1b, kaistat 9-11). rlipo-E7m havaittiin anti-HisTag vasta-aineita (kuvio 1 b, kaistat 12-14). Sen jälkeen, kun lipopolysakkaridi (LPS) oli poistettu (vähemmän kuin 0,003 EU /ug), puhdistettua rlipo-E7m ja rE7m verraten analysoitiin niiden immunogeenisyyden ja tehokkuuden eläinmalleissa.

(a) rinnastus aminohapon sekvenssi villityypin HPV16 E7 (Liittymisnumero: NP_041326) ja inaktiivisen E7 (E7m). Jokainen mutantti sivusto E7m korostuu. DNA-sekvenssi E7m geenin johdettu käyttämällä kodoninkäyttöä

E. coli

ja täysin syntetisoitiin käyttäen kokoonpano PCR-menetelmällä. PCR-tuote kloonattiin pET22b vektoriin rE7m ilmaisun ja muunnettuun pET22b vektori lipidin signaalipeptidiä rlipo-E7m ilmentymistä. Yhdistelmä-DNA-proteiinit sisältyy ylimääräinen HHHHHH sekvenssin (HisTag) on ​​C-päässä ja ilmaistiin kontrollin alaisena T7-promoottorin. (B) rlipo-E7m ja rE7m proteiinin puhdistusprosessi seurattiin käyttäen 15% pelkistävä SDS-PAGE seurasi värjättiin Coomassie Blue-värjäyksellä ja immunoblottauksella käyttäen anti-HisTag vasta-aineita. Rekombinantti rlipo-E7m ilmentyi

E. coli

kannat C43 (DE3). Kaista 1, rE7m ilmentymisen IPTG-induktion jälkeen; kaista 2, proteiinin ilmentymisen IPTG: n puuttuessa induktion; kaista 3, uutetaan osa rE7m; kaista 4, puhdistettu rekombinantti rE7m. Kaistat 5-8 osoittavat, immunoblottaus seurata rE7m puhdistusprosessi, ja näytteet näiden kaistojen ovat samat kuin kaistoissa 1-4, vastaavasti. Kaista 9, rlipo-E7m ilmentymisen IPTG-induktion jälkeen; kaista 10, proteiinin ilmentymisen IPTG: n puuttuessa induktion; kaista 11, puhdistettiin rlipo-E7m. Kaistat 12-14 esittävät immunoblottaus seurata rlipo-E7m puhdistusprosessi, ja näytteet näiden kaistojen ovat samat kuin kaistoissa 9-11, vastaavasti. Ei-lipidoitunut muoto rE7m ilmaistiin

E. coli

BL21 (DE3) tähti rasitusta. Nuolet osoittavat elektroforeettisen kannat rE7m tai rlipo-E7m geeleissä tai blotit. (C) Ehjä rlipo-E7m analysoitiin LC /MS: llä. LC /MS-analyysi paljasti, että läsnä on viisi suurta translaation jälkeisiä modifikaatioita rlipo-E7m. Molekyylimassat (daltoneina) määritettiin käyttäen enintään entropian algoritmia. Viisi suurta piikkiä näy massojen 15384,5, 15400, 15412,5, 15426 ja 15439. (d) N-terminaalista rlipo-E7m palaset saatiin ja tunnistettiin pilkkomalla rlipo-E7m trypsiinillä. Poltettu näyte analysoitiin VVaters® MALDI mikro MX ™ massaspektrometrillä. MALDI-TOF MS-spektri paljastaneet viisi piikit m /z-arvot 1452, 1466, ja 1480, 1492 ja 1506.

tunnistaminen ja karakterisointi Puhdistettu Immunogeenit

rlipo-E7m ja rE7m pilkottiin trypsiinillä arvioida niiden peptidi massa sormenjälkien ottaminen (PMF). Tulokset vahvistivat, että suuret piikit massaspektrit peräisin rlipo-E7m ja rE7m (tietoja ei ole esitetty). Tunnistaa lipidiosa on rlipo-E7m suoraan näytteen infuusio ESI-MS koskemattomien rlipo-E7m suoritettiin Q-TOF väline. Tietojen käsittelyn jälkeen, viisi suurta huiput massojen 15384,5, 15400, 15412,5, 15426, ja 15439 Da tunnistettiin (kuvio 1 c). Perustuu aiempiin tutkimuksiin, me pidetään olemassaolo näiden suurten piikkien on allekirjoituksen rasva muunnoksia lipoproteiinien [4], [7].

Sitten mitataan tarkka massa N-päätteen fragmentteja rlipo -E7m. Viisi huiput m /z-arvot 1452, 1466, 1480, 1492, ja 1506 havaittiin (kuvio 1 d). Puhdistus typtic lipo-fragmenttien massa-analyysi paljasti kaksi huippua, joita ei ole aikaisemmin tunnistettu. Sen varmistamiseksi, että rasva-muunnos kunkin huipun on N-terminaalinen kysteinyylitähteen, N-pään fragmentit rlipo-E7m tehtiin MALDI-TOF-TOF-analyysi sekvenssin määrittämiseksi jokaisen piikin. Sekvenssit nämä viisi huiput olivat samoja, ja tunnistettiin sekvenssi y5 y1 oli ”SQEAK” (tuloksia ei ole esitetty). Olemme vahvisti, että huiput rlipo-E7m liittyi lipidoitunut kysteiinitähde ja varmistanut, että rlipo-E7m sisältää bakteeri- lipidiosa sen N-terminaalissa.

rlipo-E7m Aktivoi Bone Marrow dendriittisoluja kautta TLR2

arvioimiseksi toimintaa rlipo-E7m, ensin tutkinut imusoluproliferaatiota vastaus yhdistelmä-immunogeenejä ja hallita agonistit. LPS (a TLR4-agonisti) ja synteettinen lipopeptidi palmitoyyli-3-Cys-Ser- (Lys) 4 (Pam3, TLR2-agonisti) indusoi pernasolujen proliferaatio annoksesta riippuvalla tavalla. rlipo-E7m on havaittu stimuloivan pernasolujen pitoisuuksina 10 nM ja 100 nM [rlipo-E7m yhteen 1000 nM fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS)]. Sen sijaan, rE7m ei onnistunut indusoimaan pernasolujen proliferaatio. Nämä tulokset osoittavat, että lipidi-osa rlipo-E7m pystyy aktivoimaan immuunijärjestelmän soluihin (kuvio 2a).

(a) Splenosyyttejä eristettiin villityypin hiirissä ja maljattiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Soluja inkuboitiin eri LPS-pitoisuuksilla (0-1000 ug /ml), Pam3 (0-1000 ng /ml), rlipo-E7m (0-100 ug /ml) tai rE7m (0-1000 ug /ml) 48 tuntia. Viimeisellä 24 tuntia, 1 uCi [

3H] -tymidiinin lisättiin kuhunkin kuoppaan mitata DNA-synteesiä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta näytteestä. (B) BM-DC: iden villityypin hiiret kasvatettiin väliaineessa, johon oli lisätty LPS: llä (0,01 ug /ml), rE7m (10 ug /ml) tai rlipo-D1E3 (10 ug /ml) läsnä ollessa tai poissa ollessa polymyksiini B: (20 ug /ml). Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkuboinnin ilmaisu dendriittisen solun pinnan markkereita CD40 ja CD86 analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) solujen viljelty ainoastaan ​​kasvatusalustassa määriteltiin 100%. (C) sytokiinin eritystä tutkimukset, BM-DC viljeltiin väliaineessa, jota oli täydennetty LPS: ää (0,01 ug /ml), Pam3 (0,15 ug /ml), rE7m (0,1-10 ug /ml) tai rlipo-E7m (0,1- 10 ug /ml) läsnä tai poissa polymyksiini B: tä (20 ug /ml). Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkuboinnin jälkeen supernatantit kerättiin ja analysoitiin TNF-α: n ja IL-12 (p40) tuotanto ELISA: lla. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) BM-DC: iden villityypin, TLR1-knockout (TLR1-KO), TLR2-KO tai TLR6-KO-hiiret kasvatettiin joko pelkällä väliaineella tai väliaineessa, johon oli lisätty LPS: llä (0,01 ug /ml), Pam3 (0,15 ug /ml), rE7m (10 ug /ml), tai rlipo-E7m (10 ug /ml). Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkuboinnin jälkeen supernatantit kerättiin ja analysoitiin TNF-α tuotantoa ELISA: lla. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kolmesta näytteestä.

käytetään sitten BM-DC mallina tutkia immunostimulatorisen ominaisuudet rlipo-E7m. Polymyksiini B lisättiin valvoa mitä tahansa aiheuttamia häiriöitä jäljellä LPS toiminnallisessa määrityksessä. rlipo-E7m sääteli ilmaisua pinnan markkereita, kuten CD40 ja CD86 BM-DC, kun taas rE7m ei ollut vaikutusta (kuva 2b). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin sytokiinieritystä tutkimuksissa. Eritystä TNF-αand IL-12p40 indusoitiin rlipo-E7m mutta ei rE7m ryhmä (kuvio 2c). Polymyksiini B esti LPS-välitteistä stimulaatiota BM-DC, mutta sillä ei ollut merkittävää vaikutusta stimuloivia ominaisuuksia rlipo-E7m. Nämä tulokset osoittavat, että aktivointi BM-DC: iden rlipo-E7m ei johtunut jäljellä LPS ja että immunostimulatorisen aktiivisuuden rlipo-E7m on sidoksissa sen lipidiosa.

Koska lipidien rakenne rlipo -E7m on agonisti TLR1 /TLR2 ja /tai TLR2 /TLR6, seuraavaksi tutkittiin, mitkä näistä TLR: ien on välttämätöntä immunostimulatorisen aktiivisuuden rlipo-E7m. Käsitellä tätä kysymystä, BM-DC villistä kirjoittanut, TLR1-, TLR2- ja TLR6- Knockout (KO) hiiriä käytettiin. rlipo-E7m ja Pam3 indusoiman TNF-α eritystä BM-DC: iden TLR1-KO ja TLR6-KO-hiiret, mutta ei ole edistää BM-DC: iden TLR2-KO-hiiret, mikä osoittaa, että TLR2 on tarpeen immunostimulatorisen aktiivisuuden rlipo- E7m (kuvio 2d). Nämä tiedot osoittavat, että immunogeeni fuusioitu bakteerin lipidiosa aktivoitu kypsymistä BM-DC: iden kautta TLR2.

Immunisointi rlipo-E7m Parantaa antigeeni-spesifisten vasta-aineiden ja tuottaa Th1-esijännitetty Response

arvioida luontaisia ​​adjuvantti ominaisuuksia rlipo-E7m

vivo

, olemme analysoineet suuruus antigeeni-spesifisen vasta-ainevasteen hiirissä, jotka on immunisoitu joko rE7m tai rlipo-E7m (kuvio 3a) . Vasta-ainetiitterit aikaansaama rlipo-E7m olivat 100-kertaa suurempi kuin aikaansaamat rE7m viikolla 4, 6 ja 8. Tämän jälkeen analysoida vasta-aineen isotyyppien esiin immunisoitaessa rE7m tai rlipo-E7m, indusoitu plasman IgG1 ja IgG2b mitattiin. IgG1 tasot olivat vertailukelpoisia sekä rE7m- ja rlipo-E7m-immunisoiduissa hiirissä; kuitenkin IgG2b tasot rlipo-E7m-immunzed hiiret olivat korkeampia kuin ne, jotka rE7m-immunisoidut hiiret (kuvio 3b). Tämä ilmiö voidaan selvästi havaita vertaamalla IgG2b /IgG1-suhteet näissä hiirissä (kuvio 3b, insertti).

(a) C57BL /6-hiiriä (n = 5) immunisoitiin kahdesti ihonalaisena injektiona 30 ug ja rE7m PBS: ssä tai 30 ug rlipo-E7m PBS: ssa kahden viikon välein. Seerumit kerättiin ja IgG- tai (b) IgG2b /lgG1-vasteita rE7m arvioitiin ELISA: lla. IgG2b /IgG1 suhde molemmissa ryhmissä on esitetty insertti. (C) Hiirille injektoitiin subkutaanisesti 30 ug rE7m tai rlipoE7m kaksi kertaa kahden viikon välein. Seitsemän päivää toisen immunisoinnin jälkeen pernasoluja eristettiin ja stimuloitiin rE7m (10 ug /ml) 4-5 päivää. Supernatantit kerättiin ja IFN-γor IL-5 mitattiin ELISA: lla. Data on ilmaistu keinona + SD näytteiden (n = 5).

Lisäksi olemme tutkineet eritystä INF-γ: n ja IL-5 pernasolujen immunisoitujen hiirten rE7m tai rlipo-E7m. Tason INF-γinduced upon rlipo-E7m immunisaatio oli 4 kertaa suurempi kuin, että indusoituu rE7m immunisoinnin (kuvio 3c); kuitenkin rE7m immunisointi indusoi 7-kertainen eritystä IL-5 pernasoluja kuin ei rlipo-E7m immunisointi (kuvio 3c). Yhdessä tulokset T-solun ja B-solujen määritykset viittaavat siihen, että fuusioimalla immunogeeninä bakteeri lipidiosa johtaa Th1-pohjainen immuunivasteen aiheuttama lipidoitu immunogeeninä.

Immunisointi rlipo-E7m indusoi E7- spesifisten T-Cell Responses

olivatko rlipo-E7m immunisoinnin kykeni indusoimaan E7-spesifisiä CTL-vasteita. C57BL /6-hiiriä ihonalaisesti immunisoitiin päivänä 0 ja 7, joissa rlipo-E7m, rE7m tai PBS-kontrollin. Splenosyytit immunisoiduista hiiristä stimuloitiin peptidillä RAHYNIVTF (RAH, E7

49-57) ja useita E7-spesifisten IFN-γ-erittävien solujen määritettiin käyttämällä ELISPOT-määritystä (katso materiaalit ja menetelmät). Immunisointi rlipo-E7m indusoi suuremman määrän INF-γsecreting soluja kuin että ei immunisaatio rE7m (kuvio 4a). Lisäksi, värjäystä RAH /H-2D

b R-fykoerytriini (PE) -konjugoitu tetrameerin osoitti dramaattinen kasvu E7-spesifisten CD8 + T-solujen immunisoinnin jälkeen rlipo-E7m. Määrä E7-spesifisten CD8 + T-solujen indusoima rlipo-E7m immunisaatio oli enemmän kuin 4 kertaa, joka indusoi rE7m immunisointi (kuvio 4b). Testata T-solujen tappavaa aktiivisuutta, kun rlipo-E7m tai rE7m immunisointiin, RAH peptidilisätyt T2-soluja käytettiin kohdesoluina standardissa 4 tunnin kromin vapautumisen määrityksellä. rlipo-E7m immunisointi indusoi korkeatasoisen E7-spesifisen CTL-aktiivisuuden. Sen sijaan, rE7m immunisaation vain indusoi vähäistä E7-spesifisen CTL-aktiivisuuden (kuvio 4c). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että HPV E7-spesifisiä CTL-vasteita indusoitiin rlipo-E7m rokotusta.

(a) pernasoluja (2 x 10

5 solua /kuoppa) immunisoiduista hiiristä inkuboitiin kanssa tai ilman 10 ug /ml: RAHYNIVTF (RAH) peptidi 48 tuntia in anti-IFN-γ-päällystetty 96-ELISPOT levy. IFN-γ-erittävät täplät mitattiin käyttäen ELISPOT-lukijaa. Data on ilmaistu keinona + SD oli kuusi eläintä ryhmää kohti. (B) RAH-CD8 + T-solujen havaittiin tetrameerivärjäyksellä ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus tetrameeri-positiivisten solujen kesken CD8 + T-solujen on esitetty kunkin paneelin. Lukumäärät TetraRAH-tetrameerin + /CD8 + solujen CD8-soluja (1 x 10

5) kolmen kokeet osoittivat. Pylväsdiagrammit osoittaa keskimääräinen prosenttiosuus RAH tetrameerin + /CD8 + -solujen joukossa CD8 + solut. Data ilmaistaan ​​keskiarvona + SD. * P 0,05. (C) Sen arvioimiseksi, sytotoksista vaikutusta rlipo-E7m immunisaation kasvainsolujen, standardi kromin vapautumisen määritys suoritettiin. Eristetty pernasoluja (efektorisolut) stimuloitiin RAH (10 ug /ml) 7 päivää, kun läsnä oli rIL-2 (10 yksikköä /ml). Kohdesoluja (5 x 10

3 /kuoppa) inkuboitiin eri Efektorisolujen suhde (1:25, 01:50, 1:100). Erityiset hajoaminen (%) laskettiin seuraavasti: 100 x (Sample releasecpm – Spontaani releasecpm) /(Maximum releasecpm – Spontaneous releasecpm).

arviointi terapeuttinen ja profylaktinen tehokkuus rlipo-E7m

profylaktisessa mallissa hiiret immunisoitiin kahdesti PBS: llä, rE7m tai rlipo-E7m kahden viikon välein, ja TC-1-soluja injektoitiin ihonalaisesti 7 päivää sen jälkeen, kun viimeisestä immunisoinnista. Päivänä 58 altistuksen jälkeen, kasvaimet pysyi tuskin mitattavissa rlipo-E7m-immunisoiduissa hiirissä. Sen sijaan, keskimääräinen kasvaimen tilavuus hiirissä, joihin injektoitiin PBS: ää oli suurempi kuin 2,5 cm

3, ja keskimääräinen tuumorin tilavuus oli 0,59 ± 0,62 cm

3 rokotetut hiiret rE7m (kuvio 5a). Arvioida terapeuttista malli, C57BL /6-hiiriä injektoitiin subkutaanisti TC-1-solujen dorsum. Seitsemän päivää myöhemmin, nämä hiiret saivat 30 ug joko rlipo-E7m tai rE7m tai saivat vain PBS: ää pistoksena ihon alle vatsan. Päivänä 58 altistuksen jälkeen, kasvaimet olivat tuskin havaittavia hiirillä, jotka saivat rlipo-E7m. Sen sijaan, keskimääräinen kasvaimen tilavuus hiirissä, joihin injektoitiin PBS: llä oli yli 3 cm

3, ja keskimääräinen tuumorin tilavuus immunisoiduissa hiirissä rE7m oli suurempi kuin 2,0 cm

3 (kuvio 5b). Nämä tulokset osoittavat, että sekä profylaktinen ja terapeuttinen tehokkuudet rekombinantti-immunogeenit on kasvanut dramaattisesti, kun ne toimitetaan lipidimuodossa.

(a) Hiiret immunisoitiin kahdesti ihonalaisesti injektoimalla rE7m /rlipo-E7m (10 ug ) tai PBS: ssä yhden viikon välein. Seitsemän päivää viimeisen immunisoinnin jälkeen, hiiret injektoitiin subkutaanisti 2 x 10

5 TC-1-soluja kokonaistilavuudessa 200 ui ihon alle. (B) Hiiret inokuloitiin subkutaanisesti TC-1-soluja (2 x 10

5 /hiiri). Jälkeen 7 päivää, kasvaimen kantavien hiirten (5-10 hiirtä per ryhmä) injektoitiin kerran rE7m /rlipo /rE7m (30 ug /hiiri) tai PBS: ää. Tuumorin tilavuudesta oli esitetty pituus x leveys x leveys /2 (mm

3). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina + SEM. (C) Kolme ryhmää (rlipo-E7m /CD4, rlipo-E7m /CD8 ja rlipo-E7m /Rat IgG) hiiriä injektoitiin anti-CD4, anti-CD8 ja kontrollivasta-aineita, vastaavasti, yksi päivä ennen injektiota TC -1-soluja. Nämä ryhmät ja kaksi ryhmää (rlipo-E7m ja PBS) injektoitiin kerran rlipo-E7m (10 ug /hiiri) tai PBS: ää seitsemän päivää sen jälkeen siirrostettiin TC-1-soluja (2 x 10

5 /hiiri). Tuumorin tilavuudesta oli esitetty pituus x leveys x leveys /2 (mm

3). Data on ilmaistu keskiarvoina + SEM.

Viisi ryhmää C57BL /6-hiiriä käytettiin edelleen mitkä osajoukko T-soluja osallistuu kasvaimen vastaisen immuniteetin. Kolme ryhmää injektoitiin anti-CD4 (rlipo-E7m /CD4), anti-CD8 (rlipo-E7m /CD8) ja kontrollivasta-aineita (rlipo-E7m /Rat IgG) yksi päivä ennen injektiota TC-1-soluja. Seitsemän päivää myöhemmin, nämä hiiret saivat 10 ug rlipo-E7m. Hoidot PBS: ää ja 10 ug rlipo-E7m tarjoiltiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. Päivänä 30 tuumorin istuttamisen jälkeen, keskimääräinen kasvaimen tilavuus PBS: ää ja rlipo-E7m ryhmät olivat 1,1 cm

3 ja 0,14 cm

3, vastaavasti. Mitään merkittäviä eroja ryhmien joukosta rlipo-E7m, rlipo-E7m /CD4 ja rlipo-E7m /Rat IgG. Päinvastoin, suojaava vaikutus poistettiin, kun CD8 + solut köyhdytetty rlipo-E7m /CD8 (p 0,005, kuva 5c). Tämä tulos ilmeisesti osoittaa, että anto rlipo-E7m voisi tuottaa CD8 + solujen välittämän anti-kasvain vaikutus.

Keskustelu

Olemme tuottaneet lipidoitunut immunogeeni, rlipo-E7m, joka koostuu inaktivoidun E7 proteiinin HPV16 biologisesti fuusioitu bakteerin lipidiosaan. Tuloksemme osoittavat, että rlipo-E7m yksin indusoi Th1 immuunivaste, E7-spesifisiä CTL-vasteita, ja kasvaimen suojaavan immuniteetin hiiren kasvain malli.

Tarve kehittää proteiini-pohjainen immunoterapioiden vastaan ​​kasvaimia on, että proteiini-pohjainen immunogeenit itse on alhainen immunogeenisyys eivätkä helposti saada CTL-vasteita. Muotoileminen immunogeeni adjuvanttien on yleisin lähestymistapa kehittää tehokkaita rokotteita ja voittaa rajoittamisesta proteiiniperustaisista immunoterapian. Olemme laajentaneet ajatusta yhdistämällä kovalenttisesti immunogeeninä immunovahvistajaa, luoda lipoproteiini-pohjainen rokote luontainen adjuvantin aktiivisuutta.

Early tutkimukset osoittivat voimakkaan adjuvantin aktiivisuutta bakteeri-lipoproteiini, synteettiset lipidit peptidi antigeenejä ja lipidien -häntäistä glykopro- peptidit [10], [11], [12]. Esimerkiksi rekombinantti lipidoitunut OspA voi aiheuttaa suojaavan immuniteetin korreloi vasta-aineiden kehittymiseen. Tämä Lymen tauti rokote (LYMErixTM) oli lisensoitu Yhdysvaltain FDA vuonna 1998 [13], [14]. Toinen yhdistelmä-lipoproteiinin lähestymistapa perustuu ulkokalvon lipoproteiini I (Opri) Pseudomonas aeruginosa. Opri-pohjainen -rokotevalmisteen käyttäen klassisen sikaruton (CSF) E2 ja NS3 edistetään DC aktivoinnin sika, mikä parantaa T-soluvasteiden yhdessä humoraalisten vastustuskyky [15]. OPr on myös fuusioitunut tuberkuloosi rokote, mycolyl-transferaasi-antigeeni 85A (Ag85A). Ihon alle lisäämällä tämän fuusioproteiinin adjuvantin poissa ollessa lisäsi huomattavasti Ag85A-spesifisten humoraalisten immuunivasteiden [16]. MALP-2 (makrofagien aktivointi lipopeptidi-2) on osoittanut rohkaisevia antituumoriaktiivisuus joissakin malleissa [17], [18]. Oldford ja työtoverit osoittivat, että Pam3CSK4 esti tuumorin kasvua syöttösolujen ja mast-soluista peräisin IL-6-riippuvaisella tavalla [19]. Myöhemmin kolmen komponentin GLP rokotteen Ingale ja työtoverit (kolme palmitiinihappo Pam3CSK4 osan, joka on CD4 + ja B-solu-epitoopin) osoitti induktion vahva kasvaimen IgG vasteita [20]. Äskettäin RENAUDET ja työtoverit osoittivat neljän komponentin HER-GLP-rokote- konstruktilla (yksi CD4 + T-solu-epitoopin, yksi OVA CD8 + T-solu-epitoopin, yhtä hiilihydraattia B-soluepitooppi ja sisäänrakennettu palmitiinihappo adjuvantti) esti tuumorin kasvua in HER-GLP immunisoiduissa hiirissä [21].

liitännäishoito käyttö lipopeptidien saa aikaan sekä Th1 ja Th2 sytokiinit mallista riippuen käytetty antigeeni immunizations. Esimerkiksi täysin synteettinen lipopeptideille lukien palmitoyyli-lipidoitunut peptidi ja kolesterolia lipidoitu peptidin havaittiin, että voisi laukaista Th1-riippuvaisen suojaavan immuniteetin [22]. Sen sijaan diasyloitujen lipopeptidi FSL-1 indusoi TLR2-välitteisen Th2-vasteet [23]. Kuitenkin immuunivasteita voidaan vinossa lipoproteiinit ja lipopeptidejä kohti Th1-vasteet havaittiin vielä monta kertaa. Synteettinen pam3 lipopeptidi OspA indusoivat Th1-fenotyypin kehityksen αβ T-solureseptorin siirtogeeniset hiiret [5]. Bettahi ja työtovereiden totesi, että lipopeptidi herättänyt polarisoitunut Th1 immuunivastetta [24]. Imanishi ja työtoverit osoittivat, että Pam3-CysSK4 ja MALP-2: ta tietyn aktivaattori Th1 solujen toimintaa ja merkitse osallistumista Th1-vasteita [25].

Olemme osoittaneet, että lipo-immunogeeni voi onnistuneesti parantaa sukupolven neutraloivia vasta-aineita dengue-virus [4], [7]. Tässä olemme käyttäneet rlipo-E7m osoittaa, että lipoproteiini immunogeenit voivat indusoida kasvaimen-spesifisiä CTL-vasteita. Tärkeää on, tämä kehittynyt lähestymistapa tarjoaa järkevä suunnittelu syövän immunoterapian tulevaisuutta. Uskomme, että tämä lipo-immunogeeniä lähestymistapaa voidaan kehittää uuden edullisen ja tehokas hoito HPV-syöpiä. Lisäksi lipidien rakenne itsessään on TLR2 agonisti [26] ja voi mennä läpi kehittymässä ja uudelleenlaskostusprosessin valmistelun aikana vaikuttamatta sen toimintaan. Tämä etu mahdollistaa yhdistelmä-lipo-immunogeenejä säilyttää enemmän joustavuutta ja mahdollistaa vankan tuotantoon lipidoitujen immunogeenejä. Vaikka hyväksyntää lipidoitunut OspA kysyttiin artritogeeniset vastaukset aiheuttamat molekyyli- matkiminen OspA, turvallisuuteen liittyviä ongelmia nostettiin esiin koskien lipidiosa yhdistelmä-lipo-immunogeenejä [27]. Meidän teknologiayhteisön, olemme optimoitu tuotantoketjun prosessien tuottamiseksi yhdistelmä-lipoproteiinien, rAg473 on

Neisseria meningitides

B-ryhmän, ja ovat ominaista rAg473 käyttäen optimoitua prosessien [28]. Pre-kliinisen toksikologian ja eläinkokeissa rAg473 on tehty ja olemme jo toimittaneet tiedot turvallisuudesta Taiwan Food and Drug Administration Tutkimusvalmisteita New Drug (IND) sovellus.

Jotta aiheuttaa CTL-vasteita, proteiini- pohjainen immunogeenejä normaalisti on muotoiltava adjuvanttien (katsaus [3] [29]). Esimerkiksi saponiini liitännäishoitona ISCOMATRIX [30] ja liposomi- polykationisen-DNA: ta (LPD) adjuvantti [31] on osoitettu parantavan CTL-vasteita HPV-proteiini-rokotteiden. HPV-16 E7 on fuusioitu fragmentin

Haemophilus influenzae

proteiini D formuloida adjuvantin kanssa, joka sisältää monofosforyylilipidi A: n ja QS-21 saponiiniadjuvantissa [32]. Äskettäin Nventa Biolääkkeiden (ostamien Akela Pharma) kertoi, että tehokkuus HspE7 lisäsi entisestään adjuvanttia Po1y-ICLC, ja tämä havainto palveli pohjan vaiheen 1 clinica1 tutkimuksissa [3]. Vaikka viimeaikaiset edistysaskeleet adjuvantti kenttään ovat tarjonneet useita voimakkaita ja käyttökelpoisia adjuvantti ehdokkaita, kehittää tehokas ja turvallinen apuaineita ihmisten käyttöön edelleen haasteellista [33]. Lähestymistapamme vältetään este käyttää adjuvanttia, mikä viittaa siihen, että se voi tarjota uuden menetelmän pyrkii kehittämään terapeuttisten rokotteiden.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että biologisesti fuusioimalla kasvain antigeenin bakteerin lipidiosa tehneet tämän antigeenin, joka kykenee stimuloimaan BM-DC kautta TLR2, indusoi Th1 immuunivasteen, antigeenispesifisen CTL-vasteita, ja tuottaa kasvaimen suojaavan immuniteetin hiiren kasvainmallissa. rlipo-E7m voi siis olla lupaava terapeuttinen koerokote HPV: hen liittyvän kasvaimia. Lisäksi

E. coli

on käytetty vakaa tuotantojärjestelmän biologisten, ja tämä lipidaatio teknologiaa voidaan helposti soveltaa muihin kasvaimeen osakkuusyrityksen antigeenejä joitakin rajoituksia. Tämä strategia voi tarjota menetelmä kehittämiseen onnistuneen immunoterapioiden käyttäen proteiini-pohjainen ehdokkaita ja toivottavasti saadaan turvallisuutta ja tehokkaita rokotteita ihmisten käyttöön.

Materiaalit ja menetelmät

Chemicals

Kaikki kemikaalit hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO) ja Merck (Darmstadt, Saksa). Restriktioentsyymeillä ja ligaasi hankittiin New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Käytetyt alukkeet kloonaukseen hankittiin Mission Biotech, Inc. (Taipei, Taiwan). Trypsiinillä ja matriisin käytetään massaspektrometria-analyysi hankittiin Promega Co. (Madison, WI).

Cell Lines and Medium

TC-1, hiiren epiteelisolulinja transformoitu onkogeenien Ras, HPV16 E6 ja E7, oli ystävällinen lahjoitus tri TC Wu (Johns Hopkins University). TC-1-soluja viljeltiin DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (HyClone, Logan, Utah), penisilliiniä (100 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml ). Täydellisessä RPMI-10 sisälsi RPMI-1640, johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua vasikan sikiön seerumia, 25 mM HEPES, 4 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia ja 50 uM β-merkaptoetanolia.

Perustelut Design of Inactive HPV E7 (E7m) B

HPV E7 onkoproteiinia sisältää kolme säilyneitä alueita: verkkotunnuksia CR1, CR2, ja CR3 [34].