Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuinen. Huolimatta vuosikymmenten tutkimus, hoitovaihtoehtoja keuhkosyöpäpotilaita ovat riittämättömiä, joko tarjota parannuskeinoa tai jopa huomattavaa selviytymisen etu, koska sen luontainen resistenssi kemoterapiaa. Tuloksemme ehdottavat tehokkuutta kapsaisiinin alaspäin säätäminen VEGF ilmentymisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin hapenpuuteympäristössä. Kapsaisiini-hoito uudelleen aktivoitua p53-SMAR1 positiivista palautetta silmukka näissä soluissa taivutella p53-välitteisen HIF-1α hajoamista ja SMAR1 aiheuttama tukahduttaminen Cox-2: n ilmentymisen että hillitty HIF-1α tumaanohjaussignaali. Tällainen signaali-modulaatiot vuoksi säädeltiin VEGF ilmaus estääkseen endoteelisolujen migraatiota ja verkon muodostumisen edellytyksenä angiogeneesin kasvaimen mikro-ympäristössä. Edellä esitetyt tulokset puoltavat ehdokkuutta kapsaisiinin yksinomaan kohdistaminen angiogeneesin alaspäin säätäminen VEGF kasvainsoluissa tehostamiseen ja painava terapia resistenttien NSCLC.

Citation: Chakraborty S, Adhikary A, Mazumdar M, Mukherjee S , Bhattacharjee P, Guha D, et al. (2014) Kapsaisiini aiheuttama aktivaatio p53-SMAR1 Auto-Regulatory Loop down-regulation VEGF ei-pienisoluinen keuhkosyöpä hillitä Angiogeneesi. PLoS ONE 9 (6): e99743. doi: 10,1371 /journal.pone.0099743

Toimittaja: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 joulukuu 2013; Hyväksytty: 16 toukokuu 2014; Julkaistu: 13 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Chakraborty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: SC- University Grants käyttöönottopöytäkirjasta UGC 2-8 /2002 (SA I) (SA-I) päivätty 06.11.2008. AA- Department of Science and Technology-DST R /3393/06, tehty 16.10.2006. MM- Department of Biotechnology-DBT-RA päivätty 05.06.2009. SM- neuvoston tieteellisen ja teollisen Tutkimus- CSIR 09/015 (0386) /2010 EMR-1 päivätty 22.02.2010. PB- Department of Biotechnology-DBT-RA päivätty 01.06.2010. DG- University Grants käyttöönottopöytäkirjasta UGC 2-8 /2002 (SA I) päivätty 21.04.2011. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kestää ei pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka käsittää 80% kaikista keuhkosyövässä on luontaisesti vastustuskykyinen kemoterapian ja /tai sädehoidon. Koska angiogeneesi on välttämätöntä NSCLC kasvua ja etäpesäkkeiden, siis valvoa kasvaimeen liittyvät angiogeneesiin voi olla lupaava taktiikka rajoittamisessa NSCLC etenemistä. Useat pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ovat erittäin ilmaistaan ​​kasvaimen mikroympäristössä ja vahvasti indusoivan kasvaimen angiogenesishttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3827603/- b3 [1] . Tämä muutos kasvaimen mikroympäristön angiogeeni- tilaan, tai ”angiogeenisten kytkin” [1], [2], on tärkeä nopeutta rajoittava tekijä kasvaimen kehittymisen.

ekspressio VEGF-geenin on osoitettu olevan voimistuvan hypoksia [3] – [5] ja liikevaihdon VEGF välittyy hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) [2], [3]. Under happiolosuhteissa, HIF-1α tasot voimakkaasti säädellään hapen jännittyneisyyteensä hydroksylaatio prolyyliryhmien, kun taas hypoksinen olosuhteet estävät prolyyli hydroksylaatio HIF-1α [4] ja proteiini on vakioitu, joiden avulla se transaktivoimaan kohdegeenien kuten VEGF [3] . Runsaasti raporttien tiukasti viittaavat HIF-1α ja p53 käänteinen suhde, jossa p53 inhiboi HIF-1α transkriptio [6] ja indusoi sen hajoamista useita osa-solun olosuhteissa stressin [7] siten http: //www.jbc. org /search? author1 = Joanna + Zawacka-Pankau sortspec = date esittää = Submitresulting sen voimakas tukahduttaminen. Mielenkiintoista on, että p53 on stabiloitu SMAR1 tukirakenne matriisi liittyvän alueen sitovan proteiinin kautta tilavuus MDM2 p53 N-terminaalista tasku ja siten pelastamiseksi p53 päässä MDM2-välitteisen proteasomaalisten hajoaminen [8]. Contemporary raporteissa [9], [10] osoittaa, että lievä DNA-vaurioita SMAR1 edistää p53 deasetylaation kautta rekrytointi HDAC1 ja erityisesti tukahduttaa Bax ja Puma ilmaisun estää siten apoptoosin. Nämä raportit paitsi todistavat ehdokkuudesta SMAR1 moduloimaan aktiivisuutta p53 vaan myös esiin mahdollisuuden osallistua p53 solun muiden toimintojen lievä DNA: ta vaurioittavien mikro-ympäristö solun. Tärkeää on, useat tutkimukset ovat myös tunnistettu monimutkaisia ​​rajat väliset neuvottelut p5

3

ja Cox-2, jolloin Cox-2 estää p53-verkon syöpäsoluissa [11], [12] ja

päinvastoin

[12]. Kaikki nämä tiedot houkutus voimme tehdä käsityksen olemassaoloa vuorovaikutteinen suhde SMAR1, p53, Cox-2 ja HIF1-α, jos lainkaan, joka päättää kohtalosta VEGF ilmaisun aikana kasvaimen angiogeneesiä NSCLC. Kasvaimen kasvun inhibitiota anti-angiogeeninen aineet on saatu aikaan, jos lupaava tuumorin vastainen vasteita on raportoitu erilaisia ​​anti-VEGF-aineita. Kuitenkin myrkyllisyys useimmat näistä huumausaineet sekä resistenssin kehittymistä kohti kyseisten aineiden merkitsevät tarpeellisuutta etsimällä vaihtoehtoisia myrkyttömiä aineita saavuttaa jatkuvan angiogeneesin estäminen tehokkaan NSCLC terapia.

Lisääntyvä todistusaineisto osoitti syövän vastaisen vaikutukset kapsaisiinia (8-metyyli-

N

-vanillyl-6-noneeniamidi), aktiivinen komponentti chili vastaan ​​eri syöpiä [13] – [18]. Kapsaisiini on raportoitu aiheuttavan apoptoosia ja rajoittaa bentso (a) pyreenin aiheuttaman keuhkotulehduksen tuumorigeneesiä Swiss albinohiirten [19] ja lievittää epätasapaino ksenobioottisen metaboloivien entsyymien ja kasvainmerkkiaineet [20]. Mukaan Anandakumar

et al.

[20] kapsaisiini moduloi keuhkojen antioksidantti puolustusjärjestelmää aikana bentso (a) pyreenin aiheuttama keuhkosyöpä Swiss albinohiirten [19]. Lisäksi kapsaisiini näyttää antiproliferatiivista aktiivisuutta ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän soluviljelmässä ja nude-hiirten mallien kautta E2F-reitin [21]. Viimeaikaiset raportin meidän laboratorio on osoittanut apoptogenic vaikutus kapsaisiinia ihmisen NSCLC-solujen [22]. Ei ole kuitenkaan mitään raporttia roolista tämän phytochemical on NSCLC angiogeneesissä. Lisäksi, vaikka capsacin on osoitettu tukahduttaa ihmisen fibrosarkooma indusoiman angiogeneesin kanan rakkokalvossa määritys [23] estämällä VEGF-indusoitua proliferaatiota, ja kapillaari-, kuten putken muodostuminen primaaristen ihmisen viljellyissä endoteelisoluissa, vaikutus tämän phytochemical on VEGF ilmentyminen NSCLC solussa ei ole vielä tutkittu yksityiskohtaisesti.

Tuloksemme merkitse sitä, että vaikka estettä p53-SMAR1 silmukka aiheuttama VEGF ilmentymisen NLCSC soluissa siten suosien endoteelisolujen (EY) maahanmuutto ja verkon muodostumista kasvain ympäristössä , rajaaminen uudelleen näistä angiogeneesiä signaaleiksi kapsaisiini estänyt VEGF tuotantoa jopa hypoksisissa kunnossa, mikä lähestymiskielto NSCLC-induced nettotyö muodostumista endoteelisolujen. Tällainen kehitys ymmärtämisessä voi tarjota panoraama yksinomaan kohdistaminen pro-angiogeenisten tekijöiden ja väyliä tehostamiseen ja painava keuhkosyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen syövän solulinjat, A549, MCF-7, HeLa, HCT-15, ja normaali keuhkojen fibroblasti Wi-38, saatiin National Center for Cell Science, Intia, ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Lonza, NH), L-glutamiinia (2 mM), natriumpyruvaattia (100 ug /ml), ei-välttämättömiä aminohappoja (100 uM), streptomysiiniä (100 ug /ml), penisilliiniä (50 U /ml; Invitogen, CA) [24]. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin HIMEDIA Cell Culture (Mumbai, Intia), ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 M199 (Gibco, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 20% FBS: ää ja EY kasvu täydentää (EKG, BD Biosciences, Bedford, MA). Kaikki kokeet suoritettiin HUVEC välillä kohtia 2-5. Elävien solujen määrä määritettiin trypaanisiniekskluusiolla testi [11].

Voit jäljitellä hypoksia, A549-soluja kasvatettiin läsnäollessa 100 mikromol /l CoCl

2 (Sigma, St. Louis). Soluja käsiteltiin kapsaisiinia (Sigma, St. Louis), kuten vaaditaan kokeessa. Kun vaaditaan, A549-soluja käsiteltiin Brefeldin A: n (1 ug /ml, Calbiochem, NJ) ja /tai MG 132 (10 uM, Sigma, St. Louis) ja /tai rekombinantti-VEGF: ää (0,8 ng /ml, jotta vastaava määrä VEGF, joka oli läsnä Hy-A549 käytetty kasvatusliuos, joka käytettiin 1:01 suhde kanssa M199: ssä, endoteelisolujen, Peprotech, CA) ja /tai VEGF: n neutraloivan vasta-aineen (25 ng /ml, R Cellgro, USA) ja puromysiiniä (1 ug /ml; Cellgro, USA) 14 päivää, ja solujen elossa tämän hoidon kloonattiin ja arvioitiin p53, SMAR1 ja Cox-2-immunoblottauksella. Endogeenisen hiljentäminen spesifisten geenien, solut transfektoitiin 300 pmol HIF-1α- /Cox-2 -siRNA (Santa Cruz, CA) ja p53 shRNA (Santa Cruz, CA) käyttäen lipofektamiinia-2000: ssa 12 h. MRNA ja proteiini-tasot määritettiin RT-PCR: llä ja western-blottauksella.

Kromatiini immunosaostus ja PCR

ChIP määritys suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu laboratoriomme [9]. Lyhyesti, agaroosihelmet estettiin BSA: ta ja, pesun jälkeen helmet esi-inkuboitiin vasta-aineen kanssa SMAR1 /BANP (BTG-3 liittyy ydin- proteiiniin; Santa Cruz, CA). Solulysaatit sonikoitiin DNA: n leikkaamiseksi pituuksien välillä 200 ja 1000 emäsparia ja sitten sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit laimennettiin 10-kertaisesti ChIP laimennus puskuriin ja lisättiin pelletoitiin agaroosihelmiin, että esi-inkuboitiin vasta-aineiden kanssa. Yön yli inkubaation 4 ° C: ssa jälkeen helmet pestiin vähäsuolainen, korkea suola, LiCI: n ja Tris /EDTA-puskureita. Lopuksi, kromatiinin eluoitiin inkuboimalla helmiä 5 M NaCl: a 65 ° C: ssa ja proteiinit poistettiin käsittelemällä proteinaasi K: ChIP DNA puhdistettiin sitten käyttäen tarkoituksenmukaista puhdistusvälinepakkausta ja säilytettiin -20 ° C: ssa. SMAR1 sidottu ChIP DNA monistettiin käyttäen PCR: ää. Sekvenssit todennäköisesti SMAR1 sitoutumiskohdat COX-2-promoottori, ovat seuraavat: site-1: 5′-TGA-CCAGCATCCCAAATGTA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TGAGGGA-AAAACAGGGCATA-3′ (taaksepäin); site-2 5’- CAAAAAGAAAATGA-TCCACGC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TCATGAGACACGGATGCCTA-3′ (reverse); site-3 5’- CCGTGTCTCA-TGAGGAATCA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ATCATGGGTAGTGCTCAGGG-3′ (reverse); site-4 5’- TGCT-GTCATTTTCCTGAATGC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GGGGATTTTGACAGTTGGAA-3′ (reverse); site-5 5’-GCCCAGGCA-ACTGAAAAGTA-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3′ (reverse); site-6 5’-TTT-TGGACATTTAGCG-TCCC-3 ’(eteenpäin) ja 5’TGTTCTCCGTACCTTCA -CCC-3′ (reverse); site-7 5’- TACCTTTCCC-GCCTCTCTTT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TGGGGCGAGTA-AGGTTAAGA-3′ (reverse); site-8 5’-AAC-CTTACTCGCCCCAGTCT-3 ’(eteenpäin) ja 5’CAGA-AGGACACTTGG-CTTCC-3’ (reverse).

Quantitative real-time PCR

Quantitative real -aika PCR tehtiin määrittää ajasta riippuva ekspressio VEGF ja HIF-1α in kapsaisiinin käsiteltiin Hy-A549-solut (22). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin Master cycler kaltevuus (Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System) käyttäen SYBR-vihreällä Rox mix (ABgene, Epsom, Yhdistynyt kuningaskunta). Käytetyt alukkeet VEGF ovat 5′-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CAAAGCACAG-CAATGTCCTGAAG-3′ (taaksepäin) ja HIF-1α 5’-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 ’(eteenpäin) ja 5’-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 ”(reverse).

Tilastolliset analyysit

Arvot on esitetty keskivirhettä (SEM) tai tyypillisille kokeessa paitsi toisin mainita. Data analysoitiin, ja tarvittaessa merkitys eroja keskiarvojen määritettiin Studentin

t

testiä. Tulokset katsottiin merkitsevä

p

0,05. Kaikki kokeet suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa.

Tulokset

Kapsaisiini estää NSCLC aiheuttaman EY muuttoliike ja verkon muodostumisen

Koska EY maahanmuutto on keskeinen askel kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä; Olemme tutkineet kulkeutumista HUVEC läsnä ollessa käytetyn median viljelmistä sekä normaalien solujen ja NSCLC. GIST, HUVEC viljeltiin puuttuessa tai läsnä käytetyn median normaalien keuhkojen fibroblastisoluja (WI-38) ja NSCLC-soluja (A549) sekä CoCl

2-stimuloitujen A549-solut (Hy-A549). Tulokset haavan paranemista määritys osoitti ei-merkitsevä kulkeutumista HUVEC läsnä käytetyn median WI-38-soluissa, kun taas kulkeutuu merkittävästi havaittiin, kun läsnä oli A549 käytetyn median, tilanne matkien kasvain ehto (kuvio 1A) . Prosenttia migraatio HUVEC oli vielä enemmän Hy-A549 käytetty media (kuvio 1A), mikä osoittaa, että hypoksinen edellytys suosii angiogeneesiä. Hy-A549-soluja, siis käytetään muualla kokeita määrittää hypoksinen kunnossa.

(A) muutto HUVEC läsnä tai poissa käytetyn media NME, WI-38, A549 ja Hy-A549 (CoCl

2-stimuloitujen jäljittelemään hypoksinen ehto vaaditaan kasvaimen indusoimaa angiogeneesiä) tehtiin kaksisuuntainen haavan paranemista määritys 24 h (

vasen paneeli

). Solujen lukumäärä vaelsivat haava-alueen esitetään graafisesti (

oikea paneeli

). (B) edustavat kuvat HUVEC muuttoliikkeen inkuboitaessa kapsaisiini-käsiteltyjen (0-50 uM) Hy-A549 käytetty alusta (

vasen paneeli

). Prosenttia solu vaelsivat haava-alueen on graafisesti (

oikea paneeli

). (C) Hy-A549-soluja käsiteltiin kapsaisiini annoksesta riippuvalla tavalla 24 h ja solujen elinkykyisyys tekee trypaanisinivärin-syrjäytymisen määritys (

vasen paneeli

). Hy-A549-soluja, käsiteltiin kapsaisiinia (37,5 uM), alistettiin anneksiini-V-FITC /PI sitovia ja analysoitiin virtaus cytometrically määrittämiseksi prosentin varhaisen apoptoosin (

oikea paneeli

). (D) Sytotoksinen vaikutus eri annosten capsaisin HUVEC-soluissa mitattiin trypaanisinivärin syrjäytymistä määrityksessä. (E) Graafinen esitys HUVEC muuttoliikkeen inkuboitaessa käytettyä mediaa kapsaisiinia saaneista (37,5 uM) HBL-100, HCT-15, HeLa ja A549. (F) edustaja kuvia kapillaarimaisen versoa muodostumista HUVEC läsnä median yksin tai käytetyn median WI-38 /A549 /Hy-A549 /kapsaisiinia saaneilla Hy-A549. Arvot ovat keskiarvo ± SEM kolmen erillisen kokeen kussakin tapauksessa tai tyypillisille kokeessa.

Mielenkiintoista, käytetyn median kapsaisiinia käsitellyn Hy-A549 esti merkittävästi kasvaimen aiheuttama HUVEC muuttoliikettä kapsaisiini annoksen -riippuvaista tavalla, optimaalinen vaikutus on 37,5 uM kapsaisiinia 24 tunnin, jonka jälkeen ei enää merkittävää muutosta voitaisiin saada (kuvio 1 B). Vaikutus kapsaisiinin elinkelpoisuudesta Hy-A549-solut tutkittiin trypaanisinivärin syrjäytymistä määrityksessä. Kuva 1C (

vasen paneeli) B kuvattu annoksesta riippuvainen vaikutus kapsaisiinia elinkelpoisuudesta Hy-A549-solut sekä HUVEC (kuva 1 D). Tulokset osoittivat, että altistuminen 24 h, kapsaisiini ei aiheuttanut merkittävää kuolemaa joko solujen asti pitoisuudet 37,5 uM. Nämä tulokset täten sulkea pois mahdollisuutta hidastuminen EY muuttoliikkeen takia Hy-A549 solukuoleman tässä kapsaisiinin. Kuitenkin pitoisuudet yli 37,5 uM havaittiin olevan toksinen sekä Hy-A549-soluja ja HUVEC (kuvio 1 C,

vasemmasta paneelista

ja 1D). Lisäkokeita siis rajattu 37,5 uM. Sen arvioimiseksi, onko väheneminen solujen määrä johtuu alussa apoptoosin määrä anneksiini-V-positiivisten solujen määritettiin virtaussytometrialla. Tulokset Kuva 1C (

oikea paneeli

) osoitti 37,5 uM annos kapsaisiinia kuin osa-apoptoottisten annos Hy-A549-soluja. Nämä tulokset yhdessä varmistetaan ilman ”häiriön” apoptoottisten solujen 37,5 uM annos kapsaisiinia käytettiin seuraavissa kokeissa. Että vaikutus kapsaisiinia ei rajoitu tietyn tyyppisiä, validoitiin käyttäen akun solulinjoja, eli HBL-100, HCT-15, HeLa ja MCF-7 (kuvio 1 E). Kuitenkin yksityiskohtaiset mekaaniset tutkimukset kokeet suoritettiin Hy-A549-solut.

Seuraavaksi verso muodostumisen määritys hankittua suoritettiin Matrigel, vakiintunut angiogeneesimääritys. HUVEC muodostunut putkimainen -verkkojen 8 h (kuvio 1 F). Angiogeenisten versoa muodostuminen HUVEC oli korkein läsnä käytetyn median Hy-A549-solut sen jälkeen, kun A549-soluja ja Wi-38-solut (kuvio 1 F). Kuitenkin kapsaisiini esikäsittelyn Hy-A549 tehokkaasti estänyt versoa muodostusta HUVEC (kuvio 1 F), jossa putki kaltaisia ​​rakenteita vähenivät sekä leveys ja pituus ja osoitti epätäydellistä sekä rikki verkon rakenteita (kuva 1 F).

Kapsaisiini estää VEGF hidastamiseksi syöpäsolu aiheuttama EY muuttoliike

Kaikki reaktiot toistaiseksi määritelty esiintyi riippumaton suora kosketus HUVEC solujen kasvainsolujen tai jopa läheisyys, nostamalla siten mahdollisuus läsnäolo kasvain -shed liukoinen pro-vaeltavia tekijöitä käytetyn median. Tukee tätä, käytetty alusta on Brefeldin-A-käsitellyn Hy-A549 onnistunut indusoimaan merkittävää EY muuttoliike (kuvio 2A) ja kapsaisiini ei aiheuta enää vaikutusta (kuvio 2A). Uudelleen vahvistaa hypoteesia, vaikutus kapsaisiinia säätelyssä pro-angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, seurattiin Brefeldin A esikäsitelty Hy-A549-solut. Vaikka kapsaisiini ei muuttanut bFGF, EGF ja TGF-β tasot sitä merkittävästi alassäädetty VEGF ilmaisu (kuvio 2B). Lisätutkimukset paljastivat, että käytetty media Hy-A549-solut (10

6 solua /ml media) sisälsi keskimäärin 1,6 ng VEGF että väheni merkittävästi jälkeen kapsaisiini hoidon (kuvio 2C,

vasen paneeli

) . Voitaisiin ratkaista vaikutus kapsaisiinia säätelyssä VEGF Hy-A549-solut, otimme muutamia lähestymistapoja. Ensimmäisessä lähestymistavassa, kun Brefeldin A-esikäsitellyt Hy-A549-soluja käsiteltiin kapsaisiini 24 h, solunsisäinen VEGF kumottiin sekä mRNA: ta ja proteiinia tasoja (kuvio 2C,

keskipaneeli

). Nämä havainnot tukevat myös meidän kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR data kuvaa lasku suhteellinen VEGF mRNA: n ekspression Hy-A549-solut seuraavan kapsaisiinin hoidon (kuvio 2C,

oikea paneeli

) ja uudelleen vahvisti konfokaalimikroskopiaa (kuva 2D). Toisessa lähestymistavassa ohjaus alusta täydennettynä yhdistelmä-VEGF (0,8 ng /ml) lisäsi endoteelisolujen migraatiota ja versoa muodostumiseen (kuvio 2E 2F). Kolmannessa lähestymistavassa, kun kapsaisiinin esikäsitellyt Hy-A549 käytetty media täydennettiin yhdistelmä-VEGF-proteiinia (0,8 ng /ml), käänteinen kapsaisiinia vaikutus EY maahanmuuttoa ja itävät muodostuminen havaittiin (kuvio 2E 2F). Neljännessä lähestymistavassa HUVEC osoitti merkittävää vähenemistä muuttoliike (kuvio 2E) ja versoa muodostumiseen (kuvio 2F), kun Hy-A549 käytetty alusta oli esikäsitelty anti-VEGF-vasta-aine. Kuitenkin anti-VEGF-vasta-aine ei ole esittänyt mitään merkittäviä ylimääräisiä estävä vaikutus HUVEC muuttoliikettä ja versoa muodostumista kapsaisiini esikäsitellä Hy-A549 käytetty media (kuvio 2E 2F). Nämä tulokset yhdessä vahvisti hypoteesin, että Hy-A549-irtoa VEGF on keskeinen rooli syövän aiheuttamaa EY muuttoliike ja versoa muodostumista. Edellä kalustettu havainnot taipuvainen meitä rajaamaan täydellisen mekanismi asetuksen perustana kasvaimen angiogeneesin kapsaisiini.

(A) edustaja vaihekontrasti valomikroskooppikuvat osoittavat HUVEC muuttoliikkeen inkuboitaessa käytettyä tiedotusvälineet Brefeldin-A-esikäsitellyt, kapsaisiini ( 37,5 uM) hoidetun Hy-A549-solut (

vasen paneeli

). Prosenttia solu vaelsivat haava-alueen on graafisesti (

oikea paneeli

). (B) Immunoblotit osoittavat ilmentymisen profiilit pro-angiogeenisten tekijöiden VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, läsnä tai poissa ollessa kapsaisiinin. (C) eritetty VEGF peräisin solutonta supernatanttia Hy-A549 kvantitoitiin ELISA-määrityksellä (

vasen paneeli

). Aikariippuvainen ilmentymisen profiilit VEGF-mRNA /-proteiini in kapsaisiini saaneilla Hy-A549-solut määritettiin Western blot ja RT-PCR vastaavasti (

keskimmäinen paneeli

). Kapsaisiini saaneilla Hy-A549-solut tutkittiin ajasta riippuva vaihtelu ekspressioprofiilit VEGF kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-analyysi ja esittää graafisesti (

oikea paneeli

). (D) Immuno-fluoresoiva kuvat (60x suurennos), joka esittää ajasta riippuva malli VEGF-proteiinin (TRITC- loisteputki) in kapsaisiinia saaneilla Hy-A549-solut olivat edustettuina yhdessä tumavärjäystä (DAPI: sininen). (E) edustaja kuvia HUVEC maahanmuuton inkuboitaessa (i) rekombinantti-VEGF-täydennetty ohjaus media, tai VEGF-täydennetty käytetyn median kapsaisiinia käsitellyn Hy-A549-soluja, tai (ii) anti-VEGF-käsiteltyjen Hy-A549 käytetty media (

vasen paneeli

). Prosenttia solu vaelsivat jälkeen haava-alueelle voidaan esittää graafisesti (

oikea paneeli

). (F) edustaja kuvia kapillaarimaisen versoa muodostumista HUVEC-inkuboitaessa rekombinanteilla VEGF-täydennetty käytetty media kapsaisiinia käsitellyn Hy-A549-soluja tai anti-VEGF-käsiteltyjen Hy-A549 käytetty media. GAPDH /α-Actin käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Arvot ovat keskiarvo ± SEM kolmen erillisen kokeen kussakin tapauksessa tai tyypillisille kokeessa.

Kapsaisiini estää VEGF transkriptio kohdistamalla HIF-1α

Koska kapsaisiini vähentää VEGF molempia transkription sekä translaation tasoja me arveltu, että tämä phytochemical voisi olla sääntelyn vaikutus HIF-1α, tärkein transkriptiotekijä VEGF aikana hypoksiaa [4]. Mielenkiintoista, Kapsaisiini vähensi HIF-1α on proteiini tasolla mutta ei mRNA tasolla Hy-A549-solut (kuvio 3A,

vasen paneeli

), mikä vahvistettiin edelleen meidän kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR data (kuvio 3A,

oikea paneeli

). Lisäksi HIF-1α-siRNA-transfektoiduissa Hy-A549-solut kalustettu väheneminen VEGF-ilmentymisen (kuvio 3B) ja käytetyn median näiden transfektanttien osoitti merkittävästi vähemmän EY muuttoliike (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat, että kapsaisiini esti VEGF alas-moduloimalla sen keskeinen transkriptiotekijä HIF-1α (kuvio 3C). Koska kapsaisiini hoito näiden transfektanttien osoitti lisäksi väheneminen VEGF, osallistuminen HIF-1α-riippumaton reitti (a) VEGF: n eston, jonka kapsaisiini ei tehdä tyhjäksi.

(A) aika-riippuvaisen ekspression profiileja HIF -1α mRNA ja -proteiini määritettiin Western blot ja RT-PCR, vastaavasti, kapsaisiini saaneilla Hy-A549-solut (

vasen paneeli

). Kapsaisiini saaneilla Hy-A549-solut tutkittiin ajasta riippuva vaihtelu ilmaisun profiilit HIF-1α kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-analyysi ja esittää graafisesti (

oikea paneeli

). (B) Hy-A549-solut, transfektoitiin väliaikaisesti ei-kohdistuksen ohjaus-siRNA tai HIF-1α-siRNA, inkuboitiin /ilman kapsaisiinin 24 h; sitten solut analysoitiin VEGF-ilmentymisen proteiinin ja mRNA-tasot (

vasen paneeli

). Immunoblot osoittaa transfektion tehokkuutta HIF-1α (

oikea paneeli

) (C) Ohjaus-siRNA /HIF-1α-siRNA-transfektoiduissa Hy-A549-supernatantit käytettiin arvioimaan HUVEC maahanmuuttoa haavan paranemista määrityksen jälkeen kapsaisiini -käsittelyä (37,5 uM; 24 h) ja graafisesti. (D) aika-riippuvainen ilmentymisprofiili p53-mRNA ja -proteiini määritettiin Western blotting ja RT-PCR in kapsaisiini saaneilla Hy-A549-solut (

vasen paneeli

). p53 fosforylaation Serine-15 asemassa tutkittiin myös (

oikea paneeli

). (E) Hy-A549-soluja, jotka on transfektoitu ohjaus-shRNA /p53-shRNA inkuboitiin kapsaisiini 24 tuntia ja HIF-1α VEGF-mRNA: n ja -proteiinin määritettiin Western blot ja RT-PCR: llä (

vasen paneeli

). Transfektiotehokkuutta tarkistettiin analysoimalla p53 ekspressiotason (

oikea paneeli

). (F) HIF-1α immunosaostettiin kapsaisiinia saaneista Hy-A549-solulysaateista ja immunoblotattu anti-Ub-vasta koetta HIF-1α ubikitinaation. Tikkaat bändejä edusti ubikitinoitu HIF-1α. Samanaikaisesti kokeessa immunopresipitaatit analysoitiin HIF-1α tasot Western blot. Vertailukelpoinen proteiini tulo varmistettiin suoralla Western-blottauksella anti-α-aktiini käyttäen 20%: n solulysaateista, joita käytettiin immunosaostukseen. (G) Ohjaus- ja MG-132 lääke-esikäsitellyt Hy-A549-soluja altistettiin kapsaisiinin hoitoa 24 tuntia ja sitten tutkittiin ekspressiota HIF-1α /VEGF Western-blottauksella. α-Actin /GAPDH käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Arvot ovat keskiarvo ± SEM kolmen erillisen kokeen kussakin tapauksessa tai tyypillisille kokeessa.

Kapsaisiini suunnattu HIF-1α on p53-riippuvainen tavalla

Koska p53 suoraan kohdistaa HIF- 1α varten proteosomal hajoamiseen [9], arvioimme rooli p53, jos niitä on, kapsaisiini aiheuttama säätely HIF-1α: n ja VEGF.